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emc-consulte : Le clic vers la référence médicale

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Imprimé par M. Jean Roch ALLIEZ le dimanche 17 février 2008

Bases pratiques des chromatographies Practical principles in chromatography
Biologie clinique [90-60-0027]
M. Beljean-Leymarie Centre hospitalier spécialisé Bon Sauveur, 93, rue Caponière, 14000 Caen, France Auteur correspondant.

Résumé
La chromatographie est l'ensemble des procédés qui permettent de séparer différentes substances constitutives d'un échantillon en utilisant leur différence de migration à travers une phase fixe sous l'impulsion d'un fluide mobile. Cet article présente très brièvement les différentes méthodes utilisées en chromatographie. Il développe plus spécifiquement le concept de la chromatographie d'élution sur colonne et fournit les bases théoriques et pratiques requises à l'amélioration raisonnée des procédures de chromatographie.

Abstract
Chromatography refers to the body of processes used to separate different constituting substances of a sample using their difference of migration on a stationary and a fluid mobile phase. This chapter presents briefly the various techniques available in chromatography. It presents more specifically the column elution theory, providing the theoretical and practical bases required for the chromatographic procedure improvement.

Mots clés : Chromatographie, Chromatogramme, Rétention, Efficacité, Résolution Keywords : Chromatography, Chromatogram, Retention, Efficiency, Resolution

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Introduction
La chromatographie est l'ensemble des procédés qui permettent de séparer différentes substances constitutives d'un échantillon en utilisant leur différence de migration à travers une phase fixe (phase stationnaire) sous l'impulsion d'un fluide mobile (phase mobile) [1, 2, 3, 4, 5, 6 et 7]. Les méthodes chromatographiques sont nombreuses, les dénominations sont variables selon le type de classification choisie.

Classification selon la nature des phases

file:///C:/Users/Chiraz%20Nadine/Documents/Mes%20Fichiers/Biologie%20Clinique... 28/07/2011

• la chromatographie liquide (CL) . chaque soluté étant entraîné hors de la phase stationnaire. • chromatographie chirale (lorsque la séparation s'appuie sur la différence de conformation des énantiomères. liquide ou supercritique) . soit un gaz .. 28/07/2011 . voire liquide-liquide sont délaissés aujourd'hui. mises en présence d'un contre-ion. • chromatographie d'exclusion-diffusion (perméation de gel . • chromatographie d'échange de ligands lorsque la phase stationnaire contient une espèce chimique (ions métalliques) capable de former des complexes avec les molécules organiques . liquide-solide. Classification selon le mode d'introduction de la phase mobile On parle de chromatographie par développement lorsque le mélange est déposé sous forme de microvolume de solution et les solutés séparés sur la phase stationnaire sont mis en évidence (révélés) lorsqu'ils sont encore sur la phase stationnaire et de chromatographie par élution lorsque le mélange à analyser est déposé sous forme de microvolume de solution. • la chromatographie en phase supercritique (CPS). Classification selon le matériel utilisé (technologie) • Chromatographie en colonne : tube.filtration sur gel) lorsque la phase stationnaire est formée de grains poreux à travers lesquels les solutés à séparer peuvent ou non cheminer . Classification selon la nature des phénomènes mis en jeu On distingue différents types de chromatographie : • chromatographie d'adsorption : lorsque la phase stationnaire est un solide adsorbant. Les termes de chromatographie gaz-solide.emc-consulte : Le clic vers la référence médicale Page 2 sur 17 Phase stationnaire solide ou liquide . on différencie trois grandes classes de chromatographie : • la chromatographie en phase gazeuse (CPG) . liquide.. • chromatographie d'échange d'ions lorsque la phase stationnaire est un solide ayant des propriétés particulières d'échangeur d'ions (groupements fonctionnels ionisés ou ionisables fixes et des ions mobiles assurant l'électroneutralité) . rempli ou non de phase stationnaire. FSC) . • chromatographie de partage : lorsque la séparation est basée sur les différences de solubilité (de partage) des molécules dans une phase stationnaire liquide et une phase mobile (gaz. elle peut être développée en phase gazeuse. • Chromatographie planaire (de surface) : couche mince d'un support plus ou moins adsorbant. phase mobile gazeuse. Remarque concernant les chromatographies à haute performance Les chromatographies à haute performance sont nées des progrès technologiques. file:///C:/Users/Chiraz%20Nadine/Documents/Mes%20Fichiers/Biologie%20Clinique. L'identification des substances séparées se fait dans l'éluat (c'est-à-dire la phase mobile à la sortie de la colonne). donnent naissance à des paires d'ions . la phase mobile étant soit un liquide. liquide ou supercritique . • chromatographie d'affinité : c'est une chromatographie d'un type très particulier qui vise à séparer un soluté parmi tous les autres (contrairement aux autres chromatographies qui visent la séparation d'un maximum de solutés) en utilisant la complémentarité de structure de type clé-serrure. • chromatographie d'appariement d'ions : c'est une chromatographie liquide appliquée à des molécules ionisées qui. gaz-liquide.

ω : largeur à la base . Pic d'allure gaussienne. la colonne est nécessairement intégrée dans un ensemble allant de l'injecteur à l'enregistreur. de très petite taille. Zoom Haut de page Notions liées au chromatogramme Chromatogramme La simple observation d'un chromatogramme montre qu'à la sortie de la colonne. 28/07/2011 . Le résultat observé (le chromatogramme) (Figure 1) n'est que le résultat global de l'ensemble de l'appareillage. • Chromatographie liquide haute performance (CLHP ou HPLC) correspondant à la chromatographie liquide désormais « courante » avec phase mobile liquide pulsée et supports de la phase stationnaire homogènes. Toutefois. • La chromatographie couche mince à haute performance (HPTL) utilise les supports développés pour l'HPLC contribuant à la performance. un soluté se présente sous forme d'un pic d'allure gaussienne et que la largeur des pics augmente avec leur ordre de sortie (Figure 2). Figure 1 Figure 1. sont développées succinctement les notions file:///C:/Users/Chiraz%20Nadine/Documents/Mes%20Fichiers/Biologie%20Clinique. Zoom Le but de cet article étant essentiellement pratique. aujourd'hui..emc-consulte : Le clic vers la référence médicale Page 3 sur 17 • Chromatographie en phase gazeuse haute performance (CPG capillaire). Chromatogramme. Tr : temps de rétention . La suite de cet article porte exclusivement sur la chromatographie d'élution sur colonne. δ : largeur à mi-hauteur. inutile.. Figure 2 Figure 2. les solutés s'y séparent au fur et à mesure de leur progression en fonction de leurs différences d'affinité pour les phases. L'âme de la chromatographie est la colonne. Chromatogramme. H : hauteur du pic . La notation haute performance est devenue.

menant aux deux relations majeures toujours très couramment utilisées par les utilisateurs de la chromatographie : • la notion d' efficacité d'une colonne . t = 0 au moment de l'injection . Grandeurs de rétention Ces grandeurs sont définies au moment où le soluté sort de la colonne à son maximum de concentration.7 % du soluté entre m ax ± 3 σ. son équation est telle que les deux points d'inflexion. dr est fonction de la vitesse de déroulement du papier : dr = v papier tr . proportionnelle à la quantité de soluté injectée sur la colonne. Remarque : une substance n'ayant aucune affinité pour la phase stationnaire n'est présente que dans la phase mobile. sur le même chromatogramme.emc-consulte : Le clic vers la référence médicale Page 4 sur 17 fondamentales qui permettent de juger un chromatogramme. Concepts Les différentes théories de la chromatographie d'élution en colonne visent à expliquer le chromatogramme. ○ 99. Le pic d'allure gaussienne (Figure 1) implique que le pic réponde à l'équation mathématique d'une courbe de Gauss c'est-à-dire : • le pic est symétrique autour de sa médiane (correspondant au maximum max du pic). tm = L/μ. tr = L/vitesse du soluté sur la colonne. Si D est le débit de la phase mobile perfusant la colonne (supposé constant) Vr = D tr .. La distance de rétention dr est la distance parcourue par le stylet de l'enregistreur depuis le moment de l'injection du soluté jusqu'à sa sortie au maximum de concentration. 28/07/2011 .7 % de la hauteur H du pic sont distants de 2 σ (l'écart-type).354 σ. • la notion de facteur de rétention (caractéristique d'un soluté dans des conditions données). est telle que : ○ 95 % de la masse du soluté est comprise entre m ax ± 2 σ .. la largeur à la base du triangle extrapolé par les tangentes aux points d'inflexion ω est égal à 4 σ . la largeur des pics augmente avec la rétention des solutés . file:///C:/Users/Chiraz%20Nadine/Documents/Mes%20Fichiers/Biologie%20Clinique. Si μ représente la vitesse linéaire de la phase mobile. Cette surface A = √2 π σ H. le temps de rétention tr est le temps que met un soluté à sortir de la colonne. Son temps de rétention est égal à tm . Le tr est caractéristique d'un soluté donné dans un système chromatographique donné. La première théorie de la chromatographie a établi que le pic chromatographique est gaussien et que. à son maximum de concentration. sa largeur à mi-hauteur δ = 2. situés à 60. Le volume de rétention Vr est le volume de phase mobile qui a perfusé la colonne entre le moment de l'injection et l'instant où le soluté sort à son maximum de concentration. • que la surface du pic.

. /tmob. 28/07/2011 . via le coefficient de partage K (de l'équilibre supposé). /mmob ) ou comme le rapport des temps de séjour du soluté dans ces deux phases (tstat. comme k = tr -t0 /t0 . dans sa globalité : σ2total = σ 2 colonne + σ 2extracolonne . en pratique il est difficile d'appréhender tm . Vr = Vm + K Vs . (Actuellement. on utilise des solutés supposés n'avoir aucune affinité pour la phase stationnaire (inertes) et l'on définit alors le facteur de rétention par rapport à l'inerte choisi. elle a d'autant plus d'aptitude à séparer les différents solutés . H est appelé hauteur équivalente à un plateau théorique (HEPT). Ce nombre est accessible à partir du chromatogramme. Ainsi la relation K Vs /Vm se rencontre le plus souvent sous la forme : Vr = Vm (1 + k). Le facteur de rétention k (anciennement dénommé k' facteur de capacité) peut être défini soit comme le rapport des masses de soluté distribuées entre les deux phases (k = mstat. elle est d'autant plus efficace . Conséquences pratiques Déterminer expérimentalement le facteur de rétention file:///C:/Users/Chiraz%20Nadine/Documents/Mes%20Fichiers/Biologie%20Clinique. N exprime l'efficacité apparente de la colonne. ). anciennement notée h.emc-consulte : Le clic vers la référence médicale Page 5 sur 17 Deux relations majeures Efficacité apparente d'une colonne La colonne de chromatographie est assimilée à l'empilement de N plateaux identiques (plateaux théoriques) de hauteur H. infra]. La colonne est d'autant plus performante que N est grand . Comme le terme « apparent » l'indique. La longueur L de la colonne est égale à NH. puisque la colonne est nécessairement intégrée dans l'ensemble de la chaîne de chromatographie. • que l'on est amené à avoir une exigence d'efficacité de la colonne supérieure à celle d'un calcul théorique à partir du chromatogramme. De ce fait. En chromatographie liquide. par comparaison de la grandeur de rétention à la largeur du pic gaussien : N = (tr /σtotal )2. il est tel que k = (tr -tm )/tm . Il est caractéristique de chaque soluté.) N se définit comme le nombre de plateaux théoriques sur une colonne. la notation h est réservée comme symbole pour la hauteur réduite [cf. la variance σ2total accessible par le chromatogramme est le reflet du système chromatographique.. Elle est traduite en termes de temps sous la forme : tr = tm (1 + k). Cette relation implique : • qu'il est nécessaire dans une chromatographie de maîtriser la variance extracolonne afin de ne pas nuire aux performances de la colonne . t0 étant le temps de rétention de l'inerte choisi sur la phase utilisée. par exemple. Facteur de rétention k La deuxième relation fondamentale relie le volume de rétention d'un soluté Vr aux volumes des phases stationnaire Vs et mobile Vm de la colonne. la valeur de N ainsi établie ne permet pas de juger des performances de la colonne elle-même uniquement. Les pics sont d'autant plus étroits que N est grand. Aussi utilise-t-on de préférence le terme d'efficacité Napparent ou Neffectif . ce rapport est constant pour un soluté donné dans un système chromatographique donné stable dans le temps.

..M1 ) 3 dt mesure l'asymétrie du pic. à l'aide des moments. il correspond à la valeur de t au maximum de la concentration C par définition au tr . à 50 ou 60. il est souhaitable de disposer d'un logiciel qui permette d'accéder aux moments statistiques de chacun des pics. on peut utiliser le pic de l'air avec certains détecteurs. lorsque le pic n'est pas gaussien M1 ne correspond pas à la valeur de t pour le maximum de concentration.. On calcule N = (tr /σ)2. M2 = 1/ Mo ∫0 C (t) (t . dans un système chromatographique donné.t0 )/t0 . uracile. d'autant plus grandes que la mesure est faite dans la partie la plus basse du pic. Cette aire est assimilable à la quantité de soluté injectée. Ce composé a pour temps de rétention t0 . Mo = ∫C(t) dt. Différents composés ont été proposés dans la littérature (nitrate.354 σ).. dt correspond à la valeur de t du centre de gravité pour laquelle la surface de la courbe de t inférieur est égale à la surface de la courbe de t supérieur et égale à la moitié de la surface de la courbe totale.) en chromatographie liquide . le soluté donné. • Le moment d'ordre 1 . présentant un temps de rétention tr tel que tr = to (1 + k). Il est donc différent de t). • Le moment d'ordre 3.. Déterminer l'efficacité apparente d'une colonne On envisage les deux cas expérimentaux possibles.M1 ) 2 dt mesure la variance de la courbe (du pic) σ2 pour des pics non symétriques : l'efficacité apparente de la colonne N est calculée. Pic dissymétrique L'asymétrie des pics complique l'interprétation du chromatogramme. Les calculs effectués à la base du pic. liés à la symétrie des pics.. Accéder à l'efficacité intrinsèque d'une colonne Détermination de la variance extracolonne On utilise le chromatogramme obtenu à partir de l'injection d'un mélange d'au moins trois file:///C:/Users/Chiraz%20Nadine/Documents/Mes%20Fichiers/Biologie%20Clinique. • Le moment d'ordre 0 . Dans ce cas. Il est impossible de mesurer correctement σ. M1 = 1 / Mo ∫0 C(t) .7 % de la hauteur conduisent à des valeurs différentes. il est nécessaire de disposer d'un composé que l'on puisse considérer comme n'ayant aucune affinité pour la phase stationnaire. t. Le facteur de rétention k = (tr . • Le moment d'ordre 2. Pic symétrique On mesure sur le chromatogramme : tr et σ soit à partir de la largeur à mi-hauteur (2.. Un pic chromatographique correspond à la variation de la concentration ou de la quantité du soluté dans le détecteur en fonction du temps.emc-consulte : Le clic vers la référence médicale Page 6 sur 17 Pour déterminer expérimentalement le facteur de rétention d'un soluté donné. elle correspond au rapport des moments M1 2/M2 . 28/07/2011 . représente l'aire sous la courbe. c'est-à-dire quantité de soluté pour t inférieur = quantité de soluté de t supérieur = q o /2. M3 = 1/ Mo ∫0 C (t) (t . en CPG. soit à partir de la largeur entre les deux points d'inflexion (2σ) ou à partir de la largeur à la base extrapolée par les tangentes (ω = 4σ). (Lorsque le pic est gaussien.

• une perte de résolution comme on va de le voir dans ce qui suit. On représente la courbe σ 2total = f (t0 2/N) (1+ k)2] où (1+ k)2 est porté en abscisse.emc-consulte : Le clic vers la référence médicale Page 7 sur 17 composés et d'une substance considérée comme présentant une rétention nulle. Ce paramètre est majeur car d intervenant à la puissance 4 (d4) on veille à n'utiliser que des capillaires très étroits destinés à cet effet. on veille à limiter le inj volume injecté. Comment diminuer la variance extracolonne ? La maîtrise de la variance extracolonne appartient au chromatographiste. Grandeurs de rétention relatives Le but de la chromatographie étant de séparer les différents solutés. lorsque k = 0 c'est-à-dire pour (1+k)2 = 1.. Ce sont les grandeurs de rétention relatives. • d'autre part le volume de la cellule (choix à l'achat). deux paramètres sont importants : • d'une part le temps de réponse.Au niveau de l'injecteur : σ2 = V2/a où V est le volume d'injection . Existence d'une variance extracolonne importante Elle a pour conséquence : • une perte d'efficacité apparente de la colonne comme on vient de la montrer Nobs (1 + σ2 2 extracolonne /σ colonne = Nintr / ). 28/07/2011 . D . (Nexig· est bien > Ncol. on détermine : • le facteur de rétention k et la variance σ2 total . Ainsi pour répondre à une valeur souhaitée d'efficacité de l'ensemble.Au niveau du détecteur. où d est le diamètre des tubes de jonction. D est le débit de la phase mobile et Dm est le coefficient de diffusion du soluté. /[1 + (σextracol 2/σcol 2)]. . Pour chacun des trois pics.Au niveau des capillaires de jonction : σ2 tubes = constante . on veille à régler correctement la constante de temps du détecteur .. Celle-ci doit impérativement être inférieure à 10 % de la variance des pics. Il s'agit d'une droite pour laquelle. il faut avoir une exigence supérieure pour la colonne. π d L/Dm . de temps de rétention t0 . σ 2total = σ2 inj + σ2 tubes + σ2 détect . En effet Ncol· = [tr ⁄σcol ]2 . 4 . file:///C:/Users/Chiraz%20Nadine/Documents/Mes%20Fichiers/Biologie%20Clinique. = Ncol. et des capillaires de jonction. La variance extracolonne résulte de la dispersion du soluté au niveau de l'injecteur. . la variance σ2 totale correspond uniquement à la variance extracolonne σ2extracol . du détecteur. N exigée (pour une bonne séparation par exemple) est Nexig· = [tr 2⁄σcol 2 + σextracol 2] . des critères d'estimation des séparations ont été définis. ). si les concentrations disponibles le permettent. • l'efficacité apparente de la colonne N est calculée ou donnée par l'intégrateur. Nexig.

dm ..emc-consulte : Le clic vers la référence médicale Page 8 sur 17 Pour cerner de plus près le temps que passent les solutés dans la phase stationnaire. Résolution de pics symétriques La résolution est la grandeur destinée à apprécier la séparation de deux pics consécutifs.. La première définition s'adresse à des pics gaussiens. • Les grandeurs de rétention corrigées. • Les grandeurs de rétention relatives permettant d'apprécier la séparation de deux solutés élués consécutivement. • ω est la largeur à la base du triangle. puisque tm représente le temps mis par un soluté n'ayant aucune affinité pour la phase stationnaire pour sortir de la colonne. r r m ○ d' r ○ V' r = dr . Résolution de pics symétriques. Toute modification de la nature de l'une ou de l'autre phase modifie α . • tRA est le temps de rétention du composé le moins retenu (Figure 3). K1 et K2 les coefficients de partage. plus α est supérieur à 1. il est nécessaire de s'affranchir du terme tm intervenant dans tr . • tRB est le temps de rétention du composé le plus retenu . extrapolée par les tangentes . Il s'agit des différences d'interactions des solutés dans les phases stationnaire et mobile. file:///C:/Users/Chiraz%20Nadine/Documents/Mes%20Fichiers/Biologie%20Clinique. C'est une caractéristique de la colonne. infra) : ○ t' = t . à ne pas confondre avec les grandeurs réduites (cf. La sélectivité α mesure la différence de distribution thermodynamique des deux composés. Remarque : α = k2 /k1 = K2 /K1 .Vm . α = 1 si les deux composés ne sont pas séparés . Rétention relative ou sélectivité La sélectivité est définie comme le rapport entre les facteurs de rétention de deux solutés consécutifs (la plus grande des deux valeurs étant toujours portée au numérateur) α = k2 /k1 . Elle consiste à comparer la distance qui sépare deux pics consécutifs à la somme de leurs demi-largeurs. • α > 1.t . = Vr . 28/07/2011 . Figure 3 Figure 3. plus les composés sont séparés .

15 %). Ainsi. Que penser Remarque : si un pic est nettement plus important que l'autre. il reste de part et d'autre de ce domaine 0. ainsi que les facteurs de rétention k des deux solutés d'autre part.7 % du soluté est compris sous la courbe entre tR est symétrique. 28/07/2011 . 99.85 % de B est à droite de L(K). Ce sont : file:///C:/Users/Chiraz%20Nadine/Documents/Mes%20Fichiers/Biologie%20Clinique. dans le schéma ci-dessus : OA K = 3 σA . il faut R de cette valeur ? Cette valeur repose sur deux hypothèses : les deux pics sont gaussiens et de même importance quantitative. si L et K sont confondus IF = OA K + OB L = 3 σA + 3 σB . si les deux pics sont d'égale importance (ceci est négligeable) et l'on peut considérer que les deux substances sont bien séparées. Le calcul de résolution a toujours pour but de réfléchir à la meilleure façon d'améliorer une séparation un peu délicate (d'optimiser).85 % de A est à gauche de K(L) et 99. s ≥ 1.50.15 % de soluté. σ. Les deux hypothèses les plus fréquemment rencontrées s'appuient sur le fait que les pics sont très proches l'un de l'autre.emc-consulte : Le clic vers la référence médicale Page 9 sur 17 Zoom Valeur limite de Rs On lit couramment que pour que deux pics soient bien séparés.15 % de B.. on doit avoir une plus grande exigence Rs = 2 voire 3 et plus . Il existe un chevauchement de 0..15 % de A avec 0. voire trop proches. Relations entre résolution et paramètres chromatographiques On peut montrer qu'il existe une relation entre la résolution d'une part et l'efficacité N et la sélectivité α de la colonne. le recouvrement du plus petit est bien supérieur (> > 0. la courbe Les pics sont gaussiens : 99. On trouve dans la littérature plusieurs relations voisines différant par les hypothèses faites. OB L = 3 σB .

Ces deux relations conduisent à des résultats analogues. 28/07/2011 . sur l'équation de Van Deemter. résistance au transfert de masse vers l'une et l'autre phase. Pour augmenter R. diffusion. On montre que l'élargissement des bandes de soluté sur une colonne est le résultat de trois phénomènes : variété des chemins parcourus. Il est nécessaire d'être attentif au réglage du débit de la phase mobile D . H = A + B/μ + C μ. suffisants pour répondre au but poursuivi : rationaliser l'influence de facteurs liés à la chromatographie . dans une première approche simplifiée. Influence de la vitesse linéaire de la phase mobile sur l'efficacité de la colonne. représente la demi-somme des deux k . Ainsi la variance de la bande de soluté sur la colonne : σ2 col = σ2 anisotropie + σ2 diffusion + σ2 transfert de masse . reliant la HEPT à la vitesse de la phase mobile μ. Aspect pratique : détermination du débit optimal . le temps de l'analyse augmente. À ce minimum de la valeur Hmini correspond le maximum de la valeur Nmax que l'on peut donner à l'efficacité de la colonne. • 2e hypothèse : N efficacité est la même pour tous les composés consécutifs. • avec k les facteurs de rétention. On peut s'appuyer. Il suffit pour cela de vérifier que la colonne est utilisée dans les conditions optimales de débit. Si on augmente L.emc-consulte : Le clic vers la référence médicale Page 10 sur 17 • 1re hypothèse : les pics sont si proches que l'on peut considérer qu'ils sont de même largeur ωA = ωB avec ωB = 4 trB /√NB .. on peut augmenter L ou diminuer h (HEPT). cette hypothèse présente l'avantage de donner aux deux solutés la même importance. ceci implique un changement de colonne et de plus tr augmentant. Il est aisé de montrer que la courbe représentative d'une telle équation présente un minimum.c'est dire rationaliser l'optimisation. Rs varie : • avec N l'efficacité de la colonne . ε étant la file:///C:/Users/Chiraz%20Nadine/Documents/Mes%20Fichiers/Biologie%20Clinique. Pour augmenter une résolution on peut donc envisager la modification d'au moins un de ces trois paramètres. débit et vitesse sont étroitement liés : D = ε π r2 μ. Augmenter N. • avec α la sélectivité de la colonne .. B est le composé le plus retenu à partir duquel on calcule NB . N = L/h. On préfère d'abord chercher à diminuer la HEPT H. chacun des trois termes correspond à une cause d'élargissement des pics chromatographiques.

Modifications de k. on est alors confronté à d'autres inconvénients. Résolution de pics dissymétriques file:///C:/Users/Chiraz%20Nadine/Documents/Mes%20Fichiers/Biologie%20Clinique. lorsque k passe de 5 à 10 la résolution n'augmente que de 9 %. une approche plus précise utilise la relation de Knox. 28/07/2011 . si α est très différent de 1. mais la durée d'analyse double.. Il est à noter que ce qui influence la résolution. En chromatographie liquide. • en modifiant la température. en revanche. • en changeant la nature de la phase stationnaire . est plus exactement le rapport : Les modifications sur des α très proches de 1 ont une grande influence . plus complète et reliant la HEPT réduite h (H/dp ) à la vitesse réduite de la phase mobile ν H = A ν 1/3 + B/ν + C ν Modification de la sélectivité α.= Remarque : en chromatographie liquide. en revanche. si k est très différent de 1.. on cherche habituellement des k compris entre 2 et 5 pour l'analyse de mélanges peu complexes. Par exemple : Le premier essai à effectuer en chromatographie liquide porte sur la modification de la composition de la phase mobile. Ainsi. on mesure l'efficacité apparente de la colonne à trois débits de (μopt. Pour déterminer le débit optimal. α peut être modifié : • en changeant la nature et la composition de la phase mobile . Les modifications sur des k très proches de 0 ont une grande influence . l'influence est minime. Le premier essai à effectuer en chromatographie gazeuse porte sur la modification de la température. l'influence est minime.emc-consulte : Le clic vers la référence médicale Page 11 sur 17 porosité de la colonne.

Les exigences sont différentes si les pics sont de hauteurs très différentes et si les pics sont asymétriques car. cette relation s'est avérée satisfaisante pour des pics dissymétriques. Rs doit être calculé à partir du facteur de discrimination do . Zoom hp hv = hauteur du plus petit. Facteur de discrimination. Résolution de pics dissymétriques. la mesure de la largeur du pic notamment à 60..2 e[-2Rs 2] = résolution où Rs Calculée initialement pour des pics gaussiens. ω devient supérieur à 4σ. Le facteur de discrimination est par définition le rapport (Figure 4) : Figure 4 Figure 4. comme nous l'avons montré précédemment. En analyse qualitative file:///C:/Users/Chiraz%20Nadine/Documents/Mes%20Fichiers/Biologie%20Clinique. l'existence d'une variance extracolonne minore la résolution intrinsèque sur la colonne. 28/07/2011 .7 % de hauteur (2σ) n'est plus adaptée. De plus.. Haut de page Intérêt analytique de la chromatographie Comme pour toutes les méthodes analytiques. = hauteur de vallée. dans ces cas. les applications sont qualitatives et quantitatives. La détermination géométrique n'a plus de sens. Il a été montré qu'il existait une relation simple approximative mais suffisante pour chiffrer la séparation de deux solutés consécutifs : d0 = 1 .emc-consulte : Le clic vers la référence médicale Page 12 sur 17 La définition de la résolution repose sur l'observation de chromatogrammes où les pics sont symétriques.

En théorie. ce sont les données courant ionique. nature. la séparation chromatographique repose sur des différences entre les solutés : de polarité. tr est constant dans des conditions chromatographiques données. En réalité. de tension de vapeur saturante (en CPG). De ce fait. avec barrette de diodes (en CL) ou en spectrophotométrie IR avec transformée de Fourier (en CPG) : le système de détection acquiert simultanément les données : absorbance. la maîtrise de l'exactitude du volume injecté est beaucoup plus difficile que l'on peut a priori supposer. • pour l'EI : mEI = KEI AEI X et EI sont dans la même solution de volume injecté v. • m i : masse soluté. Ainsi. on peut faire un étalonnage en injectant un volume constant de solutions de concentrations différentes et en traçant la courbe A = f(C). Il permet d'éliminer les erreurs quantitatives liées à une mauvaise maîtrise du volume injecté. l'inverse n'est pas vrai.. il est possible d'analyser toute partie du pic chromatographique et de conclure à la pureté du pic et à l'identification. Mais le tr n'est pas un critère absolu . même quasi impossible en CPG. ce problème est moins complexe du fait des nouveaux détecteurs qui sont en mesure de mémoriser simultanément trois paramètres. En effet. Par exemple : • en spectrophotométrie UV-visible. En effet. Principe de la méthode Un étalon interne (EI) est une substance que l'on ajoute aux échantillons à analyser.. si on peut incontestablement affirmer que deux solutés dont les tr sont différents. c'est-à-dire sur une colonne donnée dans des conditions données (température et P en CPG . • en détection de masse. m/z et temps qui sont mémorisées simultanément. Cette courbe devrait être une droite (dans les cas les plus simples). les constituants peuvent être identifiés. d'encombrement stérique. donc Ai = fi mi . Aussi préfère-t-on utiliser un étalon interne. • f i : facteur de réponse ou coefficient de réponse du détecteur . sont de natures différentes. K et KEI sont constants dans le temps : file:///C:/Users/Chiraz%20Nadine/Documents/Mes%20Fichiers/Biologie%20Clinique. de polarisabilité. • Ai : aire du pic correspondant à l'intégration du signal délivré par le détecteur . composition et débit de la phase mobile en CL à température donnée).emc-consulte : Le clic vers la référence médicale Page 13 sur 17 Les méthodes chromatographiques sont des méthodes de séparation. Le premier critère d'identification d'un soluté est son temps de rétention tr . 28/07/2011 . L'aire d'un pic chromatographique est proportionnelle à la masse de soluté injecté. En analyse quantitative L'analyse quantitative est liée à la théorie qui permet d'établir que l'aire du pic est proportionnelle à la quantité injectée. Si le détecteur est stable. à concentration constante. de solubilité. Il est choisi parmi les solutés se séparant parfaitement bien des composés à analyser mais présentant un temps de rétention proche. longueur d'onde et le temps .. Après séparation. De nos jours. deux solutés de structures totalement différentes peuvent présenter le même tr . • Pour un soluté X : mX = K AX ..

Figure 1 file:///C:/Users/Chiraz%20Nadine/Documents/Mes%20Fichiers/Biologie%20Clinique. chromatographie d'exclusion. ainsi que l'appareillage ou les développements récents dans le domaine de la microchromatographie. DHPLC.. chromatographie liquide à polarités de phase inversées.. etc. 28/07/2011 . Le lecteur peut se reporter aux ouvrages généraux ou spécialisés ainsi qu'aux informations très détaillées fournies par les sociétés d'appareillage. mais la quantité d'étalon interne doit être rigoureusement la même dans tous les tubes. La pratique de chaque type particulier de chromatographie.emc-consulte : Le clic vers la référence médicale Page 14 sur 17 Remarque : Le rapport mX /mEI des masses injectées est le même que celui des masses dans le tube d'échantillon traité dans le protocole (avec la quantité fixée d'EI). qEI sera impérativement constant et AX /AEI = z' qX Le volume final n'est pas nécessairement égal dans tous les tubes. de la nanochromatographie ou des flash chromatographies ne font pas l'objet de ces bases pratiques. afin de situer les problèmes pratiques rencontrés lorsqu'on aborde la chromatographie. Haut de page Conclusion Cette fiche a pour but de résumer les notions de base.. Ainsi. chromatographie en phase gazeuse..

Pic d'allure gaussienne. Figure 2 Figure 2 : Chromatogramme. ω : largeur à la base .emc-consulte : Le clic vers la référence médicale Page 15 sur 17 Figure 1 : Chromatogramme.. Figure 3 Figure 3 : file:///C:/Users/Chiraz%20Nadine/Documents/Mes%20Fichiers/Biologie%20Clinique. δ : largeur à mi-hauteur.. Tr : temps de rétention . 28/07/2011 . H : hauteur du pic .

Dauphin C. Couplage l'ingénieur. (vol [2] Caude M. (vol [4] Pradeau D. (vol TA2) Paris: Techniques de l'ingénieur. Figure 4 Figure 4 : Résolution de pics dissymétriques. liquide (partie 1) Techniques de l'analyse. Chromatographie planaire Techniques de l'analyse. Tous droits réservés. [3] Caude M. Haut de page Références [1] Caude M. 2006 . (vol TA2) Paris: Techniques de [7] Chromatographie : faire le bon choix (automates) Option Bio. chirales Techniques de l'analyse. (vol TA2) Paris: Techniques de l'ingénieur.emc-consulte : Le clic vers la référence médicale Page 16 sur 17 Résolution de pics symétriques. Facteur de discrimination.. Chromatographie liquide (partie 2). 2007. Jardy Aeditors. [5] Tranchant J. 2007. Chromatographie TA2) Paris: Techniques de l'ingénieur. Séparations TA2) Paris: Techniques de l'ingénieur.. 2007. Chromatographie en phase gazeuse Techniques de l'analyse.. Perméation de gel Techniques de l'analyse. [6] Tranchant J. file:///C:/Users/Chiraz%20Nadine/Documents/Mes%20Fichiers/Biologie%20Clinique.. 361 : 38-44 Haut de page © 2007 Elsevier Masson SAS. CG/SM/SM Techniques de l'analyse. 2007. (vol TA2) Paris: Techniques de l'ingénieur. Bargmann-Leyder N. 2007. 2007. Jardy A editors. 28/07/2011 .

..emc-consulte : Le clic vers la référence médicale Page 17 sur 17 file:///C:/Users/Chiraz%20Nadine/Documents/Mes%20Fichiers/Biologie%20Clinique. 28/07/2011 .