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SPETTROFOTOMETRIA DI FLUORESCENZA E FOSFORESCENZA

Quando gli elettroni passano da uno stato energetico superiore ad uno stato di energetico inferiore, l'energia recuperata può venire emessa sotto forma di radiazione elettromagnetica; infatti, una volta che la molecola ha assorbito la radiazione incidente può andare incontro a due tipi di processo: la maggior parte delle molecole trasferisce l'eccesso di energia all'intorno con un processo non radiativo: l'energia emessa, sotto forma di calore, permette alle molecole circostanti di compiere vibrazioni, rotazioni e traslazioni. una piccola parte delle molecole, invece, subisce un decadimento radiativo dove l'energia in eccesso viene liberata sotto forma di fotoni. Una molecola eccitata si trova in uno degli stati vibrazionali di un livello energetico superiore; essendo soggetta a collisioni con le molecole circostanti rilascia parte della sua energia sotto forma non radiativa e scende nella scala dei livelli vibrazionali. Il comportamento delle molecole fino a questo punto è indistinto; la prima differenza dipende dalle molecole circostanti: se queste sono in grado di assorbire la restante energia in eccesso della molecola eccitata questa completa il suo rilassamento in modo non radiativo, altrimenti si possono avere i processi di fluorescenza o di fosforescenza. La fluorescenza è uno dei due processi radiativi con cui si può verificare il rilassamento di una molecola eccitata, l'altro è la fosforescenza. La distinzione tra i due processi fu originariamente fatta in base al tempo di vita della radiazione: nella fluorescenza la luminescenza cessa quasi subito dopo aver eliminato la radiazione eccitante, mentre nella fosforescenza la radiazione continua ad essere emessa, almeno per un breve lasso di tempo, anche dopo aver eliminato la sorgente eccitante. Ora, invece, si possono distinguere i due processi sulla base della natura degli stati elettronici coinvolti nelle transizioni responsabili dell'emissione di radiazione. Le transizioni elettroniche che si possono verificare in una molecola organica a seguito dell’assorbimento di luce sono rappresentate nella Tabella 2.

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122 . esso può mantenere lo spin originario oppure invertirlo. Nella FLUORESCENZA la radiazione è generata in virtù di transizioni tra stati con la stessa molteplicità di spin (per esempio S1 → S0). il passaggio allo stato attivato avviene con inversione dello spin. la transizione coinvolta comporta variazione della molteplicità di spin: il caso più frequente sono transizioni tripletto-singoletto. si parla di stato di tripletto. Allo stato di singoletto compete una energia più alta e una vita media che va da 10--11 a 10-9 sec. invece. si parla di stato di singoletto e gli spin degli elettroni nello stato eccitato sono appaiati come nello stato fondamentale. invece. Lo stato di tripletto è di fondamentale importanza per la fotochimica dei composti organici. Se l’eccitazione avviene con ritenzione dello spin. Nella FOSFORESCENZA.Le energie associate ai differenti tipi di transizione sono riportate in Figura 1 Quando un elettrone viene promosso da uno stato fondamentale ad uno di eccitato. mentre lo stato di tripletto ha una energia inferiore e una vita media da 10-3 a 101 sec. Se.

2) la molecola eccitata nello stato di singoletto S1 può ricadere nello stato fondamentale S0 senza emettere radiazione 3) la molecola eccitata nello stato di singoletto S1 può ricadere nello stato fondamentale S0. Pertanto. Cosa accade ora? 1) la molecola eccitata nello stato di singoletto S2. emettendo una radiazione in un processo che viene chiamato fluorescenza 4) la molecola eccitata nello stato di singoletto S2 o S1. a seguito dell’assorbimento di luce. S2. a più alta energia. mediante una serie di transizioni. passando allo stato di tripletto T1 in un processo chiamato incrocio intersistema.Il diagramma di Jablonski riassume le trasformazioni energetiche che si verificano per assorbimento di una radiazione di sufficiente energia in una molecola. viene eccitata a uno dei suoi stati elettronici di singoletto (S1. la transizione di uno stato fondamentale di singoletto (S0) al primo stato di tripletto eccitato (T1) ha una scarsissima probabilità di avvenire in quanto è una transizione proibita. può ricadere nello stato di minor energia S1. può sottostare a un interscambio senza radiazioni che richiede il disaccoppiamento di spin. cioè le transizioni tra stati a diverse molteplicità sono proibite. chiamate conversioni interne: in una conversione interna l’energia accumulata viene dissipata sotto forma di calore. Una molecola nello stato fondamentale (S0). 123 . Quello che si genera in un primo momento è dunque uno STATO DI SINGOLETTO in quanto le molecole nello stato fondamentale sono quasi tutte dei singoletto e l’eccitazione segue la legge della conservazione dello spin. …). senza emettere radiazioni.

perde energia fino a raggiungere lo stato di vibrazione più bassa. come indicato dalle frecce piccole. se il salto è piccolo. provocando un'onda elettromagnetica che sarà visibile come luce blu. nel giro di una frazione infinitesima di secondo. in generale. situato nel primo livello di vibrazione dell'orbitale di partenza. Le due curve rappresentano l'energia dell'elettrone in funzione della distanza tra gli atomi della molecola. FLUORESCENZA Nella fluorescenza un elettrone molecolare viene investito da un'onda elettromagnetica della radiazione ultravioletta ed assorbendone l'energia si sposta su un'orbitale più esterno. a frequenze ν' minori di ν. lasciando l'elettrone in un particolare stato instabile dal quale tornerà nella posizione originaria. Infatti la lunghezza d'onda della radiazione è tanto più corta quanto più alto è il salto energetico. l’energia associata alla conversione di T1 in S0 si chiama fosforescenza. Un elettrone. emettendo un fotone di luce visibile. ma l'eccessiva energia vibrazionale improvvisamente acquisita dalla molecola viene dispersa in brevissimo tempo nell'ambiente.La molecola dallo stato eccitato T1 può a sua volta: a) ricadere allo stato fondamentale con emissione di energia. In pratica la radiazione emessa ha un’energia inferiore (e frequenza maggiore) rispetto alla radiazione incidente (la cui energia è maggiore ma la frequenza minore). mentre le linee orizzontali all'interno delle curve sono i livelli di energia corrispondenti alle loro vibrazioni. successivamente può ricadere nello stato di minor energia S0. b) lo stato T1 può sottostare a un interscambio senza radiazioni che richiede il disaccoppiamento di spin. senza emettere radiazioni. 124 . che porta la molecola eccitata al più basso livello vibrazionale del rispettivo stato elettronico S. perciò l'elettrone ricade nell'orbitale iniziale. Le radiazioni emesse possiedono. se il salto è elevato. Questa conversione tripletto-singoletto analogamente a quella singoletto-tripletto ha una bassa probabilità. da qui. viene colpito da una radiazione elettromagnetica e ne assorbe l'energia grazie alla quale viene spinto su un orbitale più esterno. o come luce verde o rossa. Ma questo è uno stato instabile. passando nuovamente allo stato di singoletto in un processo di decadimento vibrazionale. in un livello di vibrazione elevato.

prima di ricadere nell'orbitale partenza. Tale orbitale intermedio è molto stabile. Le curve dell'energia potenziale di questi due stati si intersecano e un livello vibrazionale dello stato tripletto e uno dello stato singoletto eccitati hanno la stessa energia. da qui. affinché avvenga un processo di fosforescenza. e ciò permette all'elettrone di rimanervi per parecchio tempo. in un livello di vibrazione più elevato. questo è il motivo per cui la luce di fosforescenza può essere emessa anche molto tempo dopo la fine dell'eccitazione. che possiede un'energia un pò inferiore rispetto allo stato singoletto dello stesso livello energetico. anche la luce di fosforescenza può avere un qualsiasi colore dello spettro visibile. si viene a trovare in uno stato singoletto di un livello energetico superiore e in uno dei livelli vibrazionali. Poiché l'energia dell'orbitale intermedio può variare anche di molto. perde energia fino a raggiungere lo stato di vibrazione più bassa. viene colpito dai raggi ultravioletti e. Inoltre. Secondo l’interpretazione basata sulla natura degli stati elettronici coinvolti. Una volta assorbita l'energia della radiazione incidente. essendo la probabilità che ha l’elettrone di ricadere sull'orbitale di partenza estremamente bassa (si dice che la transizione è proibita). grazie all'energia assorbita. che si trova inizialmente nel primo livello di vibrazione dell'orbitale in basso. Una volta avvenuto lo scambio la molecola cede energia all'intorno in maniera non radiativa fino allo stato vibrazionale fondamentale dello stato elettronico eccitato. gli elettroni non decadano tutti nello stesso istante. la molecola deve inizialmente essere in uno stato singoletto del livello energetico fondamentale. come indicato dalle frecce piccole della figura. Ma la struttura molecolare del materiale fosforescente è tale che la stessa energia corrisponde anche ad un orbitale intermedio più stabile. La molecola ha anche uno stato tripletto nel livello elettronico superiore. invece. A questo punto c'è un "meccanismo" che permette la conversione da singoletto a tripletto e la molecola va incontro ad un Intersystem crossing. viene spinto su un orbitale più energetico. ma in modo casuale durante un tempo ben più lungo.FOSFORESCENZA In questo caso un elettrone. a secondo della struttura cristallina del materiale. 125 . e quindi l'elettrone sarà costretto a spostarsi su quest'ultimo. come abbiamo visto per la fluorescenza.

infatti. SPETTRO DI LUMINESCENZA Poichè la fluorescenza trae origine dalla caduta dell'elettrone dal più basso livello vibrazionale del primo stato elettronico eccitato a uno dei livelli vibrazionali dello stato fondamentale. Questo spiega facilmente anche il motivo per cui l'effetto della fosforescenza non termina con il cessare della radiazione incidente. è in genere simile allo spettro di assorbimento ma spostato a lunghezze d'onda maggiori. Anche gli spettri di fosforescenza sono spostati batocromicamente rispetto agli spettri di assorbimento ma più di quanto osservato per la fluorescenza. ma l'accoppiamento spin orbitale che è stato responsabile anche dell'intersistem crossing rompe di nuovo le regole di selezione e permette un passaggio. lo spettro di fluorescenza. vale la seguente legge: LEGGE DI STOKES L'energia del fotone emesso appartiene ad una regione dello spettro spostata verso lunghezze d' onda maggiori rispetto alla lunghezza d' onda del fotone. 126 . La banda di assorbimento è ottenuta come inviluppo delle righe di eccitazione.Questo stato è più basso del corrispondente stato singoletto e la molecola non potrebbe emettere la sua energia perché il suo ritorno allo stato fondamentale è proibito essendo un passaggio da uno stato tripletto ad uno singoletto. seppure molto lento. infatti l'energia dello stato di tripletto T1 è in genere più bassa di quella dello stato di singoletto S1 Per i fenomeni di fluorescenza o la fosforescenza. La banda di luminescenza è indipendente dalla radiazione monocromatica eccitatrice purché appartenente a una medesima banda di assorbimento (l' intera banda di emissione è presente per ogni radiazione monocromatica assorbita appartenente alla banda illuminante).

a causa di fenomeni di diffusione. Notare la posizione del secondo monocromatore per evitare di raccogliere la luce trasmessa. La luce che diffonde ha la stessa lunghezza d’onda di quella incidente e un’intensità proporzionale alla quarta potenza della frequenza della luce incidente. La luce prodotta dalla lampada (L) viene focalizzata sull'ingresso di un monocromatore (M1) che seleziona la lunghezza d'onda desiderata. In un fascio policromatico le radiazioni a bassa a bassa lunghezza d’onda sono quelle che vengono diffuse più efficacemente. Il fascio monocromatico colpisce il campione (S). Il secondo monocromatore è infatti necessario per evitare che alcune radiazioni eccitanti arrivino al rivelatore. in particolare a causa della diffusione di Rayleight e della diffusione di Tyndall.SPETTROFLUORIMETRO Diagramma di uno spettrofluorimetro. DIFFUSIONE DI RAYLEIGHT: si verifica quando la radiazione attraversa un mezzo trasparente in cui incontra particelle con diametro molto inferiore (inferiore a 1/10) della propria lunghezza d’onda. 127 . e questo può accadere nonostante la radiazione emessa venga misurata perpendicolarmente rispetto a quella eccitante. La composizione cromatica della luce emessa viene analizzata dal secondo monocromatore (M2) e l'intensità dal fotomoltiplicatore (PM).

♥♥♥♥♥♥♥♥♥♥♥♥♥♥♥♥♥ L'effetto Raman risulta dall'interazione dei movimenti vibrazionali e/o rotazionali delle molecole con una radiazione elettromagnetica. Se in queste condizioni la molecola è soggetta ad una radiazione di una certa frequenza. come risultato della sua interazione con la materia.DIFFUSIONE DI TYNDALL: si verifica in presenza di sistemi colloidali nei quali le particelle hanno un diametro confrontabile con la lunghezza d’onda della luce visibile. in quanto la carica positiva del nucleo viene attratta dal polo negativo e la carica negativa degli elettroni dal polo positivo. che le molecole siano polarizzabili. era in un uno stato vibrazionale o rotazionale eccitato). Vi è però un altro tipo di interferenza che può insorgere. il fotone verrà riemesso con una frequenza inferiore di quella iniziale. ovvero i fotoni che collidono hanno uno scambio energetico con le molecole. mentre nel caso dello scattering anelastico. può essere definita elastica (Rayleigh o Tyndall scattering) o anelastica (Raman scattering). L’intensità della luce diffusa è proporzionale alla seconda potenza della frequenza della radiazione incidente Il secondo monocromatore sposta la banda di fluorescenza di 20 nm oltre quella di eccitazione. soprattutto a temperatura ambiente. In questo caso la lunghezza d’onda della radiazione può essere spostata verso valori minori o maggiori. non tutte le rotazioni o vibrazioni molecolari sono Raman attive. innanzitutto. e questa è la DIFFUSIONE RAMAN: il fenomeno. il campo subito da ogni molecola varierà creando delle oscillazioni nel dipolo della stessa frequenza della radiazione. con CHCl3 di +10 nm. le quali possono perdere o acquistare energia. In ogni caso. sempre rispettando le leggi della meccanica quantistica. sicchè abbiamo subito evidenza dell'effetto Rayleigh. Purtroppo. le frequenze sono diverse e costituiscono lo spettro del campione. Come già accennato. L'entità del dipolo indotto dipende dalle dimensioni del campo e dalla geometria della molecola. se la molecola cede energia. Riassumendo. la nuova frequenza del fotone sarà maggiore. 128 . Nel primo caso. anche se soggetto a certe regole di selezione). si verifica quando viene diffusa solo una piccolissima frazione della luce che incide su un mezzo trasparente. Questa separazione di carica comporta un momento di dipolo indotto e la molecola si definisce polarizzata. la diffusione (scattering) della luce. che dipende dal solvente. ovvero generano un effetto Raman: affinchè ciò accada occorre. Quando una molecola viene introdotta in un campo elettrico subisce una distorsione. Se la molecola guadagna energia. mentre l'altra consegue da una perdita di energia molecolare (che può solo avvenire se la molecola. tale effetto è di tipo anelastico. la quantità di energia scambiata è molto piccola: per poterla studiare è necessario l'utilizzo di uno strumento molto sensibile. al contrario. la luce diffusa mantiene la stessa frequenza del raggio incidente. perché la lettura della fluorescenza avvenga senza interferenze dovute a questi fenomeni di diffusione. la radiazione Stokes è generalmente più intensa dell'anti Stokes. Se si usa MeOH è spostata a λ maggiori di +30 nm. Poiché la prima è accompagnata da un aumento dell'energia molecolare (avvenimento frequente. al momento della collisione. La radiazione diffusa con una frequenza più bassa di quella del raggio incidente si definisce radiazione Stokes. comunque. mentre quella a più alta frequenza viene chiamata radiazione anti-Stokes.

La banda che quasi si sovrappone alla banda di assorbimento centrata a 3780 Å corrispondente alla transizione 0-0 inversa. I picchi che si rilevano sono corrispondenti alle energie di vibrazione dei legami di queste sostanze e sono molto ben riproducibili: perciò. e solo se. uno spettro Raman è come l’impronta digitale della sostanza in questione. L'analisi di sostanze Raman-emittenti è. producendo uno spettro che viene visualizzato sul computer. affinché una sostanza possa essere Raman attiva. Notare come gli spettri di assorbimento e di fluorescenza siano simmetrici rispetto alla transizione 0-0. Pertanto. ma sarà incrementata o decrementata della frequenza di vibrazione (o rotazione).Se. occorre che ci sia una vibrazione o rotazione molecolare che modifichi una componente della polarizzabilità molecolare. quindi. lo spettro di assorbimento è quello compreso tra 3800 e 2800 Å. La banda centrata a 3780 Å corrisponde alla transizione tra il più basso livello vibrazionale del livello fondamentale e il più basso livello vibrazionale dello stato eccitato ed è chiamata transizione 0-0. che è riconoscibile anche se presente in minima quantità. come rotazione o vibrazione. e la sua frequenza di oscillazione non sarà più uguale a quella della radiazione incidente. che cambiano la polarizzabilità periodicamente. possibile perché esse vengono eccitate dal raggio laser. La figura sottostante mostra lo spettro di assorbimento e quello di fluorescenza dell’antracene disciolto in cicloesano. I picchi (bande). 129 . le molecole subiscono anche dei movimenti interni. Lo spettro di fluorescenza è compreso tra 3700 e 5000 Å. corrispondono a transizioni tra il livello vibrazionale più basso dello stato fondamentale e differenti livelli vibrazionali del primo stato elettronico eccitato. Spettri di fluorescenza e di assorbimento di antracene in una soluzione di cicloesano. spesso chiamate strutture vibrazionali. Lo spettro di assorbimento è compreso tra 2900 e 3800 Å e corrisponde alle transizioni tra lo stato fondamentale e il primo stato eccitato. ESEMPI DI SPETTRI DI EMISSIONE Gli spettri di fluorescenza si ottengono con lo spettrofluorimetro. Lo spettro di emissione (fluorescenza) è quello compreso tra 5000 e 3700 Å. all'oscillazione del dipolo si abbinerà l'oscillazione rotazionale o vibrazionale. Le bande corrispondono a transizioni tra il livello vibrazionale più basso dello stato eccitato e i vari livelli vibrazionali dello stato fondamentale.

Queste interazioni sono maggiori in solventi polari e spostano i picchi di assorbimento e di emissione verso lunghezze d’onda maggiori. il coefficiente di estinzione molare. cioè del decadimento da un livello vibrazionale 130 . a causa dell’esistenza di fenomeni dissipativi non radiativi che competono con l’emissione di radiazione. eccetto per la transizione 0-0 per cui le transizioni hanno la stessa energia. TIPO DI TRANSIZIONI CHE AVVENGONO NEL PROCESSO DI FLUORESCENZA Quelle che si osservano sono transizioni a bassa energia. a destra. la lunghezza d’onda è inferiore ai 250 nm (al di sopra si ha fotolisi dei legami). a sinistra. soprattutto a causa di urti con le molecole di solvente o con le pareti del contenitore. l'intensità di fluorescenza in una scala che prende come valore unitario il valore della intensità massima e. 2) Lo spettro di fluorescenza è sempre a lunghezze d’onda maggiori dello spettro di assorbimento. Lo spettro di emissione è stato ottenuto eccitando con una lunghezza d'onda di 2537 Å. che sono pure alla base del fenomeno di rilassamento vibrazionale. Questo è dovuto al fatto che un fluoroforo ha soltanto un livello che emette radiazioni. sia perché hanno vita breve. 3) L’interazione con il solvente può impedire questa sovrapposizione degli spettri.Sulle ascisse sono riportati la lunghezza d'onda (scala in alto) e il numero d'onda (scala in basso). cioè la perdita di energia in maniera non radiativa. ma il fenomeno è in realtà rilevante solo per alcune di esse. sia perché i processi che competono con la fluorescenza avvengono con minore facilità. Sulle ordinate sono riportati. La fluorescenza è legata a transizioni π → π* . Le caratteristiche di uno spettro di fluorescenza sono: 1) Una sostanza fluorescente in un solvente omogeneo ha un solo spettro di fluorescenza indipendente dalla lunghezza d’onda di eccitazione. Questo è dovuto alla perturbazione di livelli energetici del fluoroforo dovuti ad interazioni dipolo-dipolo o a interazioni tra cariche nel caso v i siano presenti cariche spaziali. RESA QUANTICA DI FLUORESCENZA Tutte le molecole che assorbono nel visibile/UV sono quindi potenzialmente fluorescenti. La forma e la posizione dei massimi sono sensibili alle proprietà molecolari del solvente (o in generale del mezzo). Le transizioni n → π* non danno il fenomeno della fluorescenza perché la loro assorbività molare è da 100 a 1000 volte più piccola di quella della transizione π → π*. Questi comprendono: la conversione interna.

che spiega perché le frequenze di emissione sono più basse di quelle di assorbimento. Consideriamo uno ad uno. EFFETTO DELLA STRUTTURA MOLECOLARE Sappiamo che il fenomeno della fluorescenza è favorito se nella molecola sono presenti gruppi funzionali aromatici con bassi livelli di energia necessari per e transizioni π → π*. come: f fluorescenza = K fluorescenza K fluorescenza + K conversione interna + K intersystem crossing + K quencing dove le k rappresentano le costanti cinetiche dei fenomeni descritti. VARIABILI CHE INFLUENZANO LA FLUORESCENZA E LA FOSFORESCENZA Sono diversi i fattori che possono influenzare il fenomeno della fluorescenza o della fosforescenza. 131 . Ricordiamo infine che la resa quantica del processo influisce sulla sensibilità del metodo. come la fluorescina hanno un rendimento pari a 1. in cui si ha una transizione tra uno stato di singoletto e uno di tripletto le cui curve di potenziale si incontrano in un punto. dovuto alle collisioni con molecole di soluto capaci di interagire con lo stato elettronico eccitato. poiché l’intensità della radiazione emessa ad una certa lunghezza d’onda è proporzionale ad essa. il quenching.all’altro. e la resa quantica aumenta col numero degli anelli ed il grado di condensazione. Si può dimostrare che il rendimento quantico del processo di fluorescenza si può anche esprimere come: f fluorescen za numero di fotoni emessi numero di fotoni assorbiti La resa quantica è quindi un numero compreso tra 0 e 1: così sostanze chiaramente fluorescenti. si può definire la resa quantica di fluorescenza fF. l’intersystem crossing. Poiché questi fenomeni sono tutti del primo ordine o pseudo-prim’ordine (nel caso del quenching). a cui generalmente fa seguito il fenomeno della fosforescenza (emissione di radiazione ritardata nel tempo). Così tutti gli idrocarburi non aromatici non sostituiti danno fluorescenza. come O2 e I-.

Per esempio la fluorescina è altamente fluorescente perchè possiede un ponte etereo fra gli anelli aromatici. N N N H Invece. l’elettrone passa rapidamente allo stato di tripletto. mentre la fenolftaleina non lo è poiché lo stato eccitato perde la sua energia per conversione interna.N O S N In questi casi la transizione che richiede minore energia è del tipo n → π*. 132 . La presenza di gruppi carbonilici o doppi legami a elevata coniugazione in composti alifatici e aliciclici favoriscono la fluorescenza. determina una diminuzione del fenomeno. Ricordiamo che le molecole che contengono atomi pesanti (Cl. F. e questi prodotti emettono fluorescenza. impedendo la fluorescenza Qui invece la transizione più facile è del tipo π → π*. perché la transizione n → π* ha un’energia minore della π → π*. I) danno il fenomeno della fluorescenza meno accentuato a causa delle frequenti conversione intersistema. La presenza in soluzione di molecole paramagnetiche (ad esempio O2). COMPOSTO FORMULA INTENSITÀ RELATIVA Benzene Fluorobenzene Clorobenzene Bromobenzene Iodobenzene Fenolo Anilina Acido benzoico EFFETTO DELLA RIGIDITÀ STRUTTURALE C6H6 C6H5F C6H5Cl C6H5Br C6H5I C6H5OH C6H5NH2 C6H5COOH 10 10 7 5 0 18 20 3 Molti composti organici fluorescenti sono caratterizzati da una certa rigidità nella loro struttura per cui l'energia degli stati eccitati non viene persa per vibrazione torsionale della molecola. e la resa quantitativa diminuisce. invece. Br. la presenza sull’anello benzenico di un gruppo carbossilico o carbonilico riduce la fluorescenza.

Così se l’anilina emette una radiazione nell’UV (λ = 310 – 405). la possibilità. infatti. lo ione anilinio emette invece nel visibile ( la radiazione non viene rivelata dallo spettrofluorimetro). EFFETTO DEL pH Questo effetto interessa soprattutto composti aromatici contenenti sostituenti acidi o basici. questo perché la Ka per la molecola eccitata è diversa (fino a 4 – 5 ordini di grandezza) da quella allo stato fondamentale. e aumenta la fluorescenza COMPOSTO FORMULA INTENSITÀ RELATIVA Benzene Anilina Ione anilinio C6H6 C6H5NH2 C6H5NH3- 10 20 -- N H H H N+ H H N+ H FORME DI RISONANZA DELL’ANILINA Questo effetto può essere sfruttato per la rivelazione del punto finale delle titolazioni: questo perché quando la molecola passa dalla forma indissociata a quella dissociata si ha uno spostamento della lunghezza d’onda di fluorescenza dall’UV al visibile. N+ H H H 133 . Nelle molecole non rigide c’è maggiore probabilità di conversione interna e conseguentemente disattivazione del processo di emissione di energia radiante.Composti rigidi sono anche quelli adsorbiti su superfici solide o che formano chelati particolarmente rigidi. che questi esistano in più forme di risonanza rende più stabile il primo stato eccitato. In questo caso però il pH al quale si raggiunge il punto finale della titolazione è diverso da quello teorico che si ricava dalla Ka dell’elettrolita.

EFFETTO DELLA TEMPERATURA E DELLA VISCOSITÀ DEL SOLVENTE Un aumento della temperatura del solvente determina una diminuzione della sua viscosità. Ricordiamo che la presenza di atomi pesanti (CBr4 . però. EtI) o di ossigeno molecolare (O2) disciolto nel solvente determina comunque una diminuzione della fluorescenza. EFFETTO DELLA CONCENTRAZIONE L’intensità della radiazione fluorescente If ci è data dalla relazione: If = intensità della radiazione fluorescente I f = K ⋅ (I incidente − I uscente ) Iincidente = intensità della radiazione incidente sul campione Iuscente = intensità della radiazione uscente dal campione K = costante che dipende dal rendimento quantico del processo di fluorescenza Dalla legge di Lambert – Beer. e questo influisce sulla fluorescenza dell’analita in maniera negativa. noi sappiamo che: A = − log I uscente = ε ⋅d ⋅c I incidente I uscente = 10 − ε ⋅ d ⋅ c I incidente I uscente = I incidente ⋅ 10 − ε ⋅ d ⋅ c Sostituendo nell’espressione iniziale abbiamo che l’intensità della radiazione fluorescente è data dall’espressione: I f = K ⋅ I0 − K ⋅ I = K ⋅ I 0 − K ⋅10 − ε ⋅ d ⋅ c = K ⋅ I 0 ⋅ 1 − 10 − ε ⋅ d ⋅ c ( ( ) ) 134 . cioè il trasferimento dell’energia per collisione dall’analita al solvente o ad altri soluti in soluzione. Questo perché si verifica una conversione esterna.

per cui la lunghezza d’onda della radiazione emessa si sovrappone a quella di assorbimento.303 ε ⋅ d ⋅ c ) Questa relazione vale però solo per soluzioni molto diluite.Facendo quindi l’espansione in serie di Mc Laurin dell’esponenziale otteniamo una relazione che mostra come l’intensità della fluorescenza sia direttamente proporzionale alla concentrazione dell’analita: I f = K ⋅ I 0 ⋅ (2. 135 . a valori così bassi di concentrazione il termine (2. la cui concentrazione sia inferiore a 10-5 M (quindi parliamo di soluzioni da 10 a 100 volte più diluite di quelle che si usano per una determinazione UV): per questo la spettroscopia di fluorescenza è adatta per la determinazione di analiti in tracce! Se infatti I0 = k e d = 1. La relazione si riduce a: I f = K ⋅c A concentrazioni maggiori il termine non è più trascurabile. e la linearità viene meno. cioè la collisione fra molecole eccitate l’autoassorbimento. Il risultato è che la fluorescenza diminuisce man mano che il fascio attraversa la soluzione.303 · ε ) < 0. essenzialmente per due fattori che sono: l’autoestinzione.05 e quindi trascurabile.