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LUNA-GONZÁLEZ A. y ESTRADA U.

DEFORMACIÓN TRIDIMENSIONAL DE LA LEU-ENCEFALINA Y DEL RECEPTOR OPIOIDE MU AL ACOPLARSE

Facultad de Química Universidad de Guanajuato Col. Noria Alta s/ Tel. (473) 732-0006 ext. 8128 Fax (473) 732-0006 ext. 8108 lunag@quijote.ugto.mx

9/11/ 2007

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therefore docking programs allow to study this intimate relationship when they interact. The program oriented and fit the enkephalin in a 3D grid measuring x = 14. It is important to remark that the conformation of Leu-enkephalin at the lowest energy.5 Å.6 kcal/mol.Deformación Tridimensional de la Leu-encefalina y del Receptor Opioide Mu al Acoplarse Alejandro Luna-González. Facultad de Química. 66.1 molecular modeling software were used in order to determine the Leu-enkephalin basal equilibrium energy starting from its beta strand configuration form. Each amino acid of that ligand were coupled to 19 residues of the receptor.2 and Arguslab-4. U. Differences observed in the neuropeptide conformations may be due to bending originated by the two opposite charges located at both terminal residues. Conclusions. is different to the one observed in the ligand-receptor interaction -12. Tyr 148 from the receptor was used as starting point for the docking procedure.8 Å y z = 18. The 3-D structure of Leu-enkephalin is known and the same is true for the Mu receptor.4 Å between each point. de Gto. y = 17.1 Å and 0. The main purpose of this study was to determine which parts of the enkephalin fit the active zone of the receptor and the amino acids which configure the active cavity. When 3 . Uriel Estrada. Results. Methods. Abstract Leu-enkephalin and Mu Opioid Receptor 3 D Deformation when Docking Introduction.0.2 kcal/mol. Spartan-1. Through an MMFF procedure followed by an semiempirical AM1 method having the enkephalin with a positive charge and a negative one at each end.0.

shows a slightly more extended configuration and is located at the lower zone of the cavity likewise some antagonists do. Métodos Fue utilizado el software Spartan-1.4 Å entre cada punto.0.2 kcal/mol.2 y Arguslab-4. y=14. El programa orientó y acopló la Leu-encefalina en una zona de rejilla 3D con medidas de x=14.5 Å. es diferente de la observada en la interacción ligando-receptor de -13.6 kcal/mol.1 de modelaje molecular para determinar la energía basal de equilibrio para la Leu-encefalina a partir de su configuración de hebra beta inicial.Leu-enkephalin is coupled to the receptor.1 Å de 0. con 66. También fue importante determinar cuales aminoácidos configuran la cavidad activa del receptor. Resumen Introducción Se conocen las estructuras de la Leu-encefalina y receptor Mu y los programas computarizados permiten estudiar esta relación íntima cuando se acoplan. Conclusiones 4 . El objetivo principal de este estudio fue determinar cuales partes de la encefalina se acoplan con la zona activa del receptor. Es importante señalar que la conformación de mínima energía de la Leu-encefalina. A través de un procedimiento MMFF seguido del método semiempírico AM1 teniendo la encefalina una carga positiva y una negativa en cada extremo.0. Fue utilizada la Tir 148 del receptor como sitio inicial del procedimiento de acoplamiento.Se observó la interacción de los 5 aminoácidos del ligando con 19 del receptor Mu.5 Å y z= 18. Resultados Todos los aminoácidos del ligando fueron acoplados con el receptor.

Como resultado de esto. Hasta la fecha no existe información acerca de las estructuras de los receptores opioides con estudios de cristalografía de rayos X. Por otro lado. tiene una configuración ligeramente más extendida y se ubica en la porción baja de la cavidad del receptor igual que algunos antagonistas. y por consiguiente alteraciones en los sistemas centrales de 5 . y calcular las distancias interatómicas de esta unión molecular íntima. Introducción El avance de los programas computarizados actuales permite visualizar las estructuras tridimensionales de los opioides y la interacción ligando-receptor (L-R).Las diferencias observadas en las conformaciones del neuropéptido pueden ser debido al doblez originado por las dos cargas opuestas en sus extremos. cuando laLeuencefalina esta acoplada al receptor. se estima que los opioides actúan modificando las permeabilidades iónicas como la conductancia al potasio de las membranas nerviosas. razón por la cual los modelos teóricos son una herramienta muy importante para estudiar y analizar la relación estructura-función. para comprender el mecanismo de la función de agonistas y antagonistas (1). El estudio continuo de dichas relaciones permite desarrollar modelos útiles más realistas de los complejos L-R para elucidar los determinantes moleculares de la afinidad del ligando y su selectividad. Estos adelantos técnicos pueden ahora emplearse para estudiar el acoplamiento de ambas moléculas y la conformación activa del ligando. La investigación acerca de los receptores opioides ha llevado al conocimiento amplio de los mecanismos que se ponen en marcha por la unión L-R involucrada en la analgesia. lo cual a su vez da como resultado la hiperpolarización y la depresión de la excitabilidad en el sistema neuronal.

1. serotoninérgicos y dopaminérgicos. Fi.3). Los agentes que actúan a nivel de los receptores opioides Mu han sido utilizados para aliviar el dolor como analgésicos. (2. 2. El ángulo psi es el arco medido entre los planos imaginarios al tomar como referencia los 4 átomos consecutivos del esqueleto peptídico entre los átomos de nitrógeno (Ni) a nitrógeno (Ni+1) de los residuos. adrenérgicos. como son mostrados en la Figura 1 y las características funcionales de la cadena lateral hidrocarbonada en la secuencia de aminoácidos (4). son construidos con tres átomos consecutivos de la cadena y el ángulo corresponde al formado entre las dos superficies producidas al colocar el enlace de la porción media en la línea de intersección común a ambos y cada uno de los dos átomos restantes en la porción media paralela opuesta (Figura 1). Cada uno de los ocho planos que forman los cuatro ángulos diedros. 6 . también denominados de torsión. El omega de carbono Alfa (CAlfa) a carbono Alfa (C Alfa+1). carbono de carbonilo.neurotransmisores principalmente colinérgicos. 3. 4. lo cual los convierte en medicamentos muy importantes para mejorar la calidad de vida de las personas. Ji y Omega entre los átomos de nitrógeno. El Fi entre los grupos carbonilo (COi) y (COi+1). Sin embargo poseen una serie efectos secundarios o tóxicos importantes como son la depresión respiratoria y con el uso crónico el desarrollo de tolerancia y dependencia física. carbono de metino C alfa. Las propiedades tridimensionales estructurales de los ligandos opioides peptídicos están definidas en términos de los ángulos de torsión Psi. El Ji del carbonilo (COi) a carbono Beta (CBeta). etc.

90 ± 30 90 ± 30 . llamados i. si la distancia entre el átomo de carbono Alfa del residuo i y el i+3 es menor de 7 Å y si los dos residuos centrales no son helicoidales o son rompedores de hélice. i+2. Los giros Beta tipo II´ tienen una mayor preferencia (76%) para ubicar los residuos de glicina y D-aminoácidos en la posición i+1 debido a una menor interferencia estérica (6).60 ± 30 60 ± 30 Psii+1 . i+1. El Cuadro I muestra los valores comparativos ideales para los giros Beta tipo I y II (5). i+3. El receptor Mu es uno de los 7 .120 ± 30 Fii+2 .30 ± 30 120 ± 30 . Nótese que para los demás ángulos los átomos están de acuerdo a lo explicado en el párrafo anterior.60 ± 30 . Para los péptidos un giro Beta se caracteriza por cuatro residuos consecutivos de aminoácidos.80 ± 30 Psii+2 0 ± 30 0 ± 30 60 ± 30 La Leu-encefalina tiene afinidad por el receptor opioide Mu considerado mediador de los efectos analgésicos de casi todos los opioides (7).Figura 1 Ángulo de torsión Psi en un péptido. Cada tipo de giro es clasificado de acuerdo a los ángulos Fi y Psi. Cuadro I Ángulos de torsión ideales para los péptidos con un giro Beta Giro Beta Tipo I Tipo II Tipo II´ Fii+1 .

En la Figura 2 se representa la estructura completa del receptor opioide Mu. La mayoría de los modelos 8 . Los resultados de clonación. de rana y calamar. los primeros tres han sido clonados exitosamente y no hay datos suficientes para los receptores σ aunque si las referencias para su actividad farmacológica. Algunos modelos han sido construidos en base a los mapas EM de baja resolución de la rodopsina y unos cuantos mediante limitaciones derivadas experimentalmente para empacar juntas las siete hélices “ideales” con conformaciones arbitrarias de las cadenas laterales (10). Estas macromoléculas estructural y evolutivamente son las mejor conservadas. involucradas virtualmente en muchos procesos fisiológicos. Sigma). características de los GPCRs (9). estudios de homología y el análisis de hidropatía de las secuencias de aminoácidos indican la presencia de siete dominios transmembranales (TMDs) separados por asas intra y extracelulares. b) secretina/péptido vasointestinal (VIP) con un 25-50% de homología con la rodopsina y c) la familia de receptores metabotrópicos de glutamato (mGLU) (8). Estos receptores tienen varios centenares de proteínas integrales que transducen señales luminosas o químicas a través de la membrana celular y comparten una estructura tridimensional común. Además el Mu es clasificado dentro de la superfamilia de receptores acoplados a proteína G (GPCRs) y específicamente al subgrupo de la rodopsina. Kapa. Únicamente está disponible la estructura cristalina del receptor de luz rodopsina. Son clasificadas de varias formas: la más antigua integra los grupos de a) rodopsina/Beta-adrenérgicos. Poseen una forma heptahelicoidal de dominio transmembranal demostrada mediante su estudio por técnicas de criomicroscopia electrónica (EM) de baja resolución de 6 Å a 9 Å en rodopsina bovina.cuatro tipos de receptores identificados en base a sus propiedades farmacológicas (Mu. Delta. a esa clase pertenecen cerca del 90% de los GPCRs. solubilizada con detergentes.

Los círculos negros representan la ubicación de los residuos de aminoácidos conservados en la superfamilia de los receptores aminérgicos. aunque una porción muy importante del receptor se localiza en la zona externa de la membrana (11). Figura 2. Delta y Kapa. Las hélices transmembranales están designadas con números romanos. Los números de los residuos en itálicas señalan la secuencia de la cadena peptídica total. Además se muestran los sitios de glicosilación 9 . Los números arábigos designan la posición de los residuos en el dominio transmembranal.considera la ubicación del sitio activo de los ligandos opioides en el interior del cúmulo de las hélices. e indican el sitio y término del residuo en el presente modelo de receptor. Las líneas sólidas negras representan los límites aproximados externo e interno de la membrana celular. El siguiente dibujo muestra un corte longitudinal de la secuencia del receptor Mu. Los círculos grises indican los residuos conservados entre los receptores Mu. Representación de la secuencia de la estructura del receptor opioide Mu.

III. IL = asa intracelular. Objetivos Estudiar las características estructurales de la conformación activa de la Leu-encefalina al interactuar con el receptor opioide Mu y averiguar cuales son los residuos de la zona activa donde se lleva a cabo el acoplamiento del opioide. Posee siete dominios transmembranales (I. IL-II. VI. 25. 24. 25 y 22 residuos de aminoácidos respectivamente. V. 25. VI y VII. Este modelo de receptor Mu presenta en su estructura superficial una gran cavidad profunda ubicada en la porción extracelular de los dominios transmembranales entre las hélices III. Consiste en una proteína integral que transduce las señales químicas a través de la membrana celular y comparte una estructura tridimensional en común con la superfamilia de GPCRs. EL-III de las cuales las dos primeras están unidas por un puente disulfuro entre los residuos Cis 140 y Cis 217. Esta cavidad está parcialmente cubierta por las asas extracelulares. Métodos 10 . IV. VII) con 25. la porción de la cadena inicial que contiene el grupo amino está ubicada extracelularmente e integrada por 168 residuos. 25. IL-III y la cadena que contiene el carboxilo terminal. EL-II. IV. V. II. El receptor opioide Mu es uno de los blancos biomacromoleculares de 410 residuos de aminoácidos para la acción de algunos agentes analgésicos de tipo morfinoide. además de tres asas extracelulares EL-I. EL = asa extracelular (12).en la porción N-inicial y palmoilación en la sección del carboxilo terminal. En el interior de la célula se encuentran tres asas IL-I.

Se seleccionó la cavidad activa del modelo de receptor opioide Mu humano. y = 17.0. ya que puede ser aceptor o donador de puente de hidrógeno.8 kcal/mol (16). Fue calculada la diferencia de energía libre de la interacción de tipo van der Waals mediante el programa en línea de análisis energético de sistemas receptor ligando Program of Energetics Analysis of Receptor Ligand System PEARLS la cual resultó de -2.Se usaron los programas de modelaje molecular Spartan 1.15).2 y Arguslab 4. Resultados La Leu-encefalina adoptó una conformación doblada en la porción media del opioide para interactuar con el receptor Mu. seguido del cálculo por el método semiempírico Austin 1 (AM1) con una carga positiva y otra negativa en sus extremos.5 Å. para esclarecer la función del hidroxilo de la tirosina 1. este grupo se sustituyó por un átomo de flúor. de forma flexible con libre giro en sus enlaces diferentes al grupo peptídico. propuesto por Pogozheva (13).8 Å.1 Å y una rejilla de cuadrícula tridimensional con 0. con los residuos involucrados en la interacción LR.3 Å pero sin tocarse y los ubicó orientados de forma casi perpendicular con la diferencia de 11 . Para los cálculos eligió por omisión una zona de cálculo con dimensiones de x = 14.1 para calcular las geometrías de equilibrio en estado basal de la Leu-encefalina mediante un procedimiento inicial de mecánica molecular de campos de fuerza (MMFF).4 Å de separación (14. Mediante el algoritmo de ajuste y búsqueda exhaustiva Argusdock.0. Adicionalmente. con el receptor en 500 ensayos sucesivos. el programa orientó y acomodó la Leu-encefalina. z = 18. al compuesto resultante se le denominó Leu-encefalina-F y fue acoplada con el receptor opioide Mu para observar que tan significativa es la diferencia de energía libre. acercando sus grupos aromáticos hasta una distancia de 4.

En el cuadro siguiente se muestran las características de los ángulos conformacionales. Ángulos de torsión de la Leu-encefalina. Debido a que la distancia con el carbono Alfa del residuo i+3 es mayor a 7 Å muy probablemente la conformación no es de tipo Beta ideal.4º la leucina.2 60.6 kcal/mol.1 Conformación activa Psi o Fi o 64.5 -156.4 Å entre el hidroxilo de la tirosina y el grupo amonio.2 106.4º y de 66. Cuadro II. Aminoácido Tir 1 Gli 2 Gli 3 Fen 4 Leu 5 Conformación de mínima energía Psi o Fi o 65. la fenilalanina de 118. El ordenamiento puede ser representado con un mínimo de tres puntos ubicados en los centroides de los grupos hidroxilo de la tirosina y fenilalanina. El residuo de tirosina presentó el ángulo Ji de 59.1º.18).5 114. Los grupos funcionales del posible patrón farmacofórico del receptor opioide Mu mostraron las distancias de 6.6 58. La distancia entre los dos carbonos Alfa para un giro 4→1 Beta resultó de 12.2 74.energía libre más favorable de -13.7 119.7 164. situación que tampoco se presenta en muchas proteínas.5 3. Sin embargo medida a 12 .4 - La Leu-encefalina tiene en su posición i+1 un residuo de glicina de tal forma que es de esperarse una fuerte preferencia para un giro Beta tipo II´.71 -66. y el tercero en el amino de la tirosina (17.2 Å entre el hidroxilo de la tirosina y el grupo aromático del residuo de la fenilalanina.9 Å y difiere de una conformación de giro Beta ideal.9 -74. 4.1 121 120.1 58.

Ile 215 y Lis 141. Met 151. estos dos últimos ubicados a mayor profundidad en la cavidad al igual que las anteriores presentan una interacción de tipo hidrofóbica.partir de la glicina 2 para un 2→5 Beta se observó una distancia de 7. Ligando Leu-encefalina Leu-encefalina-F Blanco Receptor Mu Receptor Mu Energía kcal/mol -13. Asp 216. His 297. además con Ile 322 de la hélice VII y las cadenas de Fen 237 y Trp 293. Glu 212. El anillo aromático de la tirosina de la Leu-encefalina presenta contacto a distancia de puente de hidrógeno 3. Cuadro III. Ile 13 .5 Ǻ entre su grupo hidroxilo y el de la Tir 326. la diferencia de energía libre fue del mismo orden de magnitud como puede observarse en el Cuadro III. Asn 230. Diferencias de energía libre.1 Å con las cadenas laterales de Tir 148 y Met 151 de la hélice III. Los grupos metilo del residuo de la leucina terminal del neuropéptido muestran contactos hidrofóbicos con 4 aminoácidos del receptor opioide Mu.6 -13. Tir 148. Al acoplar Leu-encefalina-F con el receptor Mu no disminuyó notablemente la afinidad por el receptor. La interacción con más contribución al acoplamiento en este grupo es de tipo hidrofóbica con la cadena lateral de Ile 215. Trp 318. Trp 293.4 Las principales cadenas laterales de aminoácidos del receptor involucrados en la interacción L-R fueron Asp 147. La Tir 1 presenta la formación de un puente de hidrógeno a la distancia de 3.7 Å más cercana a la típica.

la correspondiente a la conformación de mínima energía en estado aislado. Aminoácido H-II Tir 1 H-III Asp 147 Tir 148. la obtenida de su estado cristalino por rayos X. en donde la cadena peptídica se observa totalmente extendida (19). Primera. Segunda. con la aproximación de sus 14 . Met 151 H-V Lis 233 Fen 237 H-VI Trp 293 H-VII Ile 322 Tir 326 EL-II Gli 2 Asn 230 Lis 233 Ile 234 Tir 148 Gln 124 Ile 144 Asp 147 Tir 148 Lis 141 Asn 230 Lis 233 Val 300 Trp 318 Gli 3 Fen 4 Trp 318 Trp 318 Ile 322 Glu 212 Ile 215 Asp 216 Leu 5 Discusión Es necesario señalar que la Leu-encefalina tiene al menos tres conformaciones distintas las cuales deben tenerse en cuenta. Cuadro IV Aminoácidos del receptor Mu que interactúan con la Leu-encefalina.8 kcal/mol. La diferencia de energía libre para la interacción de van der Waals resultó de -2. la cual presenta un doblez en la porción media correspondiente a las glicinas 2 y 3. En el Cuadro IV son presentados los residuos del receptor opioide Mu que interactúan con el ligando.322 y Tir 326.

Sin embargo. ubicó el grupo alquilo de la Leu 5 en la parte exterior alejado de los anillos aromáticos. Precisamente por la presencia intermedia en la estructura de los residuos de glicina en las posiciones 2 y 3 con características fuertes de romper la hélice Alfa (5). fenilalanina y leucina de la Leu-encefalina sugieren la conformación de tipo Beta. Las características en los residuos de los aminoácidos tirosina. En el presente informe resulta evidente su diferencia mediante la observación directa de la representación de la estructura de la Leu-encefalina en su conformación activa acoplada al receptor. se supone que las variaciones ocurren también en los residuos del sitio activo del receptor para transducir la señal y producir el efecto biológico. la conformación denominada activa. A priori fue considerada improbable una conformación activa de acoplamiento con el receptor diferente a la de mínima energía calculada o de la estructura cristalina obtenida por cristalografía de rayos X. Además. resultante del acoplamiento del ligando con el receptor y diferente de las anteriores por estar aún más doblada porque se aproximan sus grupos aromáticos. También se mantienen separadas espacialmente las cadenas laterales del residuo alifático de los anillos aromáticos del ligando (20). Además. Tercera. observada en los resultados de este estudio. la presencia de la secuencia Gli-Gli le confiere la propiedad estructural de permitir un mayor doblez debido a la ausencia de grupos voluminosos. La única molécula que sufre cambios conformacionales durante el procedimiento es el ligando.extremos con las cargas opuestas correspondientes a los grupos amonio y carboxilo respectivamente. El doblez del ligando presenta una apariencia intermedia entre los giros Beta tipo II y II´. ya sea fuerte o inicial en la estructura secundaria del opioide. En virtud de las características del software utilizado para realizar el acoplamiento. los residuos y el esqueleto hidrocarbonado del receptor permanecen fijos. Se observa una mayor similitud 15 .

24). Parecida al 2→5 Beta referida en resultados experimentales con micelas acuosas de dodecilsulfato de sodio estudiadas por RMN. La cual permite la interacción con una gran variedad de agentes opioides y opiáceos con diversas conformaciones y propiedades estructurales (23. Tal situación tiene el respaldo experimental de los resultados de mutaciones en Asp 147 del receptor Mu opioide que no afectan notablemente la afinidad de diprenorfina o naloxona (10). Informado en estudios con alcaloides pequeños. Diferente a la obtenida utilizando disolventes orgánicos y mezclas crioprotectivas que sugieren un giro 4→1 Beta en disolución (21. considerados puntos importantes farmacofóricos. En comparación con los ligandos típicos como la morfina resultó menor a la calculada entre el grupo amino y el hidroxilo aromático de la morfina de 7. a partir de nuestros resultados computacionales. se observó que la porción aromática de la tirosina del péptido opioide interactuó con los residuos conservados en la base de la cavidad ubicada entre las hélices III y V.1 Å y diferente de la conformación de mínima energía calculada. La distancia entre estos dos grupos del ligando. Estos resultados de la interacción de la Leu-encefalina con el receptor apoyan la propuesta de algunos autores al sugerir que el aminoácido Asp 147 no interactúa electrostáticamente con el grupo amino libre formando un par iónico. El grupo hidroxilo de la tirosina y su amonio libre presentan interacciones con residuos de la hélice III. sino más bien con el OH de la tirosina. Para la Leu-encefalina.22). fue de 6. como la morfina que 16 .al giro 2→5 Beta tipo II. ubicado en el tercio externo de la porción transmembranal de la cadena helicoidal y la lisina Lis 233 de la hélice V.4 Å en la conformación activa. Además es importante considerar la posibilidad de un cierto grado de tolerancia estructural en la cavidad activa del receptor opioide.

Lis 233. Es favorecido el proceso de acoplamiento donde el hidroxilo de la Tir 1 del ligando interactúa con la Tir 148 y la formación del puente de hidrógeno con el hidroxilo de la Tir 326. Ile 322. La Leu-encefalina al acoplarse al receptor Mu adoptó una conformación activa doblada formando un giro en el cual aproximó los grupos aromáticos de los residuos Tir 1 y Fen 4 a una distancia de 4. los cuales se ubican en la porción espacial “baja” de la cavidad del receptor (13). Resultado compatible con la idea de que existe una interacción importante con el grupo His 297 (His VI:20). Ile 215.3 Ǻ. Aunque nosotros no observamos dicha interacción con His 297 sino más bien con Tir 148 (Tir III:8) como ocurre con algunos derivados de morfina sustituidos con grupos voluminosos y considerados de propiedades antagonistas. Tir 148. Glu 212. Trp 318. Trp 293. Tir 326 localizados en la mayor cavidad del receptor. 2. Debido a la interacción con His 297 y con los residuos de aminoácidos Fen 152 17 . Met 151. Al realizar la sustitución del hidroxilo de la tirosina del ligando por un átomo de flúor y su acoplamiento con el receptor opioide Mu fue observado un cambio mínimo en la diferencia de energía libre. El ligando mostró interacción con 19 residuos del receptor: Ile 144. His 297. probablemente de puente de hidrógeno con Nδ1. Fen 152. Ser 214. El pentapéptido es estructuralmente flexible y puede adoptar un gran número de conformaciones diferentes debido a sus enlaces con libre giro. Ile 234.pueden ser acoplados con varias posiciones alternativas en la cavidad activa. Glu 299. Val 300. Asp 147. Conclusiones 1. Asn 230. Fen 237. donde todas las opciones proporcionan contactos entre el N+ y Asp 147 (Asp II:7) y permiten la formación de puentes de hidrógeno entre el ligando y los grupos polares (10).

Los resultados apoyan la idea de la existencia de un patrón farmacofórico con cierto grado de versatilidad en la ubicación espacial de los grupos importantes amonio. ubicados estos dos últimos en la zona más profunda de la cavidad. 18 .y Fen 237. 3. aromático e hidroxilo de agonistas y antagonistas Mu al acoplarse. se sugiere que su comportamiento es parecido al de un antagonista Mu.

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