16

BAB III
TIN1AUAN KHUSUS
BIDANG PENGU1IAN MIKROBIOLOGI


3.1 Laboratorium Mikrobiologi
Laboratorium mikrobiologi adalah tempat melakukan berbagai kegiatan
penguiian secara mikrobiologi. Status laboratorium Balai Besar Pengawas Obat
dan Makanan (BBPOM) di Bandung adalah terakreditasi oleh Komite Akreditasi
Nasional Indonesia sebagai laboratorium sesuai SNI-19-17025-2000 nomor
Akreditasi LP-173-IDN seiak 25 iuli 2003 (sudah terakreditasi Maret 2007).

3.2 Tujuan. Fungsi dan Tugas Laboratorium Mikrobiologi
a) %uiuan dari dilakukannya penguiian mikrobiologi yaitu :
1. Pengawasan mutu
2. Perlindungan terhadap konsumen
b)Fungsi dari laboratorium mikrobiologi adalah sebagai pelaksanaan
pemeriksaan laboratorium, penguiian dan penilaian mutu produk secara
mikrobiologi.
c) %ugas Bidang Penguiian Mikrobiologi Balai Besar POM di Bandung
berdasarkan pada S.K. Kepala badan POM No.05018/2001 yaitu
melaksanakan penyusunan rencana dan program serta evaluasi dan
penyusunan rancangan pelaksanaan pemeriksaan laboratorium,
penguiian dan penilaian mutu secara mikrobiologi.

3.3 Ruangan dan Sarana Laboratorium
Kebutuhan ruang di bidang penguiian mikrobiologi BBPOM di Bandung
dapat dibedakan meniadi dua yaitu ruang staI yang terpisah dari laboratorium
untuk mencegah mikroba dan ruang laboratorium yang dibagi meniadi : ruang
penyiapan sampel, ruang media dan pereaksi, ruang persiapan dan sterilisasi,
ruang timbang, ruang uii potensi, ruang cemaran bakteri, ruang cemaran iamur,
ruang inokulasi, dan ruang uii sterilitas. Kegiatan yang dilakukan meliputi
17

penguiian secara mikrobiologi, antara lain mendeteksi cemaran, mengetahui
kebenaran daya guna potensi antibiotik, uii sterilitas, dan lain-lain.

3.4 Cara Berlaboratorium yang Baik
a. SDM
Meliputi sumber daya manusia yang berpendidikan, berpengalaman
serta kompeten (selalu mengikuti pelatihan berieniang dan
berkelaniutan).
b. Bangunan
Meliputi gudang, ruang antara, ruang media, ruang cuci dan sterilisasi
alat, ruang persiapan, ruang uii potensi, ruang uii cemaran, ruang uii
steril, ruang inkubasi, ruang inokulasi.
c. Peralatan
Peralatan harus lengkap, sesuai ruang lingkup serta iumlah personil,
ada penanggung iawab, ada dokumen, serta dikalibrasi karena
berpengaruh terhadap hasil.
Peralatan standar minimum yang ada di laboratorium mikrobiologi
diantaranya: otoklaI, oven, inkubator, tangas air, Laminar Air Flow,
timbangan, stomacher, blender, tube mixer. anaerobic iar, lemari es,
colonv counter, zone reader, spektroIotomer, pH meter, pompa
vakum, mikroskop, sentrifuge, pipet EppendroI, gunting, pisau,
sendok, spatula, dan lain-lain.
d. Media dan Pereaksi
Penyimpanan media dan pereaksi harus disimpan dalam ruang khusus,
terkondisi, terpantau serta ada penanggung iawab.
e. Bahan baku pembanding
I. Standar acuan pustaka
Standar acuan yang biasa digunakan di Laboratorium Mikrobiologi
antara lain :
Farmakope Indonesia edisi IV
Standar Nasional Indonesia
Metode Analisa PPOMN 2006
Metode Analisa PPOMN 2002
Metode Analisa PPOMN 2001
18

Metode Analisa PPOMN 2000
Metode Analisa Suplemen 2000
Permenkes No. 661 tahun 1994
Surat Keputusan Kepala BPOM No.PR.02.21.1513
g. Penanganan sampel
1. Penerimaan
Dilengkapi dokumen, dicatat dan didokumentasikan serta ada
penanggung iawab.
2. Penyimpanan
Ruang khusus, sesuai petuniuk penyimpanan, aman, ada
penanggung iawab.
3. Penguiian
Dibuat SPK, dilengkapi SPP.
4. Pelaporan
Semua data dicatat dan didokumentasikan, data yang salah tidak
boleh dihapus, koreksi dilakukan dengan mencoret dan paraI,
dievaluasi (berieniang), dibuat kesimpulan.
5. Pengarsipan
Arsip sampel, dan arsip laporan (data mentah disimpan oleh
penguii, sedangkan CP, LCP dan LHU disimpan di bagian lain).
h. Sistem K3 (Keamanan dan Keselamatan Keria)
Di laboratorium mikrobiologi diwaiibkan untuk menggunakan ias
laboratorium (pakaian keria), menggunakan pengaman keria seperti
kacamata, masker, sarung tangan dan lain-lain. %idak bekeria
sendirian, dilarang makan, minum dan merokok di laboratorium,
pelatihan penanganan kecelakaan keria di laboratorium, serta tidak
ceroboh (membahayakan diri maupun orang lain).

3.5 Metode Pengujian Mikrobiologi
a. Perhitungan
Metode perhitungan digunakan untuk mengetahui iumlah cemaran
mikroba meliputi persiapan dan homogenisasi contoh, pengenceran,
perhitungan koloni, pengambilan kesimpulan.

19

b. Isolasi
Metode isolasi digunakan untuk mengetahui adanya cemaran bakteri
atau kapang patogen. Meliputi persiapan dan homogenisasi contoh,
isolasi, identiIikasi dan konIirmasi, pengambilan kesimpulan.

3.6 Mikroorganisme
3.6.1 Kehidupan Mikroorganisme
Dunia mikroorganisme terdiri dari lima kelompok organisme yaitu:
bakteri, protozoa, virus, alga dan cendawan. Mikroorganisme sangat erat
kaitannya dengan kehidupan kita, beberapa diantaranya bermanIaat dan
yang lain merugikan. Beberapa mikroorganisme menyebabkan penyakit
tetapi ada pula yang bermanIaat dalam kegiatan manusia sehari-hari.
Bahan makanan terdiri dari protein, karbohidrat, lemak, vitamin,
dan mineral. Bahan makanan merupakan medium pertumbuhan yang
baik bagi berbagai macam mikroorganisme. Mikroorganisme dapat
membusukkan protein, memIermentasikan karbohidrat dan meniadikan
lemak dan minyak berbau tengik. Pengendalian mikroorganisme dalam
bahan makanan pada prinsipnya bertuiuan untuk membuat bahan
makanan meniadi tahan lama, atau dengan kata lain bertuiuan untuk
pengawetan bahan makanan. Pengendalian mikroorganisme berarti
mencegah pertumbuhan dari mikroorganisme tersebut, yang dapat berarti
membunuh atau menghambat pertumbuhan itu sendiri. Biasanya tindakan
ini dilakukan dengan perlakuan Iisik atau perlakuan kimia. Perlakuan
Iisik dapat dilakukan dengan cara perlakuan termal, perlakuan
pengeringan dan perlakuan penyinaran (iradiasi). Perlakuan kimia dapat
dilakukan dengan cara penggaraman, pengasaman, pengasapan dan
pemberian bahan pengawet.
1.MorIologi dan Struktur Sel Bakteri
a. MorIologi bakteri
Mikroorganisme terdiri dari organisme eukariot yaitu organisme
yang memiliki selaput membran inti dan organisme prokariot yaitu
organisme yang tidak memiliki selaput membran inti. Ukuran
bakteri umumnya berkisar antara 1,0 x 2,0 5,0 µm.

20

b. Struktur Sel Bakteri
Struktur bakteri dapat dibedakan meniadi struktur di luar dan di
dalam dinding sel. Struktur utama di luar dinding sel yaitu Ilagella,
Iili, dan kapsul. Flagella berupa rambut sangat tipis yang mencuat
dari dalam sitoplasma menembus dinding sel dan terdiri dari
subunit protein yang disebut Ilagelin. Flagella berIungsi sebagai
alat gerak pada bakteri.
c. Nutrisi dan Kultivasi Bakteri
Untuk menuniang kehidupannya, makhluk hidup termasuk bakteri
memerlukan nutrisi dan kondisi lingkungan yang sesuai. Begitu
tersedia kondisi yang memuaskan untuk kultivasi, maka reproduksi
dan pertumbuhan bakteri dapat diamati dan diukur.
Persyaratan nutrisi yang diperlukan oleh bakteri dalam bentuk zat-
zat kimiawi terdiri dari :
- Sumber energi
Semua organisme terbagi meniadi IototroI dan kemotroI.
FototroI adalah organisme yang menggunakan cahaya sebagai
sumber energinya, sedangkan kemotroI adalah organisme yang
menggunakan senyawa kimia sebagai sumber energi. Bakteri
ada yang termasuk IototroI dan kemotroI.
- Karbon
Sebagai sumber karbon dapat digunakan senyawa-senyawa
karbohidrat seperti senyawa gula (glukosa, Iruktosa, maltosa,
sukrosa, xilosa, mannitol dan pati). Karbohidrat sebagai sumber
karbon paling sederhana dapat digunakan sendiri atau
digabungkan dengan senyawa lain yang sesuai.
- SulIur dan IosIor
Sumber sulIur bagi hewan adalah senyawa sulIur organik,
sedangkan bagi tumbuhan adalah senyawa sulIur anorganik.
Sumber IosIor biasanya berupa garam-garam IosIat.
- Unsur logam
Semua makhluk hidup termasuk bakteri memerlukan beberapa
unsur logam sepeti natrium, kalium, magnesium, mangan, besi,
seng, tembaga, dan kobalt untuk menuniang pertumbuhannya.
21

- Vitamin
Vitamin bagi makhluk hidup berIungsi sebagai aktivator enzim.
Semua bakteri membutuhkan vitamin untuk proses
metaboliknya.
- Air
Air pada bakteri berperan dalam proses metabolisme dan
disimpan dalam bentuk cairan sitoplasma.

Selain memerlukan nutrien yang sesuai untuk kultivasi, bakteri
iuga memerlukan kondisi Iisik yang sesuai agar pertumbuhannya
optimum. Kebutuhan bakteri akan nutrisi dan kondisi
lingkungannya sangat bervariasi. Beberapa Iaktor lingkungan yang
penting untuk menuniang kultivasi bakteri adalah :
Suhu
Semua proses pertumbuhan mikroorganisme bergantung pada
reaksi kimiawi dan karena laiu reaksi-reaksi ini dipengaruhi
oleh suhu, maka pola pertumbuhan bakteri dapat dipengaruhi
oleh suhu. Suhu iuga mempengaruhi laiu pertumbuhan dan
iumlah total pertumbuhan organisme. Keragaman suhu dapat
iuga mengubah proses metabolik tertentu morIologi sel.
Spesies mikroba yang berbeda sangat beragam kisaran suhu
optimalnya untuk tumbuh, dimana bentuk psvchrophillic
tumbuh terbaik pada suhu rendah (15-20°C), bentuk
mesophilic tumbuh dengan baik pada suhu 30-37°C dan
kebanyakan bentuk thermophillic tumbuh dengan baik pada
suhu 50-60°C. Kebanyakan organisme adalah mesophillic
dimana suhu 30°C adalah suhu optimal untuk berbagai bentuk
yang hidup bebas. Batas kisaran suhu yang dapat ditoleransi
oleh setiap spesies berhubungan erat dengan stabilitas panas
keseluruhan protein spesies yang diukur dalam ekstrak sel.
Mikroorganisme bersama dengan tumbuhan dan hewan,
menuniukkan respon terhadap panas (heat shock response)
pada saat dipapar kenaikan suhu secara tiba-tiba di atas
pertumbuhan optimal. Selain berpengaruh pada laiu
22

pertumbuhan, suhu yang ekstrim iuga dapat membunuh
mikroorganisme. Bakteri iuga menuniukkan Ienomena yang
disebut cold-shock yaitu pembunuhan sel-sel dengan
pendinginan cepat. Contohnya pendinginan cepat pada kultur
Escherichia coli dari suhu 37°C ke 5°C, dapat membunuh 90°
sel-selnya.
AtmosIer gas
Gas-gas utama yang mempengaruhi pertumbuhan bakteri
adalah oksigen dan karbondioksida. Bakteri memiliki
keragaman yang luas dalam hal respon terhadap oksigen bebas,
dan atas dasar ini maka bakteri dikelompokkan meniadi empat
yaitu aerobik (hanya tumbuh bila ada oksigen bebas), anaerob
(hanya tumbuh tanpa oksigen bebas), anaerob fakultatif
(tumbuh pada kondisi aerob dan anaerob), serta mikroaerofilik
(pertumbuhan terbaik bila ada sedikit oksigen bebas).
Keasaman atau kebasaan (pH)
Kebanyakan organisme memiliki kisaran pH optimal yang
sempit. Secara empiris pH optimal harus ditentukan untuk
masing-masing spesies. Kebanyakan organisme neutralophiles
tumbuh baik pada pH 6,0-8,0, beberapa bentuk acidophiles
atau organisme yang dapat hidup dalam suasana asam
memiliki pH optimal serendah 3,0 dan yang lainnya
alkalophiles atau organisme yang dapat hidup dalam suasana
basa memiliki pH optimal setinggi 10,5.

3.6.2Identifikasi Mikroorganisme
Keberhasilan identiIikasi suatu mikroorganisme tergantung pada
beberapa Iaktor yaitu biakan harus benar-benar murni, bekeria secara
berurutan dari karakteristik umum dan yang khusus berdasarkan ciri-ciri
organisme, menggunakan semua inIormasi yang tersedia untuk
pendekatan hasil yang ingin tercapai, selalu menerapkan logika pada
setiap tahap pengeriaan, menggunakan penomoran uii untuk memastikan
identiIikasi, dan isolat yang diuii dibandingkan dengan biakan
perbandingan yang sudah distandarisasi.
23

Beberapa hal yang harus diperhatikan dalam mengidentiIikasi
mikroorganisme :
a. MorIologis
Pengamatan spesimen dengan bantuan mikroskop, baik diwarnai
dengan pewarnaan gram atau tidak, teknik mikroskop elektron
memungkinkan pengambilan spesimen mikroba sampai ukuran
ultramikron.
b. Nutrisi
Penentuan zat kimia yang diperlukan untuk menuniang pertumbuhan
mikroorganisme.
c. Pertumbuhan mikroorganisme
Penentuan proIil pertumbuhan mikroba pada berbagai macam
medium baik yang cair maupun yang padat.
d. Metabolisme
Beberapa uii dilakukan untuk mengetahui apakah mikroba
menyebabkan perubahan kimia suatu zat khusus atau tidak.
Misalnya, mikroba dapat mengubah karbohidrat meniadi asam.
e. Susunan kimia
Berbagai teknik tersedia untuk memcahkan sel dan untuk
mengisolasi komponen-komponen sel yang khusus dari campuran
yang diperoleh, misalnya Iragmen dinding sel, bahan nukleus, dan
membran.
I. Patogenitas
Penentuan potensi suatu biakan mikroba untuk menimbulkan
penyakit dilakukan dengan menginokulasi hewan atau tumbuhan
dengan biakan murni mikroorganisme.

3.6.3Mikroba yang diuji di laboratorium mikrobiologi
Mikroba yang diuii di laboratorium mikrobiologi BBPOM
mencakup kapang, khamir, dan bakteri. Untuk bakteri, dapat dibedakan
meniadi bakteri indikator dan bakteri patogen. Bakteri indikator adalah
bakteri Ilora normal yang terdapat di tubuh manusia tetapi iika berada di
dalam produk uii merupakan indikasi kurangnya higienis saat proses
produksi. Contohnya adalah Staphvlococcus aureus, Escherichia coli,
24

dan Enterococcus, sedangkan bakteri patogen adalah bakteri yang
keberadaannya dalam produk uii tidak boleh ada karena pasti
menyebabkan penyakit, misalnya Salmonella.
a. Staphvlococcus
Staphvlococcus aureus merupakan bakteri gram positiI yang
berbentuk bulat atau loniong (0,8-0,9 µm), dapat bergerak, tidak
berspora dan tersusun dalam kelompok (seperti buah anggur).
Saureus bersiIat aerob dan tumbuh baik pada perbenihan sederhana
pada temperatur optimum 37°C dan pH 7,4. Saereus merupakan
salah satu bakteri yang cukup kebal diantara organisme-organisme
tak berspora dan beberapa strain mampu menghasilkan racun protein
yang stabil terhadap panas. Saereus tahan pemanasan pada suhu
60°C selama 30 menit dan tahan terhadap Ienol 1° selama 15 menit.
Saereus terdapat di udara, debu, kotoran, air, susu, makanan atau
peralatan masak, hewan dan manusia. Manusia dan hewan
merupakan reservoir utama. Bakteri ini dapat ditemukan di berbagai
bagian tubuh manusia sehat seperti hidung, tenggorokan, rambut,dan
kulit, karena itulah Saereus mudah masuk ke dalam makanan.
Pengidap (carrier) Saereus pada nasal sebanyak 40-50° dari
populasi. Saereus iuga ditemukan pada pakaian, sprei, dan benda
lain di lingkungan manusia.
-. Bacillus cereus
acillus cereus adalah bakteri Gram positiI, berbentuk batang besar,
bersiIat aerob IakultatiI, menghasilkan enterotoksin, membenttuk
spora yang tidak berkembang meniadi sporangium.
c. Escherichia coli
Escherichia coli adalah Ilora alami pada usus manusia atau binatang.
Penentuan adanya Ecoli pada air minum dipakai sebagai
pencemaran tinia manusia atau hewan. Bakteri ini berukuran 2,4 µm
x 0,4-0,7 µm, Gram negatiI, bergerak aktiI dan tidak berspora.
BersiIat IakultatiI anaerob dan tumbuh pada perbenihan biasa. Suhu
optimum pertumbuhan adalah 37°C. Bakteri ini dapat bertahan
berbulan-bulan pada tanah dan dalam air, tetapi dapat dimatikan
dengan pemanasan pada 60°C selama 20 menit. Bakteri ini peka
25

terhadap streptomisin, tetrasiklin, kloramIenikol, dan asam
nalidiksat E coli dapat menyebabkan inIeksi di dalam dan di luar
saluran cerna, diantaranya inIeksi saluran kemih, meningitis,
peritonitis, dan pneumonia.
/. Salmonella
Salmonella merupakan bakteri patogen untuk manusia atau binatang.
Salmonella tumbuh cepat dalam media yang sederhana, tetapi
hampir tidak pernah memIermentasi laktosa atau sukrosa. Bakteri ini
membentuk asam dan kadang gas dari glukosa dan manosa serta
biasanya memproduksi H
2
S. Bakteri ini iuga tahan hidup dalam air
membeku pada periode yang lama. Salmonella tahan terhadap bahan
kimia tertentu (misalnya briliant green, sodium tetrathionate. sodium
desoxvcholate) yang menghambat bakteri enterik lain; senyawa
tersebut kemudian berguna untuk ditambahkan pada media untuk
mengisolasikan Salmonella dari tinia. Salmonella tvphi merupakan
penyebab inIeksi utama pada manusia, dan inIeksi dari bakteri ini
bersumber dari manusia.
e. Pseu/omonas aeruginosa
!seudomonas aeruginosa berbentuk batang, merupakan bakteri
Gram negatiI berukuran 0,5-0,8 µm sampai 1,5-3 µm. Bergerak aktiI
dengan Ilagel di salah satu uiungnya. Bakteri ini tumbuh pada
kondisi aerob. Dapat ditemukan di air, tanah, atau pada permukaan
kontak dengan air dan tanah, pada tumbuhan dan iuga hewan.
1. Ji-rio cholerae
Bakteri ini bentuknya bengkok, seperti koma, berukuran 1,5µm x
0,2-0,4 µm. 'cholerae ini sangat aerob, tumbuh pada pH basa (7,5-
9,6) dan suhu 22-40°C (suhu optimum 37°C). %umbuh baik pada
perbenihan biasa. Mati pada pemanasan 55°C selama 15 menit. Mati
oleh pengeringan, demikian iuga akan mati segar oleh asam
lambung. Peka terhadap streptomisin, kloramIenikol dan tetrasiklin.
g. Clostri/ium per1ringens
lostridium perfringens berbentuk batang besar yang dapat
menghasilkan spora dan menghaslikan daerah hemolisis pada pelat
agar darah. perfringens tidak bergerak, hidup pada kondisi
26

anaerob. Spora dapat dimatikan dengan otoklaI pada suhu 121°C
selama 18 menit. Spora tahan terhadap antiseptik dan desinIektan.
h. Can/i/a al-icans
andida albicans adalah khamir berbentuk oval bertunas, berukuran
2-3µm x 4-6µm. Pada media PDA (!otato Dextrose Agar) yang
diinkubasi pada suhu kamar, terbentuk koloni lunak berwarna krim
yang berbau seperti ragi.
i. Aspegillus niger
Aspergillus niger merupakan salah satu iamur yang sering diiumpai
dalam penguiian kapang atau khamir.

3.6.4 1enis penyakit akibat kontaminasi mikroba
Dilihat dari sumber penyakit yang masuk ke dalam tubuh dan dapat
menimbulkan geiala sakit, maka geiala penyakit melalui makanan
dapat dibedakan meniadi dua macam, yaitu :
1. InIeksi
Istilah inIeksi digunakan untuk menyatakan tertelannya atau
masuknya suatu mikroorganisme patogen ke dalam tubuh,
kemudian dapat menembus sistem pertahanan tubuh, hidup dan
berkembang biak serta menimbulkan inIeksi. Bakteri yang biasa
menimbulkan inIeksi diantaranya Salmonella sp., Shigella sp.
2. Intoksikasi (keracunan)
Istilah intoksikasi digunakan untuk menyatakan tertelannya atau
masuknya suatu toksin ke dalam tubuh. Misalnya racun botulin
dan racun bongkrek pada tempe bongkrek.

Faktor-Iaktor yang menuniang teriadinya penyakit yang berasal
dari makanan diantaranya yaitu makanan yang kurang matang,
penyimpanan makanan pada suhu yang tidak sesuai, makanan yang
diperoleh dari sumber yang tidak bersih, alat-alat yang tercemar,
kesehatan perseorangan yang kurang baik, cara-cara pengawetan
yang kurang sempurna.
Proses memasak yang kurang dapat teriadi bila memasak unggas
atau daging panggang berukuran besar, karena ukurannya dapat
27

menambah masalah penetrasi panas yang cukup. %anpa
penggunaan suhu yang cukup tinggi dan cukup lama,
mikroorganisme (termasuk parasit) tidak terbunuh dan racun yang
tahan panas (seperti racun botulin) tidak dapat termusnahkan.
Penyimpanan makanan pada suhu yang kurang sesuai, seperti suhu
kamar yang hangat, memudahkan pertumbuhan mikroba.
Pertumbuhan mikroba dan pembentukan racun berkaitan dengan
waktu dan suhu. Oleh karena itu, penyimpanan makanan untuk
waktu lama paling baik dilakukan pada suhu beku.
Makanan yang diperoleh dari sumber yang tidak aman berarti
makanan tersebut sudah beracun seiak semula. Contoh makanan ini
adalah spesies iamur dan kerang beracun. Pencemaran makanan
oleh mikrorganisme lewat alat-alat dapat dikurangi bila pencucian
alat-alat tersebut dilakukan dengan sanitasi yang baik.
Beberapa ienis penyakit yang berasal dari makanan :
1. Salmonelasis
Salmonelasis merupakan inIeksi oleh bakteri Salmonella. yang
menyerang saluran gastrointestinal yang mencakup perut, usus
halus dan usus besar. %eriadinya sakit perut yang mendadak
membedakannya dari penyakit perut lain seperti disentri basiler
atau disentri amuba. Waktu munculnya geiala adalah enam
sampai enam puluh delapan iam setelah makan yang tercemar
Salmonella, ditandai oleh timbulnya rasa sakit perut mendadak.
%erinIeksinya manusia oleh Salmonella hampir selalu
disebabkan oleh konsumsi makanan atau minuman yang
tercemar. Makanan yang biasanya tercemar meliputi kue-kue
yang mengandung susu, daging cincang, sosis, daging
panggang, ikan, udang, swike, ragi, kelapa, gelatin kering,
mentega kacang, coklat, saus, dan telur.
2 Intoksikasi Stapvlococcal
Keracunan makanan yang umum teriadi disebabkan oleh
termakannya enterotoksin yang dihasilkan oleh Staphvlococcus
aureus yang mencemari makanan. Pada umumnya geiala-geiala
mual, pusing, muntah, dan diare muncul dua sampai enam iam
28

setelah makan makanan yang tercemar. Makanan yang tercemar
iika dibiarkan pada suhu kamar selama delapan sampai sepuluh
iam, cukup untuk menghasilkan toksin dalam iumlah yang
memadai untuk menyebabkan keracunan. Keracunan makanan
oleh S aureus teriadi iika menelan makanan yang tercemar
enterotoksin dari Saureus misalnya daging sapi, ikan, susu dan
hasil olahannya, coklat leleh.
3. InIeksi lostridial
InIeksi ini dapat ditimbulkan oleh lostridium perfringens yaitu
inIeksi iaringan seperti selulit, nekrosis otot, serta penyakit
gangguan cerna seperti sakit perut dan diare.
4. Intoksikasi acillus cereus
Keracunan makanan akibat acillus cereus ditandai dengan
geiala mual, muntah dan diare.

3.6.5 Media Perbenihan untuk Mikroorganisme
Perbenihan memberikan lingkungan yang diusahakan mirip
dengan suasana alamiah yang dibutuhkan untuk pertumbuhan berbagai
ienis mikroorganisme.
KlasiIikasi perbenihan berdasarkan :
a. Bentuk
KlasiIikasi perbenihan berdasarkan bentuknya dibagi meniadi 2 yaitu
perbenihan cair dan perbenihan padat.
- Perbenihan cair
Dipergunakan sebagai perbenihan pengkayaan sebelum disebarkan
pada perbenihan padat. %idak cocok dipergunakan sebagai
perbenihan untuk menginokulasikan mikroorganisme untuk
memperoleh biakan murni, iuga tidak dapat dipakai untuk
mempelaiari koloni bakteri.
Jenis-ienis perbenihan cair :
O Kaldu
Cairan iernih tembus cahaya dan berwarna kuning ierami, dibuat
dari ekstrak daging atau pepton.
29

O Pepton
Merupakan protein yang terhodrolisis sebagian dengan
menggunakan enzim hidrolitik, misalnya pepsin, tripsin, papain
dan lain-lain.
O kstrak ragi
Dibuat dengan mengekstrasikan ragi yang diotolisiskan dengan
air. Mempunyai kandungan vitamin B yang tinggi.
- Perbenihan padat
Dipergunakan untuk mempelaiari koloni bakteri. Penting dalam
menginokulasikan bakteri untuk mendapatkan biakan murni.
O Agar-agar
Isi perbenihan padat yang penting dan merupakan senyawa
polisakarida rumit, diperoleh dari rumput laut. Mencair pada
suhu 80-100°C dan membeku pada suhu 35-42°C
O Gelatin
Merupakan protein yang dibuat dengan hidrolisis kolagen
menggunakan air mendidih. Mencair pada suhu 37°C,
membentuk gel yang tembus cahaya pada suhu 25°C.
Penggunaan utama gelatin ialah untuk menguii kemampuan
bakteri dalam mencairkan gelatin tersebut. Jika perbenihan
menghitam, artinya ada pembentukan hidrogen sulIida.

b. %uiuan
KlasiIikasi perbenihan berdasarkan tuiuan terbagi meniadi perbenihan
sederhana, perbenihan kompleks, perbenihan buatan dan perbenihan
khusus.
- Perbenihan sederhana
Disebut iuga perbenihan dasar, terdiri dari ekstrak daging, pepton,
natrium klorida dan air.
O Air pepton : dibuat dengan penambahan 1 g pepton dan 0,5 g
natrium klorida ke dalam 100 mL air suling.
O Agar gizi : kaldu gizi ditambah 2° agar-agar membentuk agar
gizi.
30

- Perbenihan kompleks
Mengandung zat-zat yang dipergunakan untuk keperluan khusus
atau untuk menuniukkan adanya siIat-siIat khas bakteri atau
mengandung zat-zat khusus untuk pembiakan bakteri tertentu.
- Perbenihan buatan atau terarah
Perbenihan ini dibuat hanya dari zat kimia murni dan susunan
kandungan masing-masing zat tidak ditentukan, karena hanya
digunakan untuk tuiuan penelitian.
- Perbenihan khusus, dibagi meniadi beberapa, yaitu :
O Perbenihan diperkaya
Merupakan perbenihan dasar yang ditambahkan bahan-bahan
tertentu seperti darah, serum atau telur. Contoh : agar darah
O Perbenihan persemaian
Perbenihan yang ditambahkan beberapa zat dengan tuiuan suatu
organisme akan tumbuh lebih banyak dari pada organisme yang
tidak diinginkan. Contoh : kaldu selenit F, kaldu tetrationat.
O Perbenihan selektiI
Perbenihan persemaian yang ditambahkan zat penghambat pada
suatu perbenihan padat. Contoh : perbenihan desoksikolat sitrat.
O Perbenihan indikator
Perbenihan mengandung indikator yang berubah warna iika
ditumbuhi bakteri. Contoh : perbenihan Wilson Blair
(Salmonella tvphi mereduksi bismuth sulIit meniadi sulIida
dengan koloni spesiIik berwarna hitam berkilap logam).
O Perbenihan diIerensial
Perbenihan ini dapat menumbuhkan beberapa ienis bakteri,
tetapi mempunyai siIat mampu memunculkan perbedaan siIat-
siIat khas bakteri atau satu tipe bakteri akan tumbuh dengan
khas. Contoh : Eosin Methvlen lue Agar. etrimide Agar.
Entrobacter sakazakii Isolation Agar.
O Perbenihan gula-gula
Perbenihan yang mengandung 1° gula tertentu di dalam air
bersama-sama dengan indikator yang cocok. Di dalamnya
31

dimasukkan tabung Durham yang dibalik untuk mengetahui
adanya pembentukan gas.

Berbagai ienis media perbenihan untuk penguiian :
- Bair/ Parker Agar (BPA)
O Komposisi : agar, glisin, natrium piruvat, kasein yang
didigesti enzim pankreas, litium klorida, veast extract.
O pH : 7,0 0,2 pada suhu 25°C
O Kegunaan : dasar preparasi agar BP-% (aird !arker
EGG-Yolk Tellurite) untuk isolasi selektiI dan enumerasi
staIilokoki koagulasi positiI dalam makanan, kulit, tanah, dan
bahan lainnya. Media ini mengandung litium klorida dan
tellurite yang dapat menghambat pertumbuhan Ilora lain,
kemudian piruvat dan glisin secara selektiI menstimulasi
pertumbuhan Staphvlococcus Staphvlococcus akan
membentuk koloni hitam dari reduksi tellurit meniadi
tellurium, dengan dikelilingi zona bening akibat lipolisis dan
proteolisis kuning telur.
- Bu11er Pepton Water (BPW)
O Komposisi : gelatin yang didigesti enzim pankreas, natrium
klorida, dinatrium hidrogen IosIat, kalium hidrogen IosIat.
O pH : 7,2 0,2 pada suhu 25°C
O Kegunaan : media pra-pengkayaan untuk isolasi
Salmonella, khususnya mikroorganisme yang merusak pada
berbagai produk pangan.
- Brilliant Creen Lactose Bile Broth (BGLB)
O Komposisi : empedu sapi terdehidrasi, laktosa, gelatin yang
didigesti enzim pankreas, 4-metilumbelliIeril-ß-D-
glukuronida, pewarna brilliant green
O pH : 7,2 0,2 pada suhu 25°C
O Kegunaan : deteksi bakteri oliform pada makanan, produk
olahan susu. air, dan air buangan serta bahan tersanitasi
32

lainnya. Keberadaan Ecoli dan oliform lain diindikasikan
dengan adanya Iluorosensi pada tabung.
- Brilliant Creen Agar (BGA)
O Komposisi : agar, laktosa, sukrosa iaringan hewan yang
didigesti pepsin, kasein yang didigesti enzim pankreas,
natrium klorida, merah Ienol, pewarna brilliant green
O pH : 6,9 0,2 pada suhu 25°C
O Kegunaan : isolasi selektiI Salmonella selain Stvphi dari
Ieses atau spesimen lain, serta pada produk pangan dan
olahan susu. Salmonella, selain Stvphi, muncul sebagai
koloni merah, merah muda, hingga putih dan dikelilingi
zona merah pada agar yang mengindikasikan Iermentasi
non sukrosa atau laktosa. !roteus atau !seudomonas dapat
muncul sebagai koloni kecil berwarna merah. Bakteri yang
memIermentasi laktosa atau sukrosa muncul sebagai koloni
kuning hiiau yang dikelilingi zona kuning hiiau pada agar.
- Eosin Methvlene Blue Agar (EMBA)
O Komposisi : agar, kasein yang didigesti enzim pankreas,
laktosa, sukrosa, kalium hidrogen IosIat, eosin , metilen
biru.
O pH : 7,2 0,2 pada 25°C
O Kegunaan : isolasi, kultivasi, dan diIerensiasi bakteri enterik
Gram negatiI berdasarkan Iermentasi laktosa. Bakteri yang
memIermentasi laktosa, khususnya Ecoli. muncul sebagai
koloni hiiau metalik, hitam kebiruan, atau coklat. Bakteri
yang tidak memIermentasi laktosa muncul sebagai koloni
ungu muda yang transparan.
- lui/ 1hioglvcolate Me/ium (FTM)
O Komposisi : kasein yang didigesti enzim pankreas, glukosa,
veast extract, natrium klorida, agar, L-sistin, natrium
tioglikolat, resazurin.
O pH : 7,1 0,2 pada suhu 25°C
33

O Kegunaaan : kultivasi mikroorganisme anaerob,
mikroaeroIilik, dan aerob. Digunakan iuga dalam uii
sterilitas alat dan produk kesehatan
O Mekanisme keria : agen pereduksi tioglikolat dan sistem
meniamin anaerobiosis yang cukup bahkan untuk bakteri
anaerob yang selektiI sekalipun. Gugus sulIhidril pada
senyawa ini iuga menginaktivasi arsenik, merkuri dan
komponen logam berat lain.
- Letheen Broth (LB)
O Komposisi : pepton dari daging, pepton dari kasein, ekstrak
daging, ekstrak ragi, natrium bisulIit, natrium klorida,
lesitin.
O pH : 7,2 0,2 pada suhu 25°C
O Warna media : keruh, kuning kecoklatan
O Mekanisme keria : media kaya nutrisi yang iuga berIungsi
untuk menetralisasi kandungan gugus amonium kuartener
dari bahan pengawet yang ada di dalam sampel uii.
- MacConkev Broth (MCB)
O Komposisi : gelatin yang didigesti enzim pankreas, laktosa,
empedu sapi, bromkresol ungu.
O pH : 7,3 0,2 pada 25°C
O Kegunaan : kultivasi dan isolasi selektiI bakteri oliform
dalam susu dan air.
O Mekanisme keria : larutan ini mengandung laktosa, yang
ketika terdegradasi menghasilkan asam dan gas. Gas yang
terbentuk ditampung oleh tabung Durham dan asam yang
dihasilkan dideteksi oleh indikator bromkresol ungu yang
berubah meniadi kuning. mpedu sapi meningkatkan
pertumbuhan dari beberapa spesies bakteri saluran cerna
dan menghambat mikroorganisme lainnya yang tidak hidup
di saluran cerna.


34

- Muller-Kau11mann 1etrathionate Aovo-iocin (MKTTn)
O Komposisi : ekstrak daging, enzim pencerna kasein, natrium
klorida, kalsium karbonat, natrium tiosulIat anhidrat, oxbile.
briliant green
O pH : 8.2 0,2 pada suhu 25°C
O Kegunaan : media diIerensiasi untuk proses pengkayaan
terutama untuk bakteri Salmonella
- Autrien Agar (NA)
O Komposisi : agar pepton, natrium klorida, veast extract.
beef extract
O pH : 7,4 0,2 pada suhu 25°C
O Kegunaan : media pertumbuhan yang universal untuk
menumbuhkan sedikit mikroorganisme tertentu.
- Plate Count Agar (PCA)/1rvptone Clucose Yeast Extract Agar
(TGEA)
O Komposisi : agar, kasein yang didigesti enzim pankreas,
veast extract, glukosa
O pH : 7,2 0,2 pada suhu 25°C
O Kegunaan : enumerasi bakteri viabel dalam susu dan produk
olahannya, estimasi iumlah bakteri heterotroIik hidup dalam
air serta kultivasi dan pemeliharaan revibacterium casei,
epedermidis, dan Methvlobacterium mesophilicum Media
%GA digunakan untuk melihat bakteri yang dapat
membentuk spora seperti acillus subtilis.
- Potato Dextrose Agar (PDA)
O Komposisi : glukosa, agar, inIusi kentang, larutan asam
tartrat
O pH : 5,6 0,2 pada suhu 25°C
O Kegunaan : kultivasi dan enumerasi kapang dan khamir
O Mekanisme keria : inIus karbohidrat dari kentang
menginisiasi pertumbuhan kapang dan khamir. Nilai pH
yang rendah secara tidak langsung dapat menghambat
pertumbuhan bakteri, namun iika penumbuhan dituiukan
35

untuk penghitungan (fungal count) maka pH harus dibuat
hingga 3,5. Fungsi penumbuhan dalam media ini adalah
untuk mengembangkan tvpical morphologv.
- #appaport Jassila/is Soja (RVS)
O Komposisi : pepton dari soymeal, magnesium klorida
heksahidrat, natrium klorida, dikalium hidrogen IosIat,
malchite green
O Kegunaan : media pengkayaan untuk Salmonella
O Mekanisme keria : pepton dari sovmeal, malachite green,
dan magnesium klorida mendukung pertumbuhan
Salmonella pada suhu 42°C.
- Selenite Cvstine Broth (SCB)
O Komposisi : pepton dari kasein, sistin, laktosa, dapar IosIat,
dan natrium hidrogen selenit.
O pH : 7,0 pada suhu 25°C
O Kegunaan : sebagai media pengkayaan Salmonella. Selenit
akan menghambat pertumbuhan bakteri oliform dan
Enterococcus pada 6-12 iam pertama inkubasi secara
bertahap. Sedangkan pada Salmonella. !roteus. dan
!seudomonas. selenit hanya akan sedikit menghambat
pertumbuhan.
- 1hiosul1ate Citrate Bile Salt Agar (TCBSA)
O Komposisi : sukrosa, agar, natrium klorida, natrium sitrat,
natrium bisulIit, veast extract, kasein yang didigesti enzim
pankreas, iaringan hewan yang didigesti pepsin, empedu
sapi, natrium kolat, Ierri sitrat, timol biru, brom timol biru.
O pH : 8,6 0,2 pada 25°C
O Kegunaan : isolasi selektiI 'ibrio cholera dan
' parahaemolvticus dari berbagai spesimen klinik dan
nonklinik.
O Mekanisme keria : konsentrasi tiosulIat dan sitrat yang
tinggi serta basa kuat dalam medium ini secara luas
menghambat pertumbuhan Enterobacteriaceae mpedu
36

sapi dan kolat terutama menekan Enterococci. Bakteri
oliform lain yang memungkinkan tumbuh tidak dapat
memetabolisme sukrosa. Hanya beberapa galur !roteus
yang positiI sukrosa dapat tumbuh dan membentuk koloni
berwarna kuning seperti koloni 'ibrio. %CBSA
mengandung indikator campuran timol biru dan brom timol
biru akan berubah warna meniadi kuning saat asam
terbentuk meskipun medium ini bersiIat basa kuat.
- 1rvptone Sov Broth (TSB)
O Komposisi : kasein yang didigesti enzim pankreas, natrium
klorida, kedelai yang didigesti enzim pankreas, kalium
hidrogen IosIat, glukosa.
O pH : 7,3 0,2 pada suhu 25°C
O Kegunaan : kultivasi berbagai ienis mikroorganisme
- 1rvptone Water/1rvptone Broth (TW/TB)
O Komposisi : kasein yang didigesti enzim pankreas, natrium
klorida
O pH : 7,5 0,2 pada suhu 25°C
O Kegunaan : merupakan media untuk kultivasi produksi
indol oleh berbagai ienis mikroorganisme

3.7 METODE PENGU1IAN
3.7.1 Sumber Metode Pengujian
Balai Pengawas Obat dan Makanan memiliki kelompok penguiian
untuk menguii setiap obat dan makanan yang beredar, salah satunya
adalah penguiian mikrobiologi. Penguiian mikrobiologi penting
dilakukan untuk mengetahui mutu dan kehigienisan suatu produk. Dalam
setiap penguiian makanan, alat kesehatan, kosmetik, obat tradisional,
antibiotik, atau komplemen dilakukan berdasarkan suatu prosedur
operasional baku penguiian mikrobiologi yang disusun berdasarkan
ketentuan yang ada di dalam :
1. Farmakope Indonesia IV
2. &nited State !harmacopoeia (USP)
37

ritish !harmacopoeia
4 Manual of Food Qualitv ontrol
5. Standar Nasional Indonesia (SNI)
6. Pustaka lain yang menuniang prosedur penguiian beserta daItar
kebutuhan alat dan media yang diperlukan.

Pusat Pemeriksaan Obat dan Makanan (PPOM) telah menyusun Buku
Prosedur Operasional Baku Penguiian Mikrobiologi sebagai pedoman
umum untuk penguiian perbekalan Iarmasi dan makanan oleh Balai
Pengawas Obat dan Makanan di seluruh Indonesia.

3.7.2 Ketentuan Umum
Secara garis besar metode penguiian mikrobiologi dapat
digolongkan ke dalam dua kelompok, yaitu penguiian kuantitatiI dan
kualitatiI. Penguiian kuantitatiI dilakukan untuk mengetahui cemaran
mikroba, sedangkan penguiian kualitatiI dilakukan untuk
mengidentiIikasi adanya cemaran bakteri atau kapang patogen.
%ahapan penguiian kuantitatiI terdiri dari persiapan dan
homogenisasi contoh sampel, pengenceran, perhitungan koloni, dan
pengambilan kesimpulan sedangkan tahapan dari penguiian kualitatiI
meliputi persiapan dan homogenisasi sampel, pengenceran, isolasi,
identiIikasi, konIirmasi, dan pengambilan keputusan.
%ahapan persiapan dan homogenisasi contoh dilakukan sesuai
dengan bentuk sediaan dan kemasan dari sampel produk. Dalam tahap ini
perlu diperhatikan apakah sampel yang diuii mengandung bahan
penghambat pertumbuhan mikroba atau tidak. Pada tahap persiapan,
produk yang mengandung bahan pengawet perlu ditambahkan zat
penetral untuk menginaktivasi pengawet. Zat penetral yang biasa
digunakan adalah larutan 0,5° soy lecithin dan 4° polisorbat 20.
Selain tahapan-tahapan analisis, penguiian mikrobiologi iuga
sangat dipengaruhi oleh ketelitian keria pada penyiapan alat dan media.
Pengawasan pada pekeriaan ini perlu dilakukan secara terpadu dan
teratur.

38

3.7.3 Persiapan dan Homogenisasi Sampel Makanan. Obat
Tradisional. kosmetik
Homogenisasi sampel adalah cara persiapan sampel (makanan,
kosmetik, dan obat tradisional) untuk memperoleh distribusi bakteri
secara merata di dalam sampel uii.
Prinsip dari homogenisasi sampel adalah membebaskan sel-sel
bakteri yang masih terlindungi oleh partikel sampel dan untuk
mengaktiIkan kembali sel-sel bakteri yang mungkin viabilitasnya
berkurang karena kondisi yang kurang menguntungkan selama proses
pembuatan sampel.
Adapun alat-alat yang digunakan adalah : alat cincang yang
sesuai, alat homogenisasi (stomacher atau blender), wadah pencampur
(blender iar) dari gelas atau logam yang tahan suhu otoklaI, timbangan
dengan kapasitas 2000 g dan tingkat kepekaan 0,1 g, pisau, garpu,
sendok, gunting, spatula, pembuka kaleng, gelas piala, labu rlenmeyer,
tabung reaksi, dan botol pengencer steril, dan lain-lain.
Larutan pengencer yang sering digunakan adalah :
O Sampel makanan dan minuman
Alkaline !eptone Water (APW), uffered !eptone Water (BPW),
!eptone Dilution Fluid (PDF)
O Sampel kosmetik
Modified Letheen roth (MLB)
O Sampel obat tradisional
Letheen roth (LB), !eptone Dilution Fluid (PDF)

Disiapkan peralatan untuk penyiapan sampel yang sudah steril atau dapat
disterilkan menggunakan api bunsen setelah terlebih dahulu dibersihkan
dengan alkohol 70° sesaat sebelum penguiian berlangsung.
a. Wadah terbuat dari kertas atau plastik
Pada bagian wadah yang akan dibersihkan dengan alkohol 70°,
kemudian dibuka secara aseptik


39

b. Wadah botol kaca
Sumbat atau tutup botol dibersihkan dengan alkohol 70°, kemudian
dibuka secara aseptik di dekat nyala api Bunsen
c. Wadah kaleng
Permukaan kaleng dicuci dan dibersihkan dengan alkohol 70°,
kemudian dibuka secara aseptik di dekat nyala api Bunsen

Prosedur dalam melakukan homogenisasi sampel :
A. Homogenisasi sampel makanan
1. Makanan bentuk cairan
Sampel dikocok sebanyak 25 kali, dengan cara aseptik dipipet
25 mL cuplikan sampel ke dalam wadah steril yang sesuai,
kemudian ditambahkan 225 mL larutan pengencer, dikocok sampai
homogen sehingga diperoleh suspensi dengan pengenceran
1:10 (10
-1
)
2. Makanan bentuk serbuk
Dengan cara aseptik ditimbang 25 g cuplikan ke dalam kantong
stomacher atau labu rlenmeyer atau wadah steril lain yang sesuai,
kemudian ditambahkan 225 mL larutan pengencer, dikocok sampai
homogen sehingga diperoleh suspensi dengan pengenceran
1:10 (10
-1
).
3. Makanan bentuk kental
Dengan cara aseptik dipipet 25 mL atau ditimbang 25 g cuplikan
ke dalam kantong stomacher atau labu rlenmeyer atau wadah
steril lain yang sesuai, kemudian ditambahkan 225 mL larutan
pengencer, dikocok sampai homogen sehingga diperoleh suspensi
dengan pengenceran 1:10 (10
-1
)
4. Makanan bentuk padat
Dengan cara aseptik ditimbang 25 g cuplikan ke dalam blender iar
atau kantong stomacher, ditambahkan 225 mL larutan pengencer,
kemudian dihomogenkan sehingga diperoleh suspensi dengan
pengenceran 1:10 (10
-1
)


40

Catatan :
- Untuk sampel keiu, cuplikan dihomogenkan dalam blender yang
dihangatkan dalam larutan pengencer yang dihangatkan.
- Untuk sampel mentega atau margarin, sampel dipanaskan dalam
tangas air suhu 40°C selama tidak lebih dari 15 menit hingga
bisa dipipet. Cuplikan dipipet 25 mL secara aseptik dengan pipet
yang dihangatkan ke dalam wadah yang berisi 225 mL larutan
pengencer hangat dan kemudian dikocok homogen sehingga
diperoleh suspensi dengan pengenceran 1:10 (10
-1
)
5. Makanan beku
Sampel yang masih beku harus dipecah meniadi bagian-bagian
yang lebih kecil dengan menggunakan peralatan tumpul. Bila
sampel bentuk balok besar, misal ikan atau daging, cuplikan dapat
diambil dengan bantuan gergaii, pisau atau bor. Cara lainnya
adalah sampel beku dapat disimpan terlebih dahulu pada suhu
lemari es selama tidak lebih dari 12 iam untuk memudahkan
pengambilan cuplikan. Untuk sampel yang tidak terlalu beku
seperti es krim, dapat dibiarkan terlebih dahulu pada suhu ruangan
selama tidak lebih dari 15 menit. Setelah cukup leleh, sampel
dalam kemasan diaduk homogen dengan hati-hati, kemudian secara
aseptik ditimbang 25 g cuplikan ke dalam wadah steril yang sesuai
atau blender, selaniutnya dihomogenkan sehingga diperoleh
suspensi dengan pengenceran 1:10 (10
-1
)
6. Makanan yang dikalengkan
Keadaan wadah diamati. Bila keadaannya normal, dilakukan pra-
inkubasi sebagai berikut :
- Produk berkeasaman rendah pada suhu 30-35°C selama 10 hari
- Produk bersiIat asam pada suhu 25-30°C selama 10 hari
- Produk berkeasaman tinggi (dipersiapkan untuk penyimpanan di
atas 40°C) pada suhu 55°C selama 5-7 hari
Setelah masa inkubasi, kondisi wadah diamati kembali. Dilihat
adanya kebocoran pinhole dan kerusakan kaleng. %erhadap kaleng
yang utuh dilaniutkan penguiian. Setelah wadah dibuka, diambil
seiumlah 25 g cuplikan dan dimasukkan ke dalam wadah blender.
41

Ditambahkan 225 mL larutan pengencer sehingga diperoleh
suspensi dengan pengenceran 1:10 (10
-1
)

B. Homogenisasi sampel obat tradisional
1. Sediaan bentuk serbuk
Dengan cara aseptik ditimbang 10 g cuplikan ke dalam wadah
steril, ditambahkan 90 mL PDF. Jika iumlah sampel kurang dari
10 g, maka pengambilan cuplikan dan pengencer disesuaikan
hingga diperoleh suspensi pengenceran 1:10 dan dikocok
homogen.
2. Sediaan bentuk raiangan
Dengan cara aseptik seiumlah sampel bentuk raiangan dipotong-
potong menggunakan pisau (gunting steril) meniadi bagian-bagian
yang lebih kecil. Sebagian ditumbuk dalam cawan mortar supaya
meniadi partikel yang lebih kecil. Dari sampel yang telah dipotong-
potong, dengan cara aseptik ditimbang 10 g cuplikan dimasukkan
ke dalam wadah steril yang sesuai, ditambahkan 90 mL PDF,
dikocok homogen hingga diperoleh suspensi pengenceran 1:10.
3. Sediaan bentuk kapsul
Dengan cara aseptik ditimbang 10 g cuplikan, ke dalam wadah
steril yang sesuai ditambahkan 90 mL LB dihomogenkan sampai
seluruh kapsul hancur sehingga diperoleh suspensi pengenceran
1 : 10.
4. Sediaan bentuk tablet dan pil
Dengan cara aseptik ditimbang 10 cuplikan, ke dalam wadah steril
yang sesuai ditambahkan 90 mL LB, cuplikan dibiarkan terendam
sampai lunak kemudian dihomogenkan sehingga diperoleh
suspensi pengenceran 1 : 10. Bila cuplikan sukar hancur lebih
dahulu digerus secara aseptik di dalam mortar.
5. Sediaan bentuk cairan
Dengan cara aseptik dipipet 10 mL cuplikan, ke dalam wadah steril
yang sesuai ditambahkan 90 mL LB kemudian dihomogenkan
sehingga diperoleh suspensi pengenceran 1 : 10.

42

6. Sediaan bentuk krim dan yang mengandung minyak
Dengan cara aseptik ditimbang 10 g cuplikan ke dalam wadah
steril yang sesuai ditambahkan 1-2 mL %ween 80 dan diaduk.
Selaniutnya ditambahkan Letheen roth diaduk homogen hingga
diperoleh suspensi pengenceran 1 : 10

C. Homogenisasi sampel kosmetik
1. Sediaan bentuk cair
Dengan cara aseptik dipipet 10 mL cuplikan ke dalam wadah steril
yang sesuai, ditambahkan 90 mL MLB. Jika iumlah sampel kurang
dari 10 mL, maka volume cuplikan dan pengencer disesuaikan
hingga diperoleh suspensi dengan pengenceran 10
-1
dan dikocok
homogen.
2. Sediaan bentuk padat dan serbuk
Dengan cara aseptik ditimbang 10 g cuplikan ke dalam wadah
steril yang sesuai. Jika diperlukan cuplikan padat dihancurkan
terlebih dahulu menggunakan lumpang, mortar dan alu steril.
Untuk cuplikan bentuk serbuk perlu ditambahkan 10 mL %ween 80
steril, diaduk homogen hingga terbentuk pasta. Selaniutnya
ditambahkan MLB, dicukupkan hingga diperoleh suspensi dengan
pengenceran 10
-1
dan dikocok homogen.
3. Sediaan bentuk krim dan yang mengandung minyak
Dengan cara aseptik ditimbang 10 g cuplikan ke dalam wadah
steril yang sesuai ditambahkan %ween 80 sambil diaduk,
selaniutnya ditambahkan MLB, dicukupkan hingga diperoleh
suspensi dengan pengenceran 10
-1
dan dikocok homogen.
4. Sediaan serbuk, sabun, cairan bentuk aerosol
Bagian mulut penyemprot dibersihkan dengan kapas beralkohol
70°, kemudian disemprotkan seiumlah cuplikan ke dalam wadah
steril yang sesuai. Setelah ditimbang ditambahkan MLB
disesuaikan hingga diperoleh suspensi dengan pengenceran 10
-1
.



43

5. Sediaan yang mengandung lemak atau lilin (lipstick)
Dengan cara aseptik ditimbang 10 g cuplikan ke dalam wadah
steril yang sesuai. Jika diperlukan cuplikan padat dihancurkan
terlebih dahulu menggunakan lumpang, mortar dan alu steril.
Untuk cuplikan bentuk serbuk perlu ditambahkan 2 mL paraIin cair
steril secara perlahan-lahan kemudian ditambahkan 10 mL %ween
20, diaduk homogen hingga terbentuk pasta. Selaniutnya
ditambahkan MLB, dicukupkan hingga diperoleh suspensi dengan
pengenceran 10
-1
dan diaduk homogen.

3.7.4 Metode Pengujian Produk
A. Uji Angka Lempeng Total
Ruang Lingkup
Metode ini digunakan untuk menetapkan angka bakteri
aerob mesoIil dalam sampel makanan, minuman,
kosmetik, dan obat tradisional.
Prinsip
Pertumbuhan koloni bakteri aerob mesoIil yang masih
memiliki daya hidup, setelah cuplikan diinokulasikan pada
media lempeng agar dengan cara tuang dan diinkubasi
pada suhu yang sesuai.
Pereaksi khusus
1. Media padat
!late ount Agar (1 Liter PCA¹ 1 mL %%C 5°)
2. Pengencer
!epton Dilution Fluid (PDF) untuk sampel makanan,
minuman dan obat tradisional, Letheen roth (LB)
untuk sampel kosmetik dan obat tradisional yang
mengandung pengawet.
3. Pereaksi
Triphenvl Tetrazolium hloride (%%C)
Peralatan khusus
Lemari aseptik tipe vertikal, stomacher atau blender, pipet
ukur mulut lebar, alat hitung koloni, inkubator 35-37°C
44

Prosedur
1. Homogenisasi sampel
Dilakukan dengan cara prosedur homogenisasi sampel
sesuai ienis sampel sehingga diperoleh suspensi
sampel dengan konsentrasi 10
-1
dalam pengencer yang
sesuai.
2. Pengenceran
Dari suspensi pengenceran 10
-1
dipipet 1 mL ke dalam
tabung berisi 9 mL pengencer pertama dikocok
homogen hingga diperoleh suspensi pengenceran 10
-2
.
Pengenceran dilaniutkan dengan cara yang sama
hingga diperoleh

suspensi dengan

pengenceran sesuai
dengan yang diperlukan (dua digit di bawah syarat
SNI)
3. Inokulasi dan Inkubasi
Dari tiap pengenceran dipipet 1 mL ke dalam cawan
petri steril masing-masing dibuat duplo. Ke dalam tiap
cawan petri yang telah dimasukkan sampel,
dituangkan 15-20 mL media PCA cair suhu 45°C
yang telah ditambahkan pereaksi %%C, segera cawan
digoyang dan diputar sedemikian rupa sehingga
suspensi tercampur merata dalam media kemudian
dibiarkan memadat. Untuk mengetahui sterilitas media
dan pengenceran dibuat uii kontrol (blanko). Pada satu
cawan diisi 1 mL pengencer tanpa sampel dan media
agar, pada cawan yang lain diisi media. Setelah agar
memadat, cawan diinkubasi pada suhu 35-37°C selama
24-48 iam dengan posisi dibalik.
4. Pengamatan
Setiap 24 iam koloni yang tumbuh dalam cawan petri
diamati dan dihitung
Interpretasi hasil
1. Dipilih cawan petri dari satu pengenceran yang
menuniukkan iumlah koloni antara 25-250. Jumlah
45

koloni rata-rata dari kedua cawan dihitung lalu
dikalikan dengan Iaktor pengencerannya. Hasil
dinyatakan sebagai Angka Lempeng %otal dalam tiap
gram atau mL sampel.
2. Bila salah satu dari cawan petri menuniukkan iumlah
koloni kurang dari 25 atau lebih dari 250 koloni,
dihitung iumlah rata-rata koloni, kemudian dikalikan
dengan Iaktor pengencerannya. Hasil dinyatakan
sebagai Angka Lempeng %otal dalam tiap gram atau
mL sampel.
3. Jika terdapat cawan-cawan dari dua tingkat
pengenceran yang berurutan menuniukan iumlah
koloni antara 25-250, maka dihitung iumlah koloni
dari masing-masing tingkat pengenceran kemudian
dikalikan dengan Iaktor pengencerannya. Apabila hasil
perhitungan pada tingkat yang lebih tinggi diperoleh
iumlah koloni rata-rata lebih besar dari 2 kali iumlah
rata-rata pengenceran di bawahnya, maka Angka
Lempeng %otal dipilih dari tingkat pengenceran yang
lebih rendah (misal pada pengenceran 10
-2
iumlah
koloni rata-rata 140, pada pengenceran 10
-3
iumlah
koloni rata-rata 32, maka dipilih iumlah koloni 140 x
10
2
).
Bila hasil perhitungan pada tingkat pengenceran lebih
tinggi diperoleh iumlah koloni rata-rata kurang dari 2
kali iumlah rata-rata pada pengenceran dibawahnya
maka Angka Lempeng %otal dihitung dari rata-rata
iumlah koloni kedua tingkat pengenceran tersebut
(misal pada 10
-2
iumlah koloni rata-rata 240, pada
pengenceran 10
-3
iumlah koloni rata-rata 410, maka
Angka Lempeng %otal adalah :
240 ¹ 410 X 10
2
÷ 325 X 10
2

2

46

4. Bila tidak satupun koloni dalam cawan maka Angka
Lempeng %otal dinyatakan sebagai kurang dari satu
(·1) dikalikan Iaktor pengenceran terendah.
5. Jika seluruh cawan menuniukkan iumlah koloni lebih
dari 250, dipilih cawan tingkat pengenceran tertinggi
kemudian dibagi meniadi beberapa sektor (2, 4, atau 8)
dan dihitung iumlah koloni dari satu sektor. Angka
Lempeng %otal adalah iumlah koloni dikalikan dengan
iumlah sektor, kemudian dihitung rata-rata dari kedua
cawan dan dikalikan dengan Iaktor pengenceran.
6. Jumlah koloni rata-rata dari 1/8 bagian cawan lebih
dari 200, maka Angka Lempeng %otal dinyatakan
lebih besar dari 200 x 8 dikalikan Iaktor pengenceran
7. Perhitungan dan pencatatan hasil Angka Lempeng
%otal hanya ditulis dalam dua angka. Angka
berikutnya dibulatkan ke bawah bila kurang dari 5 dan
dibulatkan ke atas apabila lebih dari 5.
Sebagai contoh :
52,3 x 10
3
dibulatkan meniadi 52 x 10
3
83,6 x 10
3
dibulatkan meniadi 84 x 10
3

8. Jika diiumpai koloni spreader meliputi seperempat
sampai setengah bagian cawan, maka dihitung koloni
yang tumbuh di luar daerah spreader. Jika 75° dari
seluruh cawan mempunyai koloni spreader dengan
keadaan seperti di atas, maka dicatat sebagai 'Spr¨.
Untuk keadaan ini harus dicari penyebabnya dan
diperbaiki cara kerianya (penguiian diulang).
9. Jika Diiumpai koloni spreader tipe rantai, maka tiap
satu deret koloni yang terpisah dihitung sebagai satu
koloni, dan bila dalam kelompok spreader terdiri dari
beberapa rantai, maka tiap rantai dihitung sebagai satu
koloni.


47

B. Uji Angka Kapang/Khamir
Ruang Lingkup
Metode ini digunakan untuk menetapkan angka
kapang/khamir dalam sampel makanan, minuman,
kosmetik, dan obat tradisional.
Prinsip
Pertumbuhan kapang/khamir setelah cuplikan
diinokulasikan pada media yang sesuai dengan cara sebar
dan diinkubasi pada suhu 20-25°C.
Pereaksi khusus
1. Media dan Pengencer
!eptone Dilution Fluid (PDF), !otato Dextrose Agar
(PDA) yang ditambah kloramIenikol
2. Pereaksi
100 mg kloramIenikol per Liter media
Peralatan khusus
Lemari aseptik, stomacher atau blender. pipet ukur mulut
lebar, alat hitung koloni, inkubator 20-25°C
Prosedur
1. Homogenisasi sampel
Dilakukan dengan cara prosedur homogenisasi sampel
sesuai ienis sampel sehingga diperoleh suspensi
sampel dengan konsentrasi 10
-1
dalam pengencer yang
sesuai.
2. Pengenceran
Dari suspensi pengenceran 10
-1
dipipet 1 mL ke dalam
tabung berisi 9 mL pengencer pertama dikocok
homogen hingga diperoleh suspensi pengenceran 10
-2
.
Pengenceran dilaniutkan dengan cara yang sama
hingga diperoleh

suspensi dengan

pengenceran 10
-4
atau sesuai

dengan yang diperlukan (dua digit di
bawah syarat SNI).


48

3. Inokulasi dan Inkubasi
Dari tiap pengenceran dipipet 0,5 mL ke permukaan
lempeng media PDA yang sebelumnya telah dituang
ke dalam cawan petri dan dibiarkan memadat, masing-
masing dibuat duplo. Dengan segera lempeng
digoyang dan diputar sedemikian rupa sehingga
suspensi tersebar merata. Untuk mengetahui sterilitas
media dan pengencer dilakukan uii blanko. Pada satu
lempeng PDA diteteskan 0,5 mL pengencer disebar-
ratakan dan untuk uii media digunakan satu lempeng
PDA yang lain.
Seluruh lempeng PDA diinkubasi selama 5-7 hari pada
suhu 20-25°C, dengan posisi tidak dibalik.
Pengamatan dan penghitungan koloni kapang/khamir
dilakukan mulai hari ke-4 sampai ke-7. Koloni khamir
memiliki bentuk bulat kecil, putih, hampir menyerupai
bakteri. Koloni kapang memiliki miselium atau
Iilamen, sehingga penampakan umumnya seperti
benang-benang halus dan berspora. Jumlah koloni
yang tumbuh diamati dan dihitung.
Perhitungan
Dipilih cawan petri dari satu pengenceran yang
menuniukkan iumlah koloni antara 10-150. Jumlah koloni
dari kedua cawan dihitung lalu dikalikan dengan Iaktor
pengencerannya. Bila pada cawan petri dari dua tingkat
pengenceran yang berurutan menuniukkan iumlah antara
10-150, maka dihitung iumlah koloni dan dikalikan
dengan Iaktor pengencerannya, kemudian diambil angka
rata-rata. Hasil dinyatakan sebagai Angka Kapang/Khamir
dalam tiap gram atau mL sampel.
Untuk beberapa kemungkinan lain yang berbeda dari
pernyataan di atas, maka diikuti petuniuk sebagai berikut :
1. Bila hanya salah satu diantara kedua cawan petri dari
pengenceran yang sama menuniukkan iumlah antara
49

10-150, dihitung iumlah koloni dari kedua cawan dan
dikalikan dengan Iaktor pengenceran.
2. Bila pada tingkat pengenceran yang lebih tinggi
didapat iumlah koloni lebih besar dari dua kali iumlah
koloni pada pengenceran di bawahnya, maka dipilih
tingkat pengenceran terendah (misal : pada
pengenceran 10
-2
diperoleh 60 koloni dan pada
pengenceran 10
-3
diperoleh 30 koloni, maka dipilih
iumlah koloni pada pengenceran 10
-2
yaitu 60 koloni).
Bila pada pengenceran yang lebih tinggi didapat
iumlah koloni kurang dari dua kali iumlah koloni
pengenceran di bawahnya, maka diambil angka rata-
rata dari iumlah koloni dari kedua pengenceran
tersebut. Hasil dinyatakan sebagai Angka Kapang/
Khamir dalam tiap gram sampel (Misal pada
pengenceran 10
-2
diperoleh 6 koloni dan pengenceran
10
-3
diperoleh 10 koloni), maka Angka
Kapang/Khamir adalah :
6 ¹ 10
2

3. Bila dari seluruh cawan petri tidak ada satupun yang
menuniukkan iumlah antara 10-150 koloni, maka
dicatat angka sebenarnya dari tingkat pengenceran
terendah dan dihitung sebagai Angka Kapang/Khamir
Perkiraan.
4. Bila tidak ada pertumbuhan pada semua cawan dan
bukan disebabkan karena Iaktor inhibitor, maka Angka
Kapang/Khamir dilaporkan sebagai kurang dari satu
dikalikan dengan Iaktor pengenceran terendah (· 1 x
Iaktor pengenceran terendah).




X 10
3
÷ 8 X 10
3

50

C. Uji Angka Escherichia coli dalam Makanan dan Minuman
Ruang Lingkup
Metode ini digunakan untuk menetapkan angka
Escherichia coli dalam makanan dan minuman.
Prinsip
Pertumbuhan bakteri Ecoli pada media lempeng selektiI
yang sesuai, setelah cuplikan diinokulasikan dengan cara
tuang, diinkubasi pada suhu yang sesuai dan dilaniutkan
dengan konIirmasi melalui uii biokimia.
Pereaksi khusus
1. Media dan Pengencer
!eptone Dilution Fluid (PDF), 'iolet Red ile Agar
(VRBA), Escherichia coli roth (CB), Eosine
Methilene lue Agar (MBA), Nutrient Agar (NA)
atau Trvptic Sov Agar (%SA), Trvptone roth (%B),
MR-'! Medium, Simmons itrate Medium (SCA)
2. Pereaksi
Larutan Indol (Kovac`s), larutan metil merah, larutan
alIa-naItol, larutan KOH 40°.
3. Mikroba baku
Escherichia coli A%CC 25922
Peralatan khusus
Alat hitung koloni
Prosedur
1. Homogenisasi sampel
Dilakukan dengan cara prosedur homogenisasi sampel
sesuai ienis sampel sehingga diperoleh suspensi
sampel dengan konsentrasi 10
-1
dalam pengencer yang
sesuai.
2. Pengenceran
Disiapkan dua tabung atau lebih yang masing-masing
telah diisi 9 mL PDF. Dari hasil homogenisasi sampel
dipipet 1 mL suspensi pengenceran 10
-1
ke dalam
tabung PDF pertama hingga diperoleh suspensi
51

pengenceran 10
-2
, dikocok sampai homogen. Buat
pengenceran berikutnya hingga 10
-3
atau sesuai yang
diperlukan.
3. Inokulasi dan Inkubasi
Dari tiap pengenceran dipipet 1 mL ke dalam cawan
petri steril, dibuat duplo, kemudian dituangkan 15 mL
VRBA suhu 45°C. Cawan petri segera digoyang dan
diputar sedemikian rupa sehingga suspensi tersebar
merata. Untuk mengetahui sterilitas media dan
pengencer dilakukan uii blanko. Pada satu cawan
diinokulasikan 1 mL pengencer dan media, dan pada
cawan yang lain hanya diisi media agar. Setelah
memadat pada tiap cawan dituangkan lagi 5 mL media
yang sama, diratakan ke seluruh permukaan sebagai
lapisan atas dan dibiarkan memadat. Kemudian
diinkubasi dengan posisi dibalik pada suhu 35-37°C
selama 18-24 iam. Dihitung koloni yang berwarna
ungu kemerahan dengan diameter 0,5 mm atau lebih
yang dikelilingi zona kemerahan. Dipilih cawan petri
dari satu pengenceran yang menuniukkan iumlah
koloni spesiIik rata-rata 30-100. Dicuplik 10 koloni
spesiIik secara acak untuk dilaniutkan dengan
konIirmasi.
KonIirmasi dan IdentiIikasi
Koloni spesiIik dan biakan VRBA yang telah ditetapkan
kemudian diinokulasikan masing-masing ke media CB
yang dilengkapi dengan tabung Durham, diinkubasi pada
suhu 44,5 0,5°C selama 24-48 iam, diamati terbentuknya
gas dalam tabung Durham. Dari biakan positiI membentuk
gas diinokulasikan ke lempeng media MBA dan
diinkubasi pada suhu 35-37 °C selama 24-48 iam dengan
posisi dibalik. Diamati pertumbuhan koloni spesiIik pada
biakan MBA dengan ciri-ciri bentuk bulat, diameter
2-3 mm, warna hiiau dengan kilap logam dan bintik biru
52

kehiiauan di tengahnya. Dipilih koloni spesiIik yang
terpisah, diinokulasikan pada media NA atau %SA miring
untuk dikonIirmasi dengan uii biokimia IMVIC sebagai
berikut :
O Uii Indol
Satu sengkelit biakan NA atau %SA miring
diinokulasikan pada media Trvptone roth dan
diinkubasi pada suhu 35-37°C selama 24-48 iam. Ke
dalam biakan tersebut ditambahkan beberapa tetes
pereaksi Indol (Kovac`s) dan dikocok, didiamkan
selama 10 menit. Jika terbentuk cincin berwarna
merah cherrv di permukaan biakan menuniukkan
reaksi Indol positiI.
O Uii Metil Merah
Satu sengkelit biakan NA miring diinokulasikan pada
media MR-VP dan diinkubasi pada suhu 35-37°C
selama 24-48 iam. Ke dalam biakan tersebut
ditambahkan 5 tetes larutan metil merah dan dikocok.
Biakan yang kemudian berwarna merah menuniukkan
reaksi positiI
O Uii Voges Proskauer
Satu sengkelit biakan NA miring diinokulasikan pada
media MR-VP dan diinkubasi pada suhu 35-37°C
selam 24-48 iam. Ke dalam biakan tersebut
ditambahkan 0,6 mL larutan alIa-naItol dan 0,2 mL
larutan KOH 40°, dikocok dan dibiarkan beberapa
menit. Biakan yang berwarna merah muda hingga
merah menyala menuniukkan reaksi positiI, bila tidak
demikian berarti negatiI
O Uii Sitrat
Satu sengkelit biakan NA miring diinokulasikkan
pada media SCA diinkubasi pada suhu 35-37°C
selama 24-48 iam. Perubahan warna biakan
53

menuniukkan reaksi positiI, bila biakan tetap
berwarna hiiau berarti negatiI.
Interpretasi Hasil
Escherichia coli dinyatakan positiI iika hasil uii biokimia
adalah sebagai berikut :
Indol : positiI (¹)
Metil Merah : positiI (¹)
Voges Proskauer : negatiI (-)
Sitrat : negatiI (-)
Pernyataan Hasil
Angka Ecoli ditetapkan berdasarkan persentase dari 10
koloni spesiIik yang dinyatakan positiI sebagai
Escherichia coli.
Contoh :
Dari hasil perhitungan diperoleh 78 koloni pada
pengenceran 10
-2
. Bila dari 10 koloni spesiIik yang dipilih
setelah dikonIirmasi ternyata hanya 8 koloni yang positiI
sebagai Escherichia coli, maka angka Escherichia coli
dari sampel yang diuii adalah :
8/10 x 78 x10
2
÷ 62,4 x 10
2
koloni ÷ 62 x 10
2
koloni
Jadi, Angka Escherichia coli ÷ 62 x 10
2
koloni per gram
atau per mL sampel.

D. Uji Angka Staphvlococcus aureus dalam Makanan dan
Minuman
Ruang Lingkup
Metode ini digunakan untuk menetapkan Staphvlococcus
aureus angka dalam makanan dan minuman.
Prinsip
Pertumbuhan Staphvlococcus aureus pada media lempeng
yang sesuai, mereduksi kalium telurit, menghidrolisis
kuning telur dan mengkoagulasi plasma.


54

Pereaksi khusus
1. Media
aird !arker Agar ¹ Egg Yolk Tellurite (!A-EY).
rain Heart Infusion roth (HI). uffered !eptone
Water (!W). Trvpticase Sov Agar (%SA)
2. Pereaksi
gg olk %ellurite (5° emulsi kuning telur dalam
NaCl 1 :1 ¹ 1° kalium telurite 1°), koagulase plasma
kelinci dengan D%A
3. Mikroba baku
Staphvlococcus aureus A%CC 25923
Peralatan khusus
Stomacher atau blender, pipet ukur mulut lebar, batang
gelas bengkok, alat hitung koloni
Prosedur
Secara aseptik ditimbang 25 g cuplikan atau dipipet
25 mL, dimasukkan ke dalam kantung stomacher dan
ditambahkan 225 mL BPW atau dilakukan homogenisasi
sampel sesuai prosedur cara homogenisasi. Dihomogenkan
dengan menggunakan stomacher selama 30 detik hingga
diperoleh suspensi yang homogen dengan pengenceran
10
-1
. Disiapkan dua tabung yang masing-masing telah diisi
dengan 9 mL BPW. Dipipet 1 mL dari pengenceran 10
-1
.
Dibuat pengenceran berikutnya hingga 10
-3
. Disiapkan
3 cawan berisi BPA- (triplo) untuk setiap pengenceran,
dan dari setiap pengenceran dipipet 0,3 mL; 0,3 mL dan
0,4 mL ke lempeng media BPA-. Segera disebar
ratakan dengan menggunakan batang gelas bengkok.
Apabila inokulum belum terserap semua oleh agar,
biarkan cawan dengan posisi ke atas di dalam inkubator
selama 10-60 menit, kemudian inkubasi cawan dengan
posisi dibalik pada suhu 35°C selama 45-48 iam. Pilih dan
hitung cawan yang mengandung 20-200 koloni terduga
Saureus. Koloni Saureus adalah bulat, halus, konveks,
55

lembab, diameter 2-3 mm, berwarna abu-abu kehitaman,
memucat di tepi koloni dan apabila dicuplik dengan iarum
ose, koloni tampak seperti mentega sampai lengket.
KonIirmasi
Dipilih 10 koloni spesiIik yang diduga Saureus dari tiga
cawan terhitung, masing-masing diinokulasikan ke agar
miring %SA, diinkubasi pada suhu 35°C selama 18-24
iam. Diinokulasikan 1 sengkelit ke dalam tabung reaksi
kecil berisi 0,2-0,3 mL BHIB, inkubasikan pada suhu
35°C selama 18-24 iam. Ditambahkan 0,5 mL plasma
kelinci dan diaduk merata, diinkubasi 30°C selama 6 iam.
Diamati teriadinya koagulasi plasma kelinci dalam setiap
tabung dengan membalikkan tabung, apabila media tetap
ditempatnya berarti dipertimbangkan positiI Saureus.
Lakukan pewarnaan Gram untuk koloni terduga dan
kontrol positiI Saureus.
Perhitungan
Angka Saureus dinyatakan berdasarkan persentase koloni
spesiIik yang telah dikonIirmasi sebagai Saureus
(koagulasi positiI) dikalikan iumlah koloni dari tiga cawan
(triplo) dan Iaktor pengenceran.
Angka Saureus : A
10
A : Koloni spesiIik Saureus (koagulasi positiI)
B : iumlah koloni terduga Saureus dari tiga cawan (triplo)
C : Iaktor pengenceran.
Contoh ;
Perhitungan koloni terduga Saureus pada pengenceran
10
-2
(C) adalah 90 (B), dan dari 10 koloni yang
dikonIirmasi ternyata 9 positiI (A) sebagai S aureus maka
angka Saureus per gram atau per mL sampel adalah :
Angka Saureus :



.B.C
x 90 x 10
2
÷ 81 x10
2
koloni
9
10

56

E. Uji Angka Paling Mungkin (MPN) Coli1orm dalam
Makanan dan Minuman.
Ruang Lingkup
Metode ini digunakan untuk menetapkan Angka Paling
Mungkin (MPN) oliform dalam makanan dan minuman.
Prinsip
Pertumbuhan bakteri oliform setelah cuplikan
diinokulasikan pada media cair yang sesuai dengan
mengamati adanya reaksi Iermentasi dan pembentukan gas
di dalam tabung Durham.
Pereaksi khusus
Media dan pengencer
!epton Dilution Fluid (PDF), Mac onkev roth (MCB),
rilliant Green Lactose ile roth 2° (BGLB)
Peralatan khusus
Stomacher atau blender, pipet ukur mulut ukuran 1 mL,
5 mL, 10 mL, tabung reaksi dilengkapi tabung Durham.
Prosedur
Disiapkan 2 tabung reaksi masing-masing berisi 9 mL
PDF. Dari hasil homogenisasi pada penyiapan sampel
dipipet 1 mL pengenceran 10
-1
ke dalam tabung PDF
pertama hingga diperoleh suspensi dengan pengenceran
10
-2
dan dikocok sampai homogen. Selaniutnya dibuat
pengenceran 10
-3
.
1. Uii Praduga (!resumptive test)
Untuk setiap pengenceran disiapkan 3 tabung reaksi
berisi 9 mL MCB yang dilengkapi tabung Durham. Ke
dalam tiap tabung dari masing-masing seri dimasukkan
1 mL suspensi pengenceran. Diinkubasi pada suhu 37°C
selama 24-48 iam. Setelah 24 iam dicatat dan diamati
adanya gas yang terbentuk dalam tabung. Kemudian
inkubasi dilaniutkan hingga 48 iam dan dicatat tabung-
tabung yang menuniukkan uii positiI.

57

2. Uii Penegasan (onfirmative test)
Biakan dari tabung yang menuniukkan uii praduga
positiI dipindahkan 1 sengkelit ke dalam tabung reaksi
berisi 10 mL BGLB yang telah dilengkapi tabung
Durham Seluruh tabung diinkubasi pada suhu 37°C
selama 24-48 iam. Dilakukan pengamatan adanya
pembentukan gas.
Pernyataan Hasil
Jumlah tabung yang positiI gas dicatat dan diruiuk ke
tabel MPN. Angka yang diperoleh pada tabel MPN
menyatakan iumlah bakteri oliform dalam tiap gram
atau tiap mL sampel yang diuii.

F. Uji Angka Paling Mungkin (MPN) Coli1orm Dalam Air
Minum
Ruang Lingkup
Metode ini digunakan untuk mendapatkan Angka
Paling Mungkin (MPN) oliform dalam air minum
yang dikemas.
Prinsip
Pertumbuhan bakteri oliform setelah cuplikan
dinokulasikan pada media cair yang sesuai yang
ditandai dengan adanya reaksi Iermentasi dan
pembentukan gas didalam tabung Durham
Pereaksi Khusus
Mac onkev roth (M). rillian Green Lactose ile
roth 2° (BGLB)
Peralatan Khusus
%abung reaksi dilengkapi dengan tabung Durham
Prosedur
Menggunakan metode MPN 5 tabung
1. Uii Praduga (!resumptive test)
Disiapkan 5 buah tabung masing-masing berisi 10
mL media MCB konsentrasi ganda dan 10 tabung
58

masing-masing berisi 5 mL MCB konsentrasi
tunggal. Sampai air dikocok sebanyak 25 kali. Ke
dalam 5 buah tabung MCB konsentrasi ganda
masing-masing diinokulasi dengan 10 mL sampel
dan ke dalam 5 tabung konsentrasi tunggal lainnya
diinokulasi dengan 0,1 mL sampel. Semua tabung
MCB dinkubasi pada suhu 35-37
o
C selama 24-48
iam. Diamati perubahan warna tuknya gas pada
setiap tabung.
2. Uii Penegasan (onfirmative test)
Disiapkan tabung-tabung dengan tabung Durham
yang di isi 10 mL media BGLB. Dari setiap tabung
yang menuniukan gas positiI pada uii praduga,
dikocok masing-masing diambil 1 sengkelit
kemudian diinokulasikan ke dalam tabung BGLB.
Kemudian diinkubasi pada suhu 35-37
o
C selama
24-48 iam. Diamati terbentuknya gas pada setiap
tabung. Jumlah tabung yang positiI gas dicatat dan
hasilnya diruiuk ke %abel MPN (II). Angka yang
diperoleh dari tabel menuniukan MPN oliform
per 100 mL sampel air yang diuii.

G. Uji Angka Paling Mungkin (MPN) Escherichia coli dalam
Makanan dan Minuman
Ruang Lingkup
Metode ini digunakan untuk menetapkan Angka Paling
Mungkin (MPN) Escherichia coli dalam makanan dan
minuman.
Prinsip
Pertumbuhan koloni bakteri Ecoli setelah cuplikan
diinokulasikan pada media cair yang sesuai, dengan
mengamati adanya reaksi Iermentasi dan pembentukan
gas di dalam tabung Durham, dilaniutkan dengan
isolasi dan identiIikasi E coli
59

Pereaksi Khusus
1. Media dan Pengencer
!epton Dilution Fluid (PDF), Mac onkev roth
(MCB), Escherichia coli roth (CB), Eosin
Methvlen lue Agar (MBA), Trvptone roth.
Simmons itrate Agar (SCA), MR-'! Medium.
Nutrient Agar (NA) atau Trvpticase Sov Agar
(%SA).
2. Pereaksi
Larutan Kovac`s, larutan metil merah, larutan alIa-
naItol, larutan KOH 40°.
3. Mikroba Baku
Escherichia coli A%CC 25922
Peralatan Khusus
Pipet ukur mulut lebar ukuran 25 mL, tabung reaksi dan
tabung Durham
Prosedur
Dengan cara aseptik, ditimbang 25 g sampel kemudian
ditambahkan 225 mL PDF, dikocok homogen hingga
diperoleh suspensi dengan pengenceran 10
-1
. Disiapkan
2 tabung reaksi masing-masing berisi 9 mL PDF. Dari
hasil homogenisasi pada penyiapan sampel dipipet 1
mL pengenceran 10
-1
ke dalam tabung PDF pertama
hingga diperoleh suspensi dengan pengenceran 10
-2
dan
dikocok hingga homogen. Dibuat pengenceran
selaniutnya hingga 10
-3
.
1. Uii Praduga
Untuk setiap pengenceran disiapkan 3 tabung reaksi
berisi 9 mL MCB yang dilengkapi tabung Durham
Ke dalam tiap tabung dari masing-masing seri
dimasukan 1 mL suspensi pengenceran. Diinkubasi
pada suhu 35-37
o
C selama 24-48 iam. Setelah 24
iam dicatat dan diamati perubahan warna biakan
dan adanya gas yang terbentuk di dalam tiap
60

tabung. Kemudian diinkubasi dilaniutkan hingga 48
iam dan dicatat tabung-tabung yang menuniukan
gas positiI.
2. Uii Penegasan
Biakan dari tabung yang menuniukan uii praduga
positiI dipindahkan 1 sengkelit ke dalam tabung
reaksi berisi 10 mL E roth yang telah dilengkapi
dengan tabung Durham Seluruh tabung diinkubasi
pada suhu 44 ¹ 0,5
o
C selama 24-48 iam. Dilakukan
pengamatan terhadap pembentukan gas. Dari biakan
E roth yang positiI, masing-masing
diinokulasikan pada lempeng media MBA,
diinkubasi pada suhu 35-37
o
C selama 24 iam,
diamati koloni spesiIik yang tumbuh. Dipilih koloni
spesiIik yang tumbuh pada biakan MBA,
diinokulasikan pada media NA miring,
diinkkubasikan pada suhu 35-37
o
C selama 24-48
iam dilaniutkan dengan uii IMVIC.
a. Uii Indol
Dari biakan NA miring diinokulasikan pada
media Trvptone roth, diinkubasi pada 35-37
o
C
selama 24 iam, tambahkan 0,2-0,3 mL larutan
Kovac`s untuk tiap biakan dan kocok, diamati
setelah 10 menit.
b. Uii Metil Merah
Dari biakan NA miring diinokulasikan pada
media MR-VP diinkubasi pada suhu 35-37
o
C
selama 48 iam, kemudian ditambahkan 5 tetes
larutan metil merah pada tiap tabung biakan dan
dikocok. Diamati perubahan warna biakan.
c. Uii Voges Proskauer
Dari biakan NA miring diinokulasikan pada
suhu 35-37
o
C selama 48 iam. Pada 1 mL biakan
0,6 mL larutan alIa-naItol dan 0,2 mL larutan
61

kalium hidroksid 40° dikocok homogen.
Diamati perubahan warna biakan.
d. Uii Sitrat
Dari biakan NA miring diinokulasikan pada
media Simmons itrate Agar, diinkubasi pada
suhu 35-37
o
C selama 48 iam, diamati
pertumbuhan warna biakan.
Pernyataan Hasil
1. Uii praduga dinyatakan positiI bila, pada biakan
MCB teriadi perubahan warna biakan dari ungu
meniadi kuning dan berbentuk gas dalam tabung
Durham
2. Uii penegasan dinyatakan positiI bila, pada biakan
E roth terbentuk gas di dalam tabung Durham
3. Uii Indol dinyatakan positiI bila, terbentuk cincin
warna merah cherrv pada permukaan biakan.
4. Uii Metil Merah dinyatakan positiI bila biakan
berubah meniadi merah.
5. Uii Voges Proskauer dinyatakan positiI bila warna
biakan meniadi merah.
6. Uii Sitrat dinyatakan positiI bila warna biakan
berubah meniadi biru.
Uii E coli dinyatakan positiI bila hasil uii IMVIC
adalah :
Indol : PositiI
Metil Merah : PositiI
Voges-Proskauer : NegatiI
Sitrat : NegatiI
Bila uii penegasan menuniukan hasil seperti tersebut di
atas, maka dinyatakan Escherichia coli positiI dan
nilainya diruiuk pada tabel MPN.


62

H. Uji Escherichia coli dalam Makanan. Minuman dan Obat
Tradisional
Ruang Lingkup
Metode ini digunakan untuk menetapkan adanya
bakteri Escherichia coli dalam makanan dan obat
tradisional.
Prinsip
Pertumbuhan E coli pada media selektiI yang sesuai,
dilaniutkan dengan konIirmasi uii biokimia, yang
menghasilkan senyawa indol dan tidak dapat
menggunakan sitrat sebagai sumber energi.
Pereaksi Khusus
1. Media dan Pengencer
!epton Dilution Fluid (PDF) : pengencer untuk
makanan dan minuman, Letheen roth (LB) :
pengencer untuk obat tradisional, Trvptic Sov roth
(%SB), Endo Agar. Eosin Methvlene lue Agar
(MBA), Trvptone roth (%B), MR-'! Medium.
Simmons itrate Agar (SCA), Nutrient Agar (NA)
atau Trvptic Sov Agar (%SA)
2. Pereaksi
Larutan Kovac`s (Pereaksi Indol), larutan metil
merah, larutan alIa-naItol, larutan Kalium
hidroksida 40°
3. Mikroba Baku
Escherichia coli A%CC 25922
Peralatan Khusus
Stomacher atau blender. pipet ukur mulut lebar ukuran
1 mL dan 10 mL, batang kaca bengkok, alat hitung
koloni
Prosedur
1. Homogenisasi sampel
Dengan cara aseptik ditimbang 25 g cuplikan ke
dalam kantong stomacher steril ditambahkan 225
63

mL PDF/LB. Dihomogenkan menggunakan
stomacher selama 30 detik.
2. Pengkayaan
Dipipet 10 mL ke dalam %SB 90 mL, diinkubasi
pada suhu 35-37
o
C selama 18-24 iam.
3. Isolasi
Dari biakan pengkayaan kemudian digoreskan
dengan menggunakan sengkelit pada media MBA
dan Endo Agar diinkubasi pada 35-37
o
C selama 24
iam dengan posisi cawan dibalik. Diamati koloni
spesiIik yang tumbuh pada MBA dengan ciri-ciri
bentuk bulat, diameter 2-3 mm, warna hiiau dengan
kilap logam dan bintik biru kehiiauan ditengahnya,
dan pada Endo Agar dengan ciri-ciri koloni bulat,
diameter 2-3 mm, warna merah keunguan dengan
kilap logam.
4. IdentiIikasi dan KonIirmasi
Dipilih dua atau lebih koloni spesiIik pada MBA
dan Endo Agar diinokulasikan pada NA atau %SA
miring, kemudian diinkubasi pada suhu 35-37
o
C
selama 18-24 iam. Dari NA atau %SA miring
dilaniutkan dengan uii IMVIC sebagai berikut :
a. Uii Indol
Satu sengkelit biakan NA atau %SA miring
diinokulasikan pada media Trvptone roth dan
diinkubasi pada suhu 35-37
o
C selama 24-48
iam. Ke dalam biakan ditambahkan 1 mL
pereaksi Indol (Kovac`s) dikocok dan
didiamkan beberapa menit. Warna merah cherrv
yang berbentuk cincin pada permukaan biakan
menuniukan reaksi indol positiI.
b. Uii Metil Merah
Satu sengkelit biakan NA atau %SA miring
diinokulasikan pada media MR-VP dan
64

diinkubasi pada suhu 35-37
o
C selama 24-48
iam. Setelah diinkubasi tambahkam 5 tetes
larutan metil merah dikocok homogen dan
didiamkan beberapa menit, bila biakan meniadi
merah menuniukan hasil uii positiI.
c. Uii Voges Proskauer
Satu sengkelit biakan NA dan %SA miring
diinokulasikan pada media MR-VP dan
diinkubasi pada suhu 35-37
o
C selama 24-48
iam. Setelah diinkubasikan ditambahkan 3 tetes
larutan alIa-naItol dan 2 tetes larutan KOH 40°
dikocok kemudian didiamkan selama beberapa
menit. Jika warna biakan meniadi merah muda
hingga merah menyala menuniukan reaksi
positiI.
d. Uii Sitrat
Satu sengkelit biakan NA atau %SA miring
diinokulasikan pada Simmons itrate Agar dan
diinkubasi pada suhu 35-37
o
C selama 24-48
iam. Jika teriadi perubahan warna biakan
menuniukan hasil uii positiI.
Escherichia coli dinyatakan positiI bila hasil uii
IMVIC sebagai berikut :
Indol : positiI (¹)
Metil merah : positiI (¹)
VP : negatiI (-)
Sitrat : negatiI (-)
Pernyataan Hasil
Jika dari biakan %SB diperoleh hasil seperti tersebut di
atas, maka dapat dinyatakan terdapat bakteri
Escherichia coli dalam tiap gram sampel.


65

I. Uji Salmonella dalam Makanan. Minuman dan Obat
Tradisional
Ruang Lingkup
Metode ini digunakan untuk menetapkan adanya
Salmonella dalam makanan, minuman dan obat
tradisional.
Prinsip
Ada empat tahap untuk mendeteksi adanya Salmonella.
yaitu:
1. Pra-pengkayaan dalam media cair nonselektiI yang
diinkubasi pada 37 ¹ 1
o
C selama 18 ¹ 2 iam.
2. Pengkayaan dalam media cair selektiI yang
diinkubasi pada 41,5 ¹ 1
o
C selama 24 ¹ 3 iam
dalam RVS cair dan 37 ¹ 1
o
C selama 24 ¹ 3 iam
dalam MK%%n cair.
3. Inokulasi dan identiIikasi dalam dua media padat
selektiI, media selektiI pertama diinkubasi pada
37 ¹ 1
o
C selama 24 ¹ 3 iam dan inkubasi media
selektiI kedua disesuaikan dengan media yang
digunakan.
4. KonIirmasi terhadap identitas Salmonella dengan
uii biokimia dan serologi.

Pereaksi Khusus
1. Media dan Pengencer
uffered !eptone Water (BPW) : Muller Kaufmann
Tetrathionate Novobiocin roth (MK%%n),
Rappaport 'assiliadis Medium ¹ Sova (RVS),
ismuth Green Agar (BGA), Xvlose Lvsine
Desoxvcholate (XLD), Trvptic Sov Agar atau
Nutrient Agar miring. Triple Sugar Iron Agar
(%SIA), &rea Agar (Cristensen), L-Lvsine
Decarboxvlase Medium. Trvptophan Medium atau
66

Trvptone roth. MR-'! Medium. larutan Natrium
klorida 0,85° Nutrient Agar (NA) semi padat.
2. Pereaksi
Larutan alIa-naItol, larutan KOH 40°, larutan
Kovac`s, cakram kertas ONPG (o-nitrophenvl beta-
galactopiranoside), Salmonella antisera polivalen O,
H dan Vi.
3. Mikroba baku
Salmonella tvphimurium A%%C 14028
Peralatan Khusus
Stomacher atau blender. pipet ukur mulut lebar ukuran
1 mL dan 10 mL, inkubator atau tangas air pada 37 ¹
1
o
C, inkubator atau tangas air pada 41,5 ¹ 1
o
C
Prosedur
1. Homogenisasi Sampel dan Pra-Pengkayaan
NonSelektiI
Dengan cara aseptik ditimbang 25 g atau dippipet
25 mL cuplikan ke dalam kantong plastik
stomacher steril ditambahkan 225 mL BPW
kemudian dihomogenkan menggunakan stomacher
selama 30 detik, dan diinkubasi pada suhu 37 ¹ 1
o
C
selama 18 ¹ 2 iam.
2. Pengkayaan SelektiI
Dengan cara aseptik dipipet biakan prapengkayaan
masing-masing 1 mL ke dalam 10 mL MK%%n
inkubasi pada suhu 37 ¹ 1
o
C selama 24 iam ¹ 3 iam
dan 0,1 mL kedalam 10 mL RVS inkubasi pada
suhu 41,5 ¹ 1
o
C selama 24 ¹ 3 iam. Jagalah agar
maksimum suhu inkubasi tidak melebihi 42,5
o
C.
3. Inokulasi dan IdentiIikasi
Dari biakan MK%%n dan RVS diinokulasikan
masing-masing sebanyak 1 sengkelit pada
permukaan BGA dan XLD, kemudian diinkubasi
67

pada suhu 37 ¹ 1
o
C selama 24 ¹ 3 iam, koloni yang
tumbuh diamati.
Biakan diduga Salmonella positiI iika :
Pada BGA : Koloni dari tidak berwarna, merah
muda hingga merah dan translusen hingga keruh
dengan lingkaran merah muda sampai merah.
Pada XLD : Koloni translusen dengan bintik hitam
ditengahnya, dan dikelilingi zona transparan
berwarna kemerahan.
4. KonIirmasi
Dipilih dua atau lebih koloni spesiIik pada BGA
dan XLD, pada media %SA/NA miring, kemudian
diinkubasi pada suhu 35-37
o
C selama 18-24 iam.
Dari NA atau %SA miring dilaniutkan dengan uii
IMVIC sebagai berikut :
1. %SIA
Inokulaikan koloni tersangka dengan cara tusuk
dan goresan pada media %SIA, inkubasi pada
suhu 37 1°C selama 24 3 iam. Amati
perubahan warna yang teriadi.
2. Uii Urease
Inokulasikan koloni tersangka pada media &rea
Agar (Christensen) suhu 371°C. Amati
perubahan warna biakan yang teriadi
3. Uii Dekarboksilasi Lisin
Inokulasikan koloni tersangka pada media
L-Lvsine decarboxlase. diinkubasi pada suhu
37 1°C selama 24 3 iam. Amati perubahan
warna biakan dan kekeruhan yang teriadi.
4. Uii Voges Proskauer
Inokulasikan koloni tersangka pada media MR-
VP pada suhu 37 1°C selama 24 3 iam.
%ambahkan 3 tetes larutan alIa-naItol dan 2 tetes
68

larutan KOH 40°. Amati perubahan warna
biakan yang teriadi setelah 15 menit.
5. Uii Indol
Inokulasikan koloni tersangka pada media
Trvptone roth, inkubasi pada suhu 37 1°C
selama 24 3 iam. %ambahkan beberapa tetes
larutan Kovac`s. Amati pembentukan cincin
merah.
6. Uii ß-Galaktosidase
Suspensikan 0,5 mL NaCl 0,85° pada biakan
NA miring dalam tabung reaksi kecil steril.
Masukkan sebuah cakram ONPG, inkubasi pada
suhu 371°C selama 243 iam
Interpretasi Hasil
%SIA : butt positiI, slant negatiI,
gas positiI/negatiI
Gas H
2
S : positiI
Hidrolisis urea : negatiI
Dekarboksilasi Lysine : positiI
ß-Galaktosidase : negatiI
Reaksi Voges Proskauer : negatiI
Produksi indol : negatiI
Persyaratan
Makanan dan minuman tidak boleh mengandung
Salmonella (negatiI per 25 gram atau 25 mL). Obat
tradisional tidak boleh mengandung Salmonella (negatiI
per gram atau per mL)

1. Uji Staphvlococcus aureus dalam Sampel Makanan.
Minuman. Kosmetik dan Obat Tradisional
Ruang Lingkup
Metode ini digunakan untuk menetapkan adanya
Staphvlococcus aureus yang masih memiliki daya
hidup dalam sampel kosmetik dan obat tradisional.
69

Prinsip
Pertumbuhan Staphvlococcus aureus pada media
lempeng yang sesuai, yang mereduksi kalium telurit,
menghidrolisis kuning telur, memIermentasi manitol
dan mengkoagulasi plasma
Pereaksi Khusus
1. Media
Letheen roth (LB), aird !arker Agar (BPA) ¹
emulsi kuning telur 5° ¹ Kalium telurit 1°,
Manitol Salt Agar (MSA) ¹ emulsi kuning telur 5°
¹ kalium telurite 1°, 'ogel-Johnson Agar (VJA) ¹
Kalium %elurit 1°, Trvptic Sov roth (%SB),
Nutrient Agar (NA) atau Trvptic Sov Agar (%SA),
Brain Heart InIusion Broth (BHIB), !eptone
Dilution Fluid (PDF)
2. Pereaksi
mulsi kuning telur dalam NaCl 0,85° (1:1),
larutan Kalium telurit 15, plasma kelinci
3. Mikroba Baku
Staphvlococcus aureus A%CC 25923
Peralatan Khusus
Stomacher atau blender
Prosedur
1. Homogenisasi sampel
Dilakukan sesuai dengan cara prosedur
homogenisasi, digunakan PDF sebagai pengencer
sampel makanan dan minuman, LB sebagai
pengencer sekaligus inaktivasi pengawet untuk
sampel kosmetik dan obat tradisional.
2. Pengkayaan
Dengan cara aseptik dipipet 1 mL suspensi dari
homogenisasi sampel, ke dalam 9 mL %SB, setelah
dikocok homogen diinkubasi pada suhu 35-37 °C
selama 24 iam.
70

3. Isolasi
Siapkan lempeng media BPA dan MSA untuk
sampel makanan dan minuman, media VJA dan
MSA untuk sampel kosmetik dan obat tradisional.
Dari biakan pengkayaan diambil dengan sengkelit
untuk digoreskan pada lempeng BPA/VJA dan
MSA. Dilakukan pula untuk kontrol positiI
Staphvlococcus aureus. Semua lempeng diinkubasi
pada suhu 35-37°C selama 24-48 iam dengan posisi
lempeng dibalik. Diamati koloni spesiIik yang
tumbuh dengan ciri-ciri sebagai berikut :
Pada BPA : koloni cembung, warna koloni hitam
mengkilat, dikelilibgi daerah keruh (opaque).
Pada VJA : Koloni cembung, berwarna hitam
mengkilat dan dikellilingi daerah berwarna kuning.
Pada MSA : Koloni cembung, warna kuning
dikelilingi daerah keruh dan media berubah meniadi
kuning.
4. KonIirmasi
Dipilih koloni spesiIik dari biakan BPA/VJA/MSA
untuk diinokulasikan pada media BHIB, kemudian
diinkubasi pada suhu 35-37°C selama 24 iam
dilaniutkan dengan uii koagulasi. Dipipet 0,1 mL
biakan BHIB ke dalam tabung reaksi kecil steril
ditambahkan 0,5 mL plasma kelinci, diinkubasi
pada 35-37°C selama 4-6 iam. Diamati adanya
koagulasi plasma. Jika teriadi koagulasi dinyatakan
Staphvlococcus aureus positiI dalam sampel.
5. Uii mikroskopik
Dari NA miring dibuat pewarnaan Gram.
Staphvlococcus aureus adalah Gram positiI bentuk
kokus.


71

Pernyataan hasil
Jika dari biakan pengkayaan diperoleh hasil seperti
tersebut di atas maka dapat dinyatakan Staphvlococcus
aureus adalah positiI dalam tiap gram atau mL sampel
obat tradisional. Untuk sampel kosmetik dinyatakan
dalam 0,1 g atau 0,1 mL sampel.







  ,9: 20,8,3,,3 503:8:3,3 703.,3, /,3 5747,2 8079, 0;,:,8 /,3 503:8:3,3 7,3.,3,3 50,8,3,,3 502078,,3  ,-47,947:2  503:,3/,3503,,32:9:80.,7,274-44      #:,3,3/,3$,7,3,,-47,947:2 0-:9:,3 7:,3 / -/,3 503:,3 274-44 !  / ,3/:3

/,5,9 /-0/,,3 203,/ /:, ,9: 7:,3 89,1 ,3 90758, /,7 ,-47,947:2 :39: 203.0, 274-, /,3 7:,3 ,-47,947:2 ,3 /-, 203,/  7:,3 503,5,3 8,250  7:,3 20/, /,3 5070,8  7:,3 5078,5,3 /,3 89078,8  7:,3 92-,3  7:,3 : 549038  7:,3 .02,7,3 -,907  7:,3 .02,7,3 ,2:7  7:,3 34:,8  /,3 7:,3 : 89079,8  0,9,3 ,3 /,:,3 205:9  

 

503:,3 80.,7, 274-44  ,39,7, ,3 203/0908 .02,7,3  20309,: 0-03,7,3/,,:3,549038,39-49 :89079,8 /,3,3 
,3     ,7,07,-47,947:2,3, ,  $ 05:9 8:2-07 /,, 2,3:8, ,3 -07503//,3  -07503,,2,3 8079, 4250903 -070,3:9,3  -  ,3:3,3 05:9:/,3 7:,3,39,7, 7:,3 20/, 7:,3.:./,389078,8 ,,9  7:,3 5078,5,3  7:,3 : 549038  7:,3 : .02,7,3  7:,3 : 8907 7:,33:-,8 7:,334:,8  .  !07,,9,3 !07,,9,3 ,7:8 03,5  808:, 7:,3 3:5 8079, :2, 507843  ,/, 503,3:3 ,,-  ,/, /4:203  8079, /,-7,8 ,703, -07503,7:907,/,5,8  !07,,9,3 89,3/,7 232:2 ,3 ,/, / ,-47,947:2 274-44 /,39,7,3, 494,1  4;03  3:-,947  9,3,8 ,7  ,23,7 7 4  92-,3,3  8942,.07  -03/07  9:-0 207  ,3,074-. ,7  02,7 08  .443 .4:3907  430 70,/07  8509741494207  5 20907  5425, ;,:2  274845  803971:0  5509 5503/741  :393  58,:  803/4 85,9:, /,3,3 
,3  /  0/,/,3!070,8 !0325,3,320/,/,35070,8,7:8/825,3/,,27:,3:8:8  90743/8 9075,39,:8079,,/,503,3:3,,-  0  ,,3-,:502-,3/3 1  $9,3/,7,.:,35:89,, $9,3/,7 ,.:,3 ,3 -,8, /:3,,3 / ,-47,947:2 74-44 ,39,7,,3  ,72,4503/4308,0/8'  $9,3/,7,843,3/4308,  094/03,8,!!    094/03,8,!!    094/03,8,!!   


80,: 203:9 50,9,3 -0703,3 /,3

  

094/03,8,!!    094/03,8,$:50203   !07203084 9,:3  $:7,905:9:8,305,,! 4 !#      !03,3,3,38,250   !03072,,3 03,5 /4:203  /.,9,9 /,3 //4:2039,8,3 8079, ,/, 503,3:3,,-    !0325,3,3 #:,3 :8:8  808:, 509:3: 50325,3,3  ,2,3  ,/, 503,3:3,,-    !03:,3 -:,9$! /03,5$!!    !0,547,3 $02:, /,9, /.,9,9 /,3 //4:2039,8,3  /,9, ,3 8,, 9/, -40 /,5:8  4708 /,:,3 /03,3 203.4709 /,3 5,7,1  /0;,:,8 -0703,3 /-:,90825:,3    !03,785,3 785 8,250  /,3 ,785 ,547,3 /,9, 2039, /825,3 40 503: 80/,3,3! !/,3&/825,3/-,,3,3    $8902 0,2,3,3/,3080,2,9,307,   ,-47,947:2 274-44 /,-,3 :39: 203:3,,3 ,8 ,-47,947:2 5,,,3 07,  203:3,,3 503,2,3 07, 805079 ,.,2,9,  2,807  8,7:3 9,3,3 /,3 ,3 
,3  %/, -007, 803/7,3  /,7,3 2,,3  23:2 /,3 20744 / ,-47,947:2  50,9,3 503,3,3,3 0.0,,,3 07, / ,-47,947:2  8079, 9/, .074-4 202-,,,,3/72,:5:347,3,3     094/0!03:,374-44 ,  !079:3,3 094/0 5079:3,3 /:3,,3 :39: 20309,: :2, .02,7,3 274-, 205:9 5078,5,3 /,3 424038,8 .4394  50303.07,3  5079:3,3443 503,2-,30825:,3   


 

-  84,8 094/0 84,8 /:3,,3 :39: 20309,: ,/,3, .02,7,3 -,907 ,9,: ,5,3 5,9403  05:9 5078,5,3 /,3 424038,8 .4394  84,8 /0391,8/,343172,8 503,2-,30825:,3      7447,3820   0/:5,37447,3820 :3,27447,3820907/7/,72,0425447,3820,9: -,907 574944, ;7:8 ,,/,3.03/,,3 7447,38208,3,907,9 ,9,33, /03,3 0/:5,3 9,  -0-07,5, /,39,7,3, -072,31,,9 /,3 ,3 ,3 207:,3  0-07,5, 27447,3820 2030-,-,3 503,9 909,5,/,5:,,3-072,31,,9/,,20,9,32,3:8,80,7 
,7  ,,3 2,,3,3 907/7 /,7 574903  ,7-4/7,9  02,  ;9,23  /,3 2307,  ,,3 2,,3,3 207:5,,3 20/:2 5079:2-:,3 ,3 -, -, -07-,, 2,.,2 27447,3820  7447,3820 /,5,9 202-:8:,3 574903  2021072039,8,3 ,7-4/7,9 /,3 203,/,3 02, /,3 23, -07-,: 903  !0303/,,3 27447,3820 /,,2 -,,3 2,,3,3 5,/, 573853, -079::,3 :39: 202-:,9 -,,3 2,,3,3 203,/ 9,,3 ,2,  ,9,: /03,3 ,9, ,3 -079::,3 :39: 503,09,3 -,,3 2,,3,3  !0303/,,3 27447,3820 -07,79 203.0,5079:2-:,3/,727447,382090780-:9 ,3/,5,9-07,79 202-:3:,9,:203,2-,95079:2-:,39:803/7 ,8,3,93/,,3 3 /,:,3 /03,3 507,:,3 18 ,9,: 507,:,3 2,  !07,:,3 18 /,5,9 /,:,3 /03,3 .,7, 507,:,3 9072,  507,:,3 503073,3 /,3 507,:,3 5033,7,3 7,/,8  !07,:,3 2, /,5,9 /,:,3 /03,3 .,7, 503,7,2,3  503,8,2,3  503,8,5,3 /,3 502-07,3-,,3503,09   47144/,3$97:9:7$0,907 ,  47144-,907 7447,3820 907/7 /,7 47,3820 0:,749 ,9: 47,3820 ,320280,5:9202-7,339/,347,3820574,749,9: 47,3820 ,3 9/, 202 80,5:9 202-7,3 39  &:7,3 -,907:2:23,-078,7,39,7,    a2   


7/3/380./ 14949741 /..8: -.3 ..2-039:.9 /-0/.9 /..3148147 $:2-07 8:1:7 -.8.35079:2-:.3 0249741 .3 803.3808:. 8:2-07 0307  .907 . /.:./ 897:9:7 / :. :.2 $02:.3. :48./:.  17:948.7./.2/3/380 $97:9:7:9.3 .3.. -07:5.3820 907-.907 20207:.9 /:3.3820 .35079:2-:./. 47..2-:98.3 203:3. /.3/03.9958 .3  80/. 203.9:1.3:39::9.: /:5 9072.3.9...82.9.3 3:978 /.8. 2..3 80/07.2..3 203:3.0.3.8: -.7 /.9/.  2.3 203.7-43 /.34-.980-./.  2.5. 20302-:8 /3/3 80 /./.33.  8:748. 0. 80-.  :978/..3 803. 47.907 20207:.907/.3 43/8 3:3.7 /.3 907/7 /...-. 803.. 803.0..3803.907/.9 .33:978.7  $:2-070307 $02:.:2  2../.7-4/7.907 $97:9:7 -.70574/:8 /.43/8.9 .2.  1  /. 8:2-07 .-07:5.8.907 &39: 203:3.8:14949741/.9:39:203:3.948.3-.2 .5.3.3 / /.. 2.. 8:1:7 47.   -  $97:9:7$0.7-4/7..3/507:.2 8945.92.347.3 .  09: 90780/.0.5. 2.7-43 $0-. 8:2-07 03073.3.3 808:..8:2-07 .3/::7  !078.   $:1:7/.    .9/.3 /80-:9 1..-:3.907.3:9..35.7..3 -. 48...3 803/7 ...3 -0-07. .97:2  .907 /.33.3 0/:5.5.308:2  2. .3 .3394/.../.907  .907/7/.  80/.3  -08  803 902-. :38:7 4. -071:38 80-.30249741   .7.5.9 /:3.. 9:2-:.7 8:-:39 574903 ..9   &38:74.3202:. 80-.7... 47. 8:1:7 .2 80509 3.3  $:2-07148147-.3 .9 805079 803.39072.8 2.3 203.3.: /:5 9072.3 0249741  4949741 .5. 803.3820 .: /.7-43 5.21481.340-..58: .03  ...

 .23 :39: 574808 209.3 27447. 70./. 8::   S  0-.907.8 080:7:.. 5079:2-:. 574808 209.3 47.3 0. /03. 9-.2 0897.907 :.3820  07././.-039: .7..: 70. 202503.8 3 /503.3 3:978 /.3 808:.947032  $02:.3 -.5 850808 -07:-:3.9 :.745.3 -. 5.7: 40 8::  2.3820 -078. 8:: 703/.-4820 /.: 5079:2-:.7 03.8 5079:2-:. 203:-.   $0. 5../. .38 40 809.8 8..7 5079:2-:..:/:5-071:3880-.2-039:..3 .3. 9:2-: /03.9-07. .5 5.3 708543 907. -..8  -.3 -.3.3 /..9 /503..3.9..3 :2. 9:2-: 907-.3820 -07.   '9.. 8.8 0.5.907 202-:9:.3.33. 9:2-: /03..7.9 /5.3 574903 850808 .8 0-07.9..3 50393:39:203:3..8::4592.7: 5.3 -07-0/.9 -07.3.3 8:: .3 43/8 18 .2.3 /.23-. 5079:2-:. 4592:2  0-:9:. 54.8 5.39:3 5.9 /03.2.3/./.2.-4 9079039: 247144 80  $50808 274-.8:: S. :39: :9.5.7: 40 8::  $:: :.3 89.3 -039: 907245.3 3:9703 .2 8.5.907 /.3820 .5./.9 84.3 8:: /.-9.3 808:. 8::  S /.3 0-. -.3 20207:.23 '9./.9. /2.   S  -039: 20845. 80  7447. :39: 9:2-:  /2.3 9:2-:.8 70.3:9. 9-.3 -07503../.8  .1.. 8. 949..7.3 43/8 3:3.907 -07507.3..7.38945.  $:: $02:.7: .3 .   7 7 5./.33. .9473:3.82.9. -039: 58.3 07. 70854380  5.8 2. 574808 5079:2-:.8-.7.3 -. / .3 /.907 .3 47.3 /. 20207:.8.2 574808 209.3.3 /825..  $0.. /./.3 /:5 -0-.3. 5.3 /::7 /.3..:   ..-43.9 /9407.703.5.:39:-07-..3 8:: 80.3.3 8:: 4592.3  203:3:..3 4592./. 20845.

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

3 8508203 /03.3 :97.907  /./.3 :39: 20309.2 574/: : 207:5.9203.3 /50740  28..  903 274845 009743 202:33.3 .:5:3.8. -07-.. .07.3820     74-.3907/.:.3 274845  -./.2  0  $:8:3... .7:8 /507. 17.: .3 /03.25.9..9 :8:8 .9403  . $9.2.5..327447.9.-47../.9 574808 574/:8  43943.94039.3  .3 50.9203:-..3 27447. -.9.3 :39: 20384.3 3/.2 203/0391.3 2.5.32:7327447.3 20334:.907147.7-4/7./. :39: 2032-:. /.27  /..907 5.8 4254303 4254303 80 . 2030-.3 -..5.3 /03.  !079:2-:.35079:2-:. 038 8. 903 90780/.72.2 20/:2-. .3-.3472.-.8 0..8  !03039:.9.-07.9: ./. /03.54... .3 549038 8:.3 .3/:/.3 202-7..9/9:-:2..3 7.5..5. .35./. :39: 202.3 503.3:39:203:3.  0-07.4.:8 ...907  &39: -.8 :7.3 203.:70:8  8.9 /-0/.2-..909.:.947 .5.9 /.2 ..3820  .9  /  09.2743  -  :978 !03039:.9: -.92.3 80 /.-4820  0-07.73.3 503.3820 .33...947:2274-44 74-.3. : /.3 -.3.3. 8..:5 .3 /: / .3..3 274-. 274-.  8.5...32.  471448 !03.4    .907 3/.3 3:0:8  /.: 9/.: 9:2-:.8 27447.203 /3/3 80  -.3  1  !.3/507:.3 5741 5079:2-:. 8:.7 .-47.3 -./ /.39:. 2.947:2 274-44 !  203.3:8.5.. 5. 274-. ::7..3 .9./ -.3820 !03039:.3 /.3 507:-.: 9/.947 /.  07-.3 8508203 274-.73.907 3/.3 :8:8 /.3 274-./..25:7.

9 /2.. /902:.907 ..8.147.:70:8 207:5.3.3.3.3 0-07..89 2030-.3.3:8.2 04254 805079 -:..39.4 8.25..7  8:8:  2.2. -.. 9.3 .9..393.9805079/:3 903474.:9.3 .074-/.:-3. 3.3/3:3.9073-07::7.3:8.07.9 . -078547.3 5../8547..3.3:8.91  -0707.-.02.  9/. -40 . 80-. 5. .7  909.  $9. $:: 4592:2 5079:2-:./.9:7 4592:2 S /.380/07.. .2 . 47.2./.3.-078547.    /.3:8.. 2.074- 1.5./.5.3 207:5.3820 47.5.3 -:.3 5    $ .39:-:2.. 503.91  203.32.  0781.3 7.9 / :/.8: 0 /... 5.703.3 .3  .8.070:8 2:/.070:8 . -.3 2.3 0.  S 80.4.4./.254891 -07-039:-.07.-.9.9.070:8 207:5. $ .5.3 .. 8.91.  /0-:  4947./.2 30.3-.   2039  .074-/.3 a2    a2  7. 5././.370807.907 3 50. S  .91 /.3 -. /.9./.- 907.9 -0707.3 /03.2430..3  !03039:. /./.703.4 5. /.4.:3574903 .:8  80/..070:8 :..7707  $ .9 .2039  $ .5 .3/-07-.-0702-.7./.:8.9403 ..5 /.: 507..070:8.897.3:2  ..39.3:8.:8:82.2.3 /.54.8  $ .7  -0781././.80.4./.2 2..907 5./.3 5.39:2-:5.39:2-:-.5..  .47:9.32...3 .7..8.8.070:8 5.3 89.:8  $9.  8..3503..::5 0-.3 5.2.907 3 /. .3  8570  /.9.3 -.907 .2. .  /..   .3-08. 902507.: 4343   a2  /.8.33.9 28.2 574/: : 9/.070:8 9.3:8.9.9..  -  . 9:.3 502.3.7.8.3820 9.9/902:.:8.25:203.3 /.9073/./../.3 39074.3. 2039/.9: -. 80-.:8 ..5.9.3 -07-:.  .507-03.7 545:.3 2.3 -07-039: -:.070:8 907/..3 8../.3.3.:0.3 9078:8:3 /.3907.3 :9  .37.7 23:2 /5.2-:9 /.507-03. 8::  S80.9 -079.3 5.:70:8-0781.3  !03/..3.9.91..5103480.  0..3 -03/./.3 0390749483  202-0399: 8547. .3 502..3203.9077.8  $ .54. /..3 9/.$. /. .5 5.  .3.5./.8.3:7  $ . -078547.:9.907 7..39/.2 54891 ./..3-0-07.

8.2.  909.4.      /.3 439.9 203..3 203.9: ::33..:8:748.9./.502. 43/8 .2430.  /. .7 /.:7. :39: 20384.3 ./.3 /:5 /.3  a28.3 / :.3 $.0.3 203..8.9 2030-.9 ./.9 40 503073.9 /.0 / 8.907 3 :.9./.948.9 80. -.3:8.3-.3 .4 /. /..8.9.  /  $.25.5073.3.83    4897/:2507173038 4897/:2 507173038 -07-039: -.3  207:5.8./03.3S80.2 /.2 ./.3:.7 :48.-7./.207:5..07:348.2 .3.  -07::7.3 3108 /.5 .2430.907 7..2-.3 5.3:8./. 02488 5. !80:/4243.074-  .8.3530:243.3 5030-.  .9. 50.074.8.230.3.5 8970594283  9097.9075.91 /03.83  47.3.  907.72.3-.7.3 /.  /:5 5.8.  $.2430.348.  a2 0707..:-3.9403:39:2.3  $.../.3. $.9.3  /02.8./8.7 .3.:7.3 8::   S 8:: 4592:2 S  %:2-: -.3  1  '-74./. 90780-:9 02:/.39097. 5.. $.90  . 20/.3 / .3.7 -.9.9079039: 28.3 803.  /.3 -.3.3.05.907 3 -078:2-07/. 5.8.    507173038 9/. 9.038. /.907 03907 .: 5.7 40 .3/.  0  !80:/4243. 3108 8./.3 2. 5..5.91-07::7.2021072039. . 9:2-: .39.95.907 3 -039:3.3 8547.58970594283 47.7  9.2.9073 202-039: .- 3108 :9. 507-03.2579/.0 .8 . ..2 3.9 /902:.5-.3  a2   a2 ' .3 ./.2039 ./.9:2-:5. -07-039: -.2 /. 8.3.90 84/:2 /084.397003 84/:29097.9 -.3 .21034/.407.9.39.07:348.7.-.3 80/07.3 -08. :39: /9.7 202-0:5.5-.21034  /.3907.5./. 2./.7/.3 -07:3.3 1.9.3 2.2430.9:2-:.943..073. 8079.8.5.2-. 202574/:8 $ .. .8. -0707. 43/8   . 5072:.3 02  203398  50794398 /.907. 95 207:5.2430.5074/0...  .8.3 3108 / /.. /..2./.7 8.8 /.2430. -034  805079 42.3 /.3 :.407.3:8.2 20/.907 3 9:2-: 5.3 2.7 93.9    .2-:3 !0.07.

3 5.32.398059/.2430.5.3 :7... /./.3820 5.9.9 .3:7.808:.3-. 8.: 2..9.3-07-.85 $0.3.3.:..907. 8:: ..3    .5.3 90790.//:.8::.$.2.3  a2   a2  !.390790..9 20./.38073/:25.9:9483 0 /.. ..:8050797.8 07.3 8.5.9/-0/.94 097480 .9/..32.703.3 494.9..2.9: .3  89.33.9.9.9 20302-:8 88902 5079.39.8.  .3/083109.. 72 ./.3//.3.78:2-07503..3.29:-:/. 202.3/.3 /03..3 ..3 :7.9 2032-:..3//.3.73.8:3.9.3.9 907.8.947 .3:39:203.1 5.3 :39: 203.27      038503./. 3108 /:3.29:-: 8.9: 2..8/:3. -07./.3 .38025:73.:3 -49:3 /.5.8:.8:3.3.39. /..947 1.3203.7  .3.7.3-.7..: 2.2039 $547..27-07-039:4.9 .3 -07::7.3 907.3 203:3..3.3 /.38.7 2. ! !49.8. /./.2032-:.7  ./.9.7./ -.23.39:-:  /:5 /.2 .5.9 .30.38 .09.8 5.3 . .33108/.9 /2.3 :7..3.3 -07.3 /3:-. /..    850:8307 8507:8 307 207:5.: /. 20/.3. 2032-:..  !74808 202.3  50325. 503.2 9:-:  02:/..90250-4370   ..9.8274-.3..3 /50740 /.9. :3.3 /.3 907.8. .9:  3108 89. .:3.074-  $547.3. 0.-.8:0/.3 -0702-. 503..2:7 . -078  ..7  080.-.3 /.8 -07::7.5...3 2.9403 0 /.7.3..5.3 9/.33108 .3 /.9.7  907-039: 443 :3.3.9   .2503:.  ..3 -.9  2.-. .33. 503.: 2.8 .. 8:: S 80.7.9439.7 8:2-07 .8079.9: 27447.5.-079:3.85   3948..3907.9. 2.:3-43705.3 5078047.37.8.. 8:..02.33..39/.3948..3.2.9. ::7./3.3 -08.35.

3 .3 .3  8488  /.7. /.02.  !079:2-:.:8 /.3/03.:3 ..3 .33 . 907.8::.2430.3   $.3-07.  . .802:.9507:9 ..3820 0.5.:70:8. 2.3.9 .  0-07.3 /. 503:3.5.:.:../.54..3 .3 .  %0731083.3.3808:.:380.3.3 -.9 8..3.3 274-.8$9../. 07.3 07.3.3 !.::5 93 /.39.3.2430.3 .:3. 03.8.2.8. 40 $.::5  %.2 8090.02.3 5079:2-:./..: /:.3 203/.9.3 5.9 /:7.72.25.5... ..35.02.3 /.: /80-.3. 2.-07.3.7  %07.:8 .2.2 8.9 .89  9/. 8.2430.3 274-.3 203..7 .2 5:: /0.3 7.3.35..3 -.2.2:7 /./.-.3. 4092-:3.33. ./ /80-.3 -07.  .9: /. 43942./..8.3-./.3 /03.79 2..2430.:7.2-. 850808 .:3..8 8050797.3 .3.3.9.3 2. 8.8. 2:./.3.88 $.9 /.4..5.3 40 9072.3 ..: /80397 .7 205:9 :0 :0 .3 203.:2:23./3.7.3:7.3 907.3 /50740 /.32.3 805079/80397 -.5..38.  5:83  2:39. 03..3  .7. /.3 2...3820 9072.: 23:2.3 .  /9.88 207:5.3 7.54.5.3 -07.3 502-039:.3.0.3 40 2747.35.8 5.3 907.:8 /.4..  27447.3 :2:2 907.3 40 $9.3 8.99072:83...::5 .  /...3 .3:8..3 8::  0 . 0390749483 ..3 :39: .3 3108 40 -.038503.:3  !03.3 2..257 80.3.02.3.3  !0325.70 2:3.3  :/.8.3/:3 8:8:  /.8: 5.2430.3 :8:8 -08.390:7    3948.3 .9507:9 203/.25.2   .. 0.7 503.3 203.7  .3/.7 8:2-07 .  0.3 9/.8.9: 2:3.35..8 .3  80  7. 2.3 . 03.3 9.2 .. 503097.3 8:: .807 .9 .3 40 438:28 2.3 20307...8. 9:  50325.990780-:9/.7 $.33..2:-.9.3 .:3 -07. 202-0/.  203. 0.3 ...9 507:9 .4..-.8::-0:  .93 073  20390.  0.:5 507:9  :8:8 .390780-:98:/.72.2.3 .9:./..3-.9  202:/.02.907 $.3 .:3-49:3 9/./.. 8050798:: .:.9..703. . 907-:3: /.3.. 503.3./.8974390893..3..

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

3 /.3202-0:5./.7 443 -.97:247/. 548.2 20334:.7 025:3..8507-03.7 ..8.3907-.9/03. 7:29  /50740 /...380/07...  O !05943 07:5.3 207:5.3   505943 /./.7.9 .3  O 897.8.37.7.393   !07-03.7.3 :39: 20250.2 2.3 50393 /.9..7/.78:3  O .8:: S O 0. 8:: S  202-039: 0 ...7     ..3 -.502-039:.3 42508  507-03.3 507-03.907  !0393 /.7   ..23.7  O 7 505943  /-:./:  /9.3  505943  3.3 :8:8   !07-03.9 507:3./.7 5.   -  %::.32030897.  .3 80/07. 5.2-.3 2039./.9.7 0897.3 /.8.7 203//  03. 0.93 ..35..7  8 507-03...9.3 503.3 803.81..3 -:.7 202-039: .0/.3 0. :39: 203: 02.7 7:25:9 .03 203:3./...9 /03.2 203.3.907 /.  507-03..32:73  O .25:.7  907/7 /.3 .. 8::  S/.3 .3 5.5. /.907:39:203/.93 90780-:9  .3   3.97:247/.3 032 /749  28.9 /03.3-.2 .3 203:3.3 ..3.3/:3.3.3 .93  07:5./...3 9074/7488 80-.3/03.3../507-03.793..3 :9.3.3 574903 .39::./.3 902-:8 .3-./.8.. 507-03.3 /7488 4.2-..3 574903 .7 .3-07/..2.  -:.7 5.203.3 /.5.:9  03.3/74038:1/. 8:: S  !03:3.3.3 /-:..3 /03.. 507-03. 50583 97583  5.3/49488. 80-:9 :.

9 .3 .3./:9097./ 8:1/. 8:.3..5...9: 950 -.3 843 .9 9/..3/507.2  O !07-03.3 .380091 !07-03.4.2-07. 95 2070/:8 -82:9 8:19 203.3.4   /.3-0-07.9 81.3 507-03.7.3/107038./.3.3 4394.5 2025:3.: 8.3  !07-03..3507802.3/:3.9: O !07-03.3820.8 -.7  0972/0 .2-.947 . /9039:.3 -07:-.3 -0-07.907  4394  507-03.9 .9/03.. 9079039: / /.350309..3 :39: 0507:.907 ./.35.3/:3 .5.  !07-03.7 .39::.33/.47.9:507-03.2-.9078.3 -.83 .3 203.3-.../-0-07.. /03.3 9/.3/:3 3/.3820.9.7 .3:..3/9.9897.9 203:2-:./:80039 ..947 .3 :8:8 .73. /03. !07-03.3 9:2-: /03. .3 /507:3.7.:90:7 4394.25: 202:3. :.7  O !07-03.9  O !07-03.2 .5.7 $././. !07-03.3  9079039:805079/.  07:5.9..39:2-:0--./.. 2:73 /.943.3/:3  :.8.3-:.23. 8..3:8:8 /-.75. /.9 81.38:.947 !07-03. /9:2-: -.    !07-03.3507802.3/9. O !07-03.7 -078.3 203.3/:3.73. .9079079039:   !07-03.907 .9503.9.3 ..95.3..3..3   !07-03.:907.2.9 .3 3 /.907  909.3 3 /-:.: 203.203.3  .3/08484.8 -.3 507-0/.9 .3 /9.7.342508  03.2430..3.9 . 81.9.9: 47. ..9 4394507-03.9 .9 2.703. /:3.   .3 2. ..3:39:9::. 807:2.9.2-.2.3 81.943. 038 -.7/.5.9.3 3/.84.: :39: 203:3:.3 -.3.9:8:8:39:502-.7  3974-.3 .83 2.3 /.3 .9.9  O !07-03.907 .2-.344385081-07.:.3 8:8:3.54.8  4394  483 0903 :0 . 81./33.9 2..

8    07-.54.3/0343...  /2.3/0908-.707  4 %0:790  :39: 84.5.9  O O 5 ] 5.3 -. 57. .2 .3 147.8  3..8 80091 /..7  83  3.3 $9.7.5. 3 203.1444...907414725.3 //089 032 5.707.97:2 57:.8::S O 0:3.89097.574/:5./.3 90:790 .3 202-039: 443 9...8 .3 //089 032 5.3 /.7 -:.3 :39: 84.3 8:8:  . /./.7/!.5907/0/7..:8 . :8:83.3  /.803 .3   7.3207:8.8 .3.-7..39./.3 :9 9.8::S 0:3.397003.33.: .3820.3 .8   .7 70/:8 90:79 203.9 5079:2-:..4./.93.9 .3 03:207.7 !  O 425488  . 0.9  .73.370.8 9:247/. /.:.3 //0890325.8 89./.370.9 /.54..2 /..:2/74031481. 50.507-03.3 9078.../ 90:7:2 /03.7/ !.948..8::S 0:3.  0/.4..3.:8  $9.3.3 /-.8.3 9..8:.3 8079.-033.3  02:/.370.97:2 47/.3 57490488:3390:7   :1107!05943..8 $.3  ..3 83 80.3 . 503.7  /.2-. 80091 203892:.-:3 :7.2.94800749   O 4254880250/:8.7 ! % .3 57:. 0.93 .7.854891/. :39: 20309.397003 O O 5 ] 5.2430.22../. -. /3.502-039:.27447.03820/.3.9  O 5 ] 5. -07-.3 574/: 4.8   209:2-0107 Y  ::743/..3.7 5705.3:39:503:.907 !  O 425488  0.3/:3 9:2 47/.-.95488/..9 203.8 5079:2-:.3.97:2/74031481.3.3  20/.

/. 443 0. 2021072039.91 -07/. 207.:8:748..9.3.:.3 //089 50583  .3.  .370.7 10808 . 443 207.2430.7   O 425488  ..:2 /7403 1481.9. .3.8-.3 //089 032 5..8./. 5.8::S 0:3.7.948.  0.1034 50.397.9.8.8  3.3 9/./. 5:9 /./...8 3438:748.948.7..8 . 0-07. 80.89 097. 574/: 5.  :8:83.3 1072039.:!80:/4243.3  84.3 /.3 .3/107038.3 4.3 1072039.:73  O 5 ] 5. .9  3. 443 :3:2:/./. 2:/.-:3   7.7   O 425488  .948.7   48309030:0.2:3.7  .3 /03.97:2 47/.4  2:3.97:247/..: 80-.907 .:33.8::S   .7   8893  3.8.:5./.9.: 80-.3//0890325.8 .397003 O O 5 ] 5.7  .73.3 ..  80.4.1:47480385.  ..3 $ 95 /.948.3 2021072039./.8 80091 $.  8:748..803.  .8/..:80-.384.2 0-7:.90703907 7..3 $ 95  2:3../.3/3/.948.8.  8:748.: 8508203 .9 2:3.: 80-.370.3 0..97:2 944.:.3 //089 032 5.2430.:80-. 2:3.397003.7 .3 8:8:  $.907 .3 /03 43.907 ... 207.9  .948. !7490:8.8 :48.73.443 :33. 207.73.8 :9.: 209.9  0483   20903 -7:  O O 5 ] 5.  207.385.  3.3   :/%4. 5.9 708.9.4.3  8079.5.3 2021072039.-07..341472..803 . 443 .-7.3 2033/.803 .  ..370.S 0:3..8.9.900/:2 %  O 425488.: .3/0343.  .948.  ./.2 30.  9.3  .33.4/.8 /.8  .

2 /. ./:5 /8.8 .3.2 .8  ..3 907-039: /9..074-  :3..3..3 5079:2-:.250:   .5 -7427084:3:  O O 5 ] 5.803 0897.3  :9.073.3 ..8.3 //0908 40 3/.09.0741  /./.7803  207:7 /.074.8 80091 -.3820 07.:7.9 /./.-:3 :7.3 :.9.3820 . 7. 274.3 42543034.907 41472 /.3503..:7.8 ..3/:3.5:3  ::8 8:1/7 5.8.5.  0893  O O O 5 ] 5. 3 :..3 .3  0897.. 803./.948.7 -0-07.8::S .370.3 .3 80091 80.//.3 . 907/07.8.2 : 89079.4..3 O 0..28.  . /.  .3 /.3 :.8.S 0:3.9.3 3 203..9.8 .243:2 :.93.3820 07.3 09.3/:3 .  20/.5 2033.3.7.28:8:/.3//0890325.::5 -.3 .8 27447. 2033..3 84.3 /.33..947 -7427084 :3: .8 /.07: :330.430749   O 4254880.907 8.3 -07:-.73.907 .  3.7  O 0.790307 /.9 27447.25:3 40 9. 850808 -.074- .2 /.948.  0250/:8.3820.3  :9./ :33  250/: 8.8.2-. -071:38 :39: 203097./.  .3 ::8 .2-07.074-488 ..20/.9/. /.3820 07..9.073.8 .3.7/.3.7:9.3 505943/.8.      .3 203..3 .  O 0:3.97:2 -8:19  3.9.3574/:080.03 5070/:8 944./.3 :39: -.3 88902 203.23 . 3:978 .7-. 203. /.3   09003749   O 425488505943/.3 0.3.8 203.97:2 47/.39/.

3  20/.7 ! .2430.8::S 0:3.073.97:2 47/.3 032503.3 .9  -001097.943.  0.3 %%3  O 4254880897./.4-4.803 3.380/927447.:112.97:2948:1. /107038.   :9703.8:2.9 4-0  -7.33%097.:39:-.078..8 :39: 574808 503..397003 O O 5 ] 5.   :07 .7 505943  3...7   O 425488  ..8::S 0:3..7-43.3   20/.89 097.3 :3..9 O O 5 ] 5.9 3. 5079:2-:.2.97:2 47/.3 907:9.3/7.907$. :39: 203:2-:.38209079039:   !. .9.904./..904:39./.

7 8079.8:2.907:220845.9 202-039:8547.303:207.8::S 0:3..9 -.3  .370.3 .7  .3 //089 032 5.803 ..8::S 0:3./.7:9.8-.7 !  O 425488  :48.89097.%759430:.8 /.7 %  O 425488  .-. 0892.3574/: 4.-..27  .:88:-98   !49. 503:2-:.7-4/7. 9/.3 /.9 /..8 5079:2-:.9 5079:2-:.7 039..2 9.907090749741/:5/.907.3094-.3 703/...5.907:2 . % /:3.907 . .797.7  31:8 039. 5 .94097480./.80   050/072/8 /.4800..2 .3 /.:2 0/.8.9 O O O 5 ] 5.27 0.33.3 .907  3..3 70.3820 07..3/.8  0. :9.3   .3 5020. 80..  31:8 .  .28:8:/.3 :39: 20.5.9.3 -.9 :48.9 203..38:3 /. O O 5 ] 5.3 .7..303:207.-0/.8/..3.3:9.3 /9::.2-.8..3 20338.7.8997.5....805079.2:3 .5..

4:39  2..9  2.2430.0249.97:2 -8:19  0.  . :39:20302-..3 1:3.3.5 3.8  80039 .3 5. 08.  :39: 5039:3.2 20/:2 3 80..308:2 47/.7 %$  O 425488  8:748.3 80/9 203.2 20/.9  3.3820 07.97:2 47/.7 -07-.33.8::S   $003908930749 $  O 425488505943/.3 39074.55.3 0..9 /...3 $.907 41472 /. 5 .8.9 1077897.90 7003  /.8 80091 '-74 .5.  505943 /.503..3 -.8 948:1.97:2/740380039  O O 5 5.8 80.907003 O O 0:3.7  3.7.8 203..2 5079.3 '  5. 20/.3 /.0.2-.247544   #..803 8893 .71481.407. 203/::3 5079:2-:.3 3433  O 0..803 ././.3 39074-. 3:-.9 /.  3.9 3.7. :.5  $0/.3 $. .3 ..5479'./.4.9  3.3  84.2-.  2..S 0:3.2.9 .320/...3   %48:1.900$.  $0039 .3.3. $. /./8$4.7 8420..308:2 47/.9 5079:2-:. 0..3 //089 032 5.9 924-7: -742924-7:  O O 5 ] 5. #'$  O 425488  505943 /./7.  4380397.5./...2430.3 !80:/4243.  !7490:8  /.907./.:8 5.9 5079:2-:. /.9097.9  ...7:8 /-:.8  . 503. :...3  80-.9 5079:2-:.97:24.    :38 503:2-:.:8 /.2430.8::S 0:3. -079.9.   .7./.. -..:2 /7403 1481. 3 .3820 07.9  /. .3 2.2430..73.3 897.97:2 47/.0  250/:   .2-.370.97:2 897.  /.7.  2.89 097.3 93 8079.7 8420.3:39:$.88..3 //089 50583  0250/: 8.395.948.3 203... 8508203 3 /.

25:7.8-07-.5 /.:7 !7490:8 .8::S 0:3.  0/0.9 20209.  .. -0-07.907./. .3//0890325.  . .3 202:33.9 9:2-: /.73.3 202-039: 443 -07.3820  %759430.9-.:2 /74031481.803 .3924-7:/.3:9.907 41472 . 2030.370./ :33 8. 203.9 :48.9 907:9.  O O 5 ] 5.8  .2.947.03827447.8.4..  8.5.3 4. /.5..3 9:2-: 9/.5. /.-4820 8:748.3 -07:-. :33 805079 443 '-74  %$ 203..:.3 54891 8:748.3 39074.8..8 3.3 .9 . .73.370.3/:33/.97:2 47/..2 907-039:2085:320/:23-0781..9   %759430$4749 %$  O 425488.3-742924 -7: .3 //089 032 5.3.

%759430749 %.

8 3.97:2 47/..9:3..370.9: 57480/:7 4507.3 /8:8:3 -07/.9.: 4250203 /..3  207:5..39-49  .3 -07/.30038.3.3 274-44 50393 /. 8.3. O O     % !&    $:2-07094/0!03:.3 8:. .2   .3 274-44  !03:.2 809.3.9 97./.3 2.8 574/:8 3/440-07-.!03...  .3.9/.320204254503:.8.3.3//0890325.3:39:20309...7  8.3 ../843.3 2.72.3 20/.:..9 080.3 .7.//.3820 ...7.8::S 0:3./.8.3  48209  4-.:..843.4540.4503/4308.9:574/: . 503:.3 -070/.803 .3 09039:.8 -.3 274-44 .%  O 425488. -..3  .'   &390/$9.5 4-. :39: :9./.9.3.90!.72.5 503:.:2:9:/.9 /..03827447.38:. &$!    5 ] 5.3 :39: 203: 809.: 503:.

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

89 !.3.2504-.3 :7..9 ././843.3 . 502-:.250  /.3.3.25048209 4/10/09003749   O $..3..3/-:.3-07.250 .997.3 /03.3 .3  %7.3 93.2.: -03/07  ./..-9.5.8.3.3 .9.  .38073/:3.907 80.28.3 :39: 203..3 80.7079.350303.8059     .3 /.3.9 424038...3 8..3 424038.5.9:.  . 5078.3507.8    /.907 !  !059430:943:/ !  O $.3 .3 /03.9/.250 .9.8 9073/:3 40 5... ..323:2.8 /.3/.  :39: 20250740 /897-:8 -. 48209 -.3 203:3.9 424038.8./. 574808 502-:.38.3 /-078.5.//.3 80 80 -.9 97.250 .39.44 808.9. .     !078.3.8907.07.3 ...03 0. 202-0-.8 .. O $.7:9.80.38.9070- /..3 .3:39:503.078907 /.30 !059430 .. 80 80 -.3.3 /:3./.3 203:39:3.9.83.9.8 8.1  92-..3  48209  /.44    02:/.5.3 2:33 ./843.250 /./.5:3 .3 808:...3 02-.3  .907 .9 . -.:/. 09003749  !059430:943:/ !     8. 503..3 .91.8 $...250:  !7385 /.3    58. .25:7 -03/07 .250.-:7032007  9./.7.907 !  :11070/ !059430 ..38:/..7 0.907-:.3 /03.9..3-49450303./843.7  /.703.:  ..07 .3 2.3 ..5.3 .3 4-.9 /8907.907 .9 050.7 424038.9 .89.38:3  ..5..:: /-078.:5.207.2 . -07:7.5 -:3803 8090.3.790 8.-:370.2502..7./.: 4.9.  .8 8942.250 2.3 8:: 494..7.980-0:2503:.75:  803/4 :393 85./.8 8. 43/8 .85.

.  02:/.07 .:.03 /.8059 /92-.:.3424038.3 /-:..-494.25.3 /-078. /50740 8:85038 /03..8059//0.3 .07..8059//0. /50740 8:85038 /03.3 ..3/9.07 /4.3 0 /....-:7032007.4 80-..3 /03.3.3 0 /.220.. .44    02:/.  -  . ..9 03..3 50303.3 50303.3.  .3 .  ..80.:5.3 8.  02:/.93.30/.8907.07.7..3..3.3-039:807-: 03.9.3 ...32.. 8907 .3 .07  /4.3 50303. 42403 803.7 ..4 8. 42403 803.3 .7:9..3 /9.2-.3  2 . . /50740 8:85038 /03.  02:/.07  /9.7:9.2502..350303.3-039:.7./.3-039:039.3        ../.3.3   .: /92-. $:2-.9.3   .7:9.3 /03.3943 8942.07  02:/.3       .3 803.3943 8942.3   .  /03.7.44    02:/.3 $.2 ...5:3803 .3.3.8059 /5509  2 .: 9:9:5 -494 /-078.2-.250   424038.-: 7032007 .8059/92-.3.07.48./.5:3803     !7480/:7/.250 /4.25./.32..2 .48..3-039:5.2-03/07..:../..7....2-.07 /4.03 !072:.3 50303.:5.9.80. 03.350303. /50740 8:85038 /03.:..3 50303.07. /.3/-:.3 .88.250 0 /.7.3 808:.3.350303..8059 /5509  2 .9 .9.: .:5.. 42403 803.3 /42403.7:9.2-.3         .2 .3808:.3/9.: ./.9.3943 8942.07.3  2  . 8907 .88.7.9.93.9.7.:5.: .3        .25.3 808:.

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

790.. .:5.7 8:5. ..::/07:880.3 ../507408:8503850303.8907 .:5.8059 /92-.. 8.3 /2.07.07.: :3938907  203..  9./507408:8503850303.3. /50740 8:85038/03. /50740 8:85038 50303.3-039:807-: 03.25.3   2 !  ...3   2  ./843.250 :7../.3 /42403.07./.2-. :2.3 0 /...8059/5509 2.390703/.8059 /92-.3 /.4 42403    $0/. 80:7: . 02:/.8059/92-.... 8907 . .3-039:9./-.250 -039: 7.22479./.7 .3 8.7.7.:5.997.  /9.:5. 203.8:.3-039:7.8059 /92-.7.7..390.:5.2 .3 03.3 803../..3 0 /.3  0 /..2-.07.3 803.350303./. 8907 ..3 808:.8907 .3-039:.2 .2-.7.:7 803.3 808:.3 0/.-09/..2-.2 . .3.:5.2-.. 503.07.58: 03.07.3 50303.3. 8907  /9.3 /4.3   2  /42403.:7 0- /.2 ..3 /.3     .3808:.3-039:. 8.3   2 !  /4.3    $0/.7.3 .3.2504-.3.2-. . /9.58: . /9.../54943 54943  /03.07 /808:.3 50303. :3..4424033..3 /9:2-: /..3     .3 3..2-.3 -.3 0/.3  2 ..7:9.3 ..8059//.   $0/.25..35 03..3.7.2.3 /42403.358.:5..:5.250.07 803.3    .2 8.3     $0/. /9..3 /-. .3 ..3 808:.3 0- 0.. /50740 8:85038 50303.3 03.  $0-.2..3 .7    $0/.7.3 /54943 54943 203:3.3   2  02:/.3    .7     2.3 2479.3        424038.3 8:.8059 80:2..88.3   /. /50740 8:85038 50303..78..7..3 .3    ./5.3 .30-0.

3 /03.07484 .3  /808:. /50740 8:85038 /03. /9.3 9070- /.7 /..2-.  $090. . /9.07.33../:  80. /9./.3 2%003  8907  /.5. 8907 .3 808:.07./../507408:85038/03.3  /..:5.7..3 50303.2-. 907-039: 5.3 /.3 2 .3 0 /.25048209   $0/.3-039:72/.2-./.3        .:5. /9.3   2 %003   /.3-039:.3:93.2-.3 /8025749.2- /.::5..3.    $0/.3 3.8../.:5. .3 50303.3     424038..30/.2. /9.3-039:.3:93.3 :25.7 03.:5.2-..7. /9.:5.: 8907  &39:.2-.7.3 3.:: 203:3.. /507408:8503850303.... /50740 8:85038/03.89.07 /808:..3   /.3 /4./: 42403 3.:5.::5.3    .2-.3    .8059/5509 2.-:3 .88.:5.3 %003   8. 03.3203.7..07..3 09003 749 /.3203.07.3 0 /.3 .:5..9 /.3 808:.8059 /92-.3 .3    ./.3 808:.442403    $0/.3-039:72/..350303.3 . /50740 8:85038 /03.8059 /92-.07.  $0.3 5.3 . /92-./.3/4.3 /9. .3.350303.8907 .3.250:7.3 /.7.:7..3 80:2./:  $0..3 0 /...3/:323. 03.3/4.3  2479.3 /. . .4:20 . 8907 .3 .3../.3 .2 .9/.:2.2-.44    02:/..2 ..7   2  2.3807-: 8./: 42403 3.  .3 3.3 2::9 503025749 /-078.2 .3-039:5.3 /.3 808:.3808:. 8907 ..2 . /507:.4 42403    $0/.3807-: 03.442403    $0/..3 50303...3/:323..3   /.8 -07.3 0 /.3 /.3-039:807-:507:/9. 8907 .3:93.8059 /92-.

3  48209 /./843./:5 8090.3 .3 5...3 /9..3:93.907 .3 9070-/.3  /.8::.3 /.5.3    .3 443 -.33:5 094/0 3 /:3.../..02503%49.8 %7503%097.   !7385 !079:2-:./843.074- 20841 /.3 .7 8907 80.2-.3 808:. .:7..3 :39: 20309..8059950.074- 20841 .89.9 /. 8907 .3 0 /.3.7.3 203.3.7 .3. .3 /3:-./.3203.:5.   !070.9.07.997.250 48209 /.2 8. 9:.09    !070.3:25.7 907! 2%%    !0303.3!74/:   &3.7.3 /.3.507.35.3 02:/./.3/:3503.. 20/. 907-039: 5.  03.07.947 S   . 02503 ..3 50303.9 97.8.3..7/.:-03/07 5509 ::72::90-.2-.  $0.  09003 749   :39: 8.2-.250 2.07 !05943 :943 :/ !  :39: 8. /9. /507:.8:8:8   0/.3:8:8 02.9.3  23:2..4:247/0 %%   !07.7.3 2479.:5.079.7.9.3 .../843.3-039:807-:507:/9..3 3.::203:3./: 42403 3.::5.3 2.9 97.3 4-.8 202/.99:3443 3:-./:42403       094/0!03:...3 4-././..3   2%003   /.250 2.    $0/..3 .3 .:8907  &39:..8 5. -.  #:.907 .3..9 !.3 /.:5. /50740 8:85038 /03.3/34:.904:39.8059 /92-. 8942..3808:.34-.3/:302.2 .7.  ..325.3/.:3 589.13.:5.3  23:2.5.7 /03.

9 $    34:..3 7:5./.07.07 5079.820/. 3. /9 / -.3 ..3 808:.250  /9:.3/03.7 9. /9.9: .34 !.07.3 5097 /.3 $09.:.7. ! ..250303...350303.5  . 8.35488/-.3 90.. /50740 8:85038 /03. 803.88./.3 .3 /.    :2..250 /.9.7 202.3 .9.3 203:3:. .07.9:43974 -.   !7480/:7   424038.3/-:.3 5097 /.   . .3 /4.3 509789072.7...3 /.85.33:-.-:3 -078  2 50303.3 8.8:: S80.7 8. /507408:85038 50303.07. /03.3 /-. /.3 :2.. /50740 8:85038 8.2.3 /03.8.07. .3    2 20/.2.3 /5509  2 0 /.8:. 443 .8 /.5 .9 ...9/:54 0/.250 803..9: 50303.3 /550920/.7 80/02.250 .3/3:-. 8.57480/:7424038.. 038 8.8 ..    !03.2.8.3 /507:.:89079.. .39..07. 02:/.2 ..2.07.3 5097 . /4...3 .3 .4 42403 3.3 /5:9.7.8/.250/03.07. 8:85038 907.3/9:3  39075709..39:2-: /.2 20/..3 8.2.88.    !0303..29..7  5.  .78:8503850303.83 2.3202.7..3    !0303. .3 /8  2 50303.3 50303./.3 20/.07 9.3 /:. /2.8 %%  8007.83/-:.3 /8 20/.8   5 .5 50303.3:9../.25:7 207.2443 .34380397..7 8:: ] S .7... /.3.9 &39:20309./.35.3 90.  $090.2 .2 9.2-.3 .07.3 808:.2/03.3 5070..3.250 808:.9/.

 93.9 ./.3 0- 703/. 50303. 50303. 7.3   :2. /.9.3 :2. 0- -08. 443       .07.9. ..-.02503%49.. 50303.250    .9.07. /9:3 /.3 5.7  ..07.3 -07:7:9.3 1. 7.  . :2.: 0- /.  ./.9 50303. 3.9.3 90780-:9 28.   5...7  ...9.7 93.31. 443 0/:.9.3.9.3 /././...7..3 . 3.3 /. /5 :2.    2.9.9.9.93. 7.. 7. :7. 2..3 :2. 50303.07.3 . 7.9.. 443 7.33. 443  02:/..9.3 1..947 50303. /5 /. 3.2 . 93. /9:3 :2.4437.7 2.9.: /. 7.07.2 9.2. 8..9 .3 / -. 7. 50303.9.07. 02503 %49. 443 ..  2. 443 7.33.3 5.9. 3.3 5097 203:3:.9. 443 :7.            .9./. 443 7.5 7.: 28. 02503 %49.9 50303.9./.3. 5.250    .3 :2./.7 0/:. 5.   :2. 907/.3 /. 7.3   :2.8 5079:3.3 /.07.3 /-.9.07.7  .7 /:.. 02503 %49.. 7.94750303.9. 443 /.3/03.3 80-./.07.5 7.9 50303. /.. 7. .33. :2.3 /.07.5.07.9. 02503 %49.8 /3. 5.83 93. 7. 5.3 02:/. 7.   5. 443 7. 3.2 9. 443 7..7 /.3 /03.:28. 8.07.07... /.3 0- 93 /50740 :2.   2..39.9 50303.9.  443 7.9.3 /9:3 .3 .3 203:3:.8 /3.8 5079:3.947 50303. 2.9.3 /03. 7.3 0- 93 /50740 :2.9.3 80-.9. 28.7   443  /9:3 :2. 93.9.9 50303..7 . :2.83 2.7 7.9: /. 7....

9 50303.. :7..3 203:3:.9.9.. 443 /.9. 8.31.    .5.07.443/. 443 7.3/03.3/.3 :2.3/.203... 9/... 3.3    :2.31..9:  /.3 /9:3 :2.3 90793 02:/. 7.94750303.07..7 0/:.3 :2.07. 443 0- /. /.3 80-. 80947  02:/.94750303.3 93.    .80947   ..3 /9:3 7.2 ... /. /3.:2.9:5:3 443 /..390703/.9. 80:7: .. 02503%49.7   /5 .7 8..3/03.9.9: 80947  3. 7../-0-07.3/-. ..7 .3 2.:  /.7 8.9. 02503 %49./.3 /.

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

    &3.5.3..

3.3.3 :39: 20309.3 . .33:5 094/0 3 /:3..27  #:..5.5.

5..997..250 2..34-.3.27 /.3 ./843.3  48209 /.3  23:2.3.2 8.   !7385 !079:2-:.

07.8:: S   !070.2 9.7..3 808:.3!0303.3/3:-. /50740 8:85038 8..07.3 .80-..3 /.3 808:.57480/:7424038.07.8.3/9.78:8503850303.3 /03.3.07.27 8090.88.3 8.34380397. 038 8.7 .2.07 !059430 :943 :/ !  !49. 20/.7 ! . /03.3 . /03.3 .: -03/07 5509 ::72::9 0-..8  247..7.8.2-.3/03.250303. 3. /507408:85038 50303.250 803.85.. /4.8059  8942./.99:3443 3:-.3 /:.88.. /50740 8:85038 /03.3 /550920/.250 808:.2./.9.2103450790720/.9$      .7 /. /9 / -. .250/03.8 /.9./.7.. ..  !07.250 .947 S  !7480/:7   424038.07.: 808:.4 42403 3.3 5.3:8:8 02.:. .07 5079.    !0303.-:3 -078  2 50303.3    !0303.3   .3 .9.47.07.8:8:8   0/.07.3 50303.3 /507:.7.21034   !070.3 /34:.3:9..:5.94 097480 .7.

34  !.07 /.7.3 80-0:23.3  $0:7:02503!/3:-.3 5488 9/./.3 8007.  !03.3 02503 20/. 8.3 /.880.9.3.3 :39: : 20/.9: 02503 ! /90908..3 /.:.7 207.3/-.9 /:54  03..9 2..83 2..3 0/. 8::  S  /03.35097/.3 /5:9.2.    34:.8 20/.8 .7 7..2.3 443 .9. 803. /:3.3 8.2.3 : -.  &39: 20309.9.3 7:5.. /9:. . 8:85038 90780-.3 /.07.07 /80-.9: 02503 !. 90.3 50303.7 80/02.75.3.8/. ! .83 /-:. /-.3202.3 5039:3. /.33:-. 02503 /4.5.3  2 50303.7 9.5 50303./.3 /5509   2 0 5072:.: 89079./.

443 /.2- .3 .39.203  803. 7.25.8/3.2.:.3 .: 1. /9:3 :2.3 5 .07.7 /:. 443 .3 -07:7:9.3:2.3 5097 /..70 8.3 .5.3 :2:23.25720307:5..  02:/. 7. -.3 /.33.3 /03..0  443.27 202-039:-:. 5.9: 50303.  . 503..3 1.3 :2.32:.3 /9:3 .5. .7 0/:..443. .3 203:3:.25.3 1.3 /..:8 /.7 8. .3 -078547.947 50303.9.3... 93.947 50303.33.    2./.380-..3 203:3:.39.9 50303.7. 805079 -03..3 /03.3 -03.3.3 202 280:2 .90.39:2-:/.: /.9.9.27 /...3/9:3   !079:3..7.9..3 5097 /.07.3.907  443 ..07.07.  :2. .  :2. 443 /. 5:9 .9/.

.3/. 0/:.7...8 2.57.3 5097 /./:9509:3:80-.:28.9.27 /.29.2.5.3 -07-0/. 8. .2.7 50303.7. 8.39.3 ..9.3. 203:3:.250  &39: -0-07. .-07:9   .7 5073..3 ..3 :2.. 02:33.3 8..39.3 . .07.9. /.   .9: /.

 443 5.. 50303./.7/.3.:2. .3 .07.7 /:.  2.50303.4435. 5.3 0- 93 //.07.07.9 :2..  5.3 /. /5 93.3.3   /50740   443  2. 443 /./.3 / -./. 50303.. 7.9.3 /.5.07.7 0/:.9 50303.7/:. 5.9.   28.5.7 :2.9.3 0- 93 //.3 /..     /9:3 :2. 50303.2- .  2. /. /.8 /3../..3 90780-:9  . 443 :7.3    .3 80-.94750303.07. 7. .9: 443  .07.3 .5.3 / -.3 .3.. 50303.3 5.07.07. 50303./.3   /50740   443 /.. .4430--08. 93..07.3/03.31... 443 50303.7 0/:. /5 :2. :2.9 50303. 3.3.07./. 443 /.9:2.3 90703/.

3.2 9.07./.250   8. .3 /50740   443  2. 5.07..2 8. . 3..3 50303.5.27 /. 50303.5 7.3   /50740  443 /.

. /. /.. 80-03. /.07./. . . 8.. .5.3 5097 9/.3 /9:3 80-.. /.3.9 .27.3.7 93.9.39... 3.              .3 203:3:.    443  2.9:5:3 .73.7 80:7: ..3 90703/.3 :2.7.9 50303./.

.3/80-.3./.. 5079:2-:.3 5..703.. . .3 /..1. 9/.3. .5.3.3 -:. 802:.9473-947 2./.3    .27 !077.-.

        .547.3 1.07.7 8.9: /.3 /03.947 50303.3 /.3 90703/. :7..94750303.390703/.    1...3 80-.07.27 /.

.    !0303. 9:.8 /.7   .07.. 02503 80091 .250303.3 /03. /50740 8:85038   ..1.7.3:9.: %759.8 .900/:2 $    !070..3:8:8 .3 3/4 4.3.8 5. /50740 8:85038 8.7   :97039 .3 /:.3 ..33:2.88.3 808:. 20/.4 5.22.3   0 /.2 9.-.3 808:.9.3.3/.3 /03.5.: 0- .3.2.3 .3 -.07.07.2.     &3.7:9.194 .820. 3.343172.7:9.: 8. 8  .3  #:.  8090.250 803.7 %$  %759430 749 %  # '!0/:2 $2243 897.99:3443  !7480/:7   424038. ..8..9.4 749   4830 09030 :0 .9.3 8./8 2! .7:9.3      74-..907  .-:3 .57480/:7424038. 038 8.8:8:8   0/.3/03.250 808:.34380397..3 808:.7.07.7.3   !7385 !079:2-:.4/.250 ./...:5.3 2.3!0303. 8..3/. 3.88.8424038.-:3 ! 5079.3 /34:.07.::-42.3 :39: 20309.07 !059430 :943 :/ !  '409 #0/ 0 ..3 /.  .4/./.3  /3:-...3.3 209 207. $4 .250/03. 8:: ..07.8.7 '#  8.250 /5509  2 8:85038 50303.07.:.4%  !07..7:9.88.83 90.33:5 094/0 3 /:3..3 .83 2..323:2.   !070. . 9.5. /./.

.5.3 : -. 3..9  /. /8 20/.4 8.  /7. 42403  :.3 0 02503 20/.5 /03.3 50303.7.9 5079:2-:. . 7.3 5488 /-. -.: 89079.95.3 43172..3 8.3 80-.3 90.   .  &39: 20309.2.3 /34:. 8.29.3  5 .07.: /03./.3 /03.3 .9 50303.20907   22  .3:9.3 /34:.3 203:3:.  /.3 20/.3 '# .:5   443 85081 80.8/.   .220/..2 /..3 /.2 /.3 -39 -7:   . 803./. /.-:3 :7.8/.3 02:/..9 /:54 02:/.8 /./.3 /507:..3 .7.8 20/.58.3 /03.3 .3 2.9: . .32 '# 8:: S  .07 /.9907-039:3.9.7 80/02..3 /3:-.5 50303..3 5488 /-.7 207.3 -.8   43172.. .3 /-.3.07 /. :3: 0207.25.8.5 4./.7 .3 /3:-. 8::   S 80.. .2..7 -039: -:.9.   .2 .3 202.5..7-. .73.3 /5509  2 0 /.33:-..2 /03. 8:: ] S80.3 .83 0 20/.8 /03.7  $090.2.9.-:3:7. /909.34  !.3 /.07./.3    34:.  ./.2.9...    ..7 9.2  9:3 443 ..: 808:.9  02:/.  50303.3.8.3 50978907 /-:.  . 443 85081 7. 8::  S 80..3 /03.3 -07:93.9.3 7:5. 8:85038 90780-.07.3/9:.2 .3 . :39: /.73..3/0391. .3    /4.3 9..8.9.2./.3.3 0 80:7: 5072:. 0207.07..20907  22 .3  2 50303. .8 .2  /3:-.354891202-039: .8 5.3 5097 8007.3/9:.3 :2.3 5...3 443 85081 5./.3 /5:9. .3 . 202./.9.3  /03.9: 50303.8 443 85081 /.2.83 2.3 . .85.8/.:. 5.: 0- .  /.8 /34:.3 -07.3.3 /03 43.7 8.9..3 5097 /. /4.

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

3/5 8090.7 . .3 /50740  443 5. ./.3  .4  4394 .-07:9 3/4   54891 54891   0907..91  30.3 909. 8.8 9073.  203:3:.4 /.07.8 5079:3.:07 $97.9..9. 8.9  30.8 3. .  ./..5. .  443 .73..3 -07/.07./.3.:-07..3 54891 80-.91   39075709.9...3 /3. 50303.80 /.250.8 8.8.3 70.3 54891 80-.4 /3.3./.07.3 54891. /43172.07.4  2...7930.9..8 54891  -.4 /909.7.7   443 85081 .80-.. . .78.3 5078039. .07. -.8 : -42..  '408!748..8.3/:. 8.91   !073..3.7 44385081..5 -07. ..

2 .2 . 8./  3..22.3/.:70:8 /.9.250     & 3.3 :39: 20309.54....3  #:.3.5.:50728.4. . $9.32034.:8 ..3   !7385 !079:2-:..07.4.33:5 094/0 3 /:3.323:2.3$9.3.3 808:.:70:85.:70:8.:.3./.02503 .      .4      443 507 7.  2070/:8 ./.54.:8 ..85.3 $9..:8. 20/.4.82.    443 443 .3 3:2.54.3 /.:2 90:79  203/7488 :3390:7/..

07 .7 809.. 34::2 -0:2 907807.3 8942.:8.80$4. 3.3 ..7..    8.3    -:...8:.:.3  2 0 02503 20/.8  4 %0:790  02:8 :33 90:7 /.4.:8  43.3 0 /.    2039  02:/.-.9.8 .3 .3 424038.3  2 !  5509  2/.   !070.99:3443  !7480/:7 $0.8-034 ./03. /80-..:290:790 4..9  .3 5488/-.3/:3    443 907/:.8::S80.   /09 3.3 -07:93.2.57480/:7.9.7.7931:843749  :11070/!059430 . /507408:85038.-:3....:.7  -.550303.2-./.5 802:.3 0.. .2 !/. -:.7 7.07.805.07.3 -.7.3 /03.5.3 /9.83 2.3:8:8 $942.3 0.9 50303. !   $007.8390..8 42403.:70:8%  !07.:70:8  443 $ ..707 .7  -. 03.3 /03.2 .07 80..250808:.350303.907 ! %759..3 /03.3-078!  9754 :39:809.3 /03.: /. ..3 9:3 .07.08    . .9.947 80.7 50303.07...: $9.3 203.3  /.8059 /92-...7 %$    !070.8:8:8   0/.3 203:3.3%   74-.3/:.8 / /..07.07 /..8 -034  5.3 0.3 5488 0 .9.3   8.: /5509  2  /2.2.54.3   .342403/03.39:3 8942.5.424038.: -03/07  5509 ::7 2::9 0-.2 3:-. $ .5.-..5 50303.3 203:3.9.2.9. .3  2 ! .3 .3 /5509  2  2 /..3 .7   4 %0:790 !   7.3 3:-.3 /.8 8./8 /03. 40 ..9.9.2 .32./.:5..9.:70:8 .7/ !.82.

 50303.7:2 480 4439.8 5   443 85081 ..8./..-..$ .82..2  .-:3 /03.8.3.3.:70:8 4. /.:.80507920390.8 5.31.:70:8/3.9. 03.443/./.:70:8       44385081$ .854891  :2.:70:8       443          ./:207.3.2-.0309   43172.:70:8   !079:3.89073.2 809..3 5.2 9.79 /50792-.     /.:5/03..3 0 .$ .$ .7 273 %$  /3:-. .:.. $ .250..3 90.3 9754 /.8.3 9079:3  2..:50728.-./3.3  3.3 202-. . $ .79..3     .5.9.83 /34:.-:3 70. 3..20907   22  -07.94750303.93.8 5.:.   ...3 443 907/:.3 /.3:2.7 9.3  2 5.:70:85077. 8:: S 80.:70:8 4.:70:8 /.2.443907/:.35078039.$ .9.8 80-.2.  02-.82.3 9.:70:8  5.07. -078   2   3:-.../..:70:8  .$ .54891  80-.2.2  9. 4./.8 S80.-: .854891 /.3 3. $ .9.3.   .$ .5.3 7./.:.25.-:3  .2  34:...73.8.9/905443/. /.8. /.07. ..25.8 0.79.3 54891 $ . 03.3  202:.2 :39: 443 907/:.5 /9025.-: 09. 20/.94750303.7.3 50.73.3-07/.3 9754  1./.07. /3:-.80443 85081 .2.2..:70:8/.9 907..3 /43172... /43172. 8:: S 80./. -07. 909.83 2.3/.3  80309 0 /.3  4394 !079:3.3 //:.2.3 4397454891$ .5 9..7   443 .:70:82.

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

 0 /./.8 9:3.83 /34:.3:39: 20309.2 9.-:3 /03. .3 :33 !  8. 809. 70.2 9.8 /03.2 .83 /./.83 2.   ..9.30/.-0 !   3.3 203:3:.250 /.-:3  4380397.3  2 8.-:3 :2..83 -078  2  4380397.4/.3 .-:3 9.3   2 8.-0 203:3:..3 502-039:.3/..33:5 094/03/:3.3  #:.4 80-.8/..2.3:33 ! 8. .3 /34:.8..8 54891 5.25.7.  $.3 808:.9 507:-.5..9 907-039:3.-:3 .3 .. .9.9/.83 2.-:34380397.3/0391.8 5..8 .-:3   02:/. : 57.250 $02:.3 ..59.3.3 ! 41472 507 28.8/./.8 5.2  -:.3 9.3 5.8 / /.   .2 . 809. 9:3.3:9.2.!. .!./.3 23:2.3..4 8090..-:3.. ./.907  .2-  80309 02:/.7809.4 2.2.  /4.3 /3:-.354891.  2./.8.  /03.9 .2  .3 84.9.5 9.8 .89:3.-:3   &!030.8 /.29.-:3 :7.09089  8.3 43172..2  /.8.2 2./:.3 /03.8 /03.73.3 0 /. /7:: 0 %.07.33.-:3 :7. 20/.3   !7385 !079:2-:.3 /.3 9.3.59.5.83. /34:.8 5.2.07.83 2.2  . . .-:3  /3:-.3 /50740 /.3/.4 /.3/8 220/.3 203.8 5. 2.3 /34:./.3 .  .3.3 443 -.33:2. 9.7 /4.33.8 1072039. 8::  4 80..4    .3/:     &3.250.7 ..7 9. .:5. 9. 8::  4 80.2.

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

 $2243 8 97.3..:5030.8 /./-7:  &   ./207.-..29.9 .9 5079:2-:.7 -.3 5.73.0775..3   !073.9.3 749907-039:.3 54891 -. .5072:.3 -07:-.3  /  &$97. .3.9.9. -.9507:-.207.4 /3.2. -.  907-039: ..9.:2 /748/   /4.8//./:..3-.73.  5.7  /3:-..8.73.3. ...07.-:3 :7.-.3 -07:-.2 9.3 54891 -. -.3 54891 -..    & '408 !748./ :33 /. -.2..8   & 57.9...2    & 5030.    & $97.  ..3 -07-039: .-0!      ..9.2.203..:07 $97.4 42403  .3 ../. -.8  2.3203.91 0.9   .4 54891 /.9.3  273 /34:.  ../.73.90 .2    & 3/4 /3.3 /3./.:07 /3.91 3/4  0907.73..9../.73..8 5. /3.3    & 09 07./.3 3. .203.9 /3.3 54891 -./7::5../ 507:-.3 54891 -./. 20/.3 .3  907.8.. /3.3 54891 -.-:3:7.3203:3:.3./.3....  '408 !748./207. /3.9..3 54891 -.7 :3: 203. -. 8::  4 80...3.3 /.8.9.2  /.8 : ' .9.  5.       !4891 !4891 0.880507990780-:9/ .3 8.

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

  2 !.

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

8:54891  .3 /3:-.3 209 207..1.  &'408!748.../.3 /9..9: 80309 -.3 %$ 273 /34:.9../ 207. /3:-. /. # '! /.7/.8 5.194/.8 5...9 $.9.07./ 507:-.7-.   .9..:  %$ 273 /34:.3.2  $090. . 907.4 42403 /.-07:9 3/4  54891 54891   09207./.3 70. -0-07.   .8 9.3 . 207..3  /.   .5. '! $97.2.$2243 897.29..3. 2039  -.3.9: 80309 -./.3 80.5.2..35.3 203:3:.7:9.354891-.2  .2  90908 .3 5..3. -.  /3:-..3   /4.91  30.4 02:/.4/3...57.3 907/. /4.3 -0-07././..8.8 54891  /  &$97.3 /3:-.8  2.9.2-.8 5.2.9 -.7:9. 8::  4 80.3%$/50740.3 203.28.880507990780-:9/ .9. -.07..3 203.3 90908 . 203:3:. -.203:3:.4/.90. 20/.9 /3.8.3  .3 //./.2 $090. 3.250      .73.2.8. 203. 8::  4 80.2.. 2:/.390908...73.9  !073.5.907 8.8: '80-./ 207.8   30..2-.91  . 2039  . 8::  4 80.3 //. 3.:07 $.8:54891  8.2. /3:-.7:9.5.

88..3  23:2.7 .3 /. 480.4. /03..3.5:39:203/0908.3 /:3.8 20/.2. .7 /.   !7385 /.8 907...9. /.2 /.3 /3:-..5479 './.9 97.2 20/./8 0/:2 82:9 7003 .2    !03./.2.7 273  %750 $:...3 0/:2 .3 /./.7 78903803   830 0.3 /0391.8 $..2 2..5 /0399.    & $...3    43172.380744    !070.3 :-42./.85.    .3 /3:-.3.3 20/. .2./.33:5 -..2.2430..:   .7 743 ./.    4 80.2 /..9:   !7.3   4 80.7-4./843..2430..3 /03.943.: :97039 .  .9 094/0 3 /:3.99.. #'$    480 830 084.4-4./843.3!0303.025.  #:.2 #'$ .8:8:8  0/.8 5.3 749 %%3  #. /3:-. 5.. 503. /808:.3 %7.    .3 .2 /:.3 3:-.3 /.3  3:2./.07 :11070/!059430.$..3 /.2430. $.8 5.5. .90   %759.7    34:.33 %097..7 80091 . .2 20/.7 34380091 .8 /.7  $4.90 4.    .2 /. 80091 5079.9 80091  20/. .2430.2 .907 ! :07.7 %$  &70.3. $4 .3 4-.55. /.2%%3.   4 80.. 20/.:12.80 0/:2  %75945.3./.9..2.3 :39: 20309.8 /. 80091 0/:./.

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

3 -39 9.: 0- 443 85081 5. %$..3 -07.2 /903.  5.25.33./.3   5.7 9/.2.2:/.  /.7.2. 20/. 97.  /.73.3207.. !. 3.9./.2430.3 /03 43. 07: /03.$.207./.3    43172.3.  !.0207.8. .385.   443 /.3 97.9  . /.38:803 /03.   44397.  207. -07./. 207.7.2 443.73.8 5 /:.38:803 3. . 2:/.8:: 480.3 9:2-:/./.54891.3//:.

2. 20/./.194/.3907.3 /03.2./   &0. 8::  ] S 80.:07 34:. 273  02:/.3.7:9. /03. 3. 8::  4 80.80 34:.2-.3907.3.80  /3:-./.3907.  ]  .3 4439078.  ]  ..3./.5.3.3.2  .   .883 34:.9..3 /3:-.7-48.73.3. 5.3/.3 .9 507:-.8.73.2  2.3.3.7.3 4708. 20/..-07:9   %$ 34:.34439078. %$  3:-.7  ..390908. 20/. 8:: ] S 80. 5.-./.7 78903803  8:: ]S  2.7-4.: %$ 273 /.3./.. 8::  ] S 80./.8 5.3 5. # '! 5.  ]  ..9 507:-.9:8: /.3 443 9078..././    &'408!748.3:9.2  2.3 ..2.8 5.2..3007:.9 507:-.73. 20/. .390908   .2  %.8 5.8.3 : '80-./.-./    &&70..3 443 9078.1.&70.8.  830 /0.

 -. 8::]S80.  .3 ..8.3..    &Y ..7:9.3.].948/.5.2039    &3/4 34:.3 207.91  . 5...  ]  . 8::  ] S 80.2 ! 3:-.8:./8090.2  39075709./.2. 8  2.. %759430 749  3:-..2-. 8907  .9 507:-.8.2  %..8 5.85.8 %$   -:9954891 8. -. 90908 .80 $:85038. 20/..9 502-039:.3.-:3 70.  5./.3  2 .8 0..3 .3930.3 4./.854891.2.380-:./.3      2.3 443 9078.3  273 /.3907.7:9.73.7.2 9.3 -0-07.

-40203.80  #0.2430.3 .2.3/:3$./843.:8 .34-.8 202 /.:  2  -.3 :39: 20309.3 23:2.9.3 .2 $.3  3:2....3.9..3/:3 $.4.8'408!748.3 9/.54.:70:8 .9%7.54.91 54891 30.30.3. $9.948/.3 48209/.91 0.33:5 094/0 3 /:3.997.2 .5.3 2..:70:8 /. -40 203.:5072     & $9.250 ..9.3 /.     30. 30.:8 .9/.91 !74/:83/4  !078.91 507  7.3 -..8830 Y .  #:.25048209/..   54891 30.:07 30.8$  /7488:70.7./.3.9 97. 30.2430.91 5077. /:5/.28.91 .91 .7-48.4./843./843..

3 0.3 .4.85./843.07 80.25048209/.394$.997..:2 %0:79   %759..7 !   02:8 :33 90:7   .8 503.:70:8%  !07... 50303.:8 3.3 808:.7.7 '   .2 .82.. $4 ..3 ! 80-.394 /.8 2.3 /.2.07 8.09 :39: 8. $4 749 %$  :97039 .32034.79 31:843 749   !059430 :943:/ !    !070.:2 90:79  203/7488 :33 90:7  2021072039.    . 57480/:7 424038.3.3 03./.8:8:8   0/.9.7 424038.3.8 2:8 :33 90:7 /.4 42403 /3:-.  .3 23:2.9.54..7   .9.4.7 %$  7.34-.3 808:.03. 20/.3 2070/:8 .7.7 $  02:8:3390:7 . 02503  .:70:8 5.250 0/.. /4.:8 .:-03/07  !7480/:7   424038.:2 90:79   .    !03.  !070..:290:79 5.82..:8.250 .54. .:290:790 '40 43843.3 .   !7385 !079:2-:.3 $9. 8::   S 80.8059 /5509  2 8:85038 /. 50303..8   /:3.9.:.: $9.7/ !..8 5.:.3:8:8 $942. /03.250 2..707 .3   80-./. 09003 749   .2    .   74-.: %759.9.07..88...2 2%$ 8090..7:9.88.

250 48209 /..3 $ :39: 8.3 /.5.3 503.3  20/.3 4-..8 $.3 23:2.7 -.2- /03.3.3 80309 :39: /4708. ! /.3 5.     84.3 02503 20/./.3 /.  . ' /.9 97.. 02503 !./843..3 $ :39: 8.250 2.

07: 45.2.7 -./. .203./.35488 02503 /-.2/03.73./. 02503 /3:-. 9.73. :33 /03/..9 443 85081 .3 5:.07.3/03/. '  443 .:70:8  $02:./.8 5 443 85081 /.:.320/. !  443 .:8 .3 9:2-:/03.  .73.07:/.8:: S80.2 203.7 .6:0  !.73.8 5. $  443 .54. 443 9./ :33    43172.07.-07:9 !.02-:3  -07.' /. :39: 43974 54891 $9.07.3 !.-07:-.780-.9/.2.2 203.9 /0-/.-07..3 $  .02-:3  ..4.02-:3  .3.:33  !.

'.

8 0.4.8.9.:./ 4.2 /.9 50. 7.3  2 5.:70:854891/.:8 .2. 20/.85.2  $9.   02:/./../.3  0 /.3:9./.82.2 54891 -039: 4:8      .3 /03.250    &274845 .   .  /3:-.2-..2.8  5509  2 -./.4.3 $9.907.54.3.3 : 4...$ :39: /34:. 4./.  .. .82.2 9. 8907 /9.3 /3:-. 8::  S 80.3 5..:.8 5.73.-:3 70.3 7..:..:8.2.  S 80.8 /3.:70:8 .28.7  273 /-:..54.9 .8 5.2  . 03.

54.9.29.9.5.: 2 8.250            .  &39: 8.: 28.9. /.   !073.2 .3 $9.8 .9 97.:8 ....250 4-././843.250 48209 /3.5 7.:70:8. /.8 2.4...3 /.9 /3.3 /50740 ...9.9.. 54891 /.7 -.3..2..3 503.8 805079 90780-:9/..9.

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful