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Cromatografa de lquidos de alta eficiencia (HPLC)

Fase mvil es un lquido: Reparto (Particin) Adsorcin (Lquido-Slido) Intercambio inico Exclusin por tamao
Federico Williams fwilliams@qi.fcen.uba.ar

Aplicaciones de la cromatografa de lquidos


Sensibilidad Determinaciones cuantitativas exactas Separacin de especies no voltiles Gran aplicabilidad: aminocidos, protenas, cidos nucleicos, hidrocarburos, carbohidratos, frmacos, plaguicidas, antibiticos, esteroides, especies organometlicas e inorgnicas Cromatografa de exclusin por tamao: solutos con masas moleculares superiores a 10000. Cromatografa de intercambio inico: especies inicas de masa molecular ms pequea. Cromatografa de reparto: especies poco polares no inicas. Cromatografa de adsorcin: especies no polares, ismeros estructurales y grupos de compuestos como, por ejemplo, los hidrocarburos alifticos de los alcoholes alifticos.

Eficacia de la columna en la cromatografa de lquidos


Efecto del tamao de partcula del relleno

Transferencia de masa en la fase mvil CM dp2

Ensanchamiento de banda extracolumna

H ex =

r 2u

24 DM

r radio del tubo

Diferentes velocidades de flujo de las capas de lquido movindose adyacentes a las paredes del tubo y las del centro en los sistemas de inyeccin, detectores, y conectores. La parte central de la banda de soluto se mueve con mayor rapidez que la perifrica. (No es importante en CG ya que se compensa con la difusin). Se apunta a la reduccin del radio de los tubos del sistema externo a la columna.

Elucin isocrtica versus elucin con gradiente

Elucin isocrtica: Separacin con disolvente de composicin constante Elucin con gradiente: Se utilizan dos o tres disolventes de distinta polaridad y se vara la composicin de forma continua o mediante etapas escalonadas.

Instrumentacin para cromatografa de lquidos

Sistemas de bombeo
Requerimientos: 1. 2. 3. 4. Generacin de presiones por encima de 6000 psi (~410 atmsferas) Flujo libre de pulsaciones Intervalo de caudales de 0.1 a 10 ml/min (con control del 0.5%) Componentes resistentes a la corrosin (acero inoxidable o Tefln)

Bombas recprocas:
na

Desventaja: Producen un flujo pulsado (amortiguar) Ventajas: 1.Pequeo volumen interno (35 a 400 l) 2.Altas presiones (>10000 psi) 3.Adaptable a elucin con gradiente 4.Caudales constantes independientes de la contrapresin de la columna y de la viscosidad del disolvente

dor nes

Sistemas de inyeccin de muestra


Vlvulas de inyeccin con bucles de muestra

Detectores
Detectores basados en la medida de una propiedad del efluente (ndice de refraccin, la constante dielctrica, densidad) o basados en la medida de una propiedad del soluto (absorbancia en el UV, fluorescencia, o corriente lmite) que no es inherente a la fase mvil.

Sensibilidad adecuada Estabilidad y reproducibilidad buenas Respuesta lineal extendida a varios rdenes de magnitud Tiempo de respuesta corto Respuesta rpida e independiente del caudal Manejo sencillo No destructivo Respuesta similar a todos los analitos o respuesta selectiva a algunos analitos

Diferencias con los detectores de CG Rango de T de operacin menor Detector de CL volmen interno mnimo (minizar el ensanchamiento de banda)

Detectores de absorbancia
Celda del detector UV-Visible: Espectros de absorcin UV-visible:

Detectores de Fluorescencia: La fluorescencia se detecta por medio de un detector fotoelctrico colocado perpendicularmente respecto del haz de excitacin. Es ms sensible que el detector de absorbancia y se utiliza para detectar compuestos fluorescentes (se puede tratar la muestra previamente para generar derivado fluorescentes).

Detector de ndice de refraccin

El disolvente en su camino hacia la columna pasa a travs de la mitad de la cubeta y el eluyente de la cubeta pasa por la otra mitad. Los dos compartimientos estn separados por una placa de vidrio montada a un ngulo tal que si las dos disoluciones difieren en el ndice de refraccin se produce una desviacin del haz incidente con respecto a la superficie fotosensible del detector que provoca un cambio en la seal de salida. Responden a casi todos los solutos, son detectores universales. Sin embargo son muy sensibles a los cambios de T y no son tan sensibles como otros detectores.

Detectores electroqumicos

Intervalos de potencial en los que pueden tener la oxidacin o reduccin distintos grupos funcionales orgnicos. En principio las especies que contengan estos grupos podran detectarse por mtodos electroanalticos. La deteccin electroqumica brinda un detector universal y sensible

Columnas para cromatografa de lquidos


Construccin Tubo de acero inoxidable (presiones hasta 10000 psi) Ocasionalmente, tubo de vidrio con paredes resistentes (presiones hasta 600 psi) Columnas analticas Rectas, de 10 a 30 cm de longitud Extender acoplando columnas adicionales Dimetro interno: 4 a 10 mm Tamaos de partculas de los rellenos: 5 a 10 m Standard: 25 cm longitud; 4.6 mm dimetero; 5 m particulas; N = 40,000 to 60,000 Alta performance: 3 a 7.5 cm longitud; 1-4.6 mm dimetro; 3 o 5 mm partculas; N = 100000 platos/metro (Ventaja: rapidez y mnimo consumo de disolvente) Precolumnas Elimina materia en suspensin y componentes de la muestra que se unen irreversiblemente a la fase estacionaria. Composicin similar a la columna analtica. Se usa para mejorar la vida de la CA. Se reemplaza cuando se contamina. Columnas termostatizadas La mayora de las aplicaciones no requieren control de la temperatura y se trabaja a T ambiente. Aunque T constante mejora el cromatograma. Los instrumentos modernos tienen control de T desde ambiente a 100-150 C Rellenos de la columna Relleno pelicular: Esferas de vidrio o polmero no porosas de 30 a 40 m de dimetro. En la superficie de las esferas se deposita una capa delgada y porosa de silica, almina, polmero. Rellenos de partculas porosa: Micropartculas porosas con 3 a 10 m de dimetro. Las micropartculas son de silica o almina o de un polmero. Se recubren muchas veces con pelculas orgnicas que se unen qumicamente o fsicamente a la superficie.

Cromatografa de reparto

Es el tipo de cromatografa de lquidos ms utilizado. Se puede subdividir en lquido-lquido y cromatografa de fase unida qumicamente, aunque el mtodo ms utilizado es la cromatografa de reparto de fase unida qumicamente. Se distinguen dos tipos de cromatografa de reparto: de fase normal y de fase inversa en ambas la fase estacionaria se soporta sobre partculas de silica o alumina de 3, 5 o 10 m. Fase normal: La fase estacionaria es polar (grupos ciano, amino y diol) y la fase mvil no polar (hexano o isopropileter). Fase inversa: La fase estacionaria es no polar y la fase mvil polar (agua, metanol, o acetonitrilo). En fase normal, el componente menos polar es el que eluye primero y en fase inversa el componente ms polar es el primero en eluir.

Fase estacionaria reversa


R = CH3 o C8H17 o C18H37

La fase mvil es polar y consiste de soluciones acuosas conteniendo concentraciones diversas de metanol, acetonitrilo o tetrahidrofurano. El ph no debe ser mayor que 7.5 porque esto generara la hidrlisis del siloxano y la destruccin del relleno de la columna.

Eluyentes tpicos

Se requiere un equilibrio entre las fuerzas intermoleculares entre el soluto, la fase estacionaria y la fase mvil (a diferencia de CG donde la fase mvil es un gas idealy slo sirve de portador de componentes). En polaridades crecientes: hidrocarburos < teres < steres < cetonas < aldehdos < amidas < aminas < alcoholes < agua . Se elige la polaridad de la fase estacionaria bastante similar a la de los analitos y para la elucin se utiliza una fase mvil de polaridad considerablemente distinta.

Optimizacin del eluyente

Se controla el tiempo total de elucin con la polaridad (modifica los factores de retencin). Se controlan los factores de selectividad para lograr una buena resolucin variando la natiraleza de la fase mvil (manteniendo k en un intervalo) o la fase estacionaria.

Aplicaciones de la cromatografa de reparto

Aplicaciones de la cromatografa de reparto

Cromatografa de adsorcin
La cromatografa de adsorcin o lquido-slido utiliza como fase estacionaria a la silica (o en pocas ocasiones a la alumina). El orden de los tiempos de retencin es: olefinas < hidrocarburos aromticos < haluros, sulfuros < teres < nitroderivados < steres, aldehdos, cetones < alcoholes, aminas < sulfonas < sulfxidos < amidas < cidos carboxlicos Se vara la composicin de la fase mvil para ajustar ky . (se utiliza la fuerza del eluyente, en lugar de la polaridad como gua de la fuerza de los disolventes). Se eligen dos disolventes compatibles, uno que es demasiado fuerte y el otro demasiado dbil. Variando la relacin de volmenes se puede obtener un valor adecuado para k. Cuando se produce el solapamiento de picos, el cambio de un disolvente fuerte por otro (mientras kse mantiene ms o menos constante), permitir cambiar los valores de y aumentar la resolucin.
Separacin de cis y trans pirazolina por cromatografa de adsorcin. Columna: silica pelicular.

Cromatografa de intercambio inico

+ + + +

Los procesos de intercambio inico se basan en los equilibrios de intercambio entre los iones de una disolucin y los iones del mismo signo que estn en la superficies de un slido de elevada masa molecular y esencialmente insoluble. Los sitios activos ms comunes de intercambiadores catinicos son los grupos sulfnico SO3H+ (cido fuerte) y carboxlico COOH+ (cido dbil). Los intercambiadores aninicos contienen grupos amino terciario N(CH3)3+OH (base fuerte) o grupos amino primarios NH3+OH (base dbil).

Rellenos de intercambio inico

Intercambiador catinico

Intercambiador aninico

Relleno de partcula pelicular en el que la superficie de una partcula grande (30 a 40 m) esfrica y no porosa se recubre con una resina sinttica de intercambio inico. Micropartculas porosas de silica recubiertas con una delgada pelcula del intercambiador.

Mtodos de deteccin en cromatografa inica

Cromatografa inica con columnas supresoras


Problema para utilizar detectores de conductividad debido a la elevada concentracin de electrolito requerido para eluir los analitos en un tiempo razonable. Columna supresora del eluyente despus de la columna de intercambio inico convierte los iones del eluyente en especies poco ionizadas.

Para separacin de cationes se utiliza un intercambiador aninico en la columna supresora: H+(ac) + Cl(ac) + Resina+OH(s) Resina+Cl(s) + H2O Para separacin de aniones se utiliza un intercambiador catinico en la columna supresora: Na+(ac) + HCO3(ac) + ResinaH+(s) Resina+Cl(s) + H2CO3(ac)

Eluyentes tpicos
Analitos Aniones Sin supresin Na Benzoato KH Ftalato Ac. benzoico Ac. ftlico Con supresin NaOH Na2CO3 NaHCO3 HCl H2SO4 CH3SO3H

Cationes

Aplicaciones de la cromatografa de intercambio inico


Columna supresora y deteccin conductimtrica:

Cromatografa de exclusin

Partculas de silica o polmero uniformes, pequeas y porosas de ~10 m. Las molculas que son atrapadas en los poros son removidas del flujo de fase mvil, aumenta tR Si el tamao de la molcula es mayor que el tamao medio de poro, entonces es excluida - mnimo tR Las molculas con dimetros ms pequeos que los poros son atrapadas mximo tR Molculas con tamaos intermedios tienen tR estadisticamente diferenciables. La separacin no implica una interaccin qumica ni fsica entre el analito y la fase estacionaria.

Rellenos de columna para la cromatografra de exclusin por tamao

Silica: Ventajas: gran rigidez (empleo de presiones elevadas), mayor estabilidad (gran variedad de disolventes), estable a T elevadas. Desventajas: tienden a retener solutos por adsorcin, puede catalizar la degradacin del soluto.

Polimricas: Ventajas: control del tamao de poro controlando el grado de entrecruzamiento. Polmeros hidrofbicos e hidroflicos, tamaos de poros en el rango de cinco rdenes de magnitud. Desventajas: deformable (limita la presin)

Aplicaciones de la cromatografa de exclusin por tamao


Cromatografa de filtracin sobre gel: disolventes acuosos y rellenos hidroflicos para muestras hidrosolubles. Cromatografa de penetrabilidad sobre gel: disolventes no polares y rellenos hidrofbicos para sustancias solubles en disolventes no polares

Separacin de cidos grasos Ventajas:

Separacin de una resina epoxi comercial Desventajas:

Tiempos de separacin cortos y bien definidos Solo se puede acomodar un nmero Bandas estrechas limitado de bandas (escala de tiempos No hay prdida de muestra (los solutos no corta) interaccionan con la fase estacionaria No es aplicable a muestras de tamaos No se desactiva la columna debido a la ausencia similares, se necesita una diferencia de de interaccin del soluto con el relleno al menos 10% en los pesos moleculares

Cromatografa de fluidos supercrticos


Tc (Pc) es la T (P) por encima de la cual no puede existir en fase lquida independientemente de P (T). Propiedades intermedias entre las caractersticas del estado gaseoso y lquido.

Caractersticas de la cromatografa de fluidos supercrticos


Debido a las densidades elevadas (0.2 0.5 g/cm3) puede disolver molculas grandes no voltiles. CO2 sc disuelve diversos hidrocarburos alifticos y aromticos. Los analitos disueltos en un fluido supercrtico son fcilmente recuperados dejando la disolucin en atmsfera y T relativamente bajas. Los fluidos supercrticos son baratos e inocuos. La cromatografa de fluidos supercrticos es un hbrido entre la cromatografa de gases y la de lquidos. Separa compuestos que no pueden ser separados por CG ni CL: (1) Compuestos no voltiles termolbiles en los que no se puede aplicar CG. (2) Compuestos que tienen grupos funcionales no detectables por tcnicas espectroscpicas o electroqumicas empleadas en CL. Las difusividades y viscosidades intermedias de los fluidos supercrticos dan lugar a separaciones ms rpidas que en cromatogrfa de lquidos pero con un ensanchamiento de banda.

Instrumental de cromatografa de fluidos supercrticos

Fase estacionaria: Generalmente se emplean columnas abiertas con recubrimientos internos. Longitud de 10 a 20 m, dimetro interno de 0.05 a 0.1 mm y el espesor de la pelcula entre 0.05 y 1 m. Fase mvil: CO2, disolvente de moleculas orgnicas no polares, transparente en el UV, inolora, no txica Detectores: Ionizacin de llama, absorcin UV, emisin de fluorescencia, etc.

Efecto de la presin

A medida que aumenta la presin, aumenta la densidad de la fase mvil y aumenta la capacidad disolvente de la fase mvil, acortando los tiempos de elucin.

Cromatografa de afinidad