You are on page 1of 37

TECNOLOGICO DE ESTUDIOS SUPERIORES DE ECATEPEC

Ingeniera Bioqumica Fundamentos de Investigacin


Mtodo de Elaboracin de un Bioinsecticida A base de Bauveria bassiana

Guerrero Chvez Arturo. Grupo:3151 Fecha de entrega:


01/07/2011

Vo.Bo. Dra. Isabel de la Luz Membrillo Venegas Div. Ingeniera Qumica y Bioqumica

Gobierno del Estado de Mxico.

Tecnolgico de Estudios Superiores de Ecatepec


Ingeniera Bioqumica.
Fundamentos de Investigacin Elaboracin de Bioinsecticidas

PROBLEMTICA El uso excesivo de plaguicidas provoca efectos negativos en el suelo, el agua y el ambiente. Adems ha contribuido a aumentar los problemas de plagas debido al desarrollo de resistencia y a la destruccin de los enemigos naturales. Muchos plaguicidas tambin afectan la salud de las personas. Para reducir estos efectos se procura la implementacin de sistemas agrcolas sostenibles, basados en el conocimiento de las relaciones entre los cultivos, el ambiente y los organismos presentes en el campo. Una de las alternativas es el uso de organismos entomopatogenos, los cuales tienen la capacidad de reducir las poblaciones de plagas. Existen varios tipos de organismos entomopatogenos, tales como virus, hongos, bacterias y nematodos. Actualmente, se han identificado y estudiado diversas especies de hongos que afectan plagas de cultivos de importancia econmica; muchos de ellos son utilizados exitosamente en programas de control biolgico. Algunos de estos entomopatogenos son reproducidos masivamente y se venden comercialmente. DESCRIPCIN DEL PROYECTO Montaje de una planta productora de plaguicidas biolgicos, en donde el producto principal sea esporas, que son producidas por un hongo entomopatgeno llamado Beauveria bassiana. JUSTIFICACIN Debido a la ingestacin de insectos sobre distintos cultivos en el pas se generan cuantiosas prdidas econmicas, obligado a los agricultores a buscar medidas para eliminar a estos insectos y dndoles la posibilidad de exportar sus productos a mercados donde se pagan mejor por sus productos como EstadosUnidos de Norteamrica y Asia. En estos las medidas de sanidad son ms rigurosas que en nuestro pas por lo que los productores deben cuidar aspectos que eviten residuos txicos sobre sus cultivos. Beauveria bassiana es un hongo entomopatgeno especfico para algunos insectos que atacan cultivos de algodn, aguacate, caf, chile, ctricos, flores, frambuesas, fresas, frjol, papa, pltano, tomate, jitomate, tabaco, soya y zarzamora. Este se puede aplicar como medida preventiva al ataque de plagas, evitando aspectos desagradables sobre frutos, o aplicarse directamente en cultivos siniestrados e inclusive en el producto cosechado con plaga. Las plagas agrcolas han sido controladas durante aos mediante el empleo de plaguicidas qumicos de fuerte impacto negativo sobre los organismos benficos presentes en el ambiente. Con el objetivo de promover y acelerar el uso de hongos en el control de plagas en los cultivos es necesario el desarrollo de formulaciones eficaces y estables que permitan su manejo y aplicacin en el campo. En este trabajo se presentan consideraciones que se deben tener en cuenta para el desarrollo de productos de origen fungoso, los tipos de formulaciones en que pueden ser

Gobierno del Estado de Mxico.

Tecnolgico de Estudios Superiores de Ecatepec


Ingeniera Bioqumica.
Fundamentos de Investigacin Elaboracin de Bioinsecticidas

presentados y los logros obtenidos en este tema considerando que la forma granulado y polvo humedecible son las ms usada hasta estos momentos en la presentacin de este tipo de producto. INTRODUCCIN El desarrollo y aplicacin de agentes de control biolgico de plagas adquiere una importancia relevante como una alternativa en el desarrollo de una agricultura sostenible que preserve los recursos naturales y el medio ambiente para las futuras generaciones. La aplicacin controlada en agroecosistemas de organismos vivos o sus metabolitos para el control de plagas y enfermedades, implica el mejoramiento de los cultivos, al proteger las plantas del deterioro producido por agentes fitopatgenos En la naturaleza, los hongos entomopatgenos pueden eliminar o mantener las plagas en niveles que no ocasionan daos econmicos a los cultivos Estos hongos se encuentran en rastrojos de cultivos, estircol, en el suelo, las plantas; logrando un buen desarrollo en lugares frescos, hmedos y con poco sol. Constituyen, adems, el grupo de mayor importancia en el control biolgico de insectos plagas. Prcticamente, todos los insectos son susceptibles a algunas de las enfermedades causadas por hongos Se conocen aproximadamente 100 gneros y 700 especies de hongos entomopatgenos. Entre los gneros ms importantes estn: Metarhizium,Beauveria, Aschersonia, Entomophthora, Zoophthora, Erilla, Eryniopsis,Akanthomyces, Fusarium, Hirsutella, Hymenostilbe, Paecelomyces y Verticillium Para utilizar hongos entomopatgenos como insecticidas deben producirse cantidades masivas del hongo, el cual debe mantener su capacidad infectiva por un perodo de tiempo considerable. Los hongos se han reproducido para su uso como agentes biolgicos de plagas desde hace 100 aos, para lo cual se ha utilizado diferentes mtodos de reproduccin. Entre ellos, el uso de sustratos como arroz, trigo y medios lquidos mediante tcnicas ms sofisticadas La explotacin de los hongos para el control de plagas implica una amplia investigacin donde se involucran disciplinas como la patologa, ecologa, gentica, fisiologa, produccin masiva, formulacin y estrategias de aplicacin Una buena formulacin es la base para el xito de un bioplaguicida de origen microbiano; la posibilidad de obtener productos adecuados depende de las propias caractersticas del microorganismo y su relacin con los componentes de la formulacin (excipientes) y el ambiente de almacenamiento Para el desarrollo de nuevos productos de origen biolgico se deben tener en cuenta diferentes aspectos: primero definir un medio de cultivo ptimo y el mejor sistema para la obtencin masiva de inculo que permita una buena relacin costo - rendimiento en la produccin; establecer

Gobierno del Estado de Mxico.

Tecnolgico de Estudios Superiores de Ecatepec


Ingeniera Bioqumica.
Fundamentos de Investigacin Elaboracin de Bioinsecticidas

ensayos de produccin a pequea escala; garantizar la estabilidad del producto y determinar las condiciones de almacenamiento; poder utilizar la maquinaria standard de cualquier explotacin agrcola para su aplicacin, y ser efectivo a unas dosis parecidas a las utilizadas para los agroqumicos as como bioensayos de laboratorio, invernadero y campo que confirmen la efectividad del producto una vez formulado El objetivo de una formulacin de hongos entomopatgeno es aumentar la estabilidad durante el almacenamiento y despus de la aplicacin. Las propiedades fsicas y biolgicas de la formulacin deben permanecer estables por un tiempo mnimo de 12 meses, pero es recomendable que se mantengan durante 18 meses para permitir su comercializacin. Adems de mejorar la adhesin a la cutcula del insecto; aumentar o mantener la virulencia y permitir su aplicacin con equipos de volumen ultrabajo En condiciones de laboratorio es difcil mantener la viabilidad de hongos entomopatgeno por mucho tiempo. De esta manera, formular un entomopatgeno consiste en adicionarle determinados compuestos que mejoran su desempeo en el campo, facilitando su manejo, aplicacin y permita su almacenamiento en condiciones que disminuyen el costo, con una prdida mnima de las cualidades del producto Para ser formulado, la viabilidad del hongo no debe ser menor de 95 % y el contenido de humedad entre 4 - 6 %. Los materiales utilizados en la formulacin no deben tener actividad biolgica; ni afectar la actividad del hongo, deben ser inocuos al ambiente, presentar caractersticas fsicas adecuadas para mezclarse con los conidios; facilitar la aplicacin del producto y ser econmicamente rentables Existen varios tipos de formulaciones, el que una sustancia activa dada se presente de una forma u otra depender bsicamente de sus propiedades fisicoqumicas (solubilidad, tamao de partcula, densidad, fluidez), de la maquinaria de que dispone, el aplicador y de factores econmicos. OBJETIVOS Objetivo general Desarrollo de una nueva tecnologa para la produccin de un insecticidabiolgico, por medio de fermentacin slida, orientado a la produccin deproductos de exportacin en Mxico. Objetivo especficos Adaptar tecnologa limpia. Mercado de Bioinsecticida. Estudio de la biodinmica poblacional de la plaga.

Gobierno del Estado de Mxico.

Tecnolgico de Estudios Superiores de Ecatepec


Ingeniera Bioqumica.
Fundamentos de Investigacin Elaboracin de Bioinsecticidas

Tcnica:La tcnica usada para que el microorganismo produzca esporas, consiste enuna fermentacin slida utilizando una cepa mejorada originaria de Mxico. Econmica: Retorno de capital Generacin de empleo Evitar tratamientos contra plagas de alto costo Ahorros de costos a largo plazo para el manejo integrado de la broca Inversin en la calidad del producto Social: Las armas de la industria qumica como lo son los plaguicidas que se ofrecenpara el combate de las plagas, como insecticidas, herbicidas y fungicidas; loscuales provocan el envenenamiento a corto y largo plazo de la naturaleza, lostrabajadores, las comunidades rurales y los consumidores. Los secretarios desalud de los pases de Centroamrica estiman en casi 400 000 losenvenenamientos causados por los plaguicidas cada ao. En Brasil se estiman300 000; en Mxico, las autoridades registraron 2 800 casos en el 2002, en Chilese registraron 1 000; pero en la mayora de los pases de mayor parte de lasintoxicaciones no se reportan a las autoridades. Ambiental: Entorno favorable para el caficultor Uso de productos que preserven el ambiente Contribucin a la calidad de vida de la fauna Proliferacin de ecosistemas benficos La apreciacin que tiene el hombre acerca de los hongos que atacan insectos noest limitada al concepto moderno de su utilizacin para el control biolgico deplagas. Dos milenios atrs los chinos estaban conscientes de la momificacin degusanos de seda por especies de Cordyceps e Isaria. Colocaban efiges de estosgusanos elaboradas en piedras preciosas y semipreciosas en la boca de susbocas, para conferirles el mismo grado de inmortalidad. Las orugas infectadaspor Cordyceps se utilizan en la medicina tradicional china, por lo menos desdehace mil aos, para el tratamiento de la adiccin al opio hasta su consumo comotnicos y aun como afrodisacos Hasta en la dcada de los noventas la mayor cantidad de investigacionesenfocadas al control biolgico se realizaban con bacterias y virus, aunque loshongos representan el grupo ms amplio

Gobierno del Estado de Mxico.

Tecnolgico de Estudios Superiores de Ecatepec


Ingeniera Bioqumica.
Fundamentos de Investigacin Elaboracin de Bioinsecticidas

de patgenos a insectos. Al parecerexista cierto rechazo a utilizar hongos entomopatgenos como biocontroladores. Debido a los factores ambientales que no favorecan el empleo exitoso y a lasdificultades que se presentaban para su produccin a gran escala, junto con suformulacin adecuada como bioinsecticida. No obstante los hongos se hanutilizado para el control de melazas desde 1950. Siendo producidos los primerosmicoherbicidas a principios de la dcada de los ochenta en USA (Auld, 1991).Agostino Bassi (citado por Roberts y Humber, 1981) estableci la teora de losgrmenes que provocaban en animales a mediados de la dcada de 1830, consus estudios sobre las infecciones de Bauveria bassiana en larvas del gusanode seda. Bauveria bassiana es un candidato interesante para emplearse comobioinsecticida pues tiene ventajas con respecto a otros microorganismos comoBacillus thuringiensis (Bt.) y los virus: las cepas aisladas tiene un rango dehospederos amplio e infectan por invasin a travs de la cutcula, de tal formaque pueden atacar fidos, larvas de lepidpteros y colepteros, y otros insectosmasticadores Este hongo se ha producido por fermentacin slida en Rusia, la repblicapopular China y en el Brasil. La produccin deesporas de Beauveria bassiana por fermentacin en medio slido (FMS)representa una alternativa interesante para la obtencin de bioinsecticidaeconmicamente efectivo. Los medios de cultivo utilizados son sencillos, consisten en residuos o productosagrcolas que pueden contener todo tipo de nutrientes necesarios para eldesarrollo de los microorganismos, y pueden obtenerse a bajo costo cerca de lasreas de aplicacin. Requieren pretratamientos simples frecuentemente esnecesario molerlos para reducir el tamao de partcula.

Clasificacin taxonmica del hongo entomopatgeno Beauveria bassiana NOMBRE Beauveria bassiana Vuillemin Reino Fung Divisin Micota Subdivisin Eumicotina Clase Deuterimicetes Orden Moniliales Familia Moniliaceae Gnero Beauveria

Gobierno del Estado de Mxico.

Tecnolgico de Estudios Superiores de Ecatepec


Ingeniera Bioqumica.
Fundamentos de Investigacin Elaboracin de Bioinsecticidas

Especie Bassiana El hongo Beauveria, es uno de los patgenos ms importantes que afectaninsectos, ha sido recuperado de muchos insectos del orden coleptero,lepidptera y homptera y probablemente ataca a todos los artrpodos. Deacuerdo a la literatura existen dos especies: Beauveria bassiana y B.brogniartii. La primera ha sido la ms estudiada. En la actualidad Beauveria bassiana seencuentra en los mercados de algunos pases europeos como Rusia, en formacomercial con el nombre de Beauverin o Boverin Beauveria bassiana es un hongo filamentoso que produce micelio de colorblanco o ligeramente colorado dentro del sustrato o areo. Forma conideoforosconstituidos por filides simples, en manojos o en ramilletes esfricos desimpdulos que crecen en forma de cuellos ramificados. Las conidias sonunicelulares y transparentes, crecen en los plegamientos de los cuellos de lossimpdulos, y pueden tener formas diferentes: globosas, ovales o elipsoidales. Las colonias crecidas sobre medio PDA son de color blanco, aspecto lanoso yalcanzan una altura de 1-2mm. Durante la esporulacin intensa adquieren formacircular (con aspecto de algodn con polvo), de color blanco o cremoso. Elreverso de las colonias es incoloro (Fassatiov, 1986). Caractersticas del proceso de infeccin de B. bassiana Usualmente invade a travs de la cutcula (exoesqueleto quitinoso) del insecto. Las unidades infecciosas casi siempre son esporas, que se unen a la superficiedel integumento, germinan y penetran la cutcula. En algunos casos penetra atravs del tracto digestivo (Debach y Rosen, 1991). En el interior del insecto, B.bassiana se propaga y coloniza el hemolinfo. Roberts y Humber (1981)dividieron el proceso de infeccin en diez pasos: unin de las conidias a lacutcula del insecto, germinacin de las conidias en el insecto, penetracin de lacutcula, crecimiento del hongo en el hemolinfo, produccin de toxinas, muertedel hospedero, crecimiento micelar e invasin de todos los rganos delhospedero, salida de la hifas a travs de la cutcula, produccin de esporas, ydispersin de las esporas por el entorno La unin de las conidias a la cutcula de los insectos es el evento inicial en elestablecimiento de la micosis. Cuando se produce el contacto las esporas seunen fuertemente a la epicutcula (superficie externa de la cutcula) medianteinteracciones hidrfobas no especficas que juegan un papel fundamental en laadhesin (Boucias et al., 1988). La superficie exterior de la pared de las esporas y la epicutcula contienen loselementos determinantes para la unin. La superficie de las conidias de B.bassiana est cubierta de una capa bien organizada de haces entretejidos defibras, compuestas fundamentalmente por carbohidratos que le confierenresistencia contra la deshidratacin, su hidrofobicidad caracterstica, y facilitansu dispersin en el aire (Boucias et al., 1988).

Gobierno del Estado de Mxico.

Tecnolgico de Estudios Superiores de Ecatepec


Ingeniera Bioqumica.
Fundamentos de Investigacin Elaboracin de Bioinsecticidas

Los carbohidratos como -D-manosa -D-glucosa y -galactosamina yglicoprotenas como las lecitinas, presentas en la pared de las conidias, estnimplicados en procesos de quimiotaxis, adhesin e infeccin (Hegedus et al. 1992). Es probable que la formacin de estos carbohidratos pueda ser facilitadacon la correcta formulacin del medio de cultivo utilizado en la produccin deesporas (Lane et al., 1991). En la fase de crecimiento micelar y produccin de esporas, el hongo invadeprcticamente todos los rganos del insecto provocando su muerte. Si lascondiciones de humedad y temperatura ambientales no son las adecuadas, elhongo permanece dentro del cadver que sirve como su reservorio. Cuando serestablecen las condiciones apropiadas el hongo emerge a travs de la cutculay produce esporas (conidias), que se dispersan con las corrientes de aire o agua. En esta fase B. bassiana puede restablecer relaciones endofticas con diferentesplantas, colonizarlas sin daarlas o interactuar de forma especfica con estas,pues no es un hongo fitopatgeno. Se ha demostrado que este hongo puedecolonizar plantas de maz a nivel de los verticilos, moverse por su sistemavascular de forma pasiva, y persistir en su interior por largos perodos. Estacapacidad puede aprovecharse para su utilizacin en el control de plagas. La produccin de toxinas es una caracterstica de la gran mayora de las especies de hongos entomopatgenos. Estas sustancias pueden, en muchos casos, originar la muerte del insecto debido a sus propiedades biocidas; adems actan como inhibidores de las reacciones de defensa del hospedante por alteraciones en los hemocitos y retraso en la agregacin de las clulas de la hemolinfa (Vey yGtz, 1986). Las toxinas que producen los hongos entomopatgenos pueden ser macromolculas proteicas o molculas de tamao medio a pequeo con bajo peso molecular (Roberts, 1981; Vey et al. 2001). Entre las toxinas producidas por hongosentomopatgenos destacan las destruxinas producidas por M. anisopliae como las ms estudiadas. Otros compuestos txicos producidos por otras especies son listados en La muerte del insecto puede resultar de una combinacin de factores incluyendo agotamiento de nutrientes, obstruccin fsica o invasin de rganos y Toxinas producidas por algunas especies de Hifomicetos entomopatgenos. MORFOLOGIA. Beauveria bassiana (Blsamo) Vuillemin: colonias en PDA o MEA con aspecto aterciopelado a polvoriento, raras veces formando sinemas; blancas en los bordes que se vuelven amarillo-plidas, algunas veces rojizas, incoloras al reverso, amarillas o rojizas. Conidiforos abundantes, que se levantan a partir de las hifas vegetativas sosteniendo grupos de clulas conidigenas que se pueden ramificar para originar ms clulas conidigenas, globosas a forma de botella, con un raquis bien desarrollado Conidios hialinos, lisos, globosos a ligeramente elipsoidales, Clamidosporas ausentes. Difiere de B. brongniartii en que tiene las clulas conidigenas ms agrupadas y los conidios globosos.

Gobierno del Estado de Mxico.

Tecnolgico de Estudios Superiores de Ecatepec


Ingeniera Bioqumica.
Fundamentos de Investigacin Elaboracin de Bioinsecticidas

Existen, adems, las bolsas hidrosolubles que ms que una formulacin es unmodo de presentacin de una WP o SP mediante la cual se eliminan los riesgosde malas dosificaciones, se elimina el manipuleo y se minimizan los riesgos porla toxicidad de los productos. Estos envases predosificados se dejan caer en elagua del tanque del equipo de aplicacin y all la envoltura plstica se disuelverpidamente, se libera la formulacin y se mezcla uniformemente con el agua.No hay riesgos de contacto, inhalacin ni salpicadura. Una vez lograda la mezclade aplicacin, sta no es ms ni menos segura que cualquier otra formulacinsimilar de igual principio activo. Varios productores de biocontroles han elegido a polvos humedecibles, entre lasformulaciones secas, debido a su larga vida de estante, buena miscibilidad enagua, y fcil aplicacin con un equipo de atomizacin convencional ya que suspropiedades fsicas le proporcionan la habilidad al producto de mezclarse conagua y formar una suspensin homognea atomizable Formulaciones Desarrolladas En el mundo numerosos grupos de investigadores y empresas productoras seconcentran en el desarrollo de productos comerciales a partir de hongos enforma de grnulos o polvo humedecible entre los que se citan Biofox C (F.oxysporium y F. moniliforme SIAPA, Italia), Mycotal (V. lecanii, Koppert,Holanda), Mycotrol GH (B. bassiana, Mycotech, USA), Green Muscle (M.flavoviride, CABI Bioscience, UK), DiTera (M. verrucaria, Valent (Sumitomo),USA, Japn) (Burges, 1998;Butt y Copping, 2000). Algunas formulaciones granuladas muy sencillas son las del hongo en arroz oarroz molido obtenidas mediante el proceso de produccin masiva del hongo. Otras como las de grnulos de aceite hidrogenado sonutilizadas para conidios deB. Bassiana(Carballo, 1998). Se han evaluado formulaciones en grnulos de alginato usando agentesaumentadores como cscara de naranja seca molida. Existen, adems,procedimientos para la preparacin de formulaciones de micelio o conidios engrnulos de alginato (Carballo, 1998). La temperatura y la humedad son las principales limitaciones para la eficacia de hongos. Varios adyuvantes mejoran la germinacin de las esporas, como es elcaso del aceite de maz sin refinar, que mejora la actividad de Colletotrichumtruncatum (Schwein) Andrus y Morre y reduce los requerimientos de humedadnecesarios para su germinacin. Surfactantes como Tween 20 permiten a laslantas a reducir la tensin superficial y mejoran la dispersin de las esporas enlas gotas. Hay que tener en cuenta la posible accin inhibitoria / estimuladora delsurfactante en la germinacin de las esporas, infeccin y desarrollo (Fernndezy Juncosa, 2002)B. bassiana, fue registrada en 1999 como "Mycotrol" por la EnviromentalProteccin Agencia en Estados Unidos, que es utilizado en campo para elcontrol de saltamontes, mosca blanca, fidos y muchos otros plagas de insectos.

Gobierno del Estado de Mxico.

Tecnolgico de Estudios Superiores de Ecatepec


Ingeniera Bioqumica.
Fundamentos de Investigacin Elaboracin de Bioinsecticidas

Este producto es estable por ms de 12 meses almacenado a 25 C. (Wraight, Jackson, Kock, 2001) Existen otros dos formulados a partir de B. bassianacomercializados como "BotanicGard" que es recomendado para el uso en casasde cultivos y "Mycotrol O" que contiene ingredientes en la formulacin quepermite su uso por agricultores en Estados. La produccin y el uso de los entomopatgenos se han expandido rpidamentey Cuba ha desarrollado capacidades nicas en esta rea. Se han elaboradomuchas tcnicas mejoradas de produccin, cosecha, formulacin, aplicacin ycontrol de calidad para numerosas bacterias y hongos. Los bioplaguicidas basndose en hongos producidos en los CREE, de ampliouso, son: Beauveria bassiana, usada para el control de plagas de colepteros, como losgorgojos que atacan a la batata (camote) y al pltano comn; Verticillium lecanii,para controlar la mosca blanca (Bemisia tabaci), un vector de enfermedadesvirosas en tabaco, tomate, frjol y otros cultivos; Metarhizium anisopliae, paravarias plagas de insectos; y Trichoderma spp, usado como antagonista de lospatgenos del suelo en plntulas de tabaco. Entre los bioplaguicidas en procesode desarrollo a gran escala estn Nomuraea rileyei e Hirsutella thonsomii(Rosset y Moore, 1998). El desarrollo de hongos entomopatgenos como micoinsecticidas ha tenidoobstculos principalmente relacionados a la produccin masiva y la estabilidadpara el almacenamiento y formulacin (Gray, y Markham, 1997; Pell, Eilenberg,Hajek, Steinkraus, 2001; Wraight, Jackson, Kock, 2001). Investigacin limitadaen varias especies de Entomopatgenos pueden haber superado algunos deestos problemas (Pell, Barker, Clarck, Wilding y Anderson, 1998; Shah, Aebi,Tuor, 1998, 2000,2002) pero hay barreras significativas que involucran laproduccin a gran escala as como la formulacin apropiada y la tecnologa deaplicacin. Estos problemas requeriran significante inversin financiera eninvestigacin y desarrollo que necesite unirse fuertemente con la identificacinde mercados apropiados para cualquier producto eventual basado en un hongoentomopatgeno (Shah y Pell, 2003).En general estos hongos estos hongos no forman cuerpos fructferos, tienen alta produccin de esporas, son relativamente fciles de cultivar fuera del hospedante. Los hongos entomopatgenos actan principalmente por contacto, cuando el hongo es capaz de penetrar el insecto e invadirlo, provocndole la muerte por micosis. La mayora de los autores aborda ampliamente el ciclo infectivo de estos hongos dividindolo en dos fases: una parastica y otra saproftica. La primera incluye la adhesin del conidio a la cutcula del insecto, la germinacin (estimulada por los lpidos cuticulares del hospedante en calidad y proporcin), penetracin (complejos multienzimticos con enzimas secretadas como lipasas, quitinasas y proteasas activadas secuencialmente) y multiplicacin del hongo (por blastosporas fundamentalmente) con la consiguiente produccin o no de toxinas, en dependencia de la cepa presente, que finaliza con la muerte del insecto. La segunda fase se caracteriza por una

10

Gobierno del Estado de Mxico.

Tecnolgico de Estudios Superiores de Ecatepec


Ingeniera Bioqumica.
Fundamentos de Investigacin Elaboracin de Bioinsecticidas

colonizacin total con melanizacin y momificacin del individuo, emergencia del hongo y su esporulacin, cuando la humedad relativa microambiental sea alta. Estos conidios pueden diseminarse mediante el viento, el agua, otros organismos y el hombre, para as iniciar un nuevo ciclo infectivo. En el caso de los hongos antagonistas para el control de plagas (patgenos de plantas) se encuentran, dentro de los ms empleados, especies del gnero Trichoderma. Este hongo tiene la capacidad de parasitar a otros hongos lo que se conoce como hiperparasitismo o micoparasitismo, hacia diferentes patgenos de plantas. Su modo de accin es complejo donde estn incluidos el quimiotaxismo, la antibiosis y el parasitismo. La interaccin inicial entre el parsito y el hospedero parece ser del tipo quimiotrfico. La hifa del micoparsito crece directamente hacia el hospedero en respuesta a las lectinas secretadas por este, las que se unen a los residuos de galactosa en la pared celular de Trichoderma siendo la seal que permite dirigir el crecimiento hacia esa zona. Trichoderma secreta enzimas que actan como un complejo con accin sinrgica sobre el patgeno debilitando la pared y permitiendo la difusin de los antibiticos hacia este. Despus del contacto fsico microscpicamente se observa la presencia de haustorios, enrollamiento de la hifa del biocontrol sobre la del patgeno, vacuolizacin, formacin de grnulos, desintegracin del citoplasma y lisis celular. Este gnero actualmente se estudia a profundidad por la respuesta sistmica inducida al ataque de otros patgenos y por ser fuente de genes que codifican para protenas (enzimas como glucanasas, proteasas)) y metabolitos (fitohormonas) con accin estimuladora y defensiva en la planta, los que se estn usando en protocolos de transgnesis en especies de plantas de importancia econmica con resultados muy alentadores Caracterizacin de aislados fngicos para el Biocontrol El mero hecho de identificar al microorganismo taxonmicamente hasta especie implica datos que tienen importancia en la caracterizacin del aislado. Sus caractersticas morfomtricas y culturales son importantes y bsicos para estudios posteriores y ms reproducibles. Estos deben incluir estudios bioqumicos (actividad exoenzimtica, perfiles isoenzimticos especficos como patrn de esterasas, lipasas, fosfatasa alcalina. etc.). Los anlisis isoenzimticos pueden tener como desventaja que los perfiles estudiados no sean suficientemente diferentes y/o las isoenzimas expresadas no aparezcan en un aislado determinado por cuestiones fisiolgicas. Los estudios ms altamente reproducibles son los que se realizan a nivel de ADN (moleculares). Actualmente para que un aislado sea reconocido como apropiadamente caracterizado requiere de al menos un mtodo molecular que lo identifique como tal y en la fase de registro de un producto internacionalmente esta condicin es exigida en pases lderes en Biocontrol. Los estudios moleculares ms usados en hongos para la caracterizacin son los RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism) en los cuales se generan cortes por enzimas de restriccin en el ADN dando lugar a fragmentos de diversas tallas, los que son puestos en contacto con sondas especficas marcadas con un cromgeno o con un istopo radiactivo, que pueden o no acoplarse al

11

Gobierno del Estado de Mxico.

Tecnolgico de Estudios Superiores de Ecatepec


Ingeniera Bioqumica.
Fundamentos de Investigacin Elaboracin de Bioinsecticidas

o los fragmentos producidos por complementariedad de bases (hibridizacin) y luego de una electroforesis en gel de agarosa se genera un patrn de bandas en dependencia de la sonda de hibridizacin, el aislado y la enzima empleada en el corte del ADN, lo cual logra discriminar aislados aparentemente iguales como diferentes cepas. Otro anlisis molecular mucho ms barato pero menos reproducible entre laboratorio son los anlisis genticos del tipo PCR-RAPD (Polymerase Chain Reaction- Random Amplified Polymorphic DNA) los que consisten en un PCR clsico donde los "primers" (por ejemplo cebadores universales) suministrados para la amplificacin son conocidos como buenos para detectar variabilidad entre poblaciones (razas, cepas, etc.). En el mtodo se necesita ADN aislado del hongo mediante un proceso de purificacin clsico (el mtodo de extraccin debe ser suave para no desnaturalizar el ADN). Este ADN se lleva junto al "primer" a varios ciclos de amplificacin donde se tiene una ADN polimerasa resistente al calor y los nucletidos para la polimerizacin adems de cofactores y soluciones buffer. Se realiza una electroforesis y los fragmentos de ADN amplificados se visualizan en el gel. Los patrones de bandas para cada "primer" probado pueden ser iguales o diferentes. Se pueden probar tantos "primers" como se dispongan. La mayor desventaja del PCR-RAPD es que no tiene muy buena reproducibilidad entre laboratorios aunque s tiene el mismo poder de resolucin entre laboratorios cuando se trabaja con las mismas poblaciones, o sea, los patrones de bandas son los que pueden cambiar. Mtodos de aislamiento Los mtodos para aislamiento que se usan ms ampliamente son mtodos clsicos. Para hongos antagonistas se usan races jvenes, por ejemplo, de plantas libre de sntomas tomadas de una zona donde pueda existir algn sntoma de una enfermedad fngica. Las races se lavan abundantemente y se desinfectan muy ligeramente, se trituran y se siembra en medios generales para hongos con antibacterianos aadidos. Se trata de obtener colonias nicas y por observacin al estereoscopio y microscopio ptico se seleccionan las posibles especies controladoras. Tambin se procesa suelo de estas zonas donde se encuentran sorpresivamente plantas sanas o de zonas donde no se observan sntomas de enfermedades producidas por hongos lo cual resulte aparentemente inexplicable. Se realizan diluciones decimales en placa (siembra para obtener unidades formadoras de colonia). Se incuban entre 23-28 grados C y se evalan a partir de las 48 horas). Estos mtodos precisan de experiencia (Anexo 8). Para el caso de los entomopatgenos se traen del campo insectos micosados o sospechosos de micosis (insectos melanizados y/o momificados). Se realizan siembras en medios para hongos (PDA, SDA) con antibiticos y se incuban a 23-27 grados C revisando el material luego de 72 horas y hasta 14 das posterior a las siembras. Igualmente se procesan ootecas o quistes de nemtodos. En todos los casos se desinfectan suavemente en etanol 70% o hipoclorito sdico por 1 minuto al 0.5% y/o alcohol 70%.

12

Gobierno del Estado de Mxico.

Tecnolgico de Estudios Superiores de Ecatepec


Ingeniera Bioqumica.
Fundamentos de Investigacin Elaboracin de Bioinsecticidas

Las muestras de suelo tambin son interesantes para aislar entomopatgenos con insectos trampeadores , o sea, especies altamente susceptibles a los hongos entomopatgenos como es el caso de larvas de lepidpteros. Ejemplo de ello tenemos en Cuba el aislamiento de hongos entomopatgenos con larvas de Galleria mellonella o Corcyra cephalonica procedentes de cras certificadas de laboratorio, los que rutinariamente se usan para enriquecer las colecciones de cultivos Es importante destacar que los estudios no deben realizarse en zonas donde se hayan aplicado o se apliquen microorganismos de las especies que estamos tratando de aislar y siempre debe obtenerse un aislado monosprico para lograr mayor homogeneidad gentica. Mtodos de conservacin El objetivo de la conservacin es mantener el aislado con las caractersticas genticas y fenotpicas originales. Siempre debe conservarse por 2 mtodos diferentes y uno de ellos a largo plazo. Los protocolos de conservacin son muy regulares y se pueden obtener fcilmente desde libros clsicos de Microbiologa o desde INTERNET. A largo plazo tenemos la liofilizacin que se basa en la desecacin extrema al vaco del cultivo del hongo por congelacin profunda de forma que el agua pase rpidamente de slido al estado gaseoso. Tambin se cuenta con conservacin en Nitrgeno lquido pero este mtodo es engorroso pues precisa de tanques metlicos para el N que alcanzar 196 grados C bajo cero. Siempre en los mtodos de congelacin se usan agentes crioprotectores (DMSO, leche descremada, glicerol, etc.). Mtodos como conservacin en suelo previamente esterilizado y luego inoculado y desecado son tiles as como la conservacin en slica gel no indicadora (sin cobre) inoculada previamente con una suspensin del cultivo en leche descremada 5% y luego desecada. Ambos son baratos y de fcil ejecucin. Tambin el aceite mineral sobre cultivos previamente esporulados es un mtodo muy efectivo a mediano plazo. El mtodo ms usado a corto plazo es el de cultivos sobre cuas de medio agarizados nutritivo. En Cuba se han optimizado medios para producir masivamente las esporas (conidios, clamidosporas, etc) en alta concentracin en el cultivo segn los requerimientos de cada aislado, el que luego ser llevado a uno de los mtodos explicados anteriormente para su conservacin. Tecnologas para producciones de hongos. Tecnologas bsicas En el mundo se realizan desde muy puntuales y pequeas producciones de agentes de biocontrol como la tecnologa desarrollada sobre medio agarizado para la produccin de Phlebiopsis gigantea, hongo antagonista basidiomiceto del tambin basidiomiceto Heterobasidion annosum, que es el agente causal de la enfermedad que ms afecta la raz de las conferas en el hemisferio

13

Gobierno del Estado de Mxico.

Tecnolgico de Estudios Superiores de Ecatepec


Ingeniera Bioqumica.
Fundamentos de Investigacin Elaboracin de Bioinsecticidas

norte, hasta producciones a escala industrial como las desarrolladas por Mycotech Corporation que pueden llegar a varias toneladas de Beauveria bassiana anualmente. Los mtodos de produccin varan considerablemente. Muchos estn basados en fermentaciones sobre sustrato slido con granos de cereales donde el arroz es el ms universal. Otros usan sustratos no nutritivos como grnulos de arcilla. Algunos rinden conidios areos en la superficie de cultivos lquidos estticos. Otras tecnologas se desarrollan en tanques de fermentacin para obtener productos a base de micelio, blastosporas o conidios sumergidos. Las 4 formas de produccin fundamentales para hongos son: 1-cultivos bifsicos, donde se desarrolla el inculo en cultivo lquido agitado (de forma rpida) o lquido esttico (ms lento) y luego se pasa al soporte slido. En los sistemas bifsicos siempre se debe optimizar el cultivo de la fase lquida para que promueva un rpido crecimiento del aislado. Es el ms usado a nivel mundial por obtenerse estructuras infectivas de alta calidad y acortarse el tiempo cuando la fase lquida se hace por cultivo lquido agitado. Son semiartesanales (Anexo 10). 2-cultivos sobre soporte slido, siendo una forma de produccin donde se requiere menos equipamiento y se realizan muchas operaciones manuales pero se obtiene estructuras infectivas de alta calidad a concentraciones altas. Son artesanales 3-cultivos lquidos agitados o fermentaciones lquidas con un grado de automatizacin del proceso que puede ser muy alto, son muy rpidos, pero tienen como desventaja el que muchos aislados tienden a crecer como pellets miceliales discretos y/o forman abundantes blastosporas (esporas formadas propagadas por gemacin a partir de fragmentos de micelio originalmente), propgalos estos que no son apropiados por la baja estabilidad intrnseca y poseer per se baj o nulo poder infectivo. En estos sistemas se logra un ptimo aprovechamiento de los nutrientes. Pueden llegar hasta niveles industriales 4-cultivos lquidos estticos, los que constituyen una forma de produccin donde se requiere menos equipamiento y se realizan muchas operaciones manuales pero se obtiene estructuras infectivas de alta calidad a concentraciones bajas pues solamente hay formacin de estructuras deseadas en la interface lquido- gaseosa. Son artesanales Una forma especial de cultivo slido con tecnologa avanzada lo constituyen las fermentaciones en estado slido las que han dado la oportunidad a la industria de desarrollar producciones de bioplaguicidas en birreactores sellados con un grado alto de automatizacin, con principios similares a aquellos de la fermentacin lquida, lo que reduce costos de mano de obra y permite un control eficiente del proceso de produccin donde se logra biomasa de alto valor infectivo y ms resistente a condiciones ambientales adversas. En estos sistemas tambin se logra un ptimo aprovechamiento de los nutrientes pero la inversin de capital inicial es muy alta.

14

Gobierno del Estado de Mxico.

Tecnolgico de Estudios Superiores de Ecatepec


Ingeniera Bioqumica.
Fundamentos de Investigacin Elaboracin de Bioinsecticidas

Para los pases del tercer mundo esta tecnologa presenta menos posibilidades de aplicacin debido a las dificultades econmicas y el alto costo de capital de estos procesos automatizados. La presencia de mano de obra barata y un mercado que es regional y pequeo hace a los sistemas de produccin artesanales (baja tecnologa) viables econmicamente a pesar de requerir muchas operaciones manuales. Descripcin del proceso productivo artesanal ( baja tecnologa ). Parmetros clave CULTIVO INICIAL EN VIALES CON MEDIO AGARIZADO

INOCULACION E INCUBACION DE MEDIOSOLIDOO LIQUIDO (PREINOCULO)

INOCULACION E INCUBACION DE SUSTRATO

SECADO

COSECHA

FORMULACION

ENVASADO

15

Gobierno del Estado de Mxico.

Tecnolgico de Estudios Superiores de Ecatepec


Ingeniera Bioqumica.
Fundamentos de Investigacin Elaboracin de Bioinsecticidas

Diagrama de flujo general del proceso de produccin de hongos por va artesanal. En los sistemas artesanales para la produccin de hongos se establecen de manera general los pasos enunciados en la figura 1. En toda produccin de bioplaguicidas microbianos se parte de un aislado con caractersticas deseadas como agente de biocontrol, el cual es conservado previamente y subcultivado durante el escalado. Los preinculos pueden desarrollarse sobre sustratos slidos (grano arroz, grano trigo, cscara de trigo, cscara de arroz, harina de maz, etc ) incluyendo los medios agarizados de cultivo o por cultivos lquido esttico o agitado (compuestos por combinaciones de materias primas carbonadas y nitrogenadas como melaza de caa de azcar, licor de maz, almidn de maz, sacarosa, extracto de levadura torula, extracto de levadura cervecera, etc.) siendo el objetivo fundamental la obtencin de una biomasa homognea. La relacin carbono (C):Nitrgenos (N) es esencial y de este balance en lo fundamentaldepender el que se logre la formacin de los propgulos deseados. En los hongos, se necesita que la fuente C est en exceso en el medio y el contenido de N sea el factor limitante del crecimiento, lo que desencadena el proceso esporulativo. Los inculos se preparan a partir de subcultivos de preinculos a una concentracin final en el sustrato inoculado de 10(5)-10(7) propgalos/g La eleccin de los sustratos sobre los que se realizar la inoculacin, previa esterilizacin, depender de la disponibilidad local y costo de estos as como de las caractersticas del aislado a reproducir. Se han usado cereales como agentes nutritivos (arroz, trigo, cscara de trigo, cscara de arroz, maz etc.) y como agentes inertes de soporte la vermiculita, grnulos de minerales arcillosos, tela, etc. Con el uso de sustratos inertes las soluciones nutritivas en los que estos se embeben pueden ser balanceados cuidadosamente para asegurar una casi completa utilizacin de los nutrientes y ac despliegan un papel clave tambin el balance C:N. El sustrato puede ser humedecido previa esterilizacin o previa inoculacin dependiendo del tipo de materia prima o combinacin de estas y ajustes realizados. Un exceso de humedad provocara baja disponibilidad de oxgeno y por ende pobre desarrollo del microorganismo. Adems compactara el substrato impidiendo una colonizacin total de su superficie. Por otro lado, una baja humedad podra inhibir el desarrollo del microorganismo al no poner la suficiente cantidad de nutrientes en solucin para ser usado por este adems de la poca resistencia a la desecacin que tienen los hongos en el periodo activo de crecimiento micelial.

16

Gobierno del Estado de Mxico.

Tecnolgico de Estudios Superiores de Ecatepec


Ingeniera Bioqumica.
Fundamentos de Investigacin Elaboracin de Bioinsecticidas

Durante la incubacin se debe regular el rgimen luz-oscuridad. La luz es estimulante en determinadas especies y aislados por lo que este parmetro es ajustable solamente a travs de la experimentacin. Cuando se obtiene la biomasa conidial ptima sobre toda la superficie del sustrato se pasa al proceso de secado para que los conidios permanezcan viables en almacenamiento por mayor tiempo. Este proceso se optimiza con deshumidificadores o aires acondicionados o acelerando la ventilacin con ventiladores lo que depende de las condiciones locales. Posterior al secado y previo al paso final de envasado en el flujo de produccin se realiza la cosecha. Es en este momento que comienza la etapa de formulacin donde se prepara una combinacin de ingredientes de forma que el principio activo (esporas) se mantenga estable, efectivo y fcil de aplicar. Durante todo el proceso la regulacin de la temperatura ambiental es esencial la que debe ser lo ms prxima posible a la temperatura ptima de desarrollo del microorganismo. Control de calidad en la produccin de microorganismos fngicos para el control biolgico. Principales ensayos. Panormica general Un requisito esencial para la produccin de cualquier agente de control microbiano es un sistema de control de la calidad efectivo. La calidad se define como el conjunto de propiedades y caractersticas de un producto o servicio que lo hacen apto para satisfacer las necesidades a las cuales va dirigida. Las normas y procedimientos para el control de calidad de los productos y procesos conjuntamente con los registros, constituyen la garanta para la validacin de las producciones de bioplaguicidas. Un producto con especificaciones bien definidas y con los consiguientes procedimientos de control de calidad asegura su buen funcionamiento y su seguridad, promueve la estandarizacin de los costos de produccin y garantiza su estabilidad en el mercado lo que conlleva a la ganancia de confianza en el consumidor. En el caso de los productos a base de hongos su funcionamiento no confiable por falta de calidad ha limitado su xito en pases en desarrollo donde estos requerimientos son mnimos o no existen. Una produccin con un sistema de calidad establecido tiene un control estricto sobre la salida de su producto al poder analizar la calidad en cada punto crtico implicado en la elaboracin de este. En 1992, en la Reunin del Grupo Activo de Control de Calidad de la Organizacin Internacional de Control Biolgico, se estableci llevar un control de las producciones que implique el seguimiento de la ejecucin de todas las operaciones, procedimientos, equipos y condiciones ambientales de estas con el objetivo de mantener el rendimiento.

17

Gobierno del Estado de Mxico.

Tecnolgico de Estudios Superiores de Ecatepec


Ingeniera Bioqumica.
Fundamentos de Investigacin Elaboracin de Bioinsecticidas

Tambin se plante controlar el proceso de forma que se le d seguimiento a la calidad del producto no terminado, incluido la deteccin de contaminantes, adems de un sistema que controle la calidad del producto final. Esto es muy significativo para el caso de los agentes microbianos fngicos de control ya que para que sean efectivos precisan de que culminen exitosamente un complejo proceso de infeccin. Comparados con los agroqumicos, los sistemas de calidad para la produccin de bioplaguicidas microbianos deben ser ms exhaustivos y especializados. An no existen protocolos estandarizados internacionalmente lo que ha trado como consecuencia que los productores o pases desarrollen sus propios procedimientos de Control de calidad. Puntos crticos de controles de calidad El primer punto donde se controla la calidad en cualquier sistema de produccin es en el subcultivo de la cepa del hongo del cual se parte. Esto incluye los subcultivos de trabajo y los de conservacin. En ambos casos se tienen que establecer mtodos de conservacin y mantenimiento que garanticen la estabilidad gentica y fenotpica del aislado los que deben ser verificables a travs de pruebas bioqumicas y moleculares. Las transferencias sucesivas en medios agarizados deben evitarse. Se debe verificar la pureza del cultivo y la actividad biolgica con la frecuencia necesaria. En el control del proceso de produccin se requiere una descripcin completa de este con los correspondientes controles de calidad y monitoreo de cada paso. El registro de todos los parmetros como temperatura, contenido de humedad del sustrato, pH y monitoreo de la contaminacin debe tenerse por lote de produccin para facilitar el examen de todos los pasos crticos de la produccin desde el producto final hasta el inicio del proceso (trazabilidad). En la preparacin de inculos se debe tener en cuenta su concentracin y pureza. Todos los medios de cultivo deben ser verificados para su esterilidad segura antes y despus de la inoculacin. En el caso de los sustratos desafortunadamente no siempre se tienen materias primas certificadas por lo que cada nuevo lote de materia prima debe ser sometido a un anlisis fsico-qumico y a un chequeo del nivel de esterilidad pre y post inoculacin. Para que la esporulacin sea mxima se necesita una buena rea superficial en relacin al volumen. Las partculas del sustrato individuales deben estar separadas despus de la hidratacin y esterilizacin porque las que quedan pegadas reducen el rea superficial con respecto al volumen cuando se adiciona el agua, limitando el espacio efectivo en que ocurrir la esporulacin. El contenido de humedad del sustrato debe ser ajustado para el crecimiento micelial y la conidiognesis teniendo en cuenta cada combinacin sustrato-aislado y su optimizacin puede ser

18

Gobierno del Estado de Mxico.

Tecnolgico de Estudios Superiores de Ecatepec


Ingeniera Bioqumica.
Fundamentos de Investigacin Elaboracin de Bioinsecticidas

compleja. El rango de humedad 35-60% v/p es usualmente usado. Incrementos en el contenido de humedad del sustrato tienden a disminuir la disponibilidad de oxgeno lo que se puede agravar en el escalado debido a la compactacin de grandes masas de este. La aeracin en la produccin es otro parmetro que determina la calidad de las producciones partiendo de que todos los hongos mitospricos (mixomicetos) son aerobios y requieren oxgeno para el crecimiento y la conidiacin. En los sistemas de produccin artesanales es difcil determinar el requerimiento de oxgeno de un determinado hongo y la evaluacin se hace muy cualitativamente. La mayora de los sistemas de produccin de Amrica Latina, China y del programa internacional LUBILOSA, estn basados en el intercambio del aire entre la cmara de crecimiento y el ambiente externo. Otro factor crtico es la temperatura de incubacin, la que vara segn el tipo de crecimiento requerido no solo entre especies sino tambin para el aislado en cuestin. Este parmetro debe ser monitoreado cuidadosamente en el escalado, debido a que el calor que se produce durante el metabolismo puede provocar reas con temperaturas por encima de la ptima en el cultivo. Tambin se debe tener en cuenta el rgimen luz-oscuridad cuando se selecciona el sistema de produccin. En la etapa de post-cosecha, previo envasado, se precisan mtodos para extraer y/o formular los propgalos (conidios generalmente). Por ejemplo, si se necesitan conidios para aplicacin a volmenes ultra bajos se requiere de un fino polvo con partculas uniformes por lo que la extraccin debe ser eficiente y selectiva para los conidios garantizando su viabilidad. Con respecto al monitoreo de la contaminacin del proceso se sabe que todas las producciones microbianas tienen el riesgo de contaminarse y en las artesanales esto puede ocurrir con ms frecuencia si no se cumplen las buenas prcticas de produccin debido al gran nmero de operaciones manuales. Las contaminaciones pueden conducir a una prdida de eficacia del ingrediente activo por la dilucin con los microorganismos que han competido, adems del posible efecto inhibitorio de los metabolitos secundarios producidos por los contaminantes donde el reconocimiento y la cuantificacin del grado de contaminacin son importantes para determinar cualquier posible riesgo a la salud humana y demostrar que no haya entrada de patgenos humanos. Por ello se deben registrar todos los pasos crticos del sistema de produccin y el resultado de los anlisis de contaminantes para identificar la fuente y tomar medidas preventivas. Esto incluye el subcultivo del que se parta para preparar los pre-inculos, los inculos, el sustrato antes y despus de esterilizado y el producto final. Las especificaciones para el nivel permisible de contaminantes en el producto final dependern de los mtodos de produccin y el procesamiento del producto en la cosecha, post-cosecha y la formulacin, etapas ltimas que se realizan en ambientes no estriles. Por tanto se debe establecer un nivel base de entrada de contaminantes a travs de un estudio bien controlado,

19

Gobierno del Estado de Mxico.

Tecnolgico de Estudios Superiores de Ecatepec


Ingeniera Bioqumica.
Fundamentos de Investigacin Elaboracin de Bioinsecticidas

chequeando los controles en las primeras etapas del proceso para demostrar que el nivel de contaminantes del producto final es debido inevitablemente a las ltimas fases.

Principales ensayos En general, el control de calidad del producto final es el punto ms importante que garantiza el funcionamiento de ste y su aceptacin a largo plazo. Si el producto tiene una viabilidad alta al igual que una adecuada virulencia, se maximiza la probabilidad de que acte bien en el campo. Deah que las pruebas de ms amplia aceptacin para los productos bioplaguicidas a base de hongos sean: 1- la prueba de viabilidad, donde se evala si la clula est o no viva. Esto puede hacerse a travs de una prueba de germinacin conidial a un tiempo y temperatura determinados en medios nutritivos agarizados o lquidos o por conteo de viables en placa (ufc/g o ml de producto) 2- los bioensayos donde se comprueba la estabilidad de la patogenicidad y la virulencia del aislado producido masivamente. Se usan individuos de la especie plaga hacia la cual va dirigida el producto. En nuestro caso, el insecto para los entomopatgenos o el hongo fitopatgeno para el caso de los hongos antagonistas como Trichoderma. 3- la determinacin del nivel de contaminantes (pureza) que se realiza tomando determinada cantidad del producto y realizndose conteo de viables posteriores a la siembra en medios nutritivos generales para hongos y bacterias 4- la concentracin de unidades infectivas que se determina por conteo directo en cmara de Neubauer o por conteo de viables en medios agarizados 5- la determinacin de la estabilidad del producto en almacenaje lo que constituye un factor crtico considerando la no necesidad de refrigeracin o algn tratamiento especial. Los mtodos de secado y cosecha, la formulacin y el embalaje deben tenerse en cuenta para preservar la calidad del conidio. DIAGRAMA DE BLOQUES DESCRIPCIN DEL DIAGRAMA REMOJADO Debido a que nuestra materia prima tiene una estructura muy rgida, sta debe remojarse por 24 hrs. para que los carbohidratos estn disponibles y sean fcilmente asimilables por el hongo. ESTERILIZACIN Nuestro sustrato es arroz quebrado el cual costar $3.5/Kg, nos da un rendimiento de 2.5 X 1010 esporas/Kg de sustrato, para poder comenzar con nuestro proceso debemos cerciorarnos de que nuestro proceso no ser blanco de contaminacin ya que podra disminuir el rendimiento, se llevar a cabo en una autoclave por 15 min., a 15 psi. FERMENTACIN

20

Gobierno del Estado de Mxico.

Tecnolgico de Estudios Superiores de Ecatepec


Ingeniera Bioqumica.
Fundamentos de Investigacin Elaboracin de Bioinsecticidas

Una vez que se tiene listo el sustrato se inocula la charola y las condiciones a las que debe estar son: 28C, con humedad de 75%, pH 5-6 durante 5 das. Esterilizacin de materia prima

DETERMINACIONES ANALTICAS Conteo de esporas El nmero de esporas se determin por conteo directo en cmara de Neubauer de 16 cuadros por cuadricula, se contaron 9 cuadriculas de las 25 de la cmara, utilizando la dilucin adecuada. Estas determinaciones tambin se llevan a cabo despus del tamizado, para su efectividad. Viabilidad La viabilidad de las esporas se determin haciendo diluciones sucesivas en agua destilada estril, hasta obtener concentraciones de esporas de 10, 100 y 1000/mL Estas tres diluciones se sembraron por triplicado, en cajas de Petri que contenan 20mL de PDA y se contaron las esporas germinadas a las 72 horas de incubacin a una temperatura de 28C.

21

Gobierno del Estado de Mxico.

Tecnolgico de Estudios Superiores de Ecatepec


Ingeniera Bioqumica.
Fundamentos de Investigacin Elaboracin de Bioinsecticidas

Mediciones de pH La medicin de pH se realiz directamente en la suspensin obtenida de las muestras de las fermentaciones slidas. Para realizar las mediciones se utiliz un potencimetro; este se calibr con soluciones amortiguadoras de pH 4.0 y7.0. SECADO Se realiza en cuartos de temperatura controlada con un suministro de aire de 0.75 vkgm (litro de aire/Kg de medio hmedo por minuto) para quitar el agua que ya no es requerida ya que podra contaminarse nuestro producto adems de que facilita el manejo de ste, MOLIDO Aqu se hace otro molido con la finalidad de mezclar y homogeneizar el sustrato no consumido con las esporas pues ser nuestro vehculo, utilizando un molino de pistn. TAMIZADO Esta operacin tiene como objetivo homogeneizar el producto ya que los aspersores se tapan muy fcilmente, por eso debemos tener un tamao de partcula considerablemente pequeo, se utiliza un tamiz de malla 10. PRUEBAS DE CONTROL DE CALIDAD La comercializacin de controles biolgicos basados en hongos entomopatgenos requieren de un control adecuado de las propiedades biolgicas, fsicas y qumicas realizadas por el departamento de Control de la Calidad de la firma productora que asegure al usuario un producto de mxima eficacia en condiciones de campo (Vlez, 1997; Carballo, 1998; Monzn, 2001). Algunas pruebas microbiolgicas recomendadas son: Concentracin de esporas: Establece la dosificacin del producto. Germinacin de esporas: Determina la viabilidad del hongo en la formulacin. Pureza: Revela la proporcin del agente biolgico en la formulacin e identifica los microorganismos contaminantes con el objetivo de mejorar el proceso de produccin y formulacin de los entomopatgenos. Adems, es necesario realizar algunas pruebas fsicas de acuerdo al tipo de formulacin. (Vlez, 1997; Carballo, 1998) Por ejemplo los polvos humedecibleses necesario realizar pruebas de suspendibilidad, humectabilidad, contenido dehumedad y tamao de partcula (Aroonrat, Manop y Uthai, 2003). EMPACADO Las esporas se empacarn (llenadora envasadora automtica) en bolsas depolipropileno con una capacidad de 240g., enseguida se pondrn en cajas decartn para evitar el contacto con la luz UV ya que afecta considerablemente elproducto.

22

Gobierno del Estado de Mxico.

Tecnolgico de Estudios Superiores de Ecatepec


Ingeniera Bioqumica.
Fundamentos de Investigacin Elaboracin de Bioinsecticidas

ALMACENAMIENTO Se debe almacenar a una temperatura de 10C evitando el contacto con laradiacin UV, ya que puede perder su viabilidad y por ltimo se distribuye.

ESCALAMIENTO DE FERMENTACIN Al analizar los resultados obtenidos los experimentos realizados a diferentesescalas de fermentacin para la produccin de esperas B. bassiana por FMS. Seconoce que el cambio de esta escala afecta un gran nmero de parmetrosfisicoqumicos y biolgicos que influyen sobre la productividad de los procesosde fermentacin. El trmino escala se refiere tanto al volumen como a lasdimensiones lineales del fermentador (Trilli, 1986).Lonsane et al. (1992) analizaron varios aspectos de los procesos de FMS que seafectan cuando se aumenta la escala de fermentacin. Los aspectosconsiderados fueron: las variaciones en la cantidad de biomasa formada, lanecesidad de producir inculos en gran escala, la esterilizacin del medio decultivo, el suministro de aire, la agitacin, la remocin de calor, el contenido dehumedad de los slidos, el control de pH y de la contaminacin, laheterogeneidad del sistema de FMS, la purificacin de los productos obtenidos,la disposicin de los residuos y el manejo de los slidos. Debido a que es una variable de proceso importante en la FMS ya que cumplevarias funciones como el suministro de O2, la remocin de CO2 y otrosmetabolitos voltiles. Adems se utiliza para mantener la temperatura y lahumedad en el medio slido (Losane et al., 1992; Mudgett, 1986; Prior et al, 1992; Ramana-Murthy et al., 1992). Las condiciones para la transferencia degases en la FMS tambin favorecen regimenes variados de transferencia,dependiendo del mtodo de aireacin empleado. Esto puedo producir limitacinde O2 o aumentar la concentracin de CO2 hasta niveles inhibitorios en el gasque circula por los espacios vacos del lecho de slidos (Mudgett, 1986). Decidimos no usar un sistema de aire acondicionado debido a que es muycostoso, y encontramos que los sistemas de ventilacin controlada son muyeficientes adems de que ahorran energa. Se colocan los ventiladores que extraen calor del cuarto de fermentacin,generalmente un buen arreglo de los "racks" hace que este salga fcilmente, es mejor colocar los ventiladores al final de los racks. El sistema de temperaturacontrolada activa los ventiladores por medio de sensores para sacar el aire,estos se pueden activar cuando la temperatura en el cuarto sea mayor a 32C. CAPITULO III SELECCIN DE TECNOLOGA Se han formulado y comercializado varios insecticidas a partir de Beauveriabassiana, sin embargo, estos se han obtenido mediante un mtodo deproduccin en sustrato slido, ya que cuando se realiza la propagacin deBeauveria bassiana en medio lquido disminuye notablemente su virulencia. III.1 FERMENTACIN EN MEDIO SUMERGIDO Se utilizan sustratos en forma de sal disueltos en agua, y este proceso se realizaen fermentadores cerrados donde el control se realiza mediante electrodos quetienen contacto directo con el medio, la desventaja de este tipo de control es quesi el electrodo se descompone o se descalibra, se tienen problemas en cuanto alcontrol del proceso.

23

Gobierno del Estado de Mxico.

Tecnolgico de Estudios Superiores de Ecatepec


Ingeniera Bioqumica.
Fundamentos de Investigacin Elaboracin de Bioinsecticidas

Este tipo de fermentacin es muy susceptible a contaminacin debido a que losmedios deben ser muy ricos en nutrientes y a causa de esto pueden crecermicroorganismos distintos a los deseados. El diseo de los medios de cultivo es complejo debido a que se requierenfactores de crecimiento y stos tienen un costo muy elevado son ineludibles porsu vital importancia para el desarrollo del hongo y por ende para suesporulacin.Otra desventaja es el costo de los reactores biolgicos es muy alto y porconsiguiente se deben de aprovechar al mximo, a consecuencia de esto loslotes deben ser grandes para explotar la infraestructura. III.2 FERMENTACION EN ESTADO SEMISLIDO La nica diferencia de sta tecnologa es que la esporulacin se lleva a cabo enmedio sumergido y las esporas producidas se propagan en el medio slido (statecnologa se mencionar adelante) para proceder con la fermentacin. Un proceso novedoso y con mucho potencial que ha dado excelentes resultadosal que han denominado "de fermentacin en estado slido". Este sistema, quegeneralmente produce entre cinco y 20 veces ms que el convencional, puedeser utilizado para elaborar antibiticos, enzimas microbianas, cido ctrico,colorantes, estimulantes de crecimiento vegetal, antitumorales, plaguicidas yherbicidas. Para llevar a cabo esta fermentacin fue necesario contar con cepas de altaproduccin especializadas en estado slido, porque las existentes para mediolquido muchas veces no rinden tan bien en el primero, y viceversa. Y laingeniera gentica representa la mejor forma de lograrlo Los medios de cultivos utilizados en la FMS son sencillos, consisten en residuoso productos agrcolas que pueden contener todos los nutrientes necesarios parael desarrollo de los microorganismos, y pueden obtenerse a bajo costo cerca delas reas de aplicacin. Requieren de pre tratamientos simples, frecuentementesolo es necesario molerlos para reducir el tamao de partcula. El bajo contenidode agua en los slidos permite trabajar con requerimientos de asepsia mnimosen el proceso. Esto simplifica la tecnologa y hace viable su aplicacin prctica,sobre todo en zonas donde la mano de obra no es calificada. Por otro lado lautilizacin de todo el material procesado en la formulacin del producto finalelimina la posibilidad de generacin de corrientes residuales con altas cargasorgnicas, y los consiguientes problemas de contaminacin del medio ambiente. Otras variables que deben considerarse en el proceso de la fermentacin comola temperatura ptima de crecimiento de B. bassiana oscila entre los 28 y 32C;evitar la acumulacin del calor y evitar la inhibicin o reduccin de lapatogenicidad, as como el pH inicial ptimo de entre 6.8-7.2 (Galn, et al.,1996), ya que al oxidar los carbohidratos produce cidos orgnicos, lo soluciona al neutralizar con lcali (Dulmage, et al., 1990).

24

Gobierno del Estado de Mxico.

Tecnolgico de Estudios Superiores de Ecatepec


Ingeniera Bioqumica.
Fundamentos de Investigacin Elaboracin de Bioinsecticidas

25

Gobierno del Estado de Mxico.

Tecnolgico de Estudios Superiores de Ecatepec


Ingeniera Bioqumica.
Fundamentos de Investigacin Elaboracin de Bioinsecticidas

De acuerdo con la informacin contenida en la tabla donde se analizan ventajasy desventajas de dos tecnologas, obtenemos que para la fermentacin encultivo sumergido (CS) se requiera un mayor nmero de pasos para obtener elproducto final. Analizaremos con base a tres parmetros (costo, medio de cultivo y Rendimiento), cual es la tecnologa ms adecuada para nuestro proyecto.

III.4 MATRIZ DE DECISION PARA SELECCIN DE TECNOLOGIA Los principales factores a considerar en la seleccin de tecnologa son: a) Costo: La fermentacin en cultivo sumergido resulta la ms cara de lastecnologas analizadas porque el proceso requiere fermentadores biolgicos quetienen precios muy altos. La fermentacin en medio slido es barata, ya que utiliza equipo muy sencillo. b) Medio de cultivo: Tanto en fermentacin sumergida, como en fermentacin enestado semislido, los medios de cultivos utilizados son muy complejos, porquerequieren una preparacin especfica para el microorganismo, no as en lafermentacin en medio slido, para este tipo de fermentacin los cultivos sonmuy sencillos, se utilizan granos de cereales o desechos agrcolas. c) Rendimiento: Los rendimientos para las tres tecnologas no son muy variados,pero en la FMS se obtienen mejores rendimientos que en las otras dosfermentaciones.

Proceso de recobrado en las producciones slidas de hongos para biocontrol en la agricultura. Almacenaje. Registro. Elementos de bioseguridad. Recobrado de producciones slidas de hongos Cuando se obtiene la biomasa conidial ptima sobre toda la superficie del sustrato se pasa al proceso de secado para que los conidios permanezcan viables en almacenamiento por mayor tiempo. Este proceso se optimiza con deshumidificadores o aires acondicionados o acelerando la ventilacin con ventiladores lo que depende de las condiciones locales (Anexo 15 y Anexo 16). Posterior al secado y previo al paso final de envasado en el flujo de produccin se realiza la cosecha. Es en este momento que comienza la etapa de formulacin donde se prepara una combinacin de ingredientes de forma que el principio activo se mantenga estable, efectivo y fcil de aplicar. Aqu entran los mtodos de separacin de propgulos para realizar las formulaciones que varan considerablemente de producto a producto donde los procedimientos que se llevan a cabo dependern del uso al que vayan dirigidos estos. As los propgalos separados pueden mezclarse con aceites vegetales, minerales, kerosene, agua, con aditivos como protectores UV, materiales como arcillas que den volumen y sirvan para hacer un producto ms manipulable. En el caso de los conidios, si el uso aconsejado es para plagas del suelo, estos se pueden dejar sobre el sustrato que se obtuvieron y la aplicacin hacerse directamente.

26

Gobierno del Estado de Mxico.

Tecnolgico de Estudios Superiores de Ecatepec


Ingeniera Bioqumica.
Fundamentos de Investigacin Elaboracin de Bioinsecticidas

En muchos casos, posterior a la cosecha y antes de ser formulados los propgulos, se realiza un proceso de extraccin y concentracin. En este paso es decisivo lograr una humedad del biopreparado menor de 15% y poca particulacin del sustrato. Si se necesitan conidios para aplicacin a volmenes ultra bajos se requiere de un fino polvo con partculas uniformes por lo que la extraccin debe ser eficiente y selectiva para los conidios. Esto clsicamente se ha logrado con tamices que permitan seleccionar a travs de un tamao de poro crtico la mayor parte de los conidios y separarlos del resto del sustrato, lo cual es engorroso, consume mucho tiempo, genera gran cantidad de aerosoles y no garantiza uniformidad en las partculas obtenidas aunque es factible en sistemas de produccin de muy bajo costo para almacenar esporas y/o formularlas. Sin embargo, en la ltima dcada se encuentran en el mercado equipos que se recomiendan para la separacin de esporas de hongos entomopatgenos y antagonistas a partir de sustratos como arroz, trigo, etc u otros que con determinadas modificaciones ingenieriles se pueden adaptar para estos fines. Estos cosechadores de esporas permiten la eliminacin de partculas grandes menores que 100 m las que pueden bloquear los orificios de los aspersores y filtros en los equipos de aplicacin, una alta calidad de la separacin de esporas, lo cual mejora la estabilidad fsica de las formulaciones y una operacin segura ya que la generacin de aerosoles es mnima. Por ejemplo, CABI- BioScience de Reino Unido comercializa un cosechador de esporas bajo el nombre de Mycoharvester (MH). Con el modelo industrial MH-3 se logra un procesamiento de media tonelada diaria de sustrato lo que optimiza tambin espacio para el almacenamiento por el nivel alto de concentracin de esporas que se logra. Entre las desventajas de equipos muy especializados en el mercado figuran el alto precio y la poca eficiencia en la separacin de las esporas para algunos aislados y especies fngicos. Habitualmente los conidios concentrados son secados con slica gel hasta valores menores de un 5% humedad relativa. Para Metarhizium se ha logrado una sobrevivencia mayor del 90% al ao sin refrigeracin y hasta 3 aos en fro a 5 grados C (Anexo 18). Almacenamiento de los bioproductos Actualmente no se han logrado productos para biocontrol formulados de forma estable por ms de dos aos sobre una base econmica racional. Sin embargo, la opcin tecnolgica de concentrar y separar esporas desarrolladas sobre sustratos slidos est siendo cada vez usada. El empacado es esencial, de forma que se garantice una humedad relativa baja del producto y una temperatura menor de 20 grados C para por al menos tener un preparado viable por 3 -6 meses. Estos dos parmetros son los que ms influyen en la viabilidad de los propgalos durante el almacenaje. La refrigeracin de las esporas a 5 grados C y humedades relativas menores del 1% en el producto, tecnolgicamente son posibles pero econmicamente no, de ah que se ajusten estos parmetros segn el coste real para cada productor, de acuerdo a la sobrevivencia lograda, a niveles superiores. La biodegradabilidad del producto tambin est muy influenciada por la humedad y la temperatura de forma que se debe ajustar un rango permisible de contaminantes que sea

27

Gobierno del Estado de Mxico.

Tecnolgico de Estudios Superiores de Ecatepec


Ingeniera Bioqumica.
Fundamentos de Investigacin Elaboracin de Bioinsecticidas

tolerable. Adems, hay formulaciones que son dainas en almacenaje a mediano plazo como es el caso de los aceites vegetales que daan la pared de la espora y la vuelven no viable en pocas semanas. Muchos productores reconocidos almacenan esporas y formulan de acuerdo a la demanda del mercado pero en las pequeas granjas (fincas) el mtodo ms aconsejable es extraer con aceites vegetales las esporas y vender este formulado al productor agrcola o comercializar el preparado seco y empacado sin ningn otro proceso posterior listo para aplicar en solucin acuosa con algn agente tensoactivo no agresivo (tween, agral, tritn, detergente botnico, etc.). Registro de bioplaguicidas microbianos Los productos a base de microorganismos o metabolitos obtenidos para el biocontrol deben ser seguros, virulentos a las especies diana, libres de patgenos humanos y de calidad consistente y reproducible. Los hongos usados en el biocontrol de plagas agrcolas afortunadamente pueden ser propagados masivamente sin la intervencin directa de un hospedante vivo, lo que evita contaminaciones bacterianas adicionales, el mantener cras de insectos u otro hospedante sanitariamente adecuadas, laboratorio. Estos aspectos facilitan su registro. No obstante, en el mundo existe una marcada diferencia entre pases desarrollados y en desarrollo en cuanto a los requisitos para registrar un producto. De esta forma en muchos pases en desarrollo la industria de productos biocontroladores de plagas no est regulada o muy pocas exigencias existen al respecto lo que hace que salgan al mercado productos de pobre calidad. Esto se debe a que las pruebas de calidad incluyen mayores gastos de capital y de mano de obra calificada y al desconocimiento y/o ausencia parcial o completa de protocolos de calidad con amplia aceptacin internacional. De hecho, no se cuenta con normas internacionales de calidad aprobadas. Todo esto puede desacreditar el prestigio de los bioproductos por parte de los productores y endentece la adopcin de los nuevos mtodos de trabajo con bioplaguicidas. En pases donde se exige una rigurosa informacin del producto que se quiere registrar las autoridades reguladoras (en pases desarrollados y en desarrollo que son muy exigentes a la hora de registrar un producto) demandan pruebas poco realistas por desconocimiento sobre estos productos, a los que muchas veces tratan de aplicarle los mismos requerimientos que a las molculas sintticas qumicas. Otras veces exigen pruebas econmicamente inaceptables. En los ltimos aos han surgido grupos de trabajo fuertes donde se han asociado importante productores de biolgicos, instituciones de investigacin prestigiosas y organismos reguladores para lograr una mejor armonizacin y resolucin ms efectiva de estos problemas. Hoy da se cuentan con instituciones lderes que tienen establecidos protocolos para control de calidad y toxicidad e impacto ambiental de estos bioproductos. Se trabaja arduamente para lograr

28

Gobierno del Estado de Mxico.

Tecnolgico de Estudios Superiores de Ecatepec


Ingeniera Bioqumica.
Fundamentos de Investigacin Elaboracin de Bioinsecticidas

establecer estas pruebas en los laboratorios que se dedican a estas producciones. Una vez que se logre un acuerdo general el siguiente paso ser la implementacin de sistemas de acreditacin externos (tales como ISO 9000, Buenas prcticas de produccin (BPP GMP), los que corroborarn la calidad de los productos y su inocuidad en los pases desarrollados. En los subdesarrollados, los protocolos y entrenamientos se pueden ofertar a travs de organismos de cooperacin internacional especializados como el IBCD (International Biopesticide Consortium for Development) o el IBMA (International Biocontrol Manufacturers Association). Sin embargo, en los ltimos 5 aos la industria de bioplaguicidas se ha fortalecido con productos de ms calidad conjuntamente con la prohibicin en muchos pases, especialmente desarrollados, de molculas qumicas plaguicidas y la certificacin de sistemas orgnicos donde se contempla el uso de productos bioplaguicidas. Por ejemplo, la EPA (Environmental Protection Agency of USA) obtiene la informacin de una Oficina adjunta (Office of Prevention, Pesticides and Toxic Substances, United States Environmental Protection Agency) que se dedica a la evaluacin de pruebas de plaguicidas y sustancias txicas, las que se envan a la EPA para su revisin bajo las regulaciones federales. En general se exigen estudios que identifiquen a nivel molecular el aislado, estudios toxicolgicos (teratognicos, toxicidad crnica, subcrnica y aguda) incluyendo genotoxicolgicos o carcinognicos en dependencia del producto. A continuacin se listan requerimientos exigidos en los pases lderes en biocontrol desarrollados y en algunos en desarrollo como Cuba. Para el registro del producto se necesitan conocer los siguientes datos: Nombre genrico (cientfico), tipo de plaguicida (insecticida, fungicida biolgico, etc.), datos completos del grupo que lo produce, usos y formulaciones (plaga que controlar, tipos de cultivo, tipos de formulaciones (polvos humedecibles, concentrados lquidos), mtodos de aplicacin (preparado disuelto en agua con adyuvantes, equipos de aplicacin, cantidad que se aplica, etc.), literatura cientfica que apoye seguridad de uso, estudios de patogenicidad en especies no diana, bateras de ensayos con animales de laboratorio que incluyan mamferos por diferentes vas: oral, inhalacin, tpica, intravenoso, etc). Algunos estudios se pueden evadir por el anlisis de vas de exposicin ms probables a que se expone el productor del biocontrol o el usuario final producto adems de un estudio mdico riguroso de voluntarios expuestos a este. Determinar los pasos crticos del proceso productivo para evaluar posible contaminacin microbiana y cuando esta ocurra asegurar que en ningn lote hay patgenos humanos ni a animales. Estudios ecotoxicolgicos (seguros a peces, aves, reptiles, abejas, otras especies de plantas, etc.), algunos de los cuales no se aplican segn el uso al que va dirigido el producto. Destino del producto en el ambiente (por ejemplo si contamina estuarios, ros, etc). Caractersticas fsicas y qumicas (pH, densidad, color, olor). Adems de las pruebas de calidad biolgicas,Elementos de bioseguridad en la produccin de bioplaguicidas. Buenas Prcticas de produccin y diseo de instalaciones

29

Gobierno del Estado de Mxico.

Tecnolgico de Estudios Superiores de Ecatepec


Ingeniera Bioqumica.
Fundamentos de Investigacin Elaboracin de Bioinsecticidas

. Conceptos La bioseguridad es un conjunto de medidas cientfico-organizativas y tcnico-ingenieriles destinadas a proteger al trabajador directamente, a la comunidad y al ambiente, de los riesgos que entraa el trabajo con estos agentes. El desarrollo de la biotecnologa a nivel mundial ha incrementado el nmero de personas que manipulan o estn en contacto con agentes biolgicos, de ah que haya aumentado la preocupacin por el riesgo al que pueden estar expuestos. Al trabajo con microorganismos se asocian riesgos biolgicos, fsicos, qumicos y psicofisiolgicos. El riesgo biolgico es la probabilidad de que ocurra un dao sobre el personal del laboratorio, los animales o el ambiente asociado a la produccin, uso y manipulacin general de los agentes biolgicos. Grupos de riesgos y particularidades La exposicin al riesgo biolgico puede ser directa o indirecta. No todos los trabajos con microorganismos tienen igual nivel de riesgo, ya que ste depende de la peligrosidad del agente para las personas y el ambiente. La clasificacin de agentes biolgicos en grupos de riesgo se realiza considerando varios criterios: 1.- Capacidad del microorganismo para producir dao. 2.- Modo de transmisin o diseminacin. 3.- Gama de hospedantes del microorganismo. 4.- Disponibilidad de tratamiento eficaz. 5.- Disponibilidad de medidas eficaces para eliminar riesgo en la comunidad y el ambiente. 6.- Concentracin y volumen que se trabaja. Atendiendo a lo anterior se establecen cuatro grupos de riesgo para microorganismos potencialmente patgenos al hombre, a los animales y al ambiente. Los de biocontrol estn agrupados en los grupos de riesgo ms bajos que son el Grupo 1 y el grupo 2 de 4 grupos que existen en total. Grupo 1.- Escaso riesgo, pocas probabilidades de ser patgenos al hombre y animales. Por ejemplo: microorganismos de la industria lctea, de vinos, para produccin de antibiticos, as como los que se emplean en el control biolgico de forma general. Grupo 2.- Riesgo individual moderado y bajo para la comunidad. Pueden provocar enfermedades en el hombre y animales. Pocas probabilidades de afectar al personal del laboratorio y al medio

30

Gobierno del Estado de Mxico.

Tecnolgico de Estudios Superiores de Ecatepec


Ingeniera Bioqumica.
Fundamentos de Investigacin Elaboracin de Bioinsecticidas

ambiente. Cuando ocurre la exposicin el laboratorio puede provocar infeccin grave, pero existen medidas para eliminarlo y la propagacin a la comunidad es limitada. En el trabajo con microorganismos deben realizarse anlisis de riesgo Los anlisis de riesgo tienen dos etapas: 1.- Estimacin del riesgo 2.- Manejo del riesgo. 1.- La estimacin del riesgo interpreta y evala la informacin, e identifica el posible peligro y las consecuencias asociadas. 2.- El manejo del riesgo determina la poltica de mercado para decidir cmo eliminar el riesgo estimado. Por otra parte, la percepcin pblica del riesgo y los beneficios de una tecnologa influyen en la regulacin, por lo que los alcances del riesgo y sus regulaciones se deciden frecuentemente considerando la percepcin pblica en relacin con las bases cientficas correspondientes. El anlisis de riesgo, teniendo en cuenta solo los aspectos cientficos, probablemente no son del todo acertados, de ah que los criterios de la opinin pblica pueden ser muy importantes. Los riesgos principales de los bioplaguicidas son: 1.- Patogenicidad sobre organismos no diana (blanco). 2.- Toxicidad. 3.- Competitividad por espacio con otros microorganismos. 4.- Alergia. Las pruebas de seguridad deben estar dirigidas a: - Seguridad sobre vertebrados mediante pruebas toxicolgicas de laboratorio. - Efecto sobre invertebrados mediante bioensayos. Para evitar el escape de los microorganismos se han desarrollado una serie de procedimientos, mecanismos y adecuaciones fsicas que se conocen con el trmino de contencin. Contencin Todo lo que implique un control sobre la diseminacin del agente biolgico est relacionado con la contencin. En general, hay dos tipos de contenciones:

31

Gobierno del Estado de Mxico.

Tecnolgico de Estudios Superiores de Ecatepec


Ingeniera Bioqumica.
Fundamentos de Investigacin Elaboracin de Bioinsecticidas

Biolgica: conjunto de procedimientos que alteran genticamente al ciclo de vida de los organismos y slo pueden producirse artificialmente en condiciones controladas. Fsica: tcnicas, procedimientos de laboratorio, operaciones, equipos de seguridad, diseo de instalaciones. Buenas Prcticas de Produccin Las Buenas Prcticas de Produccin (BPP) son una herramienta bsica para la obtencin de productos seguros que se centralizan en la higiene y forma de manipulacin. Los elementos ms importantes son el cumplimiento de las tcnicas y prcticas adecuadas en instalaciones adecuadas. 1. Son tiles para el diseo y funcionamiento de las biofbricas que incluyen proceso productivo y productos finales. 2. Contribuyen al aseguramiento de una produccin de bioproductos segura. 3. Son indispensables para la aplicacin del Sistema HACCP (Anlisis de Peligros y Puntos Crticos de Control) de un programa de Gestin de Calidad Total (TQM) o de un Sistema de Calidad como ISO 9000. 4. Se asocian con el Control a travs de inspecciones del establecimiento. Para aplicar las BPP se necesita tener en cuenta: 1. Materias Primas La calidad de las Materias Primas no debe comprometer el desarrollo de las Buenas Prcticas. Hay que tener en cuenta medidas para evitar contaminaciones qumica, fsica y/o microbiolgica. 2. Establecimientos Hay que tener en cuenta dos ejes: a. Estructura b. Higiene La biofbrica tiene que estar ubicada en zonas seguras, no inundaciones, humo, polvo, gases, luz y radiacin que pueden afectar la calidad del producto que se elabora. En las instalaciones, las estructuras deben ser slidas y sanitariamente adecuadas. Las aberturas deben impedir la entrada de animales domsticos, insectos, roedores, mosca y contaminante del medio ambiente como humo, polvo, vapor. Asimismo, deben existir separaciones (barreras de contencin) para impedir la contaminacin cruzada. Existirn habitaciones para la inoculacin,

32

Gobierno del Estado de Mxico.

Tecnolgico de Estudios Superiores de Ecatepec


Ingeniera Bioqumica.
Fundamentos de Investigacin Elaboracin de Bioinsecticidas

incubacin, secado, empacado, almacenaje y esterilizacin y descontaminacin. El espacio debe ser amplio y los empleados deben tener presente qu operacin se realiza en cada habitacin, para impedir la contaminacin cruzada. Adems, debe tener un diseo que permita realizar eficazmente las operaciones de limpieza y desinfeccin. El agua utilizada debe ser potable, ser provista a presin adecuada y a la temperatura necesaria. Asimismo, tiene que existir un desage adecuado. Los equipos y los utensilios para la manipulacin de alimentos deben ser de un material que no transmita sustancias txicas, olores ni sabores. Las superficies de trabajo no deben tener hoyos, ni grietas. Se recomienda evitar el uso de maderas y de productos que puedan corroerse. La pauta principal consiste en garantizar que las operaciones se realicen higinicamente desde la llegada de la materia prima hasta obtener el producto terminado. . Higiene fuera y dentro de la produccin Todos los utensilios, los equipos y la instalacin deben mantenerse en buen estado higinico, de conservacin y de funcionamiento. Durante la produccin de un biopreparado hay que tener en cuenta varios aspectos para garantizar su calidad: Debe prevenirse la contaminacin cruzada que consiste en evitar el contacto entre productos elaborados y en proceso de produccin con materias primas o productos contaminados. Si se sospecha una contaminacin debe aislarse el producto en cuestin y ejecutar procedimientos contemplados para tales casos en cada laboratorio. El agua utilizada debe ser potable y debe haber un sistema independiente de distribucin de agua recirculada. La produccin debe ser llevada a cabo por empleados capacitados y supervisados por personal tcnico. En cada zona deben respetarse los requisitos de BPP establecidos. Por ejemplo, en la cosecha se deben usar caretas protectoras con filtros contra partculas 0.2 micrmetros. Deben mantenerse documentos y registros de los procesos de elaboracin, produccin y distribucin y conservarlo durante un perodo superior a la duracin mnima del producto. Para la limpieza y la desinfeccin es necesario utilizar productos reconocidos por su poder biocida o desinfectante. Para organizar estas tareas, es recomendable aplicar los Procedimientos Operativos Estandarizados de desinfeccin y limpieza que describen qu, cmo, cundo y dnde limpiar y desinfectar, as como los registros y advertencias que deben llevarse a cabo. Las sustancias txicas (solventes u otras sustancias que pueden representar un riesgo para la salud y una posible fuente de contaminacin deben estar rotuladas con un etiquetado bien visible y ser

33

Gobierno del Estado de Mxico.

Tecnolgico de Estudios Superiores de Ecatepec


Ingeniera Bioqumica.
Fundamentos de Investigacin Elaboracin de Bioinsecticidas

almacenadas en reas exclusivas. Estas sustancias deben ser manipuladas slo por personas autorizadas. Personal Aunque todas las normas que se refieran al personal sean conocidas es importante remarcarlas debido a que son indispensables para lograr las BPM. Se aconseja que todas las personas que produzcan biopreparados reciban capacitacin. Esta es responsabilidad de la empresa y debe ser adecuada y continua. Debe controlarse el estado de salud y la aparicin de posibles enfermedades contagiosas entre los trabajadores. . Por otra parte, ninguna persona que sufra una herida puede manipular agentes biolgicos hasta su alta mdica. Es indispensable el lavado de manos de manera frecuente y minuciosa con un agente de limpieza autorizado, con agua potable y con cepillo. Debe realizarse antes de iniciar el trabajo, inmediatamente despus de haber hecho uso de los retretes, despus de haber manipulado material contaminado y todas las veces que las manos se vuelvan un factor contaminante. Debe haber indicadores que obliguen a lavarse las manos y un control que garantice el cumplimiento. Todo el personal que est de servicio en la zona de manipulacin debe mantener la higiene persona, debe llevar ropa protectora, calzado adecuado y gorros. Todos deben ser lavables o desechables. No debe trabajarse con anillos, aretes, relojes y pulsos durante la manipulacin de agentes biolgicos. La higiene tambin involucra conductas que puedan dar lugar a la contaminacin, tales como comer, fumar, aplicarse cosmticos u otras prcticas antihiginicas. Asimismo, se recomienda usar ropa adecuada para la produccin y cambiarse antes de la salida del centro. Control de Procesos en la Produccin Para tener un resultado ptimo en las BPM son necesarios ciertos controles que aseguren el cumplimiento de los procedimientos y los criterios para lograr la calidad esperada en un alimento, garantizar la inocuidad y la calidad de los biopreparados. Estos fueron ya explicados en la conferencia anterior de controles de calidad. Los controles sirven para detectar la presencia de contaminantes microbiolgicos. Para verificar que los controles se lleven a cabo correctamente, deben realizarse anlisis que monitoreen si los parmetros indicadores de los procesos y productos reflejan su real estado. Documentacin

34

Gobierno del Estado de Mxico.

Tecnolgico de Estudios Superiores de Ecatepec


Ingeniera Bioqumica.
Fundamentos de Investigacin Elaboracin de Bioinsecticidas

La documentacin es un aspecto bsico, debido a que tiene el propsito de definir los procedimientos y los controles. Adems, permite un fcil y rpido rastreo de productos ante la investigacin de productos defectuosos. El sistema de documentacin deber permitir diferenciar nmeros de lotes, siguiendo la historia de los alimentos desde la utilizacin de insumos hasta el producto terminado, incluyendo el transporte y la distribucin. Un sistema adecuado de documentacin que permita seguir los pasos de un bioproducto desde el inicio (materia prima) hasta el producto final garantiza la implementacin de las BPP. En esto consisten las BPP. Liberacin microorganismos al medio ambiente. Otro aspecto de la bioseguridad concierne a la liberacin de microorganismos al ambiente, como es el caso de los usados para el control de plagas agrcolas. Hay que establecer diferentes categoras: - Microorganismos modificados genticamente- riesgo ms elevado - Microorganismos autctonos menor riesgo - Microorganismos exticos- evaluacin del riesgo, puede ser variable el nivel de riesgo. Si comparamos los riesgos de los bioplaguicidas con el de muchos agroqumicos que actualmente se emplean en el control de plagas, los agentes microbiolgicos disponen de una mayor seguridad, de ah que puedan estimarse como alternativas ms seguras. Se deben tomar a nivel de nacin regulaciones para su uso, y siempre estos bioproductos deben ser analizados bajo un punto de vista diferente a los qumicos, lo que facilitara su uso para el control de plagas agrcolas. CONCLUSIONES El desarrollo de agentes de control biolgico e investigaciones de su uso ha sido menor en su comienzo que el esperado, pero la utilizacin de estos productos est empezando a asumir un papel importante en el campo de la agricultura sostenible. La aplicacin de los biocontroles junto a otros mtodos alternativos permitir lograr buenos rendimientos de las cosechas sin perjudicar al ecosistema Las formas granulados y polvo humedecibles son las que mayor xito han tenido en la presentacin de este tipo de producto pero se necesita un mayor esfuerzo en investigaciones en esta lnea a fin de obtener formulaciones de mayor estabilidad.

35

Gobierno del Estado de Mxico.

Tecnolgico de Estudios Superiores de Ecatepec


Ingeniera Bioqumica.
Fundamentos de Investigacin Elaboracin de Bioinsecticidas

Bibliografas: Estudio de prefactibilidad para la instalacin de una planta productora de un Bioinsecticida por fermentacin slida a partir de Bauveria bassiana/cruz Aguilar Jess Fernndez Sandoval Lilia a., Jurez Martnez Nancy e., pedral Gonzlez Cintia 05 de diciembre de 2005/universidad autnoma metropolitana Manejo Integrado de Plagas (Costa Rica) No. 63 p . 9 5 - 1 0 3 , 2 0 0 1/Avances en el Fomento de Productos Fitosanitarios No-Sint.ticos/Arnulfo Monz.n1 EVALUACIN DE CEPAS DE BEAUVERIA BASSIANA CONTRA DESCORTEZADORES (COLEOPTERA: SCOLYTIDAE) DEL GNERO IPS EN PLANTACIONES DE PINOS (PINUS CARIBAEA MORELET). Autores: Ren Alberto Lpez Castilla1, Enrique de Zayas 2, Antonio Fernndez Vera3 y Natividad Triguero Isasi1. HONGOS ENTOMOPATGENOS: IMPORTANTE HERRAMIENTA PARA EL CONTROL DE MOSCAS BLANCAS (HOMOPTERA: ALEYRODIDAE)/Anas da Academia Pernambucana de Ciencia Agronmica, Recife, vols. 5 e 6, p.209-242, 2008-2009.

METODOS ARTESANALES DE PRODUCCIN DE BIOPLAGUICIDAS A PARTIR DE HONGOS ENTOMOPATGENOS Y ANTAGONISTAS/ ORESTES ELSEGUI CLARO e.mail: oelosegui@inisav.cu Instituto de Investigaciones de Sanidad Vegetal (INISAV) Ciudad de La Habana, Cuba 2006 BIOINSECTICIDAS: SU EMPLEO, PRODUCCIN Y COMERCIALIZACIN EN MXICO/CIENCIA UANL / VOL. IV, No. 2, ABRIL-JUNIO 2001/Patricia Tamez Guerra*, Luis J. Galn Wong* , Hiram Medrano Roldn**, Cipriano Garca Gutirrez***, Cristina Rodrguez Padilla*, Ricardo A. Gmez Flores* y Reyes S. Tamez Guerra TECNOLOGA INTERMEDIA EN LA PRODUCCIN DE BIOINSECTICIDAS PARA EL CONTROL DE PLAGAS DEL MAZ EN SINALOA. /*Cipriano Garca Gutirrez, Eusebio Nava Prez, Rey David Ruelas Ayala y Juan Gerardo Ramrez Garca./CIDIIR-IPN Unidad Sinaloa. COFAA. Blvd. Juan de Dios Btiz Paredes No. 250. Guasave, Sinaloa. C. 2010 USO DE BIOINSECTICIDAS PARA EL CONTROL DE PLAGAS DE HORTALIZAS ENCOMUNIDADES RURALES/Cipriano Garca Gutirrez y Mara Berenice Gonzlez Maldonado/Ra Ximhai, enero-abril, ao/Vol. 6, Nmero 1/Universidad Autnoma Indgena de MxicoMochicahui, El Fuerte, Sinaloa. pp. 17-22 BOTANIGARD, bioinsecticida de ltima generacin para el control de mosca blanca y otros insectos /Autores: C. Fernndez, I. Troytio, J. Manuel Lara, M. Louis/Localizacin: Phytoma Espaa: La revista profesional de sanidad vegetal, ISSN 1131-8988, N 173, 2005 , pgs. 46-51 http://www.monografias.com/trabajos29/hongos-entomopatogenos/hongosentomopatogenos.shtml

36

Gobierno del Estado de Mxico.

Tecnolgico de Estudios Superiores de Ecatepec


Ingeniera Bioqumica.
Fundamentos de Investigacin Elaboracin de Bioinsecticidas

http://www.fao.org/Regional/LAmerica/prior/segalim/animal/miasis/pdf/doc1.pdf http://www.grain.org/biodiversidad_files/biodiv222.pdf http://es.wikipedia.org/wiki/Beauveria_bassiana

37