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UNIVERSIDADE DE SO PAULO FACULDADE DE CINCIAS FARMACUTICAS DEPARTAMENTO DE TECNOLOGIA BIOQUMICO-FARMACUTICA

DISCIPLINA: BIOTECNOLOGIA FARMACUTICA (FBT 0535) Prof. Dr. Michele Vitolo ENZIMAS EM ALIMENTOS 1. Definio Enzimas so protenas com atividade cataltica. 2. As enzimas no contexto da biotecnologia As enzimas ocupam um papel de destaque dentro do contexto biotecnolgico, porque so as responsveis pela vida celular e ao mesmo tempo fazem os processos (fermentativo e cultura de clulas) e as tcnicas biotecnolgicas (fuso celular e DNArecombinante) acontecerem. No quadro seguinte, d-se uma idia pictrica da posio das enzimas dentro da biotecnologia.

As enzimas e o contexto biotecnolgico


Sntese do ADN (Kornberg, 1967) ADN recombinante (Bayer, 1972) Fisiologia gentica/ bioqumica de clulas

Enzimas
Fermentao

Hibridoma (Milsteine, 1975)

Cultura de tecidos
Novos produtos e/ou novos processos

3. Aplicaes das enzimas Na atualidade as enzimas so catalisadores muito utilizados na indstria (alimentcia, farmacutica, txtil, papel e celulose, qumico-farmacutica), em mtodos analticos (qumicos e de diagnstico), em medicamentos (por exemplo, auxiliares digestivos) e como alvos naturais de frmacos inibidores especficos (por exemplo, o omeprazol, frmaco usado para diminuir a quantidade de suco gstrico na luz do

estmago, um inibidor da enzima que catalisa a sada do cido clordrico das clulas acinares). O quadro seguinte d uma idia da multiplicidade de usos das enzimas. ENZIMAS: AS PROTENAS CATALISADORAS

DISPOSITIVOS ANALTICOS

USO ANALTICO REAGENTES

MEDICAMENTOS

Diagnstico/anlises qumicas

TERAPUTICA

ENZIMAS
REAES INTRACELULARES

FRMACOS INIBIDORES DE ENZIMAS

PROCESSOS INDUSTRIAIS

INDSTRIA DE ALIMENTOS

INDSTRIA QUMICOFARMACUTICA

TEXTIL

OUTROS
TRATAMENTO DE EFLUENTES PAPEL E CELULOSE

4. Fontes de enzimas As fontes das enzimas industriais encontram-se nos trs reinos, a saber, animal, vegetal e microbiano. Alguns exemplos so apresentados a seguir: 4.1. Origem animal As mais importantes so: amilase pancretica, lpase pancretica, pepsina, quimosina e pancreatina. 4.2. Origem vegetal As mais usadas so: -amilase, -amilase, bromelina (abacaxi), ficina (figo) e papana (mamo).

4.3. Origem microbiana A princpio podem substituir quaisquer enzimas de origem animal e vegetal. So fontes abundantes na natureza, podendo-se, inclusive, dizer que no momento a maioria das enzimas comercializadas so de fontes microbianas. Apenas para citar alguns exemplos, temos as enzimas amilolticas atuam na hidrlise do amido; fontes: Bacillus subtilis, Aspergillus oryzae, A.niger, A.flavus e A.awamori -, glicose oxidase oxida a glicose em cido glicnico; fontes: A.niger, Penicillium amagasakiense e P.notatum -, lactase hidrolisa a lactose do leite; fontes: Saccharomyces fragilis, Zygosaccharomyces lactis -, lpase hidrolisa triglicrides; fontes: A.niger e Rhysopus sp -, proteases hidrolisam protenas; fontes: B.subtilis, A.oryzae, A.flavus, Endothia parastica e Mucor pusillus. 5. Enzimas em alimentos A relao das enzimas com o setor alimentcio se d de quatro maneiras, a saber, na deteriorao dos alimentos devido s enzimas naturalmente presentes na constituio do alimento, geralmente pertencentes ao grupo das oxidases; so estudadas na disciplina de Bromatologia e Bioqumica de Alimentos -, no controle de qualidade dos alimentos feito na matria-prima no processada, durante o processamento e no produto final; neste caso as enzimas so usadas como reagentes analticos -, no controle de operaes unitrias industriais por exemplo, o tratamento trmico (branqueamento) de vegetais s adequado, quando no se detecta a enzima peroxidase no alimento branqueado; a pasteurizao do leite (processo trmico em que a matria-prima mantida em torno de 65C por 30-40min) s pode ser considerada eficiente, quando a atividade da fosfatase alcalina no leite pasteurizado for nula -, e, finalmente, no processamento do alimento, que efetuado em reatores enzimticos. No quadro seguinte, enumeram-se as principais enzimas usadas no processamento de alimentos.

ENZIMAS NA REA DE ALIMENTOS


ENZIMAS Amilases Proteases Lactose Fosfatase Catalase Glicoseoxidase Tanase Naringinase Pectinases APLICAES Panificao, xaropes, cervejaria, sucos Panificao, cervejaria, laticnios Deslactosao do soro de leite Alimentos infantis Desglicosao de ovos Desglicosao de ovos Cervejaria Sucos de fruta Vinhos e sucos de fruta

Existem muitos processos alimentcios que utilizam enzimas. Alguns exemplos: 5.1. Panificao 5.1.1. INTRODUO Na panificao industrial a adio de enzimas imprescindvel, pois os constituintes naturais da farinha de trigo devem ser convenientemente modificados para que a massa obtida seja adequada maquinaria da panificao em grande escala. 5.1.2. ENZIMAS 5.1.2.1. Amilases 5.1.2.1.1. -amilase Fontes: vegetais, animais e microrganismos. Termoestabilidade: as -amilases de origem fngica so mais termosensveis que as de origem bacteriana. Faixa de pH: 4,5 a 7,0 Unidade de Atividade (SKB): 1 SKB o inverso do tempo requerido para que a hidrlise de uma soluo de dextrina-padro pela -amilase provoque em presena do I2 o aparecimento de uma intensidade de cor, previamente, estabelecida (Cereal Chemistry, 16:712, 1939). 5.1.2.1.2. -amilase (enzima sulfidrlica e que no requer cofator) Caractersticas: kcat : 250.000 ligaes rompidas/min (30o C e pH = 4,8); Faixa de pH de atividade: 5,0 a 6,0; Faixa de pH de estabilidade: 4,0 a 8,5; Termoestabilidade (depende da procedncia da enzima): Cevada: inativao 70o C/10 min; Soja: inativao 70o C/30 min. 5.1.2.2. Proteases Fontes: B.subtilis, A. oryzae, A. niger Atividade Proteoltica (Anson Unit, AU): 1AU a quantidade de enzima que sob condies do teste libera 1 mol/min de aminocidos Folin-positivos (tirosina). 5.1.2.3. Outras 5.1.2.3.1. Lipoxidase Usada para branquear o miolo do po. Usualmente usa-se a farinha de soja desengordurada (0,5% de farinha desengordurada em relao ao peso total de farinha usada para fazer a massa). 5.1.2.3.2. Pentosanase Hidrolisa as pentosanas existentes na farinha, evitando o amanhecimento do produto (staling).

5.1.3. EFEITOS DA SUPLEMENTAO ENZIMTICA 5.1.3.1. Noes sobre o processo de panificao 5.1.3.2. -amilases 5.1.3.2.1. Efeitos desejveis a serem conseguidos a) Formao de acar e velocidade de fermentao b) Propriedades da massa e qualidade do po (Efeito na viscosidade e na maciez da massa) 5.1.3.2.2. Mtodos de adio das -amilases a) Suplementao na moagem da farinha: -amilase fngica, trigo ou cevada malteada: 10 a 15 SKB/100 g farinha; b) Suplementao no processo de panificao: A quantidade a ser usada depende da composio da mistura, tipo de po e tipo de equipamento. Exemplos: -amilase bacteriana (canaps, brownies); -amilase fngica (produto com miolo no gomoso); xarope diastsico (obtido do malte) em biscoitos e bolachas. 5.1.3.3. Proteases Usadas com o objetivo de influir na extensibilidade da massa, tornando-a adequada para uso em laminadores. A adio obrigatria porque o pH da massa sendo em torno de 7,0 no o mais adequado para a atividade das proteases originalmente presentes na farinha (pH= 4,0). Alm disso, nos pes salgados costuma-se usar 3% de sal, que inibe as proteases naturais da farinha. 5.1.4. PERSPECTIVAS Espera-se um aumento na intensidade de uso das proteases, devido ao fato de que as farinhas disponveis no mercado esto cada vez mais ricas em protenas. O aparecimento de pentosanases em grandes quantidades , tambm, uma perspectiva nesta rea, pois o staling um fenmeno danoso para os produtos de panificao. De um modo geral, o uso de enzimas em panificao tende a aumentar, por causa dos rigores da legislao alimentcia no que se refere ao uso de farinhas modificadas por via qumica (remoo de pigmentos, por exemplo). 5.2. Produo de Xaropes 5.2.1. INTRODUO Ao contrrio do que sucede na panificao, a produo de xaropes requer uma hidrlise intensa do amido. O incio da produo de xaropes em grande escala deu-se nos anos trinta, quando foi desenvolvido o processo de hidrlise cida do amido de mas. Os xaropes passaram a ser usados como adoantes e como componentes de meios de cultura para processos fermentativos. No entanto, a indstria de xaropes recebeu grande impulso, quando a glicoamilase, enzima responsvel pela hidrlise final dos oligossacardeos oriundos da

hidrlise do amido, e a glicoseisomerase, enzima que catalisa a isomerizao da glicose em frutose, passaram a ser usadas nos anos 60 e 70, respectivamente. 5.2.2. ETAPAS DO PROCESSAMENTO ENZIMTICO DO AMIDO AMIDO Gelatinizao PASTA DE AMIDO
LIQUEFAO: CIDA OU ENZIMTICA

OLIGOSSACARDEO
GLICOAMILASE

MALTO-DEXTRINAS

( Sacarificao)

Xp de Maltose

Xp Misto Xp de Glicose
GLICOSEISOMERASE

( Isomerizao) Xp de Frutose

Na Tabela 1 so indicados os usos mais comuns dos produtos oriundos da hidrlise do amido.
TABELA 1. Produtos provenientes da hidrlise do amido.

PRODUTO

USOS

MALTO-DEXTRINAS ESTABILIZANTES, GOMAS, PASTAS, ESPESSANTES Xp MISTOS CONFEITARIA, REFRIGERANTES, SORVETES, BABY FOODS, CONSERVAS Xp DE MALTOSE CONFEITARIA Xp DE GLICOSE REFRIGERANTES, FERMENTAES, BALAS Xp DE FRUTOSE REFRIGERANTES, CONSERVAS, YOGHURT, COMPOTAS

5.2.2.1. Gelatinizao do Amido ( AMIDO: 25-40%, BS)

H2O mistur Aquecimento* Pasta de Amido Amido gelatinizado**

*A temperatura de aquecimento da pasta depende da origem do amido (por ex.,milho:70 o C, aveia 58o C). **Nesta condio a hidrlise do amido pequena, ocorre um aumento acentuado da viscosidade e pode ocorrer a retrogradao (insolubilizao espontnea do amido devido formao de pontes de hidrognio entre as molculas). 5.2.2.2. Liquefao A liquefao pode ser feita por via cida (soluo aquosa de HCl a 75o C) ou por via enzimtica (-amilase bacteriana termoresistente). O grau de liquefao do amido expresso em Equivalente em Dextrose (DE) , que consiste em se comparar o poder redutor do amido liquefeito frente uma soluo de dextrose pA (tomada como 100%). 5.2.2.3. Sacarificao a etapa que se segue liquefao, sendo executada com glicoamilase de A.niger e/ou -amilase fngica. O amido, que se apresenta na forma de grnulo( bi-refringente, dependendo sua forma e tamanho da espcie vegetal), constitudo pela amilose (homopolissacardeo linear da glicose, que representa 15-30% do grnulo) e pela amilopectina (homopolissacardeo ramificado da glicose, que representa 70-85% do grnulo ), que se entrelaam e so mantidas fortemente unidas atravs de pontes de H. A amilopectina no inteiramente degradada por via enzimtica, pelo fato das enzimas -amilase bacteriana e glicoamilase no hidrolisarem as ligaes osdicas ,1-6, que formam os pontos de ramificao. Por isso, necessrio empregar-se as enzimas desramificantes para a hidrlise completa do amido. 5.2.2.4. Isomerizao a ltima etapa do processamento do amido, quando se deseja obter um xarope contendo frutose. A isomerizao um processo contnuo no qual se emprega a glicoseisomerase imobilizada. A produo de xaropes contendo frutose teve incio nos anos 70, permitindo aos pases no produtores de sacarose a partir da cana-de-acar ou beterraba, disporem de

um adoante comparvel ao acar invertido e, proveniente, em ltima anlise, de materiais amilceos. 5.2.3. PERSPECTIVAS Neste setor as perspectivas resumem-se nos aspectos: - Melhoramento das caractersticas da glicose isomerase imobilizada; - Disponibilidade de -amilase termoestvel (T > 105o C); - Disponibilidade de glicoamilase imobilizada - Disponibilidade de enzimas desramificantes mais puras e termo resistentes 5.3. Produo de Sucos de Fruta 5.3.1. INTRODUO A indstria de sucos de frutas tem como principal problema a variabilidade das frutas a serem processadas. A otimizao da produo implica no processamento da fruta a baixo custo, no controle do tempo total de processo, na manuteno ou melhoramento da estabilidade e das propriedades organolpticas do produto final e no aumento da capacidade da planta. Em geral, o suco de fruta comercializado na forma de concentrado, que permite no s a reduo do volume (facilita o transporte e o armazenamento), mas tambm aumentar a estabilidade frente contaminao por microrganismos. Estes objetivos vm sendo alcanados com o uso de enzimas nos vrios estgios do processamento desde 1930, quando Kertez e Mehlits usaram enzimas pela primeira vez neste tipo de indstria. Atualmente o produtor de suco de fruta tem a seu alcance diversas enzimas. Inclusive o fabricante das enzimas est apto a fornecer preparados enzimticos cada vez mais puros e especficos, ou ento, misturas de enzimas em quantidades adequadas para otimizar determinado processamento de fruta. 5.3.2. PAREDE CELULAR E SUBSTNCIAS PCTICAS A parede celular a principal barreira a ser desarranjada para a extrao adequada do suco. A parede celular em essncia oferece proteo clula vegetal, sobretudo, contra o choque e s mudanas da presso osmtica extracelular. A composio da parede celular depende: a) da fruta; b) das condies sazonais; c) do modo e tempo de estocagem da fruta. Em linhas gerais, as substncias pcticas so polissacardeos contendo unidades de cido galacturnico, e podem ser divididas em: cido pctico (as carboxilas das unidades galacturnicas esto livres) e cido pectnico (as carboxilas das unidades galacturnicas encontram-se esterificadas (ex., pectina). Nas substncias pcticas, alm do cido galacturnico, encontram-se oses do tipo: L-ramnose, arabinose, galactose, xilose. Alm das substncias pcticas, acham-se na parede celular, tambm, a celulose (cristalina na parede secundria e amorfa na parede primria) e hemiceluloses. Dentre estas ltimas tem-se as xiloglicanas, cuja cadeia principal formada por glicoses ligadas

por ligaes osdicas ,1-4 e com ramificaes de D-xilopiranose, atravs de ligao osdica do tipo . interessante destacar que uma malha celulose-xiloglicana est inserida numa matriz constituda de substncias pcticas, determinando a fora da parede celular e, talvez, a porosidade da mesma. 5.3.3. ENZIMAS 5.3.3.1. Pectinases As pectinases so classificadas em dois grandes grupos: Saponificantes (pectinoesterases) e Despolimerizantes. As despolimerizantes, por sua vez, se subdividem em: DESPOLIMERIZANTES

AGEM SOBRE A PECTINA

AGEM SOBRE O CIDO PCTICO

POLIMETILGALACTURONASE (PMG)

PECTINA LIASE (PL)

ENDO-PL

EXO-PL

ENDOPMG

EXO PMG

PECTATO LIASE (PAL)

POLIGALACTURONASE (PG)

ENDO PAL

EXO PAL ENDO PG EXO PG

A endo-PL possui grande afinidade por substncias pcticas altamente metiladas. Hidrolisa a pectina ao acaso. Uma hidrlise da ordem de 5%, causa uma reduo da viscosidade da ordem de 50%. A endo-PL de A.niger tem pH timo entre 4,0 e 5,0.

A pectinoesterase s hidrolisa as ligaes ster da substncia pctica. Por isso, no capaz de reduzir a viscosidade. Alis, a viscosidade poder at aumentar se alm dela existir Ca2+ no meio. A de A.niger tem pH entre 4,0 e 4,5. As poligalacturonases agem s sobre substncias pcticas com baixo grau de esterificao. A endo-PG atua ao acaso e a exo-PG atua a partir da extremidade no redutora. A exo-PG no reduz significativamente a viscosidade. A endo-PG de A.niger tem pH timo entre 4,0 e 4,5 e a exo-PG em pH = 5,0. As pectinases so de origem vegetal e microbiana. A ramnogalacturonase hidrolisa a substncia pctica nos pontos em que a ramnose se liga ao resduo de cido galacturnico. A substncia pctica deve ter baixo grau de esterificao. encontrada em A.aculeatus e tem pH timo entre 3,0 e 4,0. Os polmeros da arabinose (arabinanas, arabinoxilanas, arabinogalactanas) so hidrolisados pelas arabinofuranosidases (endo-arabinase e exo-arabinase). Evitam a turbidez posterior do suco (ma, pera). 5.3.3.2. Hemicelulases Existem vrias enzimas diferentes com o nome genrico de hemicelulase. As mais importantes so as galactanases (hidrolisam a arabino-1,4--D-galactanas e a arabino1,3-1,6-linked--D-galactanas), xilanases, xiloglucanases e mananases. 5.3.3.3. Celulases So sistemas multienzimticos, que atuam sinergisticamente. As enzimas constituintes so: endo-glucanase (Cx) (hidrolisa ligaes osdicas -1,4 ao acaso); exoglucanase (hidrolisa ligaes -1,4 a partir da extremidade redutora da cadeia do polissacardeo); celobiohidrolase (CBH)( atua aps a ao da Cx, hidrolisando as ligaes a partir da extremidade no redutora da cadeia, resultando a celobiose) e celobiase (tambm chamada de -glicosidase; hidrolisa a celobiose em glicose). 5.3.3.4. Amilases So usadas para evitar a turvao do produto final pela precipitao do amido naturalmente presente na fruta, sobretudo no madura. Em geral, utilizam-se a amiloglicosidase (pHotimo 4,3 e temperatura entre 55 60o C) e a -amilase cida (pHtimo entre 3,0 e 4,0; temperatura entre 70o C e 75o C). 5.3.4. PROCESSAMENTO Na planta de processamento do suco de fruta as enzimas pectinase (20g de enzima/100 Kg de fruta; Esta enzima hidrolisa as substncias ppticas existentes nas frutas) e celulase (2g de enzima/100 Kg de fruta; Esta enzima hidrolisa a celulose e a hemicelulose, que formam as paredes celulares das clulas vegetais) so adicionadas no tanque auxiliar que precede a prensa hidrulica e operado a temperatura entre 3050C -, enquanto que no tanque de clarificao que se localiza depois da prensa e da centrfuga e operado a temperatura entre 25-45C adicionam-se a -amilase (0,52,0g/100 Kg de fruta; Esta enzima hidrolisa o amido presente no suco) e mais um reforo de pectinase (1,5-3,0 g/100 Kg de fruta). A adio de enzimas no tanque auxiliar visa a eliminao da pectina insolvel, enquanto que no tanque de clarificao o objetivo a

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reduo da viscosidade, a degradao do amido residual e facilitar a floculao de substncias insolveis; 5.3.5. PERSPECTIVAS a) Aumento da disponibilidade de pectinases que atuam em pH cido, para que possam ser usadas no processamento de ctricos; b) Introduo de enzimas especficas, tal como a naringinase (eliminar o gosto amargo do suco ctrico). 5.4. Glicose Oxidase (GOD) A GOD uma enzima sui generis em termos de tecnologia de alimentos, porque ela uma oxidase, enquanto que a grande maioria das outras enzimas so hidrolticas. A glicoseoxidase uma enzima que apresenta alta especificidade. As GODs comerciais, em geral, so contaminadas com catalase. Este fato, contudo, no impede seu uso na indstria de desglicosao de ovos, ao contrrio, como ser visto adiante a presena da catalase importante para o processo. As principais fontes de GOD so o A.niger e o P.amagasakiense. uma enzima intracelular. Aps a ruptura do miclio, o tratamento a ser dado ao extrato ir depender da forma de apresentao final da enzima, quando for posta disposio do mercado. Se for na forma lquida, o extrato oriundo da ruptura do miclio filtrado e concentrado. Na forma slida, entretanto, o extrato filtrado e a seguir precipitado e seco. A atividade da GOD expressa de duas maneiras: a) Unidade manomtrica: 1GOU (Glucose Oxidase Unit) a quantidade de enzima que promove o consumo de 10 mm3 de O2/min sob condies padronizadas; b) Unidade colorimtrica : 1 BU (Boehringer Unit) a quantidade de enzima que catalisa a converso de 1 mol de glicose por min nas condies padro. Em geral para a GOD comercial (com baixo grau de pureza) a atividade da ordem de 750-1500 GOU/mL ou g, enquanto a GOD para fins analticos tem atividade entre 60.000 120.000 GOU/mL ou g. Apenas como exemplo, cita-se a GOD de A.niger cuja massa molecular de 192 kD, a temperatura tima est entre 30 e 50o C, o pH timo entre 4,5 e 6,5. inibida por metais pesados e agentes quelantes sulfidrlicos. A GOD usada como anti-oxidante, em kits para dosagem da glicose e no processo de desglicosao de ovos ou derivados, que na forma de p so usados na fabricao de massas em geral. O processo de desglicosao da clara de ovo e/ou do ovo integral visa evitar a reao de Maillard reao entre os acares e as protenas presentes na matria-prima -, quando este material desidratado para ser transformado em ovo em p, o qual usado na fabricao de massas. Em linhas gerais, a desglicosao da clara de ovos, por exemplo, consiste em se aquecer o material a 32C, ajustando-se o pH do meio entre 7,0 e 7,5 com cido ctrico (1Kg de cido/100 Kg de clara). Adiciona-se parte da gua oxigenada (35%) necessria antes da adio da glicose oxidase no reator. Durante a desglicosao continua-se a adio da gua oxigenada, geralmente por gotejamento. Em geral, so necessrios 3,6-4,0L de H2O2 (35%) por tonelada de clara. O processo tem durao total de 8h.

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6. Disponibilidade das enzimas no mercado As enzimas comearam a ser comercializadas em meados do sculo XX, podendo a disponibilidade delas ao longo das dcadas ser elencada como segue: (1900-1910): amilase; (1911-1920): invertase; (1921-1930): nenhuma enzima nova surgiu no mercado; (1931-1940): proteases; (1941-1950): celulases e pectinases; (1951-1960): catalase, glicose oxidase; (1961.......): lpases, lactases, coalhos, aminoacilase imobilizada, uroquinase, asparaginase, estreptoquinase, glicoseisomerase imobilizada,........; Atualmente so conhecidas cerca de 3000 enzimas diferentes. 7. Evoluo do mercado mundial de enzimas A importncia econmica das enzimas pode ser intuda a partir das cifras crescentes envolvidas na sua comercializao. Assim, o mercado mundial de enzimas nos anos de 1983, 1995 e 2005 movimentou montantes da ordem de US$ 400 milhes, US$ 1 bilho e US$ 2 bilhes, respectivamente. 8. Referncias Bibliogrficas TARABOULSI-Jr, F.A. Enzimas microbianas na converso da sacarose em frutose e cido glicnico usando reatores descontnuo-alimentado e contnuo com membrana. Dissertao de Mestrado Faculdade de Cincias Farmacuticas da USP, 2010. TOMOTANI, E.J., NEVES, L.C.M., VITOLO, M. Oxidation of glucose to gluconic acid by glucose oxidase in a membrane bioreactor. Applied Biochemistry and Biotechnology, v.121-124, p.149-162, 2005. SAID, S., PIETRO, R.C.L.R. Enzimas como agentes biotecnolgicos. Ribeiro Preto, Leggis Summa, 2004. SCHMIDELL, W., LIMA, U.A., AQUARONE, E., BORZANI, W. Biotecnologia industrial: Engenharia bioqumica. So Paulo, SP, Ed. Edgard Blucher LTDA, 2001. vol.3. 593p. NAGODAWITHANA, T., REED, G. Enzymes in food processing. 3rd Ed., San Diego, Academic Press, 1993.

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