Práctica 7 Electroforesis de ácidos nucleicos en geles de agarosa

Objetivo: que el estudiante conozca un método de análisis de ácidos nucleicos

Fundamento
Como se mencionó en la Práctica 3 “Electroforesis de proteínas en geles de poliacrilamida”, la electroforesis es el movimiento de partículas cargadas en un campo eléctrico. A diferencia de las proteínas, las cuales pueden tener una carga positiva o negativa, los ácidos nucleicos están cargados de forma negativa debido a su esqueleto de grupos fosfato. Por lo tanto, en una electroforesis, los ácidos nucleicos migrarán hacia el polo positivo, es decir, el ánodo. Además de la poliacrilamida, la agarosa puede se utilizada como soporte para la corrida electroforética. La agarosa es un polisacárido extraído de algas marinas que tiene la propiedad de mantenerse en estado sólido a temperatura ambiente pero que a altas temperaturas se torna líquida. Esta característica permite una fácil preparación de una matriz porosa para ser usada en electroforesis: simplemente se pesa la cantidad de agarosa requerida, se disuelve en un amortiguador adecuado, se calienta y se “chorrea” sobre un molde particular. Una ventaja que posee la agarosa sobre la acrilamida es que no es un compuesto tóxico y además permite el análisis de ácidos nucleicos con pesos moleculares muy variados. Sin embargo, su poder de resolución es menor que el de los geles de poliacrilamida. La concentración de agarosa típicamente utilizada para electroforesis está entre el 0.5 % y el 2%. La concentración a usar se escoge según el tamaño del ácido nucleico a analizar. Esto porque la concentración de agarosa define el tamaño de los poros de la matriz, a mayor concentración, menor el tamaño de los poros y viceversa. Durante la electroforesis, los ácidos nucleicos lineales con un alto peso molecular migrarán al ánodo más lentamente que ácidos nucleicos lineales con un menor peso molecular. La razón de esto es que los ácidos nucleicos de alto peso tardan más tiempo en atravesar los poros de agarosa. En el caso de ácidos nucleicos no linealizados, como plásmidos circulares en conformación nativa, la migración no solo dependerá del peso molecular sino también de otros aspectos como el grado de superenrrollamiento que éste poseea. Generalmente en una preparación de plásmido se pueden observar distintas conformaciones de la misma molécula, la forma superenrrollada, la forma semi relajada y una relajada. Dependiendo de las condiciones externas como pH y salinidad se pueden observar todas las formas o solo una (s). Una electroforesis típica consiste de los siguientes pasos:

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Visualizar los ácidos nucleicos.vivo.5 g de ácido bórico.colostate. El bromuro de etidio generalmente se incorpora a la agarosa antes de “chorrear” el gel. Preparar un gel de agarosa a la concentración requerida 2.5X. En el sitio web: Materiales y reactivos -Muestra obtenida en la Práctica 7 “Aislamiento de ADN de plásmido”. En nuestro caso.1. Realizar la corrida electroforética 5.7 g de EDTA sódico. Para la visualización de los ácidos nucleicos se utiliza un colorante fluorescente. 27. peines. Debido a esta propiedad es un agente mutagénico y debe manipularse con cuidado. http://www. lo utilizaremos para analizar la preparación de plásmido que se realizó durante la Práctica 7 “Aislamiento de ADN de plásmido”. etc. analizar los fragmentos cortados con enzimas de restricción. La solución se prepara 5X y se utiliza 0. Algunos de los usos de la electroforesis de ácidos nucleicos en geles de agarosa son: determinar los tamaños moleculares de los ácidos nucleicos. Para preparar 1 l de una solución 5X TBE mezclar: 54 g de Tris Base. o puede incorporarse luego de la corrida electroforética. burbuja niveladora. Mezclar las muestras a analizar con un amortiguador adecuado y un colorante (azul de bromofenol) el cual indica el frente de corrida de la electroforesis 3. 64 . 4.edu/hbooks/genetics/biotech/gels/virgel .html usted podrá realizar una corrida electroforética virtual de una muestra de ADN que fue digerida con diferentes enzimas de restricción. Este colorante tiene la propiedad de intercalarse entre las bases nitrogenadas del ADN y el ARN. Montar las muestras en el gel 4. -Solución amortiguadora de Tris-Boratos-EDTA (TBE). tabla niveladora. el bromuro de etidio. comparar los tamaños entre sí de distintos tipos de ADN y aislamiento y recuperación de fragmentos de ADN purificados. -Cámara de electroforesis y accesorios requeridos: soporte. -Marcador de peso molecular. llevar a 1 l con agua y autoclavar.

5 ml . Disolver la agarosa en 30 ml de amortiguador TBE 0.25 μl de bromuro de etidio a 10 mg/ml en la solución caliente de agarosa y agitando con movimientos circulares. Hay que evitar que se derrame la disolución o tener contacto directo con esta.5x.Beaker o erlenmeyer de 125 ml -Micropipeta de 20 µl con sus respectivas puntas -Lámpara de UV. Precaución: El bromuro de etilo es un carcinógeno y debe manejarse con cuidado. La punta que contiene bromuro de etidio debe ser descartada en un recipiente especial para descartar material contaminado con bromuro de etidio. Precaución: el bromuro Procedimiento Pesar la cantidad de agarosa requerida para obtener un gel de agarosa al 1%. Se debe tener precaución con los recipientes calientes ya que pueden causar quemaduras. luego se agita con movimientos circulares hasta que se disuelvan todas las partículas de agarosa translúcidas. Calentar en el microondas por 45 s. -Guantes -Gel de agarosa al 1% en TBE con bromuro de etidio. El volumen final es de 30 ml.de etidio es un agente mutagénico. NUNCA observe un gel bajo la luz ultravioleta sin el uso de anteojos que filtren dicha luz. Incorporar 1. utilice guantes para manipular cualquier material o solución que contenga este químico -Amortiguador de muestra con azul de bromofenol -Tubos de 1. 65 . Precaución: la luz ultravioleta puede dañar sus ojos.

66 . el gel tarda de 20–40 minutos para solidificar a temperatura ambiente. El soporte para “chorrear” el gel debe estar limpio y seco. Esquema de cómo ensamblar el soporte para “chorrear” el gel de agarosa. sujetándolo con ambas manos y jalando cuidadosamente hacia arriba. colocando los pozos mas cercanos al borde hacia el polo negativo (de color negro) debido a que las muestras migrarán hacia el ánodo (de color rojo) durante la electroforesis (ver Figura 2).Figura 1. Una vez solidificado el gel se quitan los peines. Manual de instrucciones de la cámara mini sub cell para electroforesis en geles de agarosa. Se deja reposar. se ajusta en el molde portagel o tabla niveladora y se colocan los peines que generarán los pozos para aplicar las muestras (ver Figura 1). Cuando la agarosa alcanza los 50–60 °C aproximadamente se vierte en el centro de la bandeja para gel evitando la formación de burbujas. Posteriormente se translada el soporte para el gel hasta la cámara de electroforesis. Se agrega TBE hasta sumergir el gel unos 2 a 6 mm. Tomado de: BioRad. Rev A.

Manual de instrucciones de la cámara mini sub cell para electroforesis en geles de agarosa.Figura 2. añada en un tubo de 1. 67 . e introducirla hasta el fondo del pozo liberando su contenido mientras se va sacando lentamente la punta del pozo. El volumen de los pozos depende del tipo de peine usado y del espesor del gel. Pregunte a su instructor qué tipo de peine su utilizará en esta ocasión. Tome nota del orden en que se colocaron las muestras y el marcador de peso molecular. Tomado de: BioRad.5 ml: 7 μl de agua destilada desionizada 3 μl del marcador de peso molecular (MPM) 2 μl de buffer de la muestra Con una micropipeta de 20 µl con punta aspirar la muestra preparada previamente. Rev A. Para preparar las muestras añada en un tubo de 1.5 ml: 5 μl de agua destilada desionizada 5 μl de su preparación de plásmido 2 μl de amortiguador de la muestra Para preparar el marcador del peso molecular. Colocar la micropipeta en forma perpendicular al gel de agarosa. Esquema de cómo se ensambla la cámara de electroforesis. En el Cuadro 1 se indican las características los peines disponibles.

Cuadro 1.50 1.52 5. Examine el gel bajo la lámpara de luz ultravioleta para determinar la posición de las bandas en el gel.0 20.7 41.75 150 0. 50 miliamperios durante 30 minutos aproximadamente. 68 .0 37.29 26.87 5.43 50.75 1. Características de los peines de altura fijos para el Sistema Sub-Cell GT y Wide Mini-Sub Cell GT Número pozos 1 2 4 10 10 15 15 20 20 30 de Grosor (mm) Ancho (mm) 1. apagar la fuente de poder.50 0. Finalizada la electroforesis.2 de Para iniciar la corrida electroforética. se destapa la cámara y se retira el soporte para gel de la cámara.75 150 150 106. Encienda la fuente de poder. asegurándose que los electrodos estén en contacto y conectados a la fuente de poder.0 74.0 200.4 20.87 9. La Se electroforesis se realiza a 100 V.84 4. sosteniendo con los dedos los bordes para evitar que el gel se caiga.50 0.0 377.2 36.4 18.50 1. colocar la tapa.69 Capacidad volumen (μl) 800.42 9.52 4.84 2.

Resultados Con la ayuda de su instructor. Si lo desea. Laura Ramírez. puede tomar una fotografía. Bioquímica y Biología Molecular. Rev A -Facultad de Medicina UNAM.html visitado en enero del 2010. Bibliografía -BioRad. La redacción de esta práctica fue realizada con la colaboración de la Dra. Pregunte acerca de la calidad de la preparación según se pueda juzgar de la electroforesis. interprete lo que observa bajo la luz ultravioleta. 69 . Mc Graw-Hill Interamericana Editores. Manual de instrucciones de la cámara mini sub cell para electroforesis en geles de agarosa. México. Indique cuántas bandas observa en su preparación de plásmido y a qué corresponden.edu/hbooks/genetics/biotech/gels/principles.colostate. http://www.vivo. 2000. Objetivos del curso y manual de prácticas de laboratorio. Departamento de Bioquímica.

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