LP3.

Dozarea proteinelor prin metoda Biuret
Principiul metodei. Sulfatul de cupru, in mediu bazic, reactioneaza cu substantele care contin doua sau mai multe legaturi peptidice, formand un complex violet. Intensitatea culorii este o masura a numarului de legaturi peptidice prezente in proteina. Numele acestei metode vine de la compusul biuret, care da o reactie pozitiva tipica. Reactia nu este absolut specifica pentru legaturile peptidice, deoarece compusii continand doua grupari carbonil legate printr-un atom de azot sau de carbon dau rezultate similare. Metoda este utilizata pentru determinarea unor cantitati relativ mari de proteine (1-20mg/ml). Reactivi si solutii. 1. Solutie standard proteica BSA 10mg/ml. 2. Reactiv biuret (3g CuSO4*5H2O + 9g tartrat de sodiu si potasiu in 100ml sol. NaOH 0,2M + 5g KI si se aduce la 1 L cu sol NaOH 0,2M). 3. Extract proteic total. Mod de lucru. In 6 eprubete se pipeteaza: Sol BSA A.D.

Concentratie proteica D.O. mg/ml 540nm 1. 0 2 0 2. 0.1 1.9 0.5 3. 0.5 1.5 2.5 4. 1 1 5 5. 1.5 0.5 7.5 6. 2 0 10 Peste toate punctele din curba si peste 2 ml din extractul proteic total (cu concentratie necunoscuta) se adauga 3 ml de reactiv biuret. Se agita energic. - incubare 10 min la 37˚C. Racire la temperatura camerei Se citesc punctele curbei etalon si proba necunoscuta la 540nm. Se construieste pe hartie milimetrica curba etalon si se extrapoleaza DO a probei necunoscute, pentru aflarea concentratiei proteice.