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Bases moleculares del iRNA y aspectos aplicados

Introducción
La investigación básica en biología molecular comenzó con el DNA, una molécula que porta toda la información necesaria para generar nuevos organismos de su propio tipo. Esto fue seguido por la era de estudios sobre proteínas, las moléculas que confieren funcionalidad a la célula. Sin embargo, el RNA ha permanecido ignorado como un mero intermediario de las moléculas que llevan la información y desempeñan las funciones, y solo recientemente se ha comenzado a comprender el inmenso peso en la tarea de regulación de la información que estas moléculas poseen. Además de los diferentes clases de RNA aceptados, el descubrimiento reciente de los pequeños RNAs (~19-30 nts), los cuales se pensaba que eran únicamente productos de degradación de moléculas de mayor tamaño, condujo al establecimiento de una clase de RNA independiente. Esta clase de RNA se piensa actualmente que gobierna los diversos procesos celulares a lo largo del reino eucariota. Mientras que la tecnología de “antisentido” fue el primer método que empleaba ácidos nucleicos sintéticos para alterar la expresión génica, otras metodologías han surgido desde entonces que emplean oligonucleótidos como instrumentos para regular los niveles de expresión a través de muy diferentes mecanismos de acción. Esos métodos incluyen ribozimas, aptameros, y los más recientemente, los RNA interferentes (Los largos dsRNAs son procesados en especies de menor tamaño que son las moléculas efectoras reales que desencadenan la respuesta de iRNA. Esas especies pequeñas, denominadas RNAs pequeños interferentes (siRNAs), son funcionales en células de mamíferos y siRNAs sintéticos pueden ser usados con relativa seguridad para activar experimentalmente la vía del iRNA. iRNA). La iRNA es una vía anciana que está presente en plantas, mamíferos e incluso en algunos hongos. En los sistemas primitivos, iRNA puede ser efectivamente desencadenado por la presencia de especies de dsRNA largas, mientras que en los organismos superiores, las largos dsRNA también desencadenan respuestas inmunes innatas y su uso puede ser tóxico como analizaremos posteriormente (activando por ejemplo la respuesta mediada por interferón). El RNA interferente (iRNA) fue descubierto como convergencia de tres líneas de investigación no relacionadas; el trabajo más familiar es el del laboratorio de Andrew Fire y Craig Mello, cuyo trabajo fue publicado en la revista Nature en 1998 .En su artículo en Nature, Fire y Mello comprobaron los efectos fenotípicos de inyectar RNA dentro del gusano C.elegans, estableciendo que el RNA de doble cadena, pero no el DNA sentido ni antisentido por separado, provocaba cambios fenotípicos. Además solo la inyección de RNA bicatenario (dsRNA) conducía a la perdida eficiente del RNA objetivo. Fire y Mello pudieron presentar una serie de conclusiones extraídas de sus estudios, las cuales pueden resumirse de la siguiente forma:    Primero, el silenciamiento génico era desencadenado eficientemente por inyección de dsRNA, pero solo ligeramente o ausente por RNA monocatenario sentido o antisentido. Segundo, el silenciamiento era específico para un mRNA homologo al dsRNA; otros mRNAs no se veía afectados. Tercero, los dsRNA debían corresponderse con la secuencia del RNAm maduro, ni intrones ni secuencias promotoras desencadenaban una respuesta, lo cual indica que un postranscripcional, presumiblemente citoplasmático mecanismo. Cuarto, la desaparición del RNAm objetivo sugiere que este es degradado. Quinto, solo unas pocas moléculas de dsRNA por célula eran suficientes para con completo silenciamiento, lo cual indica que el dsRNA debe ser amplificado y/o actuar catalíticamente en lugar de estequiométricamente.

 

Sexto, el efecto del dsRNA podría difundir entre tejidos e incluso a la progenie, sugiriendo una transmisión de los efectos entre células.

Además, Fire y Mello apuntaron que el RNAi podría proporcionar una explicación para un fenómeno estudiado en plantas desde hace muchos años, el silenciamiento génico postranscripcional (PTGS).Y por último, ellos finalizaron su artículo especulando acerca de la posibilidad de que el dsRNA podría ser usado por los organismos para el silenciamiento génico fisiológico. Los trabajos de estos autores le valieron el premio Novel en el año 2006. Así, el descubrimiento del elaborado y versátil sistema de silenciamiento en eucariotas es uno de los avances más importantes en el campo de la biología en la última década. Hay dos principales, formas distintas de RNA pequeño interferente implicadas en el silenciamiento génico de eucariotas, los small interfering RNAs (siRNAs), y los microRNAs (miRNAs). IMAGEN 1 Los siRNAs son generados a partir de RNAs bicatenarios de virus o elementos transponibles, los cuales son procesados por la nucleasa Dicer, uno de los componentes esenciales de los complejos de silenciamiento inducidos por RNA (RICs). Dicer rompe las largas moléculas de dsRNA en pequeños, 2122 dúplex de nucleótidos que son subsecuentemente separados por RISC para rendir siRNAs maduros. La maquinaria puede ser también desencadenada experimentalmente por la introducción de dsRNA sintéticos, proporcionando un instrumento importante para el silenciamiento de genes in vivo. Por su parte, a diferencia de los siRNAs, los miRNAs son fragmentos de 21-25 nts codificados por el genoma eucariótico y son o perfectamente (en plantas), o imperfectamente (en animales) complementarios a las secuencias en 3´ UTR de específicos mRNAs endógenos. El apareamiento de bases de los miRNAs con los mRNAs diana, que esta mediada por una forma distintiva de RISC, resulta o bien en el clivaje o bien en la regulación a la baja de la traducción de los mensajeros (en función de si la complementariedad es total o solo parcial). Evidencias se están acumulando rápidamente acerca de que numerosos, probablemente miles de miRNAs en animales y plantas están implicados de forma importante en la regulación del desarrollo y en el remodelado de la cromatina. Los miRNAs son pequeños RNAs no codificantes que contienen regiones de repeticiones invertidas de complementariedad. Esas repeticiones conducen a la formación de hairpins bicatenarios que desencadenas la maquinaria de iRNA. En plantas, los miRNAs funcionan principalmente clivando los mRNA homólogos, En animales, sin embargo, parecen regular la expresión génica uniéndose de forma parcialmente complementaria a las dianas en las regiones 3´UTR., que resulta en la represión de la traducción. A pesar de ser diferentes, tanto los miRNA como los siRNAs comparten los requerimientos de dsDNA como precursor, así como la asociación con las proteínas Dicer y Ago. Con el progreso en este campo, se fueron descubriendo diferentes tipos de siRNAs, como por ejemplo, los trans-acting small interfering RNAs (tasiRNAs), los repeat-associated small interfering RNAs (rasiRNAs) y los scanRNAs (scnRNAs), los cuales describiremos con posterioridad. Un tercer tipo de silenciamiento génico en respuesta al dsRNA implica la modificación del DNA celular y las histonas y su empaquetamiento en condensada y transcripcionalmente silenciada heterocromatina. El desencadenamiento de este tipo de respuesta parece estar asociada a los siRNAs, generados por la hibridación de transcritos a partir de secuencias repetidas como transposones. Así, este tipo de iRNA puede también representar un mecanismo de defensa celular para proteger contra los potenciales efectos deletéreos de elementos genéticos extraños como transposones. Los procariotas tienen aparentemente funcionalidad equivalente al sistema de los miRNA, es decir, regulación de los genes bacterianos por pequeños RNAs antisentido. El mejor caracterizado de esas vías emplea a la proteína de unión a RNA Hfq para la presentación del small RNA y la RNAsa E para la degradación de la diana.

E. coli tiene ≈ 60 genes miRNA, y un comparable número de expresados, pequeños RNA antisentido han sido detectados en la arquea Archaeoglobus fulgidus y Sulfolobus solfataricus, sugiriendo un importante rol de este mecanismo regulador en la fisiología de los procariotas. Como las plantas y los invertebrados carecen de células implicadas en la inmunidad adaptativa, la habilidad del silenciamiento génico en una manera específica de secuencia constituye una sofisticada una forma de inmunidad cuya diana son DNAs exógenos. Aunque su papel del iRNA en la inmunidad innata en humanos no es bien conocido aun, este proceso es considerado como el principal mecanismo antiviral en plantas, donde muchos virus usan dsRNA durante su replicación. En el caso de las plantas la defensa de iRNA es muy específica, porque solo actúa sobre ácidos nucleicos que son idénticos en secuencia al dsRNA desencadenante.

Tipos de RNA pequeños (sRNA)
A continuación vamos a presentar a los 4 principales tipos de sRNAs descritos hasta la fecha: los RNAs pequeños interferentes (siRNAs), los microRNAs (miRNAs), los RNAs de interacción con piwi (piRNAS) y los 21U-RNAs.

MicroRNAs (miRNAs)
Los genes de miRNA constituyen en torno al 1% del total de genes codificados, y forman la mayor clase de moléculas reguladoras. Evidencias sugieren que la expresión de los miRNA esta regulada a nivel transcripcional. Muchos promotores de miRNA han sido estudiados. El cluster policistronico de miR-17-18-19ª- 20-19b-92 esta regulado positivamente por el factor de transcripción oncogénico c-myc, y el músculo específico miR-1 esta regulado positivamente por factores de respuesta séricos (SRF), MyoD y Mef2. La regulación de la expresión de los miRNA a nivel de procesamiento de Drosha o Dicer no ha sido mostrado.

Biosíntesis

La biosíntesis del miRNA se piensa ahora que puede ser llevada a cabo por mas de una via, como describiremos a continuación: Via canónica de miRNA: los microRNA son cadenas sencillas de RNA de 19-23 nt de longitud generados a partir de transcritos de cadena simple que poseen una estructura local de hairpin (figura 3, paso a). Esos transcritos son generados por la pol II, mostrando una caperuza en 5´ y una cola poli A en 3´. A diferencia de la maduración de los RNA grandes, que ocurre en el núcleo, la maduración del miRNA comienza en el núcleo y termina en el citoplasma. En animales, el procesamiento nuclear se inicia con la actividad endonucleotidica de Drosha, una enzima RNAsa tipo III, que en asociación con Pasha, reconoce y genera la estructura de tallo y lazo (pre-miR) a partir del pri-miR (figura 3 paso b). Mediado por Exp-5 y Ran-GTPasa, los pre-miR son transportados fuera al citoplasma donde esos son sustrato de Dicer (figura 3, paso c). Excepto por las diferentes proteínas que participan en la via de miRNA, las plantas siguen una biosíntesis similar . Sin embargo, una importante diferencia existe entre la ruta de biosíntesis en plantas y en animales, y se basa en en el hecho de que en las plantas la DCL1 actua sobre los pre-miRs en el núcleo . En arabidopsis y Drosophila, los dúplex de RNAs pequeños son sustrato de metiltransferasas que añaden grupos metilo a los residuos 2´-hidroxilo del azúcar ribosa terminal, de forma que esta modificación protege a esas especies de RNA de cualquier tipo de de degradación o uridilación. Los dúplex de miRNAs son entonces separados por Argonauta1, un miembro destrajando de la formación miRNA-RISC

(miRNP), generando miRNAs maduros (figura 3 paso d). El mi-RISC/ miRNP así formado, bajo la influencia del miRNA y las proteínas asociadas , cumple su función, o sigue diferentes destinos. IMAGEN

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Mirtrons, un concepto emergente de la biogénesis de miRNA: además de la via canónica de síntesis de miRNA, los animales han mostrado seguir otro modo de biogénesis de miRNA donde la secuencia intrónica puede producir miRNAs. Así, los miRNAs originados apartir de intrones fueron denominados mirtrones. 14 mirtrones de Drosophila y 4 mirtrones de C. elegans han sido identificados hasta la fecha; dado que tanto los genes que codifican proteínas como los que no codifican poseen intrones, se piensa que mas del 80% de los miRNAs procedes de estos sitios. La generación de mirtrones se diferencia de la via canonica de biogénesis de miRNA principalmente en el no requerimiento de las proteínas DROSHA/DGCR8 que eliminan la secuencia que flankea la región tallo del pri-miRNA Interesantemente, aunque los mirtrons no han sido aun identificados en plantas y otros organismos, la presencia de intrones de longitud de pre-miRNA conduce a la posibilidad de que vías similares estén operativas.. Dado que los intrones no están sujetos a presión selectiva es lógico asumir que ellos con poca probabilidad preservan sus secuencias, con lo que el concepto de los mirtrones podría explicar la rápida evoluciónde la especificidad a lo largo de las especies que es observada en los miRNAs.

Función de los miRNAs

Los microRNAs muestran una alta especificidad de tejido y expresión temporal y se piensa que han evolucionado para cudar de forma intensiva las vías de desarrollo lo cual puede ser conseguido através de la supresión de la traducción (teniendo lugar principalemente en animales) o por el clivaje de dianas (que ocurre principalmente en plantas). Sin embargo, hay excepciones a las funciones generales asignadas a los miRNAs de animales y plantas. Por ejemplo, en animales, el miRNA-196 dirige el clivaje de del transcrito HOXB (gen que actua sobre el eje rostro-caudal para determinar la identidad de las vértebras y las somitas individuales), y en plantas, por ejempolo Apetala, un factor de transcripción, es reprimido traduccionalmente por miRNA-172. Recientemente microRNAs han sido mostrados a jugar un rol crítico en conferir inmunidad tanto a animales como a plantas. El reconocimiento de la diana de miRNA, como en el caso del siRNA, es iniciado por la secuencida de la seed región. En animales sin embargo, la diana transcripcional puede poseer mas de un sitio de reconocimiento de miRNA, permitiendo a algunos miRNAs unirse a dianas en localizaciones múltiples en la proximidad. Esto probablemente mejora el efecto del silenciamiento de forma acumulativa y también puede conferir redundancia al fenómeno, haciéndolo más riguroso. Por otro lado, los miRNA de plantas poseen sitios de unión únicos através de los que consigen el objetivo destino. Sin embargo, la compleja relación existente entre las los miRNA de plantas y sus dianas en la mayoría de los transcritos diana cae dentro de la categoría de factores de transcripción y puede así regular muchos procesos corriente a bajo. Interesantemente, los miRNAs son encontrados a regular negativamente los niveles de expresión de las principales enzimas de RNAi, como dicer o Argonauta, lo que añade otro peldaño de dificultad a la red reguladora alcandazo por estas moléculas. En animales, los estudios sugieren que la unión de miRNAs promueve o la desadenilización o la decapitación de las dianas que es probablemente conseguida por la interacción del complejo RISC con proteínas asociadas a cap o a la cola de poli-A. Sin embargo, preguntas como cómo la unión de los miRNA actua através de diferentes mecanismos (supresión de la traducción o la activación) es pobremente entendido. Recientes estudios han modostrado que los miRNAs puden conducir a la activación traduccional y una probable mecanismo ha sido propuesto. Estudios previos llevados a cabo

por Pillai y colaboradores había insinuado al posible interferencia existente entre los RNAi y la activación de la maquinaria de traducción. Esos autores mostraron que la unión de AGO2, que esta guiada por miRNAs (let7 en este caso), puede disminuir la detención traduccional de los correspondientes mensajeros. Mostrando un fuerte apoyo a esos descubrimientos, dos publicaciones posteriores de los mismos laboratorios han dado luz a nuestro entendimiento de los miRNAs y las proteínas asociadas que participan en la regulación al alza de la traducción. La observación de que TNF-a, una proteína clínicamente importante, varia significativamente en condiciones de hambre y suficiencia de nutrientes permitió a esos autores hipotetizar en la implicación de los elementos ARE sobre el mRNA en su estabilización o directamente activando la traducción a partir de los RNAm. Interesantemente los autores encontraron que esos AREs portaban secuencias complementarias a los miRNAs. Invetigaciones posteriores mostraron que dos proteínas, AGO2 y FXR1 asociadas, están bajo la dirección del reconocimiento del miRNA en esos sitios y exclusivamente bajo condiciones de hambre (baja glucosa). Importantemente, los autores observaron fenómenos similares con otros miRNAs tan bien, lo que les condujo a hipotetizar que los miRNAs generalmente actual como represores durante el crecimiento celular activo, mientres queellos tienden a comportarse como activación de la traducción cuando las condiciones son limitantes para el crecimiento. Esos estudios demostraron la asociación de los miRNAs en la activación de la traducción de mRNAs diana ha proporcionado una completa nueva dimensión de los atributos funcionales del miRNAs. Además, en contra de la localización normal, los microRNAs han sido demostrados estar canalizados de vuelta al núcleo de una manera dependiente de secuencia (figura 3, paso e), Este fenómeno permite a los miRNAs extender su capacidad reguladora da otros territorios, concretamente el núcleo, proporcionando así una oportunidad para sea para elegir como blanco muchos transcritos sin procesar o bien para llevar a cabo silenciamiento génico. Interesantemente esto fue expeculado por Bao y colaboradores,que estudiando los mutantes de Arabidopsis PHB y PHV que gobiernan la polaridad y son regulados por miR165 através de la via de degradación, observaron que los mutantes resitentes a la degradación tenían signficativamente reducida medida de metilación cuando se comparaban con las plantas silvestres y que no había un impacto de otras proteínas de la maquinaria de RNAi como consecuencia. Estudiso de Hwang y colaboradoeres y Bao y colaboradores , aunque con diferentes sistemas, claramente apoyan la nocion de que los miRNAs juegan un papel esencial en el silenciamiento génico mediado por RNAi. En las plantas, los patrones de expresión de los microRNAs se piensa que están dirigidos por multiples interacciones de feedback que implican varias fitohormonas, en particular a las auxinas y las giberelinas. Las fitohormonas regulan la trascripción de varios genes por unión a los elementos cis y esos transcritos poseen sitios para ciertos miRNAs. En contraste, la transcripción de algunos miRNAs esta directamente regulada por fitohormonas. Así, la intrincada relación entre los miRNAs y las finohormonas es central par a muchos procesos biológicos.

Modulación de las dianas del miRNA

Los miRNA de animales, como regla general, se unen a la región 3´de la diana, mientras que en el caso de las plantas, la unión ocurre en la región codificante. Normalmente , un máxido de desapareamientos es aceptado en la región semilla que , por otra parte, modularía el rango de silenciamiento. Enzimas de edición localizadas en el nucleo adenosina desaminasa que actua sobre RNA (ADARs), edita adenosina a inosina en posiciones específicas a lo largo de dsRNAs (figura 3). La sobreexpresión de ADAR humana muestra que dos isoformas (ADAR1 y ADAR2) están implicadas en la edición de miRNAs in vivo. Aunque la eficiencia de la edición de ADAR1 fue encontrada ser mayor que en ADAR2, la ultima, a diferencia de ADAR1, muestra una edición en una sola posición del precursor. Esto cambia la secuencia seed región y finalmente modula el rango de dianas en los precursones. Así, la edición de los miRNA (tanto pri- como pre-miRNA) puede explicar poruqe algunos miRNAs provocan especificidad en tejidos.

Ademas de la edición, la unión del miRNA a su diana puede estar impedida por la presencia de secuencias flanquedoras que tanbien están sorprendentemente conservadas y pueden servir como sitio de ataque para ciertas proteínas. Las bien conocidas Hur proteínas y las recientemente descubiertas Dnd1, una proteína de unión , pertenecen ambos a esa clase de proteinas.

Tanto Hur como Dnd1se unen a elementos ricos en AU- (ARE) en el 3´UTR y modulan la función de miRNAs. Dnd1 ha sido demostrado disminuir la represión de miRNA122 de p27 en líneas celulares humanas, y similares efectos se han visto con el miR430 del pez zebra. Esos resultados muestran claramente la posibilidad de otros mecanismos post-transcripcionales sean operativos durante la modulación de la funcionalidad de los miRNA. Los transcritos reprimidos por miRNA en animales son introducidos en el interior de vesículas dinamias denomiandas cuerpos P. (GW1 o cuerpos citoplasmáticos, que llevan a cabo la degradación activa de los mRNA y el silenciamiento génico.

RNASs pequeños interferentes (siRNAs)
Los siRNAs son moléculas reguladoras de longitud comprendida entre 20-24 nucleótidos que, además de proteger a la célula de la intrusión de cualquier ácido nucleico exógeno (como los virus), están implicadas en el mantenimiento de la integridad del genoma por el silenciamiento transcripcional de locus indeseables (como retrotransposones o secuencias repetidas).  Biosíntesis

El principal requerimiento para la generación de siRNA es una larga molecula de RNA bicatenario, los cuales son formados a partir de cualquier evento de transcripción que genere mensajeros con complementariedad de secuencia o por alguna actividad enzimática capaz de convertir RNA monocatenario en bicatenario (figura 1, pasos a y b). La molécula principal en la generación de siRNA es Dicer, una RNAsa III tipo endonucleasa. Los animales normalmente codifican un único tipo Dicer para generar varios tipos de RNAs pequeños (aunque hay excepciones como Drosophila o C. elegans, los cuales codifican dos dicers). Las plantas, sin embargo, requieren de múltiples Dicer. Dicer, en general, posee 6 dominios, DExH helicasa, DUF283, PAZ, RNasa IIIa, RNAsa IIIb y un dominio de unión a RNA (RBD). Así, por ejemplo, Arabidopsis y el arroz poseen cuatro y seis poteinas similares a Dicer (DCLs) respectivamente. En Arabidopsis, DCL 2,3,4 estan implicadas en la generación de diferentes especies de siRNA mientras que DCL1 es responsable únicamente de la biosíntesis de miRNA, de forma que la actividad de cada Dicer genera siRNAs de diferente longitud, como por ejempo DCL2 ,DCL3 y DCL4 que generan fragmentos de 22, 24 y 21 nucleótidos respectivamente. Estudios llevados a cabo en mutandes de Dicer tanto en plantas como en hongos , han permitido concluir que esas proteínas son funcionalmente redundantes. Otra interesante conclusión extraida de esos estudios con mutantes fue la observación de la existencia de una jerarquía funcional a lo entre las diferente dicers. Otra importante proteína implicada en la biosíntesis de siRNA en plantas, hongos y C.elegans (pero no en humanso) es una RNA polimerasa dependiente de RNA (RdRP). La principal función de esta proteína es generar siRNAs secundarios,en una etapa denominada amplificación de la señal en la via del siRNA. RdRP puede reconocer moléculas aberrantes de RNA para producir dsRNAs o bien de forma dependiente de primer, o bein de manera independiente. Las moléculas de dsDNA así formadas son posteriormente clivadas por la actividad agua debajo de dicer. Los dúplex del siRNA son entonces separados por la actividad helicasa de Argonauta, una proteína reclutda por Dicer. Esta proteína tiene 3 dominios bien caracterizados llamados PAZ, MID y PIWI. Tanto

en animales como en plantas codifican múltiples argonautas que participan en diferentes de iRNA. Aunque no todas las proteínas argonauta están caracterizadas, la función de unos pocos miembros ha sido elucidado, así por ejemplo, AGO2 y AGO1 son miembros destacados de siRISC y miRISC respectivamente, en plantas y animales. De forma similar a Dicer, evidencias sugieren una redundancia funcional en estas proteínas. IMAGEN 2 Junto con otras proteínas accesorias, argonauta sienta la estabilidad térmica de los extremos del dúplex del siRNA e inicia la separación de las hebras a partir del extremo con una relativamente menor estabilidad térmica. De las dos cadenas, la que es retenida por el complejo proteico siRISC es denomianda cadena guía , mientras que la otra (denomianda cadena pasajera) esta destinada a ser degradada por exonucleasas. En arabidopsis, la cadena madura simple de siRNA son metiladas por HEN1 , proporcionándole estabilidad. La cadena simple de siRNA cargada en el complejo proteico puede ser considerada análoga a las enzimas de restricción procarioticas que actúan contra cualquier ácido nucleico foraneao. Sin embargo, a diferencia de los mecanismos de defensa procarioticos mediados por las enzimas de restricción, los RNA pequeños eurocariotas pueden regular incluso cuando el DNA extraño ha sido transcrito a RNA. Si un RNA hibrida con la cadena guía del si-RISC, se activa argonauta, la actividad RNAsa que actuará específicamente sobre la secuencia diana en la posición complementaria a una distancia de 10 a 11 nucleotidos apartir del 5´ del siRNA IMAGEN 3  Clases de siRNA

Dependiendo de la naturaleza del loci y la biogénesis del precursor de dsRNA diferentes tipos de siRNAs han sido indentificados. RNA pequeños interferentes transactivador (ta-siRNA): son pequeños RNA de 21 nt de longitud que regieren transcritos endógenos como molde, que son convertidos a dsRNA por una polimerasa dependiente de RNA (RdRP) y subsecuentemente requiere la actividad aguas abajo de DCL4 y AGO7 para generar tasiRNA funcionales. Animales como los humanos o las moscas, que carecen de RdRP, no poseen este tipo de siRNA. Los tasiRNA se parecen a los miRNAs tanto en tamaño como en función y están implicados en dianas de mRNAs no idénticos. Ha sido demostrado que los miRNAs transcritos reclutan RdRP que consecuentemente genera tasiRNAs, estableciendo así un ejemplo de regulación de RNAs pequeños mediada por otros RNAs pequeños. En una via alternativa, RdRP puede también actuar sobre transcritos aberrantes (normalmente trascritos virales) convirtiéndolos en dsRNA y este mecanismo es probable ser responsable de prevenir a la célula de cualquier evento de transcripción errónea queu pueda afectar a la integridad celular. RNAs pequeños interferentes asociados a repeticiones (rasiRNAs): son fragmentos de 24-26 nts generados por la actividad de DCL3 sobre dsRNAs generados durante eventos de transcripción, normalmente locis de retrotransposones. Esos locis están generalmente metilados lo que previene de su transcripción. Al igual que los tasiRNAS, estos requieren también de RdRP para la amplificación del pool de RNAs pequeños. Los RasiRNAs juegan un importante rol durante la gametogénesis en las moscas, gusanos y mamíferos através de la modulación del estado de la cromatina, y el silenciamiento de transcritos virales através del reclutamiento de proteínas modificadores de histonas. Scan RNA (scn RNA): otro tipo de relativamente largo siRNA ( 29 nts) ha sido encontrado en el protozoo Tetrahymena thermophyla. Este organismo muestra un dimorfismo nuclear que difiere aproximadamente en el 15% de la secuencia. Durante la conjugación, los scn RNAs derivados apartir del micronucleo son generados (nucleo reproductivo) y eliminan locis correspondientes a su propio genoma

mientras que los generan en el macronucleo. Este fenómeno requiere una proteína similar a argonauta denominada Twi1, y parece ser una forma de RNA interferente através de la cual los organismos pueden eficientemente modificar versiones del genoma a partir de otros existentes.

siRNA largos (lsiRNAs): constituyen la clase de siRNA mas recientemente introducida , constituida por fragmentos de 30-40 nts de longitud y están inducidos en respuesta a infecciones bacterianas o condiciones de crecimiento. Descubierto en Arabidopsis, la generación de lsiRNAs requiere de las proteinas DCL1, DCL4 y AGO7 y depende de otros miembros de las vías de tanto el miRNA como el siRNA, como RDR6, HYL1 o HEN1. Uno de los lsiRNAs tiene como diana una proteína que confiere resitencia contra infecciones bacterianas.

Naturaleza sistémica del silenciamiento

Los siRNAs se creen que participan en una forma primitiva de respuesta inmune generada contra ácidos nucleicos extraños. Por lo tanto, ellso deben surgir a partir de sitios de producción para conferir una rápida defensa celular. Esta hipótesis está apoyada por estudios genéticos llevados a cabo en animales, donde la importancia de los siRNAs dentro de las células ha sido demostrado a través de una proteína de membrana llamada “Systemic RNA Interference – Defective” (SID-1), encontrando que la asimilación de dsRNAs por la SID-1 era dependiente de longitud, con mayores moléculas (500 pbs´), siendo importada a una mayor velocidad que las moléculas pequeñas (30 pbs). Además, observaron que la importación de siRNA no estaba afectado ni por el tratamiento de las células con frio ni por el agotamiento de ATP, lo que sugiere un mecanismo de asimilación pasiva. El cómo la proteína SID-1 discrimina entre los siRNA y los miRNAs continua siendo un fenómeno desconocido. La funcionalidad de los siRNAs es consecuencia de su unión a las secuencias objetivo y es gobernado por una regió crítica dentro de la secuencia del siRNA denomianda regíon semilla (“seed región”) , que son críticas para conferir a los siRNAs su especificidad. Es através de la “seed región” se une, lo reconoce y consecuentemente lleva a la secuencia objetivo a su clivaje o represión. Desde que los siRNAs se unen a les secuencias de las cuales ellos derivan, ellos no están bajo ningún tipo de presión de selección. Cabe señalar que aunque la seed región es importante en el reconocimiento de la diana, la complementariedad en otras regiones del siRNA es crítica durante el evento de clivaje. El floema es el tejido vascular de las plantas terrestres implicado en la distribución de azucares, nutrientes y otras biomoléculas através de la planta, y recientemente, Yoo y colaboradores han proporcionado evidencias de que este tejido es capaz de movilizar otra clase de moléculas, los RNA pequeños (figura 1, paso g). Estudios con savia de floema de diferentes especies como cucurbitaces o yuca revelan la presencia de siRNAs y miRNAs . Además, el descrubimiento de una nueva proteína, la proteína-1 pequeña del floema de unión al RNA (PSRP1), que es funcionalmente similar a SID1 en los animales y se une a las especies de RNA pequeño; esto fue confirmado por estudios de silenciamiento de la cubierta proteica de virus y líneas no silenciadas, donde los autores pudieron encontrar acumulación de siRNAs de cubierta proteica en las líneas silenciadas, pero no en las silenciadas; sin embargo el significado del transporte de miRNA através del floema continua sin ser dilucidado. Sin embargo la proteína PSRP1 no esta conservada a lo largo de las plantas. Así, aunque la naturaleza sistémica del silenciamiento es un fenómeno bien aceptado, los mecanismos que subyacen están todavía mal definidos y requieren esfuerzos para solventar las diferencias entre las proteínas descubiertas en plantas y animales.

Interferencia de RNA estable

La introducción de siRNAs de 21bp ha permitido la aplicación exitosa de la tecnología de iRNA en células de mamíferos. Sin embargo, ensayos usando este método son transilentes en la naturaleza y el fenotipo supresivo puede ser perdido en tiempos duplicativos varios, debido seguramente a la dilución del siRNA. Mientras esta aproximación es de confianza para estudios a corto tiempo de expresión de genes, no puede reemplezar a los modelos de Knocuk en ratones o permitir screenigs genéticos precisos de perdida de función. Pero esto no es lo que ocurre en organismos coo C elegans o N crassa porque en ellos se produce una síntesis directa de siRNA a través de la acción de una polimerasa de RNA dependiente de RNA. En estos sistemas, el fenotipo suprimido no es solo mantenido, sino que además pasa a generaciones futuras, auque el efecto disminuye gradualmente. Para superar los inconvenientes del uso de siRNA en mamíferos, un sistema para la expresión estable de siRNA ha sido desarrollado, tomando como modelo la estructura de los miRNA endógenos, vectores de expresión en mamíferos han sido diseñados para dirigir la síntesis intracelular de siRNA. En la mayoría de los casos, en inserto de dianda específico esta constituido por una secuencia de 19 nucleótidos copmplementarios a la secuenca diana, seguida por un corto espacio y la secuencia complementaria inversa a la misma diana. Una vez transcrito, una estructura en tallo-lazo de 19 bp, denominada RNA hairpin pequeño (shRNA) , es procesado por Dicer en un siRNA que puede dirigir la regulación a la baja de la expresión del gen diana a través de los elementos de la maquinaria de RNAi. Promotores de la polimerasa III, como T7 o U6 , fueron inicialmente usados en esas construcciones, ya que ellos producían siRNA que mimetizaban a los requerimientos para un siRNA eficiente. Esos requerimientos incluyen, pero no son los únicos, la ausencia de una cola poli A en la cola y una señal de terminación que da lugar a un transcrito con un 3´ protuberante. Los vectores de expresión para shRNA conducidos por la poL II han sido también desarrollados, que permitirán la reculación regulada de los siRNAs. Esos vectores de iRNA incluyen un marcador seleccionable que permite la selección de las células transfectadas y también incluye elementos inducibles que permiten la regulación de la expresión de shRNA. En casos donde la eficiencia de transfección son bajas, vectores virales han sido diseñados para la expresión de sinterso de shRNAs.

RNAs de interacción con piwi (piRNAs)
Diversos trabajos muestran que las proteínas piwi (perteneciente a la familia de proteínas argonauta es un miembro bien establecido del complejo ejecutor RNAi) se asocian con especies de RNA de 25-31 nucleotidos que son específicas de la línea germinal han añadido nuevas dimensiones a nuestor conocimiento hacerca de la variedad de RNA pequeño en la naturaleza. La clonación y la secuenciación de las poblaciones de RNA pequeño de la línea germinal revelan que la mayoría de las piRNA secuencias fueron mapeadas en regiones del genoma que previamente se pensaban ser no trascritas, mientas otras se corresponden con regiones intergenicas, exonicas, intronicas y regiones repetidas.

Biogénesis de piRNA

Un mejor entendimiento de la biogénesis de piRNA ha emergido a partir de estudios dirigidos por Gunawardane y colaboradore, y Brennecke y col. Que propusierno un mecanismo paralelo a la generación secundaria de siRNA denomindo como modelo ping-pong. Se observaba que los sentidos piRNAs asociados con AGO3 mientra que lo antientidos e asocian con Piwi/Aub y están complementario hata la primera 10 bases. También el extremo 5´ del piRNA antientido fue observado tener fuerte preferencia por las bases de uridina y que el sentido piRNA por la adenina en posición 10. De acuerdo con el modelo, el complejo piR-Piwi/Aub generadoso a partir del cluster piRNA se une a la diana trascrita (normalmente una secuencia transposon) y lo rompe entre 10 y 11 bases. Subsecuentemente, AGO3 se une y guía el clivado transcrito al cluster piRNA transcrito donde es seguido el clivaje endonucleotido sello depues del décimo residuo (normalmente adenina). Este bucle de retroalimentación puede generar rápidamente suficiente piRNA para cuidar de cualquier trascripción aberrante epecialemnte de retroelemento (Figura 7). El ciclo puede ser regulado por detección de producción reducida del transcrito diana y consecuentemente de lo piRNAs a si mismos. Si las especies de piRNA en un organismo están generadas sigiendo el modelo ping-pong o por otras vías similare a la biogénesis de si- y miRNA sigue siendo una cuestión abierta. Así, mietras que los miRNA y los siRNAs son producidos por clivaje de RNAs bicatenarios por la familia de proteínas dicer, los piRNAs parecen ser indepedientes de dicer y son geredados por un clivaje mediado por piwi a partir de transcrito de elementos transponibles sintidos y antisentidos en el zigoto por piRNAs derivaos de la madre. IMAGEN 6  Funciones de los piRNA

Estudios previo habían mostrado que PIWI realiza multiple funciones que van dede la programación epigenética y la represión de la transposición a la regulación post trascripcional. Sin embargo, en contra de la regulación negativa de PTGS de si y miRNAs, los piRNAs promueven la estabilidad del mRNA diana y probablemente mejora también su tranducción . Además, las piRNA han mostrado también participar en la supresión de la actividad de los elementos transponibles en la línea germinal, proceso que depende de las proteínas de la familia piwi de las proteínas argonatura, y de su interacción los los piRNAs.

21U-RNAs
En un intento de redefinir el perfil de los RNA pequeños en C.elegans, Ruby y colaboradores descubrieron un nueva clase de RNA pequeño, el 21U- RNAs. En todos las lecturas analizadas, esas moléculas fueron encontradas en tener exactamente 21 nucleótido de longitud con uridina en el extremo 5´. De las aprox 5454 secuencias obtenidas, la mayoría fueron mapeadas en dos regione principales del cromosoma IV, con pocas lectura cayendo entre ambas regione.  Biogénesis

En ausencia de alguna evidencia para la existencia de un precursor dsRNA, la biogénesis de los 21-U RNAs parece ser dependiente de algunos factore, que podrían sentir el residuo de uridina como el punto de referencia para contar las bases. 21U-

RNA muestra no particulares cadenas parciales y la mayoría estaban mapeadas en regione intergénicas e intronicas.

IMAGEN 7 
Funciones de los 21U-RNAs

Considerando el hecho de que las secuencias de lo 21U-RNAs no muestan homología con ningún transcrito apunta a la posibilidad de un posible papel en la estabilidad del genoma. Sin embargo, en vista de lo encontrado hacerca de que los sRNAs responsable de la estabilidad del genoma tienen un numero mayor a 24 nts, el posible rol de los 21U-RNAs (tamaño de 21 nts) en la etabilidad del genoma continua sin estar claro. Además, dado que los 21U-RNAs parecen someteré a maduración en el nucleo, su posible implicación en el esplicing no puede ser rechazada.

Proteínas implicadas en el iRNA
Un modelo simplicado para la ruta del RNAi esta baso en dos etapas, cada una de las cuales envuelve una maquina ribonucleasa. En el primer paso, el RNA desencadenante (ya sean transcritos primariso de dsRNA o miRNA ) son procesados a siRNA por las enzimas RNAsas III Dicer y Drosha. Las proteínas de dominio a unión a dsRNA (dsRBD) Pasha, Loquacious y R2D2 son cofactores para los eventos de procesamiento. En una segunda etapa, los siRNAs son cargados dentro del complejo de silenciamiento inducido por RNA (RISC). El siRNA es separado las dos cadenas de manera especifica durante la unión a RISC. El siRNA monocatenario localiza dianas de mRNA por apareamiento de Watson y Creek. Así, el silenciamiento génico resulta en la degradación nucleolitica del mRNA diana por la enzima RNasaH Argonauta (Slicer). Si el dúplex de siRNA/mRNA contiene bases desapareadas en el sitio de escisión, como suele ser el caso de los miRNAs, el mRNA no es clivado. En este caso el silenciamiento génico es resultado del la imbibición traduccional. IMAGEN 8

Dicer
Dicer, en general, posee 6 dominios, DExH helicasa, DUF283, PAZ, RNasa IIIa, RNAsa IIIb y un dominio de unión a RNA (RBD). (RBD, figura 2, a). La estructura cristalizada para algunos dominios ha sido resuelta proporcionándonos la oportunidad de predecir el model para la actividad de dicer. RBD reconoce la estructura dúplex del DNA mientras que el domino PAZ se une al extremo saliente 3´ de 2 nucleótidos del RNA. Dicer ha sido propuesto a actuar como un centro de procesamiento simple, donde los dominios RBD y PAZ participan en la asociación con la molécula de RNA y colaboran ambos con el dominio RNAsa III para formar un dímero intra-molecular. Esos dominios de RNAsa III se yuxtaponen de una manera para el clivaje del dúplex de 21 nts de RNA a partir del precursor dsRNA. La generación de un siRNA a partir de un dsRNA requere potencialmente cuatro reacciones endonucleoticas. ¿Cómo consigue Dicer esto? Datos recientes apoyan un modelo en el cual Dicer actua como un monómero , usando dos reacciones endonucleóticas para generar una nueva terminación. Esto

ocurriría si Dicer se une a una terminación existente y hace un corte de aprox. 21 nucreotidos desde el final. La primera dicer cristalizada fue la RNAsa III de Aquifex aeolicus, cuya estructura fue obtenida en ausencia de un sustrato dsRNA, pero la posición del sustrato fue inferida en base a la localización de los residuos catalíticos esenciales. El modleo estructural predijo dos centros activos por monómero con resudos de cada monómero contribuyendo a la formación de sitios activos . El dímero entonces podría unirse internamente al sustrato dsRNA, y generar dos nuevas terminaciones. Los dos nucleótidos salientes en 3´ , así como la longitud de los productos dsRNA, eran el resultado del espaciado entre los residuos de las cadenas peptídicas individuales. Esos datos descartaban la existencia de dos centros activos por dominio de RNAsaIII. El modelo mas congruente se muestra en la figura siguiente. Los dos doiminios RNAsaIII en dicer se asocial en un pseudo-dimero intramolecular estabilizado por puentes de hidrógeno, creando un sitio activo similar al de la RNAsa de E.coli. Cada dominio cortariá una cadena simple del dúplex, generando así una nueva terminación, de forma que RIIIDa sería el responsable de la generación de los extremos 3´ OH del producto, mientras que RIIIDb generaría los extremos 5`, observándose que sustituciones de aminoácidos que inactivan un dominio no afectan a la actividad del otro. Los dos nucleótidos salientes son medidos por el alineamiento de los dímeros, en lugar de por la distancia entre los residuos de los sitios activos de una cadena peptídica. El producto de 21 nucreotidos de longitud es medido por la distancia entre el dominio terminal de unión PAZ y el sitio activo. El centro activo de Dicer conserva muchoas residuos de aminoácidos característicos de la RNasa III bacteriana. IMAGEN 8 Dicer es capaz de clivar dsRNA con extremos romos, pero su actividad es mucho mayor con dsRNA pretarado con RNAsa III. Un loop de RNA o un hibrido DNA-RNA en un extremo del dsRNA suprime la actividad de Dicer. Así, Dicer no reconoce solo un extremo del dsRNA, pero requiere una estructura específica con un extremo 3´saliente de 2 nts y un grupo fosfato. Esta estructura es reconocida por el domino PAZ (PIWI/Argonaute/Zwille). La organización del dominio PAZ y RIIID en Dicer determina el sitio de clivaje en el dsRNA como hemos dicho. Dicer mide la distancia a el sitio de clivaje (22-25 bp) desde el extremo del dsRNA, clivando un dsRNA de 40 bp en fragmentos de 22 y 18 ph. Recientes análisis de rayos X de Dicer de Giardia han mostrado como esta “regla” cuenta 25 bp desde el extremo de un dúplex de RNA . La distancia entre el centro activo de RIIID y el bolsillo PAZ acomoda el extremo del RNA coincide exactamente con el tamaño de una región de 25 pb en un dúplex de RNA. El dsRNA unido se extendía entre el dominio PAZ y RIIID de Dicer lo largo de susuperficie plana enriquecido en residuos de aminoácidos básicos, que interaccionan con el esqueleto azúcar fosfato del dsRNA. Así, el tamaño del siRNA resultante esta determinado por la distancia entre PAZ y el dominio RIIID. En Drosophila Dicer2 falta un típico dominio PAZ, por lo que es probable que sea compensado por proteínas adaptadoras, como R2D2. Generado por Dicer, el siRNA puede ser incorporado en RISC si este no es impedido por una proteína especifica de unión al siRNA. Esta proteína supresora de RNAi, otra regla molecular, es codificada por el genoma de algunos virus de plantas y sirve para proteger al virus del sistema de RNAi de la célula. El sitema es inducido en respuesta a la infección convirus cuyo genoma o forma replicativa es dsRNA. Por ejemplo, p19 del tomate tiene una afinidad extremadamente elevada por los siRNAs de 20-24 nts. De acuerdo con los datos de rayos X, un dimero de p19 utiliza sus b laminas cóncavas para interaccionar con los grupos 2´OH del RNA en una forma dependiente de secuencia. Las a hélices, unidas a las b laminas, contienen 2 triptofanos que interaccionan con las bases en los extremos 3´y 5´del RNA, el stacking determina la habilidad de medición de p19. La síntesis de p19 bloquea el RNAi en las células de

mamíferos. No puede ser excluido que similares supresores celulares están implicados en la generación de RISC. Dicer juega un papel en la generación no solo de siRNA, sino también de miRNA. Como ya mencionamos el miRNA resulta a partir del procesamiento de pri-mRNA, que forma un hairpin. Solo una cadena del hairpin funciona como miRNA (figura siguiente).La generación de pre-miRNA a partir de primiRNA es conducida por la RNAsa III Drosha en un complejo con Pasha en Drosophila o con su análogo DGCR8 en humanos. El dominio PAZ se encuentra en todos las proteínas Dicer implicadas en la biogénesis de los miRNA. En Schizosaccharomyces pombe a Dicer le falta el dominio PAZ; el miRNA no ha sido encontrado de forma clara en este organismo. El domino catalítico RIIID de Dicer introduce una doble rotura , a distancia de 21-23 nts del extremo reconocido por el domino PAZ. Para procesar pre-miRNA Dicer requiere proteínas acompañantes, como Loqs en Drosophila y la proteína de unión al RNA TAR (TRBP) en humanos. Tres isomoformas de Loqs resultan del splicing alternativo. Dos de ellas, cada una de las cuales contienen dos dsRBDs canónicos y uno no canónico, enteractua con Dicer1, procesando el pre-miRNA en Drosophila. La tercera isoforma, que le falta el dsRBD no canónico, es incapaz de activar el procesado. Loqs es responsable de la especificidad de Dicer1 al premiRNA: La TRBP humana, que es homologa a Loqus, une a TAR ( respuesta transactivada), un hairpin de RNA regulador del virus de la inmunodeficiencia humana; este RNA es probablemente un pre-miRNA viral y regula muchas proteínas diana en la célula. Una Dicer es capaz de procesar tanto pre-miRNA como largos dsRNA en humanos y nematodos, Otros organismos tienen diferentes proteínas Dicer que permiten selectiva regulación de la generación de siRNA y miRNA. En Drosophila Dicer 1 procesa miRNA mientras que Dicer2 es responsable de la biosíntesis de siRNA. Arabidopsis thaliana tiene 4 genes codificadores de proteínas similares a Dicer (DCLs). No solo Dicer cliva dsRNA, también un componente del complejo de proteínas intermedio que carga el siRNA en el RISC. Como Dicer1 y Drosha, Dicer2 de Drosophila actua en un complejo con la proteína de unión al dsRNA R2D2, que posee dos dsRBDs. R2D2 no esta implicada en el clivaje de dsRNA. Contenida en RLC, cuyo principal componente es el heterodímero Dicer2/R2D2, R2D2 juegea un rol importante en cargar RISC con el siRNA, así como en la selección de la cadena guía. El extremo del dúplex de siRNA que es termodinámicamente mas estable se une con R2D2, mientras que el extremo con una temperatura de fusión mas baja se une con Dicer2. La cadena que une con R2D2 atarvés de el etremo 3´ actua como cadena guía. Esta regla termodinámica ha sido confirmada por muchos experimentos. Dicer1 de Drosophila esta implicada no solo en la maduración del miRNA, sino también el en silenciamiento inidiado por siRNA o por dsRNA. Cuando siRNA es introducido en una celula en ausencia de Dicer1, la diana no es clivada. Dicer1 y Dicer2/R2D2 son detectables en un gran complejo de proteínas en lisados de células que contienen siRNA exógenos. Entonces, Dicer1 no solo genera miRNA, sino que también estabiliza algunos componentes del siRISC. De este modo, la generación de siRNA y miRNA se entrecruzan e interrelacionan. IMAGEN 9

Drosha

Los miRNA son transcritos por la RNA polimerasa II como transcritos primarios largos. Las especies activas de miRNA, denominadas RNA maduro, están presentes en una estructura tallo-loop, el cual puede estar localizado en un intron o un exón. Por ejemplo, los miRNAs miR-106B, miR-93 y miR-25 estan localizados en el interior de un intron de la proteína que codifica el gen mcm-7. Después de la transcripción, los miRNAs, son extraidos a partir del transcrito primario, mientras que el mRNA maduro es exportado y traducido. No se conoce si los miRNA son procesados antes, duranteo o después del splicig. El procesado secuencial de de un transcito primario por las enzimas RNAsasIII Drosha y Dicer libera el RNA maduro. Drosha cliva liberando el tallo-lazo, denominado precursor, que es esportado desde el núcleo de una manera dependiente de Exportina-5/RAN-GTPasa. En el citoplasma, el precursor es procesado a una estructura similar a siRNA por Dicer. Drosha es una enzima de clase II que adopta un nucleo catalítico pseudo-dimerico similar a Dicer. El sustrato de Drosha, los transcritos primarios del miRNA, estructuralmente distinto a los sustratos de DICER. Drosha no procesa a partir del extremo del dsRNA, sino que los datos sugieren que la estructura de tallo-lazo es reconocida, en particular , el tamaño del loop parece ser importante para el reconocimiento. Además, secuencias desestructuradas que flanquean el tallo-lazo son esenciales para el procesamiento. No se sabe como Drosha reconocería esas secuencias, ya que están fuera del tallo del dsRNA Posiblemente otros cofactores no idenfiticados jugen algún rol. IMAGEN 10 Identificado como un componente del procesamiento de los pre-rRNA, Drosha posee dos RIIIDs y un dsRBD. Como Dicer, los dos RIIIDs de Drosha forman un centro de procesado. El sustrato del complejo Drosha/Pasha es un hairpin con un lop de no menos de 10 nts. Drosha tieen solo débil actividad RNasa, pero el cofactor de unión a dsRNA Pasha/DGCR8 basta para restaurar su actividad hacia pri-miRNA in vitro.Se piensa que la proteína compañera, que contiene dos dsRBD, utiliza una a hélice adicinal del dsRBD para reconocer el stem-loop de la estructura del RNA, como en el caso con Saccharomyces cerevisiae Rnt1 (RNAsa III). Presuntamente, Pasha/DGCR8 une a el loop del pri-miRNA y entonces interactua con dos RIIIDs de Drosha, oriendando el centro activo de la endonucleasa aproximadamente 30 nts lejos del loop. La base de la horquilla e dsRNA es posiblemente unida por el dsRBD de Drosha. El dominio RS de Drosha, que contiene repeticiones de dipeptidos de ArgSer, es característico de proteínas de splicing. El dominio RS es capaz de interaccionar tanto con otras proteínas como con RNA, En el splicing, el dominio RS interactua con una secuencia intronica implicada en la formación de un lazo, que es debido a la unión 5´-2´internucleotídica. RS dominios carecen de una estructura distinta y se clasifican como intrínsecamente desordenados regiones de la proteína, que siguen siendo capaces de interactuar con las proteínas asociadas varias. El carácter desordenado se piensa a facilitar la generación de nuevos motivos estructurales en esos dominios. El dominio RS de Drosha uno a cadenas sencillas de RNA mas allá del hairpin, como forma de asegurar la máxima actividad del complejo. Drosha genera un extremo saliente 3´de 2 nts en el precursor que es reconocido por el dominio PAZ de Dicer, análogo al reconocimiento de los dsRNA terminales. Los miRNA bicatenarios son incorporados dentro de RISC de una manera similar a los siRNAs.

En Drosophila, exportina 5 asegura el transporte del pre-mRNA desde el núcleo al citoplasma, donde Dicer, actuando en complejo con cofactores de unión al dsDNA, cliva el pre-miRNA miRNA bicatenarios de 21-23 bp.

Cofactores con dominio dsRBD

Desde los procariotas a los humanos, la mayoría de todas las proteínas implicadas en la interacción con RNA bicatenarios poseen dsRBD.Este dominio se encuentra en muy diversas enzimas como la RNAsaIII procariotica, ADAR (una adenosina desaminasa implicada en la edición del RNA), en la proteína kinasa PKR dependiente de RNA.El análisis de rayos X de dsRBD que aparece en la RNAsaIII ha revelado que este dominio consiste en 70 residuos de aminoácidos y esta formado por una a-helice N-terminal, tre cadenas-b antiparalelas y una a-helice C terminal, que forma un sándwich-ab. Se ha observado que este dominio contacta con 16 pb de la doble hélice en conformación A. El reconocimiento de los rupos 2´OH asegura la unión específica al RNA, pero no al DNA. Tres contactos principales no específicos de secuencia entre la proteína y el RNA resulta de interacciones no iónicas entre el esqueleto azúcar fosfato: un contacto es formado con el surco menor, y dos contactos se forman con el surco mayor. La forma A del dsRNA no cambia su conformación al interaccionar con el dsRBD. Datos recientes muestran que tanto Dicer como Drosha requieren la asociación con proteínas con domino dsRBD para desarrollar su actividad.. En Drosophila, Dicer-1, Dicer-2 y Drosha están asociados con Loquacious, R2D2 y Pasha respectivamente. El papel de R2D2 en dirigir la incorporación específica de la cadena del siRNA es bien conocida. Loquacious puede llevar a cabo un rol similar con el microRNA cargándolo dentro de RISC. La función de Pasha aun no está clara, dado que la especifidad de la cadena parece ocurrir aguas debajo de la acción de Dicer. Una posibilidad es que Pasha confiera regulación a la expresión de los microRNA al nivel del procesamiento de Drosha. Los limitados datos no sugirieren ningún papel, dado que el knouckdown de Pasha redujo el procesamiento de todos los microRNA probados.

Complejo de silenciamiento inducido por RNA (RISC)
La existencia de un complejo nucleasa secuencia-específico fue predido por Fire después de estudios iniciales sobre la ruta de RNAi en C.elegans. La demostración formal de su actividad fue reportada por dos grupos independientes trabajando en Drosophila. La primera información , a prtir de una colaboración entre Zamore, Sharp , Bartel y Tushl, demostró que los dsRNA podía inducir el silenciamiento génico en extracto de embriones de Drosophila, lo cual era acompañado por la destrucción del RNAm diana. En la segunda referencia, usando extractos libres de células de Drosophila procedentes de cultivos celulares, el grupo de Hannon caracterizó esta actividad nucleasa. Ellos mostraron que existía como una preformada y fraccionable entidad. Importante, esta referencia también mostró que la actividad nucleasa conteniá un siRNA como componente integral, lo cual apoyaba la hipótesis de que un RNAi era afectado por un complejo nucleasa secuencia-específico. La exclusión de tamaños por cromatografía sugería muchos posibles tamaños para RISC, desde 500 a 360 kD a 140 kD, dependiendo del sistema modelo. Esta discrepancia puede reflejar la ausencia o presencia de cofactores no esenciales, o la remanencia de factores de montaje de RISC. Si este fuera el caso, 140 kD representaría la nucleasa RISC minima, y ahora sabemos que esto es lo que sucede, dado que Argonauta y un siRNA son suficientes para la mínima actividad de clivaje. La purificación por cromatografía de la nucleasa RISC de Drosophila muestra que esta posee muchos componentes. El primer componente identificado fue Argonauta2 (Ago2), una proteína miembro de la familia de genes conservados en la mayoría de los eucariotas y muchos genomas procariotas. Estructuralmente estra proteína esta caracterizada por dos dominios, el dominio PAZ y el dominio PIWI. Las estructuras de ambos dominios han sido resueltas (ver debajo). Componentes adicionales de RISC con roles desconocidos en el RNAi han sido también identificados. Entre ellos se incluye a la proteína de unión al RNA VIG, el homologo de Drosophila de la proteína X Fragil, dFXR, proteínas helicasas, y Tudor-SN. Esta última proteína tiene 5 dominios de nucleasa estafilococa, (Snasa) y un dominio Tudor. La presencia de dominios Snasa la hace un obvio candidado para Slicer. Muchas lines de evidencia, sin embargo, son inconsitentes con esto. Muchos residuos catalíticos esenciales están ausentes en los tominios Snasa de Tudor-SN. Mientras queu la proteína continua mostrando alguna actividad nucleasa, la

química de las reacciones de clivaje difiere de cualquiera de las observadas con Slicer. Especificamente, los productos de la reacción de Slicer tienen motivos 5´fosfato y 3´OH. La unión escindible ha sido . mapeada en el centro del siRNA, indicando que una reacción endonucleotidica. Snasa, sin embargo, es una exonucleasa que produce 5´OH y 3´fosfato productos. Mientras que Tudor-SN puede tener un papen el la degradación de los productos de Slicer, no es Slicer en si mismo.

Argonauta

Muchas líneas de investigación apuntaron a Argonauta como Slicer. La etapa efectora del silenciamiento de RNA es el reconocimiento del una secuencia de RNA complementaria por RNAs pequeños y el clivaje del RNAm por proteínas de la familia Ago . Las proteínas Ago están altamente conservadas , existiendo en algunas arqueas y la mayoría de los eucariotas. El nombre de la familia deriva del hecho de que una mutación en la proteína relacionada de arabidopsis distorsiona la morfogénesis y resulta en hojas deformes pareciendo los tentáculos del cefalópodo Argonauta. Los miembros de la familia Argonauta muestran varias funciones biológicas, que pueden ser explicadas por su papel en el silenciamiento génico con siRNAs, y especialmente, miRNAs. Mutaciones en los genes Ago muestran varios defctos en el desarrollo. Por ejemplo, mutaciones en el D. melanogaster dAgo1 afecta a las neuronas de todos los tipos y células gliales, y provoca letalidad en el embrión. Ratones con los Ago2 mutantes muestran varias anormalidades en el desarrollo y mueren en el estado de embrión que es probablemente causado por un defecto regulación dependiente de mi-RNAs de la expresión génica. Las proteínas Ago son los principales componentes del complejo efector implicado en el silenciamiento de RNA: ellos catalizan el clivaje de RNA, la supresión de traducción y el silenciamiento transcripcional. El rol central de las proteínas Ago en el silenciamiento génico es debido a su capacidad de unir siRNA y miRNA, y catalizar el clivaje del mRNA complementario. Las proteínas Ago poseen conservados dominios PAZ Y PIWI, que han sido identificados y caracterizados en estudios de RNAi. El dominio PIWI toma su nombre de una mutación en Drosophila piwi (P-element induced wimpy testes), que codifica para una familia de proteínas Ago. La estructura de los dominios Ago ha sido estudiada en Drosophila, humanos y arqueobacterias, por resonancia magnética nuclear y rayos X. La función en arqueobacterias y eubacterias de las proteínas Ago es oscura, porque el RNAi no ha sido detectado en procariotas. Sin embargo, su análisis estructural es de inmensa importancia para un mejor entendimiento de las funciones de las proteínas Ago en eucariotas. El domino PAZ ha sido encontrado solo en Dicer y en Ago, y es una variante estructural del domino de unión de oligonucleótidos/oligosacáridos, que une cadenas simples de DNA o RNA. El domino OB se encuentra en un factor de terminación de trascripción procariotico, en eucariotas RPA, que une regiones de DNA de cadena simple y juega un rol en la replicación del DNA; y en proteínas de unión de extremos 3´ protuberantes de los DNA telomericos. El dominio PAZ de Drosophila Ago1 y Ago2 consisten en 2 subunidades que se estabilizan entre si. El principal subdominio es estructuralmente similar al dominio OB y consiste en 5 cadenas B formando un barril B abierto y dos a-helices; el otro subdomino consiste en un b-hairpin y una a-helice. Entre ambos subdominios hay un bolsillo de acomodación de los dos extremos 3´ protuberantes del siRNA.; los extremos interactúan con residuos de aminoácidos aromáticos e hidrofóbicos conservados. Los nucleótidos que no están unidos al bolsillo se encuentran en un surco formado sobre la superficie del domino PAZ. Un análisis estructural del domino PAZ en complejo con siRNA revela que interacciona con una sola cadena del RNA dúplex. La unión del dominio PAZ con el RNA es nucleótido-no especifico, debido a que el dominio eficientemente se une al extremo protuberante 3´dTdT de una doble cadena artificial de siRNA. El dominio PAZ varia ligeramente en estructura a lo largo de diferentes proteínas Ago, mostrando una elevada afinidad por DNA o por RNA. Es posible que la unión al DNA sea esencial para las correspondientes proteínas Ago en el silenciamiento génico a nivel de cromatina.

El papel del dominio PIWI en la unión del siRNA fue descubierto debido a estudios estructurales del complejo de un dúplex artificial de siRNA y AfPiwi de la arqueobacteria Achaeoglobus fulgidus y al análisis de mutación de la Ago2 humana. AfPiwi tiene el dominio PIWI y difiere de la Ago eucariota en que le falta el dominio PAZ. Nucleotido fosforilado en 5´terminal de una cadena de siRNA se une dentro de un bolsillo que es el la estructura mas conservada del dominio PIWI y se alinea con residuos de aminoácidos básicos. El grupo fosfato 5´ interactua con un ion metal divalente y cuantro residuos de aminoácidos invariantes. Las sustituciones de esos residuos afectan a la actividad de Ago2 en humanos, sugeriendo que la uunión del 5´ fosfato tiene significado funcional. La base del nucleótido terminal 5´descansa sobre el anillo aromático de la tirosina AfPiwi, que sigue estabilizando la unión. El bolsillo no tiene contactos específicos destinados a reconocer el grupo 2'-OH, es decir, PIWI puede unir varios aminoácidos. Los nucleótidos fijados por el dominio PIWI no está enlazado con la cadenacomplementaria en el dúplex siRNA. La localización extrahelicoidal del nucleótido 5´terminal concuerda bien con la idea de que el apareamiento del nucleótido 5´terminal del siRNA o del miRNA de la cadena guía con el Mrna es innecesaria para el reconocimiento y clivaje del miRNA. Los nucleótidos adjacentes (posiciones 2-5) de la misma cadena forman una conformación A de hélice y están organizados en un surco sobre la superficie del dominio PIWI debido a uniontes entre los residuos de aminoácidos básicos de la protenia y el esqueleto azúcar-fosfato del RNA. Así, el domino PIWI es similar al dominio PAZ en la interacción una sola cadena del dúplex del siRNA. Aunque RISC es cargado con siRNA bicatenario, se piensa que los dominios PAZ y PIWI de Ago se une solo a la cadena guía y forma contactos no intensos con la cadena pasagera, que podía entonces ser separada durante la formación del RISC activo. En el RISC activo el domino PAZ de Ago une el extremeno 3´ de la cadena guía, mientras que el dominio PIWI une el extremo 5´. Un análisis estructural de dos proteínas de arqueobacterias, PfAgo y AfPiwi, y el análisis bioquímico de mutantes humanos Ago2 han mostrado que los dominios PIWI tienen elementos estructurales que son similares a los de la RNAsa H, que cliva la cadena de RN a en hibrodos RNA-DNA. La RNAsa H contiene la triada de aminoácidos catalíticos AspAspGlu. Un domino de aminoácidos similar, AspAspHis, ha sido encnotrado en el domino PIWI de PfAgo y muchas proteínas Ago eucarioticas, incluyendo la Ago2 humana. El motivo AspAspHis del dominio PIWI de la humana Ago2 es esencial para el clivaje del mRNA. Los mutantes de Drosophila y de mamíferos de Ago aislados a partir de células de E.coli no requieren proteínas accesorias para catalizar el clivaje del mRNA en presencia de siRNA. Modelando el dúplex de la cadena guía-mRNA sobre la superficie del dominio PIWI de AfPiwi coloca el enlace fosfodiester diana del mRNA cerca del centro catalítico putativo. Anotamos que era un análisis estructural de Ago con un subsecuente análisis de sustituciones de aminoácidos que revelaron que el domino PIWI (Slicer) es el responsable del clivaje del mRNA. Bases en la región terminal 5´ del RNA guía (posiciones de 2-8) son de especial importancia para el clivaje del mRNA. Cuando el mRNA guía y el mRNA forma un dúplex completametne complementario, que ocurre en la correcta conformación A, Ago cliva el mRNA para que el enlace fosfodieste diana es contado hacia atrás desde el extremo 5´ de la cadena guía y esta entre los nucleótidos del mRNA complementaiors a los nucleótidos 10 y 11 a partir del extremo 5´ de la cadena guía. Cuando las secuencias son parcialmente complementarias, la iniciación de la traducción en un mRNA dado es suprimido. Es probable que las características estructurales de diferentes proteínas Ago son responsables de sus funciones en diferentes niveles de expresión génica. Clonando pequeñsos RNAs y experimentos in vitro con plantas y Drosophila revelaron tanto siRNAs pequeños (21-23) y grandes (24-27). Hay evidencias de que los siRNAs pequeños están implicaos en la degradación del mRNA y la suprsión de la traducción, mientras que los siRNAs largos juegan un papel een el silenciamiento transcripcional Dado que el extremo 3´ de la cadena guía esta unido al domino PAZ y el extremo 5´e esta unido con el dominio PWI de Ago, de acuerdo con los datos estructurales, es posible asumir que las proteínas Ago que difieren en la distancia entre los PAZ y los dominis PIWI prefieren siRNAs de diferentes tamaños.

Por ejemplo, una variedad particular de Ago puede unir solo siRNAs grandes para iniciar el silenciamiento génico. Las variaciones estructurales de los siRNAs y las proteínas Ago son posiblemnte responsable de su implicación tanto en el silenciamietno transcripcional como posttranscripcional. En humanos hay cuatro muy relacionados miembros de la familia Argonauta, denominados Ago1-4, los cuales unen siRNA y microRNA en niveles similares , y están ampliamente expresados. Solo Ago2, sin embargo, esta presente en una RISC clivaje-competente. De forma similar, el knockout de Ago2 afecta al proceso de RNAi, mientras que el Knockdown de Ago1, Ago3 y Ago4 no tuvieron efecto. Esos datos peuden ser interpretados de dos formas: Solo Ago2 es capaz de interactuar con Slicer, o bien Ago2 es Slicer. La respuesta fue proporcionada por la estructura cristalina de miembros de la familia argonauta procedente de Pyrococcus furiosus. La estructura reveló un plegamiento RNAsa H para el dominio PIWI. La estructura cristalizada de una segunta Argonauta de arquea, Archaeoglobus flugus Piwi (AfPiwi), confirmó el plegamiento RNAsaH. La demostración final de que la actividad Slicer estaba en Ago2 fue la reconstrucción del RISC mínimo con expresión bacteriana, purificando Ago2 y una cadena simple de siRNA. Los estudios mecanísticos de RISC han alcanzado recientemente un ápice con la estructura cristalina del complejo AFPiwi con un dsRNA. Las proteínas AfPiwi no son un modelo perfecto, dado que les falta el domino PAZ, y su rol celular es un misterio. Sin embargo su estructura proprocionó detalles moleculares a un gra número de observaciones experimentales. Por ejemplo, los pares microRNA/diana han demostrado la importancia de lso nucleótidos 2-8 en el microRNA, denominados región semilla (seed región), para el reconocimiento de la diana. La estructura de AfPiwi muestra que el primer nucleótido del siRNA no aparea con la diana, pero es secuestrado en un polsillo de unión. No solo es un apareamiento innecesario, sino que un fuerte apareamiento puede distorsionar la unión del RNA y reducir al actividad Slicer. Interesantemente, un fuerta apareamiento en el extermo 5´no debe ocurrir en ningún caso, dado que las reglas que rigen la incorporación en línea deRISC se basan en el emparejamiento de bajaenergía en el extremo 5´ de la cadena incorporada (guía), comparanndola con la descartada (pasajera). Esto significa que un siRNA o miRNA efectivo empezará con A o U. Por supuesto, otra via para conseguir una carga carga de cadena especifica es tener una G o C desapareada en el extremo 5, lo cual no reduciría la tasa catalítica de Slicer. El model catalítico de Slicer se muestra en la siguiente figura. El extremo 5´ del siRNA guía esta unido al dominio PIWI. El 5´fosfato, que es importante para la unión de alta afinidad, esta coordinado por cuatro residuos conservados, y torsionados lejos de la cadena diana del mRNA. El extremo 3´ del siRNA se extiende mas aya del dominio PIWI,. Estudios estructurales de dominios PAZ aislados sugieren su unión el extremo 3´OH terminal del RNA, o hibrida con el extremo 3´saliente. Dado que a AfPIWI le falta el dominio PAZ, solo se puede predecir que este sominio se une al extremo 3´del siRNA guía. El RNAm diana hibrida primero con la región semilla en 5´ del siRNA, en el contexto del dominioPiwi. La afinidad de la unión del mRNA se basa en gran parte en esta interacción, aunque el la eficiencia de la tasa catalítica de Slicer depende de la formación del dúplex con la región 3´ del siRNA. El motor catalítico es el plegamiento RNAsaH en el domino PIWI. Las RNAsa H endonucleasas típicas clivan la cadena de RNA o de RNA/DNA dúplex, deuna manera dependiente de catión, generando 5´fosfato y 3´OH productosCuando se presentó con un largo ARN sustrato dúplex con un oligonucleótido cortas de ADN, sin embargo, la enzima que rompe el ARN en el centro del oligonucleótido. Esto es esencialmente una máquina de cortar la actividad, aunque la guía del siRNA toma ellugar de los oligonucleótidos de ADN. Este modelo tambén explica la unión de las dianas de mRNA a los microRNA en RISC. La región semilla en 5´ de el microRNA es esencial para la unión afín.Dado que la actividad de Slicer no es necesaria, la región 3´ de el microRNA es relativamente poco importante. Lo que no esta claro es el mecanismo de supresión traduccional.La degradación de la diana ocurre, pero no parece ser la principal causa del silenciamiento. La perdida de función de la actividad exonucleasa 5´-3´ en C.elegans casuó un incremento

en el let-7 destino lin-41, sin un incremento de la proteína 41 . El modelo mas convincente para los microRNA función ha sido recientemente publicado por el grupo de Filipowicz. Ellos presentaron evidencias de que el microRNA bloquea la iniciación de la traducción dependiente de caperuza en 5´.vMensajeros independientes de cap que se inician a partir de una Sitio Interno de entrada al Ribosoma (IRES) no son diana de los microRNAs.

Un IRES, (Internal Ribosome Entry Site) o Sitio Interno de entrada al Ribosoma es una secuencia nucleotídica que se encuentra en el extremo 5´UTR (untranslated region o región no traducida) que permite la iniciación de la síntesis proteica, la traducción del marco abierto de lectura de un RNA mensajero (mRNA o ARNm). A diferencia del mecanismo más conocido de traducción proteica en organismos eucariontes que requiere una modificación previa en el extremo 5', en el cual se añade lo que se denomina Cap, y que no es más que la adición de un grupo metilo al carbono 7 de laguanina del extremo 5´ del mRNA para el ensamblaje de la maquinaria de traducción, las secuencias IRES son reconocidas por el complejo de pre-iniciación 43S, de manera que pueden comenzar la traducción del RNA mensajero a pesar de carecer de modificación Cap en su extremo 5'. Estas secuencias han sido encontradas en miembros de las familias virales picornavirus, retrovirus yherpesvirus. Además, recientemente se han encontrado secuencias IRES en mRNA de organismos eucariontes, especialmente en proteínas implicadas en la regulación del ciclo celular, así comomecanismos apoptóticos. Los elementos IRES tienen elementos en cis (es decir en la propia secuencia del IRES), los cuales son reconocidos por proteínas de la maquinaria de traducción de la célula. Algunas de estas proteínas también intervienen en la iniciación de la traducción dependiente de cap, como por ejemplo eIF3, eIF4B y eIF4GII. Los mRNA silenciados son localizados en los cuerpos p en el citoplasma (citoplasmatic mRNA processing bodies). Estos son estructuras imprecisamente definidas que contienen las poblaciones de mRNA y la maquinaria de degradación y procesamiento nucleolítico. El modelo Filipowicz predice que es una consecuencia de la inhibición traduccional, lo cual esta en armonía con la degradación exonucleótica 5´-3´ de las dianas de mRNA, dado que esta actividad esta localizada en los cuerpos P. Mientras que los microRNA y la RNAi vías comparten la misma maquinaria central, algunas especializaciones pueden existir . Por ejemplo , en Drosophila AGO1 preferencialemente une microRNAs y Ago2 siRNAs. De forma similar, Dicer1 es esencial para el procesamiento del microRNA. Las moscas que carecen de Dicer-1 poseen niveles mínimos de microRNA y exiben fenotipos de desarrollo que serian esperados de su deficiencia. Estas moscas pueden procesar largos dsRNAs en niveles normales.Los mutantes de Dicer-2, inversamente, tienen niveles normales de microRNA maduros pero no pueden procesar los dsRNAs largos. Interesantemente, ambos mutantes tienen reducidos niveles de silencimiento génico desencadenado por siRNAs. Esto no sorprende para Dicer-2, dado que su rol en en el ensamblaje de RISC. Pero el porque es necesario Dicer-1 para el procesamiento de los siRNAs es un misterio. Es posible que exista algún tipo de solapamiento funcional, dado que el particionamiento de siRNAs y los microRNAs en los complejos Ago2 y Ago1, respectivamente, no es absoluta. Una explicación alternativa es que las moscas Dicer-1 , que les falta la función de microRNAs, tienen una serie de defectos celulares, y esto conduce a reducción de eficacia de los siRNAs. Es interesante que en humanos hay solo un gen Dicer, que esta mas relacinado con el gen Dicer-1 de Drosophila. De forma similar, la Ago1-4 humanas están relacionadas con Ago1 de Drosophila, no existiendo ortólogos de Ago2 de Drosophila en humanos. Esto sugiere que el genoma humano se ha mantenido la preferencia sub microRNA-vía. Dado que los dslargos son toxicos para las células de los mamíferos, la via de procesamiento para este tipo de RNAi sería innecesaria. La función de Slicer, sin embargo, ha sido mantenida en un miembro de la familia en humanos, Ago2.

Variantes de los genes argonauta en los eucariotas superiores

El genoma de los eucariotas superiores codifican para muchas proteínas Ago. Hay 10 genes de proteínas Ago en plantas, cinco genes en Drosophila, y siete genes en humanos. Paralogos de la familia Ago pueden estar implicados en diferentes vías de silenciamiento de RNA, y Dago1 esta implicada en la via de miRNA D. melanoganster Dicer2/R2D2 y Dicer1/LOQS entregan miRNA y siRNA para diferentes RISCs, que contienen Dago2 Y dAGO1 respectivamente. El análisis del silenciamiento de RNA en un sistema in vitro ha hecho posible caracterizar las propiedades de esos complejos efectores, y ha mostrado que tanto siRISC y miRISC son capaces de inducir la degradación de las dianas complementarias de mRNA. Sin embargo, Ago específicas para el silenciamiento con siRNA o miRNA no han sido encontradas en mamíferos. Human Ago1, Ago2 y Ago3 unidos tanto siRNA y miRNA en vitro. Una posible explicación es que el mismo Dicer esta implicado en la generación y carga de RISC con RNAs pequeños de ambos tipos. Las variantes de Ago de mamíferos pueden ser especialmente adaptados a diferentes mecanismos de silencimiento; la degradación de mRNA dianas, la supresión de traducción, o el silenciamiento transcripcional. De hecho, solo RISC que contienen Ago2 induce la degradación del mRNA en las células humanas. Es posible que Ago1 y Ago4 sean incapaces de clivar la diana, porque l la tríada catalítica carece en su ago1 y uno de los residuos Asp en ago4. Sin embargo, una falta de Ago2 no previene el silenciamiento traduccional de un gen reportero en células cultivadas, sugiriendo que algunas proteínas Ago están implicadas solo en la supresión de la traducción, pero no en la degradación del mRNA. En contra de los eucariotas superiores, la levadura Schizosaccharomyces pombe tiene solo una Ago, que juega un rol tanto en el silenciamiento transcripcional como en postranscripcional.

Helicasas en el iRNA

Al principio se creía que la función de las helicasas de RNA estaban restringidas a la separación del dsRNA, debido a la energía de la hidrólisis de los NTP. Estudios recientes han mostrado que las proteínas de esta famila juegan un papel en la disociación de los complejos proteína-RNA. Las helicasas de RNA contenidas en los grandes complejos rebonucleoproteicos (RNP)están implicadas en muchas etapas del metabolismo del RNA, incluido el splicing, la maduración del ribosoma y la traducción. El grupo mas abundante de la familia incluye DExH/D helicasas ( donde X puede ser cualquier residuo de aminoácdo), que derivan su nombre de la secuencia de aminoácidos de uno de los motivos mas conservados. Esas enzimas poseen seis motivos conservados. Uno es el implicado en la unión de NTP, mientras que los otros aseguran la unión de RNA dependiente de NTP. Como las mutaciones y los análisis de X-ray de DExH/D RBA helicasas de varios organismos han mostrado, los motivos I, II (DExH/D) y IV juegan un rol en la hidrólisis de NTP; el motivo III esta asociado con actividad helicasa; y los motivos IV y V están implicados en la unión al sustrato. Estructuralmente, las proteínas de la familia parecen una garra con residuos de aminoácidos de los dominios conservados mirando hacia el interior, donde el sustrato y los NTP están acomodados. Se piensa que la garra, formada por los dominos I y II, se habre y se cierra de una manera dependiente de NTP para determinar la actividad translocadora del enzima. La mayoría de las helicasas de RNA contienen dsRBD, que reconoce 2´OH del motivo ribosa de un dúplex de RNA sin tener en cuenta la secuencia. Un N terminal extendido, que es característico de muchas DExH/D helicasas esta probablemente implicado en las interacciones con otras proteínas. De hecho, las helicasas de RNA suelen encontrarse en grandes complejos nucleoproteicos como el spliceosoma, el complejo inhibidor de la traducción y otros. En algunos casos, la actividad helicasa es solo detectable en presencia de una proteína cofactor.

La mayoría de las helicasas son solo activas cuando se unen a un extremo monocatenario de un RNA dúplex, uniendo extremos protuberantes 3´ y 5´ con similar eficiencia. Presumiblemente, una helicasa DExH/D se mueve a lo largo de una cadena del RNA y entonces desplaza a la otra. Una separación progresiva de los dúplex del RNA es característico solo de las proteínas DExH/D; las proteínas de la familia DEAD tienen baja procesividad. Esas helicasas temporalmetne unen pequeños (alredor de 10 bp) fragmentos de un dúplex abierto de RNA para prevenir la reasociación y permitir nuevas interacciones RNA-RNA y RNA-proteinas. Además, las helicasas DExH/D son capaces de desplazar proteínas asociadas con dúplex de RNA. Esta , también llamada, actividad RNPasa no esta siempre acompañada por la separación del dúplex. La actividad RNPasa es de inmensa importancia, permitiendo la redistribución dinámica de las interacciones proteína-RNA, que juegan un papel clave en el metabolismo del RNA, en particular en el RNAi. El papel bioquímico de las helicasas de RNA DEAD y DExH/D continua en debate; aunque métodos genéticos han implicado a esas enzimas en el RNAi y el silenciamiento de transgenes, transposones y genes repetidos en varios organismos,. La actividad RNA-helicasa se suele sugerir para componentes proteicos de los complejos RNAi a partir de la presencia de los correspondientes dominios conservados. Inicialmente se asumía que las helicasas de RNA “melt”? los siRNA o miRNA bicatenarios durante la formación del RISC activo, que contiene sono una, guía, cadena de RNA pequeño. Los los nucleótidos protuberantes en el extremo 3´ del RNA pequeño se pensaba de ser los sitos de reposo para las helicasas. La desestabilización subsiguiente del dúplex por las RNA helicasas puede facilitar la separación de las cadenas y la eliminación de la cadena adecuada del RISC. Se encontró, sin embargo, que el siRNA es cargado como un dúplex en el RISC y entonces Ago cliva la cadena pasajera y libera la cadena guía. Es posible que las helicasas estén implicadas en el desplazamiento de los fragmentos del siRNA pasajero del RISC y entonces regerar el RISC para la siguente ronda de clivaje. La eficiencia del clivaje del mRNA diana es de hecho alto en presencia de ATP, debido a la elevada multiplicidad de los ciclos de RISC funcional. Actuando como ATPasas, DExH/D helicasas están presumiblemnte implicadas en las etapas del iRNA que implican cambios en la composición de los complejos proteicos con pequeños RNA. Los datos indican a continuación indirectamente el posible papel de helicasas de RNAen particulares etapas de RNAi. Los genes codificados por las helicasas putativas e implicadas en varias etapas del iRNA han sido identificadas en muchos organismos. Una mutación de D. melanogaster spindle-E (spn-E), que codifica para la helicasa putativa de RNA DExH/D, distorsiona RNAi causado por dsRNA exógeno. SPN-E es probablemente un componente de muchas rutas efectoras. El gen spn-E esta implicado en el silenciamiento de un amplio rango de varios retrotransposones, incluyendo repeticiones largas terminales y LINEs, en tejidos germinales de Drosophila y regula la expresión de las repeticiones endógenas en tamdem de Stellate a través de un mecanismo similar al RNAi. Ha sido observado que el siRNA específico para Stellate y los retrotransposones teloméricos HeT-A y TART son idetectables en los mutantes spn-E de Drosophila, implicando a SPN-E en la generación y/o estabilización del siRNA. SPN-E esta probablemente implicado en el silenciamiento transcripcional, debido a la distribución de las proteianas asociadas a las heterocromatinas a lo largo del cromosoma están distorsionadas en los mutantes spn-E. Otra helicasa de RNA putativa de Drosophila , ARMITAGE (ARMI), es homologa a la helicasa SDE3, que en Arabidopsis esta implicada en el silenciamiento postranscripcional. ARMI no pertenece a las helicasas de RNA DExH/D. Como SPN-E, ARMI es probablemente un componente esencial de varias vías efectoras. Mutaciones en armi conducen al bloqueo de la represión de los retrotransposones y Stellate y a la prematura traducción del mRNA oskar, que contiene una secuencia complementaria a miRNA en el extremo 3´. ARMI es necesario en la formación el RISC activo en D.melanogaster pero no por la separación de los siRNA, porque pequeños RNA monocatenarios exógenos no restauran la actividad de RISC en un lisado de embriones con mutantes armi. El homologo ARMI SDE3 esta implicado en un paso temprano del RNAi y es necesario para la generación de siRNA en Arabidopsis.

Muchos genes de Caenorhabditis elegans codifican para helicasas putativas de DExH/D esenciales para el silenciamiento dependiente de dsRNA. Uno de esos, mut-14, codifica para la helicasa de RNA DEADque no juega ningún papel en la generación del siRNA y es poblablemente un componente de RISC.

Un análisis de la composición de los complejos de proteínas caractarísticos de varias etapas de RNAi sugiere que algunas helicasas de RNA son componentes de un complejo intermediario esencial para la formación del RISC activo. En una evidencia de inmunoprecipitación, dos helicasas DEAD relacionadas de C. elegans , DRH-1 y DHR-2 , están unidas con Dicer (DCR-1) y esta interacción en necesaria para una eficiente iRNA. Además, esas helicasas interactúan con RDE-4 ligadora de RNA, que es un socio de Dicer encontrado encontrado en coplejos similares a RLC, también con RDE-1 que pertenece a la familia Ago. Esos descubrimientos apoyan el rol de las helicasa de RNA en la separación de los dúplex de siRNA durante la carga de la cadena guía y la formación del RISC activo. Actividad separadora de RNA ATP dependiente ha sido observada en vitro solo para la Germin 3 de mamíferos, que coinmunoprecipita con Ago2 y miRNA con un componente de las partículas de miRNP. Aunque las helicasas de RNA son factores obligatorios de iRNA y procesos similares en muchos organismos, los datos genéticos y bioquímicos disponibles son insuficientes para mostrar tu papel estructural y bioquímico en esos procesos.

Otras proteínas de unión al RNA implicadas en el RISC

Purificaciones de Drosophila de RISC han identificado VIG y dFXR como componentes adicionales del complejo efector del iRNA. Evolutivamente conservados VIG contiene los bien conocidos dominios de unión al RNA RGG, que están enriquecidos en Arg y Gly. En C. elegans, VIG-1 esta contenido en RISC. La otra proteína, dFXR, alberga el dominio RGG y dos dominios KH ( K homologos; el dominio ha sido identificado en la proteína K del RNP nuclear), que están inplicados en la unión al RNA. Por el contrario a dsRBD, los dominos KH y RGG consisten solo en 10-25 aas y, mas probablemente, unen cadenas simples de RNA , aunque el dominio KH contiene el mismo elementro estructural alpha-beta de dsRBD. Se piensa que el reconomiento del RNA esta mediado por un loop conformación de lazo débil que separa las cadenas beta y las hélices alpha. Sin embargo, el modo de unión al RNA por KH ifiere del modo de unión de dsRNA por dsRBD. FMRP , un homologo de la dFXR humana, esta asociado con la regulación transcripcional de algunos mRNAs en células del sistema nervioso. Además, FMRP ha sido detectado en complejos con Ago y Dicer, que están presumiblemente implicados en la regulación traduccional dependiente de miRNA. Así, VIG y FXR homologos son componentes del RISC activo en varios organismos. La función de esas proteínas en el iRNA continuna oscura. La nucleasa Tudor-SN es otro componente de RISC en Drosophila y C.elegans. Tudor-S alberga 5 dominios homologos al dominio nucleasa de la endonucleasa estafillococa-micrococal. El dominio Tudor ha sido observado en varioas proteínas asociadas con la cromatina, el transporte de RNA y su metabolismo. El dominio Tudor esta contenido en SPN-E de Drosophila, pero su función no esta clara.

Ensamblaje del RISC

Recientes trabajos han empezado a refinar los roles de las proteínas Dicer en el RNAi. Por ejemplo, basado en un modelo de dos etapas para el RNAi, la introducción directa de siRNA no debería requerir la función de Dicer. Sin embargo, la eliminación de Dicer reduce de forma importante el silenciamiento de siRNA. Hay también evidencias de hairpins sintéticos que actúan como sustratos de dicer son mas

efectivos en desencadar la RNAi que los siRNAs. Esas observaciones apuntan a una interacción entre Dicer y RISC. Esa interacción fue primeramente sugerida por estudios de co-inmunoprecipitación, pero su naturaleza era desconocida. Datos recientes de dos laboratorios han indicado un proceso de ensamblaje multietapa para RISC que requiere Dicer. En un paso temprano, Dicer un socio dsRBD ( ej. R2D2 y Dicer-2 en Drosophila) une al siRNA. El ensamblaje de este complejo de carga de RISC (RLC) puede esr una simple etapa o puede incluir multipes etapas con diferentes y no caracterizadas proteínas diferentes.La orientación de la unión de R2D2 es asimétrica, favoreciendo la carga de la cadena guía de el siRNA dentro del RISC. De forma concertada, el siRNA es separado y la cadaena guía es transferida desde el RLC al RISC. Evidencias sugieren que este ensamblaje ocurre en un complejo 80S. Dado que RISC ha sido mostrado unirse a los ribosomas, este gran complejo puede ser el ribosoma. Este holo-RISC es ahora activo, y puede unir mRNA mientras el ribosoma esta unido, o puede disociarse como RISC libre. Seguido al clivaje por RISC, el dúplex de miRNA o siRNA maduros deben ser cargados desde Dicer a Argonauta para formar el RISC activo. Este proceso conduce a la selección de la cadena guía y la eliminación de la pasajera. En humanos, los compnentes mínimos requeridos para la garda de Argonauta 2 (Ago2) son el complejo Diceer con su cofactor dsRBP, TRBP, y un dúplex de siRNA maduro . El complejo de carga de RISC en humanos ( RLC) y sus componentes han sido recientemente analizados por negative-stain electron microscopy, proporcionando un marco estructural para probar coom los dúplex de siRNA puede ser transferidos desde Dicer-TRBP a Ago2 durante la carga de RISC. La reconstrucción por EM de la Dicer humana (Figura 3ª) revela una molecula en forma de L conteniendo una grieta en su eje mayor. El brazo corto de la L corresponde al dominio helicasa N terminal (DExH/D) , basado en el análisis de mutantes de delección que han perdido aprox. 80 kDa de la región helicasa. Recostrucciones de EM de varias combinaciones de varios componentes de RLC fueron usados para diseccionar los componentes restantes del RLC completo. Esos análisis sugirieron que TRBP interactua flexiblemente con el dominio helicasa de Dicer, mientras que Ago2 se extiende entre TRBP y el brazo largo de Dicer, formando un complejo cerrado een algunas partículas. La interacción Ago2- Dicer se piensa que ocurre entre el dominio catalítico PIWI de Ago2 y el dominio RNAsa IIIa de Dicer, basado en previos análisis Para determinar como el dúplex de siRNA puede ser acomodado dentro del RLC, un siRNA de 22 pb fue modelado a lo largo de la cara de unión a RNA putativa de Dicer, revelando que el dsRNA se une perfectamente dentro del hueco entre Ago2 y Dicer . IMAGEN 11 En un modelo de unión a RNA alternativo, el dúplex de 22 bp puede también unirse entre los domigios PAZ y Ago2 de Dicer, sugiriendo que los dos dominios podrían unier ambos extremos del siRNA al mismo tiempo. Esta observación sugiere una cusiosa posibilidad para un intermediario de conformación de RLC durante el RNA hand-off. Aunque TRBP se sabe que es importante para el reclutamiento de siRNAs a Ago2, su rol exacto no se conoce. La localización y flexibilidad del TRBP sugerida por el modelo EM puede permitir al dsRBP accteder al dominio PAA de Ago2. Trbp podría entonces cubrir el espacio entre Dicer y Ago2, reteniendo al siRNA dentro del RLC una vez que Dicer lo libere, y posicionando el correcto extremo del siRNA para la unión por el dominio PAZ de Ago2. El proceso de orientación del siRNA durante la transferencia de Ago2 es particularmente importante para la selección de la cadena, que esta basada principalmente en la asimetría termodinámica del dúplex de RNA pequeño. TRBP puede tener un papel adicional de corrección para la selectividad de la cadena durante la carta de RISC mediante la detección de la estabilidad termodinámica relativa de cada extremo del dúplex. La etapa final de activación de RISC, la eliminación de la cadena pasajera, ha sido recientemente el objeto de muchos estudios bioquímicos. En Drosophila melanogaster , la cadena pasajera es eliminada pr

un proceso a través de diferentes mecanismos dependiendo de qué homologo de Argonauta esta presente en RISC. Sobre la transferencia del dúplex de siRNA a RISC , la Ago2 de Drosophila cliva la cadena pasajera y la endoncleasa C3PO elimina los productos clivados, actuvando al complejo Cadena guíaAgo2.. En contra , Ago1 ,que une miRNAs y tiene relativamente una actividad de clivaje débil comparada con Ago2, separa los dúplex de miRNA a través de un mecanismo independiente de slicer. Ago2 Humanos contienen RISC probable sigue el mecanismo dependiente de slicer para la eliminación de la cadena pasajera, aunque la C3PO humana no ha sido confirmada como un activador de RISC.

Limitaciones en el empleo de iRNA como herramienta biotecnológica
.. Muchas de esas limitaciones dependen del tipo de polimerasa empleada para el reconocimiento y amplificación de las secuencias de siRNA. Sin embargo, incluso siguiendo las reglas recomenadas para el diseño de siRNAs, no asegura en silenciamiento seguro de una diana. La eficacia de la supresión mediada por siRNA de la expresión génica depende de un numero de factores , incluyendo no solo la secuencia de siRNA escogida, pero también la estructura del siRNA, y la receptividad del tipo de célula que asimilará el siRNA. Además la vida media del mensajero diana y/o proteínas necesitabas para ser consideradas para conseguir el silenciamiento optimo. El uso de RNAi para fines terapéuticos depende de otros factores. Aunque los siRNAs son relativamente estables en condiciones de cultivo de células, ellos necesitan una mejorada estabilidad nucleasa y termodinámica in vivo. Mientras hay opiniones mezcladas hacerca de que tipo de modificación será mas efectiva en la mejora de la estabilidad, sin comprometar la actividad de silenciamiento, avances han sido hechos para conseugir el propósito de siRNA adecuados para propósitos terapéuticos. Otra de las desventajas de la terapia de iRNA es la saturación de la maquinaria de iRNA, dado que mientras la facilidad y la eficiencia de la inhibición de siRNA puede ser derivada a partir del hecho de que esas moléculas exógenas añadidas están empleando una via celular natura, problemas de seguridad cada vez mayor es que esto podría interferir con las funciones de regulación de miRNAs endógenos que son conocidos a compartir algunas de las misma maqunaria. Evidencias sugieren que cuando un exceso de siRNA son liberados en células de mamíferos, la maquinaria de procesamiento de iRNA intracelular puede saturarse, pudiendo alterar los mecanismos de regulación génica en los que intervienen los miRNA. Además, alteracioens en la expersión de miRNAs o su maquinaria de procesamiento ha sido recientemente implicada em muchas enfermedades neurológicas y canceres. En algunos casos la sobreexpresión de miRNA ha demostrado ser oncogénica, pero en otros casos la expresión reducida de miRNA es observada en células cancerosas. Otra limitación es que , aunque el iRNA es mas potenet que otros métodos de silneciamiento génico, hay que tener en cuenta las limitaciones inherentes a esta tecnología, dado que el iRNA ha mostrado knocks down genes, pero generalemnte no elimina por completo su expresión.

Efectos inéspecíficos o fuera de diana del iRNA

Dos de las pricipales consideraciones para el desarrollo de iRNA para la terapia clínica son primero, la elaboración de mecanismos eficientes para el desarrollo de siRNA en las células diana en vivo, y segundo, evitar los efectos no específicos del siRNA. Con el incremento del uso del iRNA como una herramienta de investigación, esta claro que la introducción de una molecula de siRNA en una celula puede tener múltiples efectos mas haya de los causados por el silenciamiento gen-específico. En muchos casos esos efectos colaterales pueden no ser aparentes hasta que estudios de expresión genética

global son llevados a cabo que muestran en los efectos del siRNR mas ayá de la inhibición esperada de la expresión del gen diana. Dos principales tipos de respuesta no específica ha sido observada. Primpero, los siRNA pueden activar una vira celular de respuesta al dsRNA alternativa que resulta en la sobreregulación de un gran numero de genes típicamente asociados con las vías de respuesta inmune innata, incluyendo genes estimulados por inteferon (ISGs). Es representa un mecanismo específico de siRNA, en lugar de un mecanismo específico de diana, de la regulación semiglobal de la expresión génca en que la secuencia de siRNA es irrelevante. Un segundo tipo de efecto , denominado fuera de objetivo (off target), es observado cuando otros genes además de los genes diana muestran una expresión alterada en resesta al siRNA. Por último, dado que el iRNA experimental emplea la misma maquinaria celular que es requerida para la regulación génica endógena mediada por miRNA , es posible que ambos procesos pudieran interferir entre si. El iRNA ha revolucionado los estudios de función de gen y y representa una gran promesa como la validación de dianas de medicamentos y el tratamiento de enfermedades humanas. Sin embargo, a pesar del éxito que ha conseguido esta tecnología, estudis llevados a cabo en células humanas sanguíneas han mostrao que los siRNA podrían generar diversas alteraciones, incluyendo la activación de la respuesta innata y la inhibición de indeseadas dianas génicas. Así, aunque iniciale estudios sugerían que los siRNA eran específicos y suficiente pequeños para evadir los efectos indeseados que podían ser desencadenados por el siRNA, como la respuesta de interferón y la degradación de mRNA medianda por complementaci´n parcial de secuenia. Aunque algunos de estos efectos pueden ser reducidos usando bajas concentraciones de siRNAs, la respuesta de interferón fue observada incluso a bajas concentraciones. Interesantemente, siRNAs modificados en 2´uridina no desencadenan la señalización de TLR (Toll-like receptors). Así, a diferencia de lo que se pensaba, el iRNA no tiene una acción tan específica, y bajo ciertas circunstancias puede condicur a efectos indeseados: las tres principales causas de ello son: algunas siRNA son detectadas por la célula desencadenando la activación de la respuesta mediada por interferón, la sobreexpresión de los siRNA puede saturar la maquinaria de silenciamiento celular que ens necesaria para el control de la expresión de muchos genes esenciales , y por ultimo , muchos siRNA no son específicos para su diana y pueden actuar como miRNA para inhibir la expresión de otros quenes que podriena ser necesarios para el propio funcionamiento celular. Como los efectos indeseados son dependiente de dosis, es esencial el desarrollo de protocolos que reduzcan al minimo estos efectos.

Combinación de iRNA y inhibición de U1

La expresión génica puede ser también inhibidas con U1 small nuclear RNA—U1 snRNA—interference (U1i). U1 snRNA acompañado de U1-70K y otras proteínas celulares forman una ribonucleoproteina nuclear madura (U1 snRNP), que es un bien conocido factor de splicing constitutivo. U1 snRNP funciona en el splicing uniendo el pre-mRNA a través del apareamiento de bases entre los nucleótidos 211 del U1 snRNA y la secuenica en 5´del sitio de splicing. A parte de esta función en el splicing, U1 snRNP puede actuar también como un potente inhibidor de la expresión génica mediante la inhibición de la formación del extremo 3´ del pre-mRNA. Cuando los nts 2-11 de U1 snRNA se unene al extremo 3´ de un pre-mRNA, U1 snRNP inhibie la poliadenilización de pre-mRNA, y con ello la expresión génica., dado que sin la cola polyA, el pre-mRNA falla su maduración y es rápidamente degradado en el nucleo conduciendo a la reducción de la expresión. Esta actividad inhibidora del U1 snRNP constituye la base de la tecnología de silenciamiento Uli. Uli requiere la expresión de un U1 snRNA mutado en el extremo 5´ diseñado para aparear bases del exón 3´ terminal del gen diana. El inhibidor U1 snRNA (U1in) se une al mRNA diana y bloquea su expresión. La expresión de genes endógenos ha sido inhibidoa por U1i después de trasnfecciones estables o transilentes, así indicando una buena especificidad y baja toxicidad de esta técnica. La expresión de múltiples U1ins que tienen como diana

diferentes partes de un exón terminal del mismo gen ersulta en una inhibición mejorada sinérgica, mostarndo ser útil por ejempolo contra la replicación del HIV. El RNAi y U1i afectan a dianas de mRN por diferentes mecanismos y en diferentes compartimentos celulares. Mientras que U1i afecta al metabolismo nuclear de una diana de RNA, el RNAi disminuye la estabilidad del RNA en el citoplasma, donde esta localizado el complejo RISC. Así, ambas técnicas pueden ser combiadas sin aumentar el riesgo de saturar la maquinaria de silenciamiento. IMAGEN 12 Diversas investigaciones han demostrado un efecto sinérgico de la combinación de RNAi y U1i, indicando que esos mecanismos pueden trabajar juntos para producir mayores niveles de inhibición que los obtenidos por cualquiera de las técnicas independientemente; dicho sinergismo puede ser resultado de un descenso nuclear en la diana de RINA por U1i acompañada de un descenso citoplasmático de la misma diana por el iRNA. Así, la acción de U1 podría disminuir la cantidad de mRNA diana citoplasmático. De este modo, la combinación de ambtas técnicas permitiría inhibición funcional con un descenso de la dosis de inhibidores, evitando la toxicidad debida a los efectos dependientes de dosis.

miRNA activado por siRNA

Estudios en miRNA han ayudado a determinar la causa de algunos de esos efectos no específicos. Estudios de expresión génica destinados a explorar la posibilidad de que un siRNA pueda inducir la supresión transcripciónal de la expresión de un determinado gen , actuando de forma similar a los miRNA. Esos efectos de inhibición no específicos se han observado a bajas concentraciones de siRNA y solo una complementación parcial de los genes suprimidos es necesaria. Mientras un simple apareamiento incorrecto entre un siRNA y su diana reducirá la eficiencia del silenciamiento, el mismo siRNA puede ser capaz de regular a la baja la expresión de genes no objetivo que contienene regiones parcialmente complementarias. Cuando análisis computacionales fueron llevados a cabo sobre siRNAs, multiples 3´UTR potencialmente dianas fueron indentificadas que contenían secuencias parcialmente homologas a cada cadena de un determinado siRNA. Si los siRNA pueden actúan de hecho como miRNAs en el control de la expresión de múltiples genes, los perfiles de expresión global deben ser analizados para asegurar la especificidad de los siRNAs, especialmente cuando esos estudios son usados para determinar la función de un gen.  Respuesta inmune inducida por sRNAs

Los interferones son citoquinas cuya función en primer lugar de defensa contra infecciones virales en mamíferos. Ellos pueden ser inducidos en respuesta a patrones moleculares específicos de patógenos, incluyendo bacterias, virus y hongos, y son secretados para proporcionar una protección paracrina contra infección de virus y para mediar la respuesta inmune adaptativa. La activación de esta respuesta inmune innata es eficientemente desencadenada por dsRNA, un patrón molecular asociado a patógenos (PAMP), comúnmente generado durante la el ciclo de replicación de la mayoría de los virus. El dsRNA es ersponsable de la inciación de 3 conocidos tipos de eventos de señalización implicados en la respuesta antiviral. Inicialmente dsRNA une a proteínas de reconocimiento de dsRNA constitutivas. Estas proteínas actúan ya sea para mediar directamente eventos antivirales o iniciando las cascadas de señalización que resultan en la sobreregulación de IFNs y otras proteínas antivirales. dsRNA puede también activar directamente la transcripción de genes específicos atraves una una ruta alternativa independiente de IFN. La inducción descontrolada de este mecanismo de defensa innata tiene efectos citotóxicos. IFNs inducen la activación transcripcional de genes estimulados por interferón (ISGs), cuyos proteínas producto

confueren actividad antiviral y antriproliferativa. Muchas de esas proteínas productos de esos genes antivirales son constitutivamente expresados en células no ifectadas. Algunas de esas proteínas son PKR, la cual inhibe tanto la replicación viral como la síntesis celular de proteínas, además de actuar como señar de transducción en las vías que conducen a la activación de NFkB y ATF2, , y otro tipo de proteínas son las 2´-5´ oligoadenilato sinthetasas (OASs) , que convierten ATP en pequeños oligoadenilatos asociados 2´-5’ denominadas molecuas 2-5 A , que unen y activan la RNAsa L, resultando en la degradación no específica de RNAs celulares monocadena, y el inicio de la apoptosis. Además de esas vías, dsRNA también es capaz de desencadenar eventos de señalización mediados por receptores Toll-like receptor 3, así como la sobrerregulación de genes directamente controlados por la expresión de dsRNA via activación del factor de transcripción IRF3. Aunque los siRNAs se pensaba originalemente que eran demasiaod pequeños para inducir la respuesta iniciada por dsRNA dentro de la célula, la sobreregulación de genes clásicos estimulados por IFN, como GBP1, CCL2 o FGF2 han sido detectados. Los efectos no específicos eran depedientes de concentración , y parecían ser consistentes en todos los siRNA sintetizados químicamente probados. Así, es claro que al menos en algunas circunstancias la activación de estas respuestas puede ocurrir en respuesta a dsRNAs menores de 30 pares de bases, en contra de lo que se pensaba. Diferentes estudios se han realizado para aumentar las características de los siRNAs que aumentan la funcionalidad mientras minimizan los efectos no específicos: Así se ha visto que: Una alta eficiencia de siRNA puede ser conseguida a bajas concentraciones, reduciendo los efectos no específicos dependientes de concentración Otras 8 características se han identificado para aumentar la funcionalidad:         30-50% G/C contenido Al menos 3 A/U bases en posición 15/19 (sense strand) Ausencia de repeticiones internas Una A en posición 19 (sense strand) Una A en posición 3 (sense strand) Una U en posición 10 Una base deferente de G o C en posición 19 (sense strand) Una base diferente de G en posición 13

Así, bajo condiciones específicas, los ensayos de iRNA usando químicamente sintetizados siRNA han sido optimizados y los efectos no específicos cmo resultado de esta técnica han sido minimozados. Efectos no específicos pueden ocurrir en mucho mayor cantidad en respuesta a siRNAs sintetizados a partir de promotores de Pol III. Si bien es muy efectiva en el silenciamiento de genes diana, los siRNAs sintetizados a partir de la pol tipo III (como T7 o U6) suelen resultar en la producción de efectos no específicos intensos, lo cual se ha visto que puede deberse a elementos presentes en la región 5´ de esos siRNAs producidos enzimáticamente , los cuales parecen responsables de la inducción de la ISG.

Efectos terapéuticos del iRNA
Son muchas las aplicaciones terapéuticas que el iRNA ofrece: 1. Infecciones virales: Uno de los efectos terapéuticos mas tempranos propuestos para el uso del iRNA fue la inhibición de infecciones virales, y muchas commpañias se encuentran trabajando en terapias basadas en el iRNA.

2.

3.

Enfermedades neurológicas: La enfermedad del Parkinson, el síndrome de Huntington, el síndrome X frágil, la esclerosis lateral amilotrofica o la atrofia muscular espinobulbar son solo algunas de las enfermedades neurológicas prominentes para los que las terapias basadas en iRNA pueden ser de utilidad. Oncología. Mientras la quimioterapia convencional ha provado ser efectiva para matar células cancerosas, su falta de sensibilidad para distinguir células tumorales de células normales resulta en un significamente grado de muestes celulares colaterales. Entonces, una terapia que pudiera ser diana específica a las células cancerosas proporcionaría una opción de tratamiento más atractiva.

4.4. Ocular disease Angiogenesis additionally has a causal role in several ocular diseases including age-related macular degeneration (AMD), herpetic stromal keratitis, and diabetic retinopathy [171]. VEGF has been found to be directly involved in the destructive vascularization associated with these ocular disease. The ability of VEGF-specific siRNAs to reduce VEGF-dependent vascular invasion of the eye has not only been demonstrated in animal models [130,131] (Table 3), but phase I AMD clinical trials in patients is ongoing as well

4.5. Inflammation and apoptosis In some diseases, the pathology observed is caused by the activation of innate cellular processes. Hence, by targeting key molecules involved in these pathways, RNAi therapeutics may provide a means of controlling the cellular processes responsible. For example, tumor necrosis factor (TNF)a is a proinflammatory cytokine involved in the chronic pathogenesis of rheumatoid arthritis (RA). While drugs currently being used to block the action of TNFa have been shown to be effective in reducing inflammation and slowing RA progression, several risks, such as congestive heart failure, demyelinating diseases, systemic lupus erythematosus, lymphoma, and serious infections, have been associated with the use of systemic TNFa-blockers

Transkingdom RNA Transkingdom RNAi (tkRNAi) As outlined above, the delivery strategies developed thus far have focused mainly on developing chemically modified siRNA to increase stability, and on complexing

siRNA with liposomes, nanoparticles and polymers to prevent degradation and promote cell uptake. The main disadvantage of these approaches, however, is that they tend to have a limited ability to target specific cell types or tissues. Moreover, they typically require large quantities of siRNA that is expensive to manufacture. Viral vectors have also been explored as a means of delivering RNAi in vivo. While this approach has important research applications, problems associated with insertional mutagenesis, safety, lack of tropism, and the generation of host immune responses have significantly limited the utility of viral vectors for gene therapy. Recently, in an effort to overcome the “delivery problem”, we have developed TransKingdom RNAi (tkRNAi) for in vitro and in vivo gene silencing in mammalian cells (Figure 1) (Xiang et al., 2006). In this system, silencing shRNA are transcribed from a TransKingdom RNAi plasmid (TRIP) by T7 RNA polymerase inside nonpathogenic bacteria that have been engineered to invade target cells. Following uptake into phagosomes, the bacteria are lyzed releasing their silencing shRNA into the host cell cytoplasm. RNAi-mediated gene-silencing is then achieved through the canonical Dicer/RISC pathway. This novel approach has several advantages over delivery mediated by complexed siRNA and viral vectors. First, the TransKingdom system may provide a practical and clinically compatible way to achieve RNAi for medical indications. In contrast to viral vectors, non-pathogenic bacteria have been used clinically for decades with a proven track record of safety in the treatment of gastrointestinal diseases such as diarrhea, irritable bowel syndrome and inflammatory bowel disease. For example, a strain of Lactococcus lactis engineered to secrete interleukin-10 has recently been investigated for the treatment of Crohn’s disease (Braat et al., 2006). There has also been renewed interest in the use of bacteria to treat human solid tumors (Pawelek et al., 2003; Ryan et al., 2006; Wei et al., 2007). This is based on the observation that various non-pathogenic anaerobic bacteria can infiltrate and replicate within solid tumors when given intravenously. Indeed, attenuated S. typhimurium expressing E. coli cytosine deaminase has proven effective for the selective conversion of the pro-drug 5-fluorocytosine to 5-fluorouracil in tumors of tumor-bearing mice, and has

been tested in 3 phase I clinical trials with demonstrated safety in patients with late stage cancer (Cunningham et al., 2001; King et al., 2002). Thus, this RNAi approach can potentially be exploited to silence genes of interest at various sites colonized by non-pathogenic and/or commensal bacteria.

Second, the production of silencing shRNA by engineered non-pathogenic bacteria eliminates the siRNA manufacture issue, and significantly reduces the cost compared to other delivery technologies. Moreover, the bacterial RNAi approach may circumvent, or mitigate, host interferon-like responses since direct cytoplasmic release of shRNA by the engineered bacteria will likely avoid activation of TLR, PKR and

RIG-I in target cells. Third, tkRNAi may have significant implications for high throughput functional genomics in mammalian systems. Bacteria, especially E. coli, have served as a wellvalidated and versatile vector system for the revolution in molecular biology and biotechnology that has occurred over the last few decades. Using the tkRNAi approach, a laboratory can easily establish E. coli-based RNAi against any gene of interest. A major advantage of this system for functional genomics studies is that it can be easily reproduced and stored for long term use. Thus, tkRNAi should provide a stable and consistent gene silencing tool. Another benefit of the tkRNAi approach is that it can be easily translated to in vivo systems in order to verify in vitro observations in live animals. Furthermore, non-pathogenic bacteria can be used in a routine biological laboratory, rather than a BL2 laboratory which is required for viral vector-based systems. Other advantages of using bacteria as a delivery vector for siRNA include the ability to control the vector using antibiotics and/or auxotrophy, and the ease of engineering specific vectors for particular applications.