REPBLICA BOLIVARIANA DE VENEZUELA. UNIVERSIDAD NACIONAL EXPERIMENTAL RMULO GALLEGOS.

REA DE INGENIERA AGRONMICA DIRECCIN DE PROGRAMA DE PRODCCIN VEGETAL

CARACTERIZACIN MORFOLGICA EN MEDIO DE CULTIVO DE HONGOS ENDFITOS PRESENTES EN PLANTAS DE CACAO (Theobroma cacao L.) REALIZADA EN LA FUNDACIN INSTITUTO DE ESTUDIOS AVANZADOS (IDEA), UBICADO EN EL SECTOR SARTENEJAS, ESTADO MIRANDA.

. Autor: Andrs E. Baralt. C. Tutor Acadmico: Dr. Antonio Manrique Tutor de campo: Dr. Simn Prez.

Junio, 2010.

REPBLICA BOLIVARIANA DE VENEZUELA. UNIVERSIDAD NACIONAL EXPERIMENTAL RMULO GALLEGOS. REA DE INGENIERA AGRONMICA DIRECCIN DE PROGRAMA DE PRODCCIN VEGETAL

CARACTERIZACIN MORFOLGICA EN MEDIO DE CULTIVO DE HONGOS ENDFITOS PRESENTES EN PLANTAS DE CACAO (Theobroma cacao L.) REALIZADA EN LA FUNDACIN INSTITUTO DE ESTUDIOS AVANZADOS (IDEA), UBICADO EN EL SECTOR SARTENEJAS, ESTADO MIRANDA.

Junio, 2010

TABLA DE CONTENIDO Pginas. DEDICATORIA.. AGRADECIMIENTOS.. RESUMEN. OBJETIVOS INTRODUCCIN.. CAPITULO I. Caractersticas generales de la institucin. 1. Contribucin legal de la institucin. 2. Descripcin general... 3. reas de investigacin.. 4. Misin... 5. Visin... 6. Metas 7. rea de Agricultura y Soberana Alimentaria 8. Departamentos adscritos. 9. Laboratorio de trabajo CAPTULO II. Bases tericas. 1. Aspectos generales del cultivo de cacao 1.1. Caracteristicas de la flor del cacao.. 2. Historia del cacao en el mundo 3. Breve resea histrica del cacao en Venezuela... 4. Manejo Agronmico del cultivo 5. Plagas y Enfermedades del cacao. 5.1. Insectos plagas del cacao. 5.1.1. Insectos perforadores del tronco 5.1.2. Plagas que afectan hojas 5.1.3. Plagas que afectan frutos 5.2. Enfermedades que afectan al cacao... 6. Aspectos generales de los hongos.. 6.1. Divisin Ascomycota.. 6.1.1. Aspectos generales.. 6.1.2. Ciclo de vida de los Ascomycota I. II. IV. V. 1.

5. 6. 6. 7. 7. 7. 8. 8. 9.

11. 13. 14. 17. 20. 23. 23. 26. 29. 31. 37. 39. 39. 40.

Caractersticas de algunos gneros de hongos encontrados como endfitos. 6.2.1. Cladosporium 41. 6.2.2. Curvularia... 43. 6.2.3. Lasiodiplodia. 44. 6.2.4. Colletotrichum... 45. 6.2.5. Glomerella.. 48. 6.2.6. Fusarium 49. 6.2.7. Pestalotiopsis 50. 6.2.8. Penicillium. 51. 6.2.9. Phomopsis. 53. 7. Identificacin molecular de hongos 7.1. Extraccin de ADN. 54. 7.2. PCR (Polymerase Chain Reation).. 54. 7.2.1. Ciclo de amplificacin.. 56. CAPTULO III. Actividades realizadas en el periodo de pasantas. 1. Descripcin de las actividades realizadas por semanas 2. Metodologas aplicadas 2.1. poca y lugar de muestreo. 2.2. Coleccin de las muestras 2.3. Procesamiento de las muestras 2.4. Clasificacin de las muestras segn su origen.. 2.5. Purificacin y conservacin de los aislados 2.6. Caracterizacin macromorfolgica 2.7. El diseo experimental 2.8. Tcnicas de conservacin de hongos.. 2.9. Caracterizacin micromorfolgica 2.10. Extraccin de ADN. 2.11. PCR (Polymerase Chain Reaction) CAPTULO IV. Resultados y Discusiones. 1. Caracterizacin Macromorfolgica 2. Caracterizacin Micromorfolgica. 3. Extraccin de ADN... 4. PCR. CONCLUSIONES... RECOMENDACIONES. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS ANEXOS..

6.2.

60. 66. 67. 67. 68. 68. 69. 70. 70. 70. 72. 73.

76. 84. 89. 89. 92. 95. 96. 104.

DEDICATORIA

A mi padre, Efran E. Baralt Gonzlez, quien desde el universo envi su bendicin y fortaleza para superar todos los obstculos que se presentaron durante la realizacin de la carrera; a mi madre, Francisca Josefina Contreras, quien ha sido la fuente de inspiracin, apoyo y compaa incondicional, para caminar por el sendero de la vida y as realizar todas las metas planteadas; a mis hermanos, Alejandro Baralt Contreras y Abraham Baralt Contreras, por estar siempre conmigo y confiar en m en cada momento vivido.

AGRADECIMIENTOS Primeramente quiero dar gracias al Dai Gojonzon, por darme salud, fortaleza e intelecto para cumplir con sta meta planteada, y por ayudarme a seguir da a da con buena conviccin para la superacin de los obstculos que se presentan a diario. Gracias a todas las personas que confiaron en m y me brindaron su apoyo durante la realizacin de la carrera de Ingeniera Agronmica en Produccin Vegetal, en especial a mi To Omar Calzadilla y Ta Fanny Briceo, quienes fueron un pilar fundamental en el curso de la carrera por brindar su apoyo, confianza y cario incondicional. Agradezco a la familia Garca Muoz, quienes dieron su compaa, confianza y apoyo en todo momento. A la Abuela Sol Bentez, Ta Soledad Ramrez y primos Samuel Baralt y Raquel Baralt, por estar presentes y quienes han sido de gran ayuda en el culmino de mi carrera, dndome no slo su apoyo, sino tambin su comprensin y cario. Agradezco a dems familiares que compartieron y confiaron en m. Doy gracias al universo, por haber tenido un excelente padre, que si bien no est presente fsicamente lo est espiritualmente, y que durante mucho tiempo me brindo mucho apoyo, confianza, cario, sabidura y fue quien particip en el desarrollo de mi intelecto. Una excelente madre sper amorosa, inteligente, comprensiva, quien ha sido la fuente de inspiracin en mi superacin personal, siempre brindndome el apoyo necesario, corrigindome y educndome para lograr todas las metas que platee en la vida. A mis hermanos, quienes han sido los mejores compaeros de vida, buscando siempre las soluciones a los problemas que se han suscitado en nuestro hogar, aplicando las herramientas que nos dieron nuestros padres.

Agradezco a la Universidad Nacional Experimental de los Llanos Centrales Rmulo Gallegos, por darme la oportunidad de formarme como profesional, brindarme todo el conocimiento necesario en el mundo del agro, y permitirme la experiencia de vida universitaria. Agradezco a los profesores que me impartieron el conocimiento, en especial a los profesores Antonio Manrique, Fabio Giunta, Manuel Wagner y Pedro Lpez, quienes no slo formaron parte de mi instruccin, sino que tambin formaron parte de mi educacin, dndome lecciones de vida importantes para ser un excelente profesional y una excelente persona. A mis compaeros de la universidad que de una forma u otra estuvieron presentes en el logro de esta meta, compartiendo momentos buenos y malos durante la carrera. A mis amigos cotidianos (compaeros scouts) por ser de gran apoyo y estar presentes en todo momento. Finalmente, agradezco a la Fundacin Instituto de Estudios

Avanzados (IDEA), por darme la oportunidad de realizar las pasantas en sus instalaciones, y por haberme aportado tanto aprendizaje, y conocimiento en el campo de la biotecnologa agrcola, agradeciendo a todo el personal que labora en sta rea, que fueron quienes brindaron el apoyo y conocimiento en el ramo.

Caracterizacin morfolgica en medio de cultivo de hongos endfitos procedentes del cacao (Theobroma cacao L.).
Andrs E. Baralt C. Universidad Nacional Experimental Rmulo Gallegos Ingeniera Agronmica en Produccin Vegetal. Laboratorio de Fitopatologa Molecular de la Fundacin Instituto de estudios avanzados (IDEA) E-mail: andrewbaralt@hotmail.com Resumen Los hongos endfitos crecen internamente en el tejido vegetal, sin manifestaciones externas, y que son organismos inherentes a las plantas en donde establecen una asociacin especfica con su hospedero, para mutuo beneficio. Se realiz un estudio morfolgico de estos hongos provenientes de rganos areos como hojas y frutos sanos, aislados de plantas de cacao (Theobroma cacao). Los fragmentos de tejidos esterilizados se colocaron en PDA (por triplicado) a una temperatura de 24 C (promedio ambiente del laboratorio) por 6 das. Se evaluaron las caractersticas tanto macromorfolgicas como micromorfolgicas de las colonias, para as, conocer los gneros de endfitos que se presentan comnmente en el cacao. Las evaluaciones nos permitieron reconocer los gneros Colletotrichum, Glomerella, Pennicilium, Cladosporium, Lasiodiplodia, fusarium, Nigrospora, Phomopsis, Curvularia y Pestalotiopsis, los cuales pueden producir sntomas sobre la planta como hongos patgenos latentes, una vez que el tejido en el que habitan se debilite o empiece a morir. Palabras claves: hongos endfitos; macromorfologa; micromorfologa.

OBJETIVOS Objetivo general Caracterizar morfolgicamente en medio de cultivo, hongos endfitos presentes en plantas de cacao (Theobroma cacao L.). Objetivos especficos: Evaluar el crecimiento de hongos endfitos, aislados de partes areas (Hojas y frutos) de la planta. Analizar las caractersticas macromorfolgicas de cada aislado, que sirva de dato para su identificacin taxonmica. Analizar las caractersticas micromorfolgica de cada aislado, con el fin de determinar el gnero y en algunos casos la especie del hongo endfito. Estudiar las caractersticas moleculares de los diferentes grupos morfolgicos que se presenten. Emplear diversos medios de cultivos, con el fin de evaluar el comportamiento del hongo. Utilizar diversos medios de montaje, con el fin de evaluar el comportamiento de las estructuras frente a los diferentes medios.

INTRODUCCIN

El cacao es un cultivo ntimamente ligado a la cultura venezolana, tanto por su origen como por su gran importancia en el desarrollo econmico y social del pas desde que se estableci su comercializacin hace ya ms de trescientos cincuenta aos. Venezuela lleg a ser el primer productor mundial de cacao, y este producto supuso la fuente principal de ingresos durante un largo perodo de la poca colonial (Marquina, 2005). Asimismo, el autor intuye que, tradicionalmente Venezuela ha sido considerada como un productor de cacaos finos y de aroma de alta calidad. Sin embargo, en 1993 fue rebajado a la condicin de productor parcial de cacaos finos y de aroma debido a la proliferacin de otras variedades de rboles de cacao a lo largo del ltimo siglo y medio (forastero principalmente, que se introdujo en el pas en un afn de los tcnicos por aumentar la productividad del rbol y lograr una mayor resistencia a plagas y enfermedades). A pesar de ello, el pas sigue siendo capaz de producir el cacao fino de alta calidad que le ha otorgado fama mundial. Igualmente, el especialista in comento, expresa, que al tratarse de un rbol tropical, el cultivo del cacao requiere de unas condiciones climticas clidas y hmedas, requisitos que Venezuela rene perfectamente. La cosecha del cacao se realiza cortando los frutos maduros de los rboles, abrindolos (normalmente con un machete) y extrayendo las semillas de los frutos. Se trata por tanto de un cultivo altamente intensivo en mano de obra y cuyo proceso de produccin parece, al menos a corto plazo, muy poco industrializable.

Venezuela ha tenido ventaja comparativa desde la poca colonial en la produccin del cacao de alta calidad, debido al saber hacer en la tcnica, el mtodo y a los conocimientos adquiridos con la experiencia acumulada a lo largo de los siglos. Desde siempre, la actividad cacaotera venezolana ha estado ligada a los campesinos que laboran en pequeas parcelas situadas en zonas deprimidas econmicamente en las cuales las rentas derivadas de la produccin del cacao han sido hasta ahora muy importantes. Sin embargo, la poltica cacaotera del pas no parece haber sido efectiva en potenciar y explotar esta ventaja, especialmente desde que se empez a desarrollar la industria del petrleo, ya que desde entonces los diferentes gobiernos de la Repblica se han preocupado ms de los ingresos generados por las exportaciones de hidrocarburos que de los dems sectores, especialmente del agrario (Marquina, 2005). Debido a que se desarrolla en ambientes hmedos, sta planta es susceptible a diversos agentes negativos como fidos, chinches,

crisomlidos, escoltidos, entre otros insectos; y a la presencia y ataque de hongos, que han trado consecuencias econmicas a los productores del pas, lo que lo ha convertido en una de las problemticas ms importante que se presenta en este cultivo. Por tales razones, es importante estudiar los diversos agentes que afectan negativamente al cultivo; pero as como se consiguen agentes negativos para el cultivo, tambin se consiguen agentes positivos, como hongos y bacterias endfitos que, aunque sus mecanismos de accin actualmente se desconocen para la mayora de las especies, se sabe que establecen asociaciones simbiticas con las plantas en la que prevalece el mutualismo, hasta que la planta se debilita o comience a morir, que es cuando estos organismos endfitos se convierten en parsitos para stas (Prada et al., 2008).

Los hongos endfitos son organismos inherentes a las plantas donde establecen una asociacin simbitica mutualista con su hospedero. La planta provee al hongo de alimento, hospedaje y proteccin; mientras que por otro lado, aun no hay certeza acerca de cules son los mecanismos de accin por parte del hongo hacia su hospedero, aunque se cree, que confieren un gran potencial adaptativo a las especies vegetales, frente a condiciones adversas que generan estrs, ya sean del tipo abitico (salinidad, acidez) o biticos (ataque de plagas y patgenos). Esta simbiosis otorga mayor habilidad competitiva a las plantas y permite una plena expresin de su potencial gentico traducido en altas tasas de germinacin, mejor densidad, ms biomasa en los tejidos y mayor produccin de semillas (Prada et al., 2008). El trmino endfito se conoce desde el siglo XIX y se us inicialmente para agrupar aquellos organismos fngicos que viven dentro de las plantas (Gamboa, 2006). Este grupo de microorganismos viven mayormente dentro de los tejidos areos vegetales sanos y vivos, incluso en las races, excluyendo, a los hongos productores de micorrizas, y ha mostrado un gran potencial econmico en reas como la agronoma y la medicina. Sin embargo, como endfitos pueden pasar una parte de su ciclo de vida considerndose saprfitos o patgenos (Petrini, 1991; Gamboa, 2006). Estos ltimos pueden producir sntomas sobre su hospedero cuando el tejido en el que habitan se debilita o empieza a morir. Muchas de las especies endfitas descubiertas recientemente son desconocidas para la ciencia (Arnold et al. 2000), por tanto, aunque se ha logrado cultivar en medio de cultivo artificial, no se les conoce su nombre segn los sistemas de clasificacin actuales. Para solventar esta situacin, y considerando la inmensa cantidad de especmenes aislados, se ha recurrido a bosquejar las posibles especies a travs de la formacin de grupos

morfolgicos, tomando como base las caractersticas de las colonias de los hongos. Este enfoque permite, en lo que los taxnomos definen los nombres de las especies, hacer estimados de la riqueza de especies de hongos presentes en los trpicos y de determinar su papel en la ecologa de los cultivos y plantas silvestres (Herre et al. 2007).

CAPITULO I CARACTERISTICAS GENERALES DE LA INSTITUCIN La Fundacin Instituto de Estudios Avanzados IDEA fue creada segn Gaceta Oficial No. 31.863 de fecha 15 de noviembre de 1979. Desde entonces se iniciaron las tramitaciones correspondientes para asignar un espacio para la construccin de IDEA. 1. Contribucin legal 1980 El 12 de junio de este ao fue constituida legalmente con la participacin de organismo del sector pblico y privado. 1999 La Fundacin IDEA es finalmente adscrita al Ministerio del Poder Popular para Ciencia, Tecnologa e Industrias Intermedias, quien lo recupera de su inminente desaparicin, hacindolo pasar de 4 investigadores a 129 investigadores de planta, y realizando grandes inversiones en el rescate de una infraestructura en deplorables condiciones para la poca. Todo ello marc un crecimiento, diversificacin y fortalecimiento de proyectos cientficos y tecnolgicos con un alto impacto social. 2006 Desde este ao y hasta la actualidad el IDEA se caracteriza por un fortalecimiento institucional cuya principal prioridad es la expansin de sus capacidades humanas, cientficas, territoriales y de infraestructura. En terrenos propiedad de la Nacin, Sartenejas, Municipio Baruta del Estado Miranda, en un rea superior a las 22 hectreas, que tiene como lmite Norte y Oeste terrenos de la Nacin; y por el Sur y Este con la

Carretera Nacional Hoyo de La Puerta, se desarroll el proyecto para la sede del Instituto de Estudios Avanzados IDEA, actualmente terrenos afectados a favor de IDEA por Decreto Presidencia N 5.869 y publicado en Gaceta Oficial N 38.873 de fecha 19 de febrero de 2008. 2. Descripcin general Creada en 1979, y con un desempeo ininterrumpido en el mbito de la investigacin cientfica, tecnolgica y social, la Fundacin IDEA ha transformado su gestin desde 1999, perfilando polticas cientficas comprometidas con las necesidades de desarrollo que exige la Nacin en el actual marco sociopoltico. Precisamente desde ese ao la Fundacin viene perfilando una gestin comprometida con las necesidades de desarrollo que exige el Pas. Ha crecido en infraestructura y en proyectos que generan soluciones cientficas y tecnolgicas a la diversidad de problemas que aquejan a la poblacin venezolana. La expansin y diversificacin de las reas de investigacin ha sido muy significativa: en los ltimos 10 aos IDEA pas de tener tres programas de investigacin, a ms de 26. Entretanto, en planta actualmente, se cuenta con ms de 110 profesionales de distintas reas, entre investigadores, profesionales y tcnicos. 3. reas de investigacin Tiene cuatro reas de investigacin y desarrollo que generan continuamente soluciones cientficas y tecnolgicas a los ingentes problemas que aquejan a la sociedad venezolana, gracias a la alta calidad de su personal de investigacin y a la extraordinaria infraestructura de sus laboratorios.

El Instituto focaliza su trabajo diario esencialmente en las reas de Agrobiotecnologa, Energa y Ambiente, Salud y Sociopoltica y Cultura. 4. Misin La Fundacin Instituto de Estudios Avanzados -IDEA- aporta al Sistema Nacional de Ciencia, Tecnologa e Innovacin soluciones concretas a las realidades del agro, la salud integral, el sector energtico, el acontecer sociopoltico y el sistema de Educacin Superior; para lo cual posiciona las capacidades del talento institucional y prioriza los procesos de gestin en pro de concretar los lineamientos establecidos en el Plan Nacional Simn Bolvar (Proyecto Nacional Simn Bolvar. Desarrollo Econmico y Social 2007-2013. Primer Plan Socialista). 5. Visin Ser una institucin pblica reconocida socialmente por sus aportes cientficotecnolgicos de avanzada e innovaciones integradas a los procesos de Desarrollo Endgeno Sustentable, llevados a cabos por un talento profesional con compromisos ticos, sociales y polticos. 6. Metas Como poltica dictada por su ente tutelar, el Ministerio del Poder Popular para Ciencia, Tecnologa e Industrias Intermedias, la Fundacin IDEA tiene entre sus metas ampliar el campo de intervencin ms all del Valle de Sartenejas, creando nuevas unidades de investigacin, desarrollo y gerencia en reas vitales para el pas. En una primera fase se pretende ampliar las instalaciones de Mochima, en el estado Sucre. Otras regiones del pas estn siendo sujetas a estudio para toma de decisiones, en particular la vasta zona que corresponde

con la Faja Petrolfera del Orinoco, Los Andes y Apure, entre otros. Tambin, y de manera revolucionaria, se est estructurando la Escuela Superior Internacional, que pretende incorporarse al enorme esfuerzo nacional de formacin de investigadores, con sentido de solidaridad regional con nuestros hermanos latinoamericanos y africanos. 7. rea de Agricultura y soberana alimentaria En el contexto de los objetivos estratgicos institucionales, se pretende abarcar toda la actividad prevista en investigacin, desarrollo y transferencia tecnolgica en innovacin en materia agrcola por la comunidad del IDEA. En este sentido, se estima dar respuesta, bajo un enfoque integrado, a todas las demandas y necesidades sectoriales planteadas en el rea de la produccin agrcola y el desarrollo sostenible a modo de contribuir con la soberana agroalimentaria de la nacin a travs de la implementacin de productos de la investigacin agrcola, derivados de los programas y proyectos de mejoramiento gentico, salud agrcola integral y bioseguridad; propagacin de germoplasma en rubros de inters nacional y desarrollo sustentable de los sistemas agronmicos nacionales. 8. Departamentos adscritos El rea de Agricultura y Soberana Alimentaria cuenta con dos departamentos; el departamento de tejidos in vitro y embriognesis somtica y el departamento de Fitopatologa y Biologa Molecular. El departamento de Tejidos in vitro y embriognesis somtica se encarga de crear una coleccin de plantas propagadas por cultivo de tejidos, con el fin de evaluar el comportamiento de las plantas en diferentes medios de cultivo, adems de mejorar las plantas ante el ataque de plagas y enfermedades, de ese modo buscar el control ms efectivo para prevenir y

sanar las diversas patologas causadas por los diversos organsmos. El centro cuenta con la coleccin ms amplia en el pas de yuca (Manihot esculenta crantz), tambin tiene una coleccin de solanceas como papa (Solannun tuberosum), algunos helechos, hortalizas de hoja, entre otros. Est a cargo del Ing. Agro. Juan Mateus y la Ing. Agro. Elizabeth Gamez, quienes en conjunto de un personal calificado realizan estas labores de investigacin. El departamento de Fitopatologa y Biologa Molecular, donde se realizan todas las tareas cientficas para la identificacin de especies fitopatgenas, saprfitas y endfitas, as como tambin la determinacin de metaboltos secundarios inmersos en diversos organismos con el fin de analizar su actuacin en los diferentes aspectos de la vida. Este departamento est a cargo del la Dra. Daynet Sosa y el Dr. Simn Prez, que quienes en conjunto de un equipo calificado realizan las labores de investigacin, tanto en la fitopatologa molecular como en la Biologa molecular. Ambos departamentos estn bajo la direccin del Dr. Digenes Infante y el Dr. Ramn Rea. 9. Laboratorio de trabajo Todas las labores realizadas durante las pasantas, se hicieron en el laboratorio de Fitopatologa Molecular, que cuenta con un cuarto de campanas, donde se encuentran tres campanas de flujo laminar, y una de ellas est dotada con todos los parmetros de bioseguridad necesarias. Tambin cuenta con un cepario de hongos fitopatgenos y endfitos, conservados con la tcnica de Castellani. Tiene todos los materiales y

equipos necesarios para la realizacin de las investigaciones que se plantee por el equipo de investigadores. Este laboratorio est a cargo de la Licenciada en Biologa Diamarys Domnguez quien aport todo el apoyo necesario para la realizacin de las tareas asignadas durante el periodo de pasantas.

CAPITULO II BASES TERICAS

1. Aspectos generales del cultivo del cacao (Theobroma cacao L.). Theobroma cacao L. es el nombre cientfico que recibe el rbol del cacao o cacaotero. Theobroma significa en griego (alimento de los dioses), cacao deriva del nahua cachua. Este nombre cientfico lleva aadida al final una abreviatura botnica convencional, en este caso L., que es la inicial del apellido del naturalista sueco que clasific la planta, Linneo (Anexo, Cuadro 1). La palabra cacao puede hacer referencia a tres conceptos muy relacionados entre s: 1. Cacao puede referirse, en primer lugar, al fruto del cacaotero, entendido este bien como la mazorca que crece directamente de su tronco, bien como las semillas contenidas en ese fruto. 2. En segundo lugar, el cacao es tambin el producto que resulta de la fermentacin y el secado de esas semillas (o habas o maracas) del fruto del rbol del cacao. El cacao, entendido as, es el componente bsico del chocolate. 3. Por ltimo, se denomina adems cacao al polvo seco que se obtiene moliendo los granos y extrayendo, total o parcialmente, la grasa o manteca de cacao. Muchos afirman que este es originario de Amrica del Sur, de la cuenca del ro Orinoco o el ro Amazonas y que de ah empez a extenderse hasta el sureste de Mxico. Mientras que otros, afirman que empez en

Mxico y se extendi hasta la cuenca del rio Amazonas, sin embargo, no se sabe con certeza. Lo que s se sabe es que su primera utilizacin por el hombre fue hecha en Mxico. El cacaotero es un rbol que necesita de humedad y de calor. Es de hoja perenne y siempre se encuentra en floracin, crece entre los 6 y los 10 m de altura. Requiere sombra (crecen a la sombra de otros rboles ms grandes como cocoteros y platanos), proteccin del viento y un suelo rico y poroso, pero no se desarrolla bien en las tierras bajas de vapores clidos. Su altura ideal es, ms o menos, a 400 msnm. El terreno debe ser rico en nitrgeno y en potasio, y el clima hmedo, con una temperatura entre los 20 C y los 30 C y una humedad relativa que va de 90 % a 95 %. rbol caulfloro (flores y frutos nacen directamente del tallo y ramas). Sus pequeas flores de color rosa y sus frutos crecen de forma inusual: directamente del tronco y de las ramas ms antiguas. Las flores son polinizadas por unas pequeas mosquitas. El fruto es una baya denominada mazorca, que tiene forma de calabacn alargado, se vuelve roja o amarillo purprea y pesa aproximadamente 450 g cuando madura (de 15 a 30 cm de largo por 7 a 12 de ancho). Un rbol comienza a rendir cuando tiene 4 5 aos. En un ao, cuando madura, puede tener 6.000 flores pero slo 20 mazorcas. A pesar de que sus frutos maduran durante todo el ao, normalmente se realizan dos cosechas: la principal (que empieza hacia el final de la estacin lluviosa y contina hasta el inicio de la estacin seca) y la intermedia (al principio del siguiente periodo de lluvias), y son necesarios de cinco a seis meses entre su fertilizacin y su recoleccin (McNeil y Cameron, 2007).

La inflorescencia del cacaotero: Cojines o pulvnulos florales: aparecen en el tronco sin hojas (Caulfloro), de yemas latentes dando origen a las inflorescencias. Puede formar de 40 60 flores de las cuales slo el 1,5 al 6 %, desarrollan el fruto (Anexo Figura 1). La inflorescencia es dicasiforme (Anexo Figura 2). Floracin: la flor inicia su apertura en horas de la tarde, a primeras horas de la maana emite el polen y presenta el estilo receptivo, importante para realizar la polinizacin controlada. 1.1. Caractersticas de la flor

La flor es diminuta, de 8 mm de dimetro, aunque su tamao puede variar de 5 10 mm de dimetro, son inodoras, regulares, hermafroditas, pentmeras (5 verticilos), ovario spero de cinco carpelos fundidos (gamocarpelar). Pedicelo: de 1 a 3 mm de longitud el cual sostiene a la flor (Anexo Figura 3). Cliz (S): formada por 5 spalos agudos, carnosos, soldados en la base, de color blanco a rosado, de 1 a 7 mm de longitud, y son pubescentes ( Anexo
Figura 3).

Corola (P): cinco ptalos con lneas, de 6 a 8 mm de longitud, alternan con los spalos. Parte basal en forma de copa bordeada internamente por dos nervios de color violeta. Parte terminal estrecha con cuello de cisne y se ensancha como una esptula (Anexo Figura 4). Androceo: presentan cinco estambres frtiles y cinco estriles llamados estaminodios, ambos forman un tubo estaminal pubescente, los estambres

frtiles estn curvos hacia afuera, las anteras de cada filamento se cobijan dentro de la concavidad de los ptalos mientras que los estambres estriles se son ms largos y salen por encima de los ptalos (Anexo Figura 5), el polen es viable cuando se abre la flor slo por 24 h. Gineceo: ovario simple, spero, sincrpico, ovoide, pentagonal, con cinco carpelos fundidos con el estilo, ovario de placentacin central, cada cmara con 6 a 10 vulos, de placentacin axial (Anexo Figura 5).

2. Historia del cacao Los primeros rboles del cacao crecan de forma natural a la sombra de las selvas tropicales de las cuencas del Amazonas y del Orinoco, hace unos 4000 aos. Los primeros cultivadores en Centroamrica fueron los habitantes del sitio de Puerto Escondido, en Honduras, alrededor de 1100 a.C. Entre 600 y 400 a.C. se extendi a Belice tambin. En la poca de la civilizacin Olmeca, cerca de 900 a.C., es probable que en Mesoamrica la siembra de cacao haya sido extensiva (Coe et al, 1996). En 2006, estudios realizados por la Universidad de Cornell en Ithaca, Nueva York, encontraron que los vestigios ms antiguos sobre el uso del cacao como bebida se situaban 1.100 aos antes de Cristo. Sin embargo, estudios recientes realizados por investigadores mexicanos del Instituto Nacional de Antropologa e Historia (INAH), de las universidades de Columbia, Arizona, Yale, Wisconsin y Kennesaw, sealan que existen evidencias del consumo de cacao como bebida en el periodo formativo (1900 -900 a.C), es decir, 800 aos antes de lo que se crea hasta ahora. Los residuos de una bebida preparada a base de cacao fueron localizados en

una vasija de cermica encontrada durante las excavaciones realizadas en el sitio sagrado del Cerro Manat, ubicado dentro del ejido del Macayal, en el municipio de Hidalgotitln, Veracruz, Mxico. La vasija se localiz asociada con una gran cantidad de objetos suntuosos entre los que destacan: hachas labradas en piedra verde, jadeta, pelotas de hule, mazos de madera y varias estacas con la punta quemada, as como semillas de jobo, coyol, nanche, calabaza, huesos de tortuga y venado de cola blanca. Este contexto llev a los investigadores a deducir que posiblemente la vasija datada mediante carbono 14 en 1750 a. C, de paredes cilndricas ligeramente divergentes, con el fondo plano y engobe de color rojo en la parte inferior del cuerpo y manchas negras, fue creada para contener bebidas como la chicha (cerveza de maz), chocolate o atole, preparaciones consumidas exclusivamente por los jerarcas o gente de alto prestigio social. La evidencia de cacao en esta vasija localizada en la costa del Golfo de Mxico, indica que el uso de la bebida precede a las evidencias encontradas en las reas Mayas de Belice y en Puerto Escondido, Honduras (Coe et al, 1996). Los mayas, en torno al siglo X a.C., casi simultneamente con los olmecas, se haban establecido en una extensa regin al sur del Mxico actual, que se extiende desde la pennsula del Yucatn en Amrica Central a lo largo de regin de Chiapas, Tabasco y la costa de Guatemala en el Pacfico. Los mayas llamaban al rbol del cacao ka'kaw: frase relacionada con el fuego (kakh) escondido en sus almendras, y al Chocolate le llamaba Chocolhaa o agua (haa) amarga (Chocol). El cacao simboliza para los mayas vigor fsico y longevidad. La palabra nahuatl cacahuaxochitl se refiere a la flor (xochitl) del rbol de cacao (Coe et al, 1996).

Los mayas crearon un brebaje amargo el Chocolha hecho de semillas de cacao que consuman exclusivamente los reyes y los nobles y tambin usado para dar solemnidad a determinados rituales sagrados. En sus libros, los mayas describen diversas formas de elaborar y perfumar la bebida: ms lquido o ms espeso, con ms o menos espuma, con aditamentos como la miel, llamada por ellos hikoth, el maz o Ixim, el chile picante (Coe et al, 1996). El chocolate se usaba con fines teraputicos. Los mdicos mayas prescriban el consumo de cacao tanto como estimulante como por sus efectos calmantes. Los guerreros lo consuman como una bebida reconstituyente, y la manteca de cacao era usada como ungento para curar heridas. Era tambin usado como moneda (Coe et al, 1996). Ms tarde, los mayas lo llevan hacia el norte, a las tierras que ocupaban los toltecas, el pueblo que precedi a los aztecas en la historia de Mesoamrica. El dominio azteca supuso, pues, la sumisin de los toltecas, los olmecas y todos los pueblos que constituyeron el inmenso imperio de los adoradores del Sol y de la Serpiente Emplumada, o Quetzalcatl, Kukulkn para los mayas, el dios fundador de la estirpe y de la cultura precolombina. Era precisamente a Quetzalcatl a quien los aztecas hacan remontar el primer origen de cacao, regalo divino para aliviar su cansancio y deleitar el reposo. Los aztecas prescribieron tambin una pocin a base de cacao mezclado con el polvo de los huesos machacados de sus antepasados para curar la diarrea (Coe et al, 1996). No obstante, la bebida de cacao que Corts haba tomado en copas de oro durante los banquetes organizados en su honor por Moctezuma II era

muy diferente a lo que hoy estamos acostumbrados. El xocolatl, que as era como se llamaba, era un agua amarga. Los aztecas mezclaban chile con las semillas del cacao tostadas y molidas, y aadan harina de maz como emulsionante bsico para absorber la manteca de cacao. La espuma era una de las partes ms importantes y deliciosas de la bebida. Los mayas hacan que la bebida fuera an ms espumosa vertindola desde un recipiente elevado a otro que estaba en el suelo. Ms tarde, los aztecas inventaron una especie de molinillo para provocar la aparicin de la espuma (Coe et al, 1996).

3. Breve resea histrica del cacao en Venezuela, segn CAPEC (2010). 1498 Cristbal Coln llega a las costas de Paria en su tercer viaje. Los primeros datos sobre el cacao en Venezuela se remontan a finales de 1600, en ellos se cataloga al cacao como un producto generado en Mrida y exportado a Espaa. Dicho cultivo se extendi a las costas de Aragua, Barlovento y Sucre. 1620 - 1700 Los volmenes exportados llegaron a 600 Tm/ao, alcanzando unas 2.230 Tm/ao durante el perodo 1701 - 1703. 1728 Primer monopolio de la comercializacin de cacao venezolano. La Corona Espaola otorga a la Compaa Guipuzcoana la comercializacin exclusiva de los bienes producidos en estas provincias y con esto, el primer monopolio de cacao.

 1742 Separacin de la Provincia de Venezuela del Virreinato de Nueva Granada. 1749 Descontento y protestas por los bajos precios pagados a los productores de cacao, lo que trae como consecuencia el primer levantamiento contra la compaa y el rgimen por parte de Juan Francisco Len desde Panaquire (Barlovento). 1777 Creacin de la Capitana General de Venezuela y anexo a ste, de las Provincias de Maracaibo, Guayana, Cuman, Islas de Margarita y Trinidad. 1780 Eliminacin de los privilegios otorgados a la Compaa Guipuzcoana y su posterior disolucin en 1785 1799 Desembarco del explorador y naturista Alejandro de Humboldt por Cuman y su investigacin por Venezuela narrando sobre el cacao y sus condiciones. 1810 - 1824 La Guerra de Independencia. Durante la mitad de 1800 se genera un estancamiento en la produccin con un promedio de 5.000 Tm/ao, el caf reemplaza al cacao como mayor generador de ingresos. 1854 Abolicin de la esclavitud. 1858 - 1863 La Guerra Federal. 1900 - 1920 Incremento de la produccin de cacao alcanzando volmenes de 22.000 Tm/ao.

 1928 Explotacin del petrleo desplazando una sociedad trabajadora de una economa agrcola por una minera industrial. 1933 Devastacin de las plantaciones de cacao en el Edo. Sucre por el cicln de Oriente. 1936 Creacin del Ministerio de Agricultura y Cra por parte del Gobierno Nacional durante el gobierno de Eleazar Lpez Contreras. 1956 Produccin mxima histrica de cacao 23.000 Tm/ao. 1959 Creacin del Fondo Nacional de Cacao y Caf (FNCC) por parte del Estado Venezolano. 1960 Promulgacin de la Ley de Reforma Agraria. 1967 Divisin del FNCC en el Fondo Nacional de Cacao (FONCACAO) y el Fondo Nacional de Caf. 1974 Promedio anual de produccin de cacao 20.000 Tm/ao. 1975 Segundo monopolio de la comercializacin de cacao por parte de FONCACAO. 1984 Abandono y/o sustitucin del rubro cacao por otras actividades agrarias, esto ocasiona una disminucin en la produccin nacional de cacao llegando a producirse slo 10.500 Tm/ao para la fecha. 1991 Desmonopolizacin de la comercializacin de cacao por parte del estado venezolano y por consiguiente un incremento en la produccin nacional de cacao; alcanzado actualmente un promedio de 17.000 Tm/ao.

4. Manejo agronmico del cultivo de cacao Temperatura Puede crecer en zonas con temperaturas hasta de un mnimo de 15 C. Sin embargo, la formacin de flores depende en gran parte de la temperatura. Cuando sta es menor de 21C, casi no hay formacin de flores, en cambio cuando alcanza 25C, las flores se forman normal y abundantemente. En todo caso, no hay lmites de calor, si se tiene en cuenta que es un cultivo que debe estar a la sombra (Giusti, 2003). El Agua Segn el autor previamente mencionado, la cantidad de lluvia que satisface al cultivo oscila entre 1.500 y 2.500 mm en las zonas bajas ms clidas, y entre 1.200 y 1.500 mm en las zonas ms frescas o los valles altos. La distribucin mensual de la lluvia es muy importante, tanto por su falta como por su exceso. Un mnimo de 100 mm en los meses ms secos sera ideal para el cultivo del cacao. Este hecho es importante para el cacao bajo riego. Sombreamiento El cacao es una planta que se desarrolla bajo sombra, se le considera tpicamente humbrfila, aunque bajo condiciones especiales de luminosidad y distribucin de agua, puede cultivarse a plena exposicin del sol. La seleccin de las especies para sombra definitiva debe ser hecha cuidadosamente pues debe producir algn beneficio econmico. Es necesario un nmero de rboles permanentes de sombra capaces de

producir de un 25 a un 30% de sombreamiento. Varias son las especies de rboles usados como sombra; los ms comunes han sido las leguminosas bucare (Erythrina), guamas (Ingas). Sin embargo; debera investigarse el uso de otro tipo de rboles econmicamente importantes, como maderables, laurel, cedro, cenzaro y terminalia y/o frutales como los ctricos, aguacate, zapote, rbol de pan, algunas palmas, entre otros (Giusti 2003). El Viento Ante la presencia de brisas permanentes, el autor in comento, expresa que las hojas de cacao pierden agua, dejan de trabajar, se secan y mueren. Si el viento es de cierta intensidad, las hojas caen prematuramente. El propsito de la sombra al iniciar la plantacin no slo es reducir la luz para reducir la actividad de la planta sino tambin reducir el movimiento de aire que la perjudica. Suelos El cacao es bastante exigente en cuanto a la calidad del suelo. Requiere suelos ricos, profundos, franco arcillosos, con buen drenaje y topografa regular. Para el transplante, los hoyos deben tener un mnimo de un metro de profundidad, a fin de proporcionar suficiente espacio para el crecimiento y desarrollo de las races. No es recomendable sembrar cacao en: suelos pantanosos, de pendientes muy fuertes, muy pedregosos, poco profundos, pobres y suelos arenosos cercanos al mar (Giusti 2003). Cultivo La siembra debe realizarse en la primera mitad de la temporada de lluvia para tener suficiente tiempo para que el rbol se establezca antes de la

siguiente temporada seca. A pesar que madura 24 meses despus de la siembra inicial, los rboles llegan a ser productivos nicamente despus de cinco aos. Los rendimientos son mximos entre el octavo y dcimo ao, pero se pueden obtener buenos rendimientos durante varias dcadas. En condiciones normales, la produccin vara entre 300 y 500 kg/ha por ao. Los hbridos presentan rendimientos mayores, por encima de los 1.000 kg/ha (Giusti, 2003). Los frutos maduran a lo largo de todo el ao, sin embargo, se llevan a cabo dos cosechas anualmente: la cosecha principal y la cosecha intermedia. La cosecha intermedia es en general menor que la cosecha principal, sin embargo, el tamao vara segn cada regin. Dichos cultivos requieren de 5 a 6 meses entre la fertilizacin y la cosecha de los frutos, la cual dura alrededor de 5 meses y en cortar los frutos maduros de los rboles, abrirlos (normalmente con un machete) y extraer las semillas de los frutos. Estas semillas se ponen a fermentar entre 2 y 8 das antes de secarlas al sol. Los granos se transportan en sacos para su comercializacin. Las altitudes apropiadas para sembrar cacao estn entre 300 y 800 m.s.n.m., sin embargo en zonas cercanas a la lnea ecuatorial puede sembrarse hasta en altitudes de 1.300 m.s.n.m. por existir una compensacin trmica entre la latitud y altitud. Intuye el mismo, que para sembrar una hectrea de cacao se requieren mil cien semillas, sembradas en filas con una distancia de 3 x 3 m, lo cual da una densidad de entre 950 y 1330 rboles/hectrea. Se deben comprar alrededor de cien semillas ms, para cubrir las resiembras, que se estiman en 10%. Las condiciones climticas y las enfermedades son los principales factores que afectan la produccin. Se estima que hasta un 30% de la produccin mundial se pierde debido a las enfermedades. Entre las enfermedades ms comunes que afectan al cacao estn la podredumbre

negra de las nueces del cacao, la escoba de bruja y VSD (Muerte regresiva vascular). Es importante la poda para: eliminar las partes poco productivas, estimular el desarrollo de nuevos brotes, equilibrar los puntos productivos, regular la altura del rbol y regular la entrada de luz a los estratos inferiores.

5. Plagas y Enfermedades 5.1. Insectos plagas del cacao Las plagas y enfermedades han constituido en un factor importante en la disminucin de la produccin de cacao, La incidencia de plagas depende de las condiciones climticas de la zona, adems del microclima existente dentro del cacaotal, de los hbitos y ciclo de vida de los insectos y del manejo que se le est dando al cultivo. Este manejo requiere ser equilibrado, porque a pesar de ser una planta atacada por diversas enfermedades y plagas, necesita tambin de aquellos insectos benficos que participan en su polinizacin y que actan como controladores biolgicos (Moya et al., 2004), .

5.1.1. Insectos Perforadores del Tronco Coquitos Perforadores: Xyleborus ferrugineus (Fabricius) (ataca plantas adultas) Xylosandrus morigerus (Blandford) (ataca plantas jvenes)

Sntomas y Daos: Insectos que atacan el tronco y las races. Realizan gran nmero de galeras preferiblemente en la base del tallo. Su actividad se detecta porque la planta presenta sntomas de marchitamiento y en el suelo y tronco se observa un

aserrn muy pulverizado producto de su actividad. Tienen gran importancia por ser vectores de hongos patgenos (Ceratocystis, Fusarium y Lasiodiplodia), formando un complejo o asociacin insecto-hongo que limitan severamente al cultivo. El Xylosandrus ataca plantas en viveros, el dao se manifiesta por un marchitamiento generalizado que culmina con la muerte de las plantas. El ataque es muy frecuente en las plantas ms lignificadas, es decir, madera vieja (Moya et al., 2004).

Medidas de control:

Segn, Moya et al., 2004, El control debe dirigirse a disminuir la poblacin del insecto, as como tambin las plantas que presentan sntomas de la enfermedad, asociacin insecto - hongo, realizando las siguientes actividades: 1. Cortar y quemar las plantas enfermas y secas, ya que en estas persiste el inculo del hongo, y se pueden producir varias generaciones de insectos. 2. Desinfectar las herramientas utilizadas. 3. Evitar heridas en las plantas sanas. 4. Cultivo bajo adecuadas condiciones de fertilizacin, humedad y sombra. 5. Proteger las plantas vecinas con aplicaciones en la base de los tallos, con una mezcla de insecticida + fungicida. 6. Realizar curetajes en la zona afectada de la planta y aplicar una pasta cicatrizante. 7. Aplicar medidas fitosanitarias en viveros; no dejar sobrepasar las plantas en la bolsa, darles adecuado mantenimiento y eliminar plantas afectadas. 8. Insectos masticadores y raspadores de la corteza en ramas y tallo.

La Gota

Steirastoma depressum (Beter) Steirastoma breve (Sulzer)

Sntomas y Daos

Esta plaga afecta las plantas nivel de troncos y ramas, el dao lo realiza en estado larval ya que devora la corteza y a su vez construye tneles por debajo de sta, ocasionando un anillado que interrumpe el paso de la savia, causando la muerte de la planta o ramas. La larva se detecta fcilmente porque el rea afectada se ennegrece y aparece un exudado gelatinoso, los adultos slo raspan la corteza de las ramas tiernas. Su importancia radica en que por estas heridas pueden penetrar hongos patgenos que pueden ocasionar la muerte de plantas (Moya et al., 2004).

Medidas de control: 1. Si las poblaciones son muy altas y la plantacin est en brotacin, conviene establecer programa de manejo de malezas que mantenga hospederos naturales, de los que se alimentar esta especie. 2. Al detectar el dao conviene practicar ciruga vegetal y proteger la herida. 3. Realizar jornadas de recoleccin del insecto adulto, contribuye a reducir la poblacin insectil y a bajar los niveles de dao.

Comejenes Nasutitermes ephratae Holmgreen N. corniger Montschlsky

Los comejenes se encuentran formando nidos muy voluminosos, en el tronco o en las ramas del rbol, localizndose preferiblemente en la horqueta o

vrtice de las plantas. Los daos se deben al efecto mecnico por el peso, afectando directamente la corteza y a la produccin al cubrir los cojines florales (Moya et al., 2004).

Medidas de control

1. Tumbar y quemar los nidos. 2. Limpiar el tronco y las ramas de las numerosas galeras superficiales. 3. No dejar partes secas de madera o restos de poda.

5.1.2. Plagas que Afectan Hojas

Vaquita Brachyomus octotuberculatus (F.)

Insectos de color gris y que presentan en la regin Terminal del abdomen un abultamiento, se alimenta de hojas tiernas, sobre las cuales hace un dao parecido al del bachaco rojo, pero los cortes son ms irregulares. Este insecto slo ataca cuando la plantacin permanece mucho tiempo libre de malezas, por lo que debe contemplarse un control racional de malas hierbas (Moya et al., 2004).

Medidas de control:

1. Dado que la plaga no puede volar, su ataque se restringe a reas localizadas, por lo que un manejo adecuado de malezas y plantas hospederas como el cordoncillo, facilita su control. 2. Si el ataque y dao es muy severo y en la plantacin est en perodo de brotacin, se recomienda la utilizacin de insecticida de contacto e

ingestin dirigido al follaje, slo cuando sea necesario por sus efectos sobre los polinizadores.

Bachacos Atta sp. Acromyrmex sp.

Son insectos de color pardo rojizo, cabeza grande y mandbulas fuertes viven bien organizados en colonias denominadas bachaqueros. Los daos se caracterizan por cortes semicirculares desde los bordes hacia la nervadura central de las hojas. En cacao pueden causar defoliacin severa en las hojas y tambin cortan las flores (Moya et al., 2004).

Medidas de control

1. Se puede usar plaguicida atrayente en forma de cebo, cerca de la entrada del bachaquero o de los caminos por donde transitan los bachacos, el cual es llevado a los nidos, donde ejerce accin fungicida, impidiendo el crecimiento del hongo que sirve de alimento. 2. Aplicar un insecticida en polvo, con bomba de presin forzada de aire, a travs de las bocas de entrada, para alcanzar las cmaras de cra que constituyen el bachaquero (utilizar equipo de proteccin para la aplicacin de plaguicidas: ropa, zapatos, guantes y mascarilla).

Piojitos o Thrips Selenothrips rubrocinctus Giard

Insectos que atacan hojas y frutos. En el follaje, el dao es ms importante ya que debido a su actividad alimenticia raspan las hojas las cuales

amarillean y caen. Si el ataque es severo se puede producir una defoliacin progresiva de la planta. En frutos el dao avanza y toma una coloracin ferrosa, debido a la deposicin de excrementos y a las heridas causadas por el insecto, ocasionando dificultad al momento de la cosecha, ya que hace difcil determinar si la mazorca est madura (Moya et al., 2004).

Medidas de control

1. Como los ataques son ms intensos en plantas expuestas al sol, se recomienda hacer una adecuada regularizacin de la sombra.

Coquitos Esqueletizadores Disonycha sp. Omophoita sp. Los insectos adultos se alimentan de follaje, preferiblemente de brotes y hojas tiernas. Los ataques se localizan en la regin intervenal de la hoja. Con frecuencia ocasionan ataques en vivero (Moya et al., 2004).

Medidas de control

1. S las poblaciones son muy elevadas, se pueden colocar trampas de captura, para lo cual se debe consultar con el asesor tcnico ms cercano. 2. Si el ataque y dao es muy severo, se recomienda la utilizacin de un insecticida de contacto e ingestin, en forma dirigida donde se localicen los focos, slo cuando sea necesario. Ya que sus efectos son nocivos a los polinizadores. 3. Para plantas en vivero, se recomienda un programa de manejo fitosanitario que incluya el control de todas las plagas.

5.1.3. Plagas que afectan el Fruto:

Perforadores del Fruto Carmenta theobromae (Busck) La hembra del insecto deposita los huevos en la superficie de los frutos tiernos, de donde salen las larvas que perforan la corteza para alimentarse. Daan la corteza al ocasionar galeras, las cuales se rellenan con los excrementos que son de color oscuro y apariencia a borra de caf. Sin afectar la parte interna ni los granos, por lo que estas se pueden aprovechar parcialmente (Navarro et al., 2004).

Carmenta foraseminis (Eichlin)

La hembra coloca los huevos en forma individual en las hendiduras y rugosidades tanto de frutos tiernos como en los prximos a alcanzar la madurez fisiolgica. La larva al momento de la eclosin se introduce en el fruto causando una perforacin al lado del huevo muy pequea, la cual es difcil de observar a simple vista. Las larvas de los primeros instares, se alimentan del tejido placentario y los ltimos del mesocarpio, dejando las excretas esparcidas dentro del fruto. Las larvas al llegar a la ltima fase de desarrollo, se dirigen al epicarpio del fruto y comienzan a construir el capullo con las excretas y una sustancia cerosa que ella misma expulsa (Herrera y Snchez., 2005). Sntomas Los frutos atacados presentan externamente la apariencia de sanos, observndose una mancha o peca que sella la abertura de la perforacin, que corresponde a una capa muy delgada del epicarpio del fruto, que la larva deja para usarla de proteccin y evitar la entrada de otros insectos que

puedan perjudicarle; esta capa es destruida cuando emerge el adulto del capullo, dejando una perforacin en el fruto que facilita el ingreso de otros agentes patgenos, ocasionando prdidas importantes en la produccin (Navarro et al., 2004). Medidas de control 1. Realizar cosechas peridicas, para evitar la sobre maduracin de los frutos. 2. Eliminar las mazorcas con daos por insectos, hongos y vertebrados como ardillas, monos y pjaros. 3. Depositar las cscaras de los frutos de los picaderos a los composteros o productores de abono orgnico y aplicar tratamiento fitosanitario para el control de hongos e insectos. 4. Acatar las disposiciones de Sanidad Vegetal de no trasladar frutos de cacao, de una entidad federal a otra, ni dentro de la misma entidad federal

La Chinche amarilla Monalonion dissimulatum

Conocida como chinche amarilla, o mosquilla del cacao. El insecto adulto es una chinche de 10 a 12 mm de largo, color naranja con dos manchas oscuras transversales y cabeza de color negro con antenas y patas largas. Las ninfas son de color amarillo naranja brillante, sin alas, con patas largas color negro. Esta plaga se presenta preferiblemente en zonas hmedas y sombreadas, en pocas de lluvia, con temperaturas altas y exceso de malezas. Los brotes y las mazorcas, son atacados por las ninfas y adultos que chupan la savia e inyectan toxinas. El ataque origina manchas necrticas circulares de color negro que se van uniendo entre s. Sobre stas se pueden desarrollar hongos patgenos del cacao. El ataque a las

mazorcas se inicia en la punta extendindose hacia el pednculo (Moya et al., 2004).

Medidas de control

1. Poda de mantenimiento del cacaotal y el raleo del sombro permanente, a fin de regularizar la entrada de luz y aire dentro de la plantacin. 2. Mantener controladas las malezas. 3. Realizar inspecciones frecuentes para localizar los focos del insecto en sus fases iniciales y proceder a su control y proceder a su control, mediante presin mecnica con las manos o flameo con una antorcha.

Mamferos

Entre estos animales se encuentran las ratas, ardillas, rabipelados y monos que causan daos en los frutos y ramas; otras veces destruye cojines florales. Los ataques ocurren en perodos de escasez de frutos silvestres, por lo que se recomienda preservar algunas de stas especies (Ramos et al., 2000).

Aves Causan perforaciones en las mazorcas prximas a la cosecha y destruyen frutos de cualquier edad. Entre stos se encuentran los loros, pjaros carpinteros (Ramos et al., 2000). .5.2. Enfermedades del cacao

Las condiciones del ambiente influyen marcadamente sobre la incidencia de las enfermedades en el cacao. La mayora de las que afectan hojas y frutos aparecen durante y a la salida de las lluvias.

Moniliasis Mancha Ceniza Moniliophthora roreri (Cify Par.) Evans et al., s.f.

Es una enfermedad que slo ataca los frutos en cualquier estado de su desarrollo. En frutos menores de tres meses aparecen deformaciones o gibas ligeramente plidas, estos frutos se momifican y permanecen adheridos al rbol. En frutos mayores a los tres meses, se observa una mancha caf claro, que en condiciones de alta humedad, se cubre de un polvo color crema, constituida por millones de conidias que son como semillitas, que reproducen la enfermedad y que son diseminadas por el viento, la lluvia y los insectos. Las almendras se pudren y se adhieren a la cscara. Los frutos enfermos presentan hinchazones y son de mayor peso que los sanos (Rumbos, 2004).

Medidas de control

1. Limpieza general de la plantacin eliminando las malezas y realizando las podas necesarias en los rboles de cacao y rboles de sombra, a fin de mejorar las condiciones de aireacin y remocin del exceso de humedad. 2. Recoger y quemar o enterrar todas las mazorcas enfermas incluyendo los chireles negros y momificados pegados al rbol y las que se encuentren en el suelo. 3. Cosechar peridicamente los frutos maduros sanos, para evitar prdidas por infecciones tardas. 4. La apertura o limpieza de drenajes. 5. Realizar la fertilizacin de manera fraccionada para fortalecer las plantas, obedeciendo al respectivo anlisis de suelo. 6. Slo en caso necesario aplicar fungicidas a base de cobre.

Pudricion Parda de la mazorca (Cncer del Tronco) Phytophthora palmivora (Butler)

La enfermedad se manifiesta con una mancha de color marrn chocolate que con el tiempo se oscurece. Esta mancha se puede encontrar en la parte basal, en la unin del pednculo con el fruto, avanzando rpidamente hacia el pice de la mazorca. En ocasiones avanza desde la punta hacia la base y tambin puede iniciarse desde la zona central hacia los dos extremos del fruto. La necrosis avanza hacia el interior alcanzando las almendras, a las cuales les produce necrosis hmeda. El hongo a travs del pednculo puede alcanzar el cojn floral, afectando las flores y los chireles. En el tronco el hongo causa necrosis de color marrn oscuro y exudado gomoso rojizo. Si la necrosis avanza y rodea el tallo, causar la muerte de la planta (Capriles, s.f.).

Medidas de Control

1. Evitar sobre maduracin de los frutos. 2. La deteccin temprana del sntoma de la enfermedad en el tallo, permite realizar ciruga vegetal local y aplicar la pasta cicatrizante. 3. Desinfectar las herramientas. 4. Limpieza general de la plantacin eliminando las malezas y realizando las podas necesarias en los rboles de cacao y rboles de sombra, a fin de mejorar las condiciones de aireacin y remocin del exceso de humedad. 5. Recolectar, enterrar o quemar todos los frutos y otros rganos enfermos de la planta y los que caen al suelo. Escoba de brujas Crinipellis perniciosa (Sthael) Singer

El nombre de la enfermedad se corresponde con el aspecto que toman los brotes en las plantas. Afecta los cojines florales, las flores, las hojas y sobre todo los frutos, especialmente cuando son pequeos. Aunque no llega a matar los rboles, la colonizacin permanente del patgeno los vuelve improductivos (Capriles, s.f.).

Medidas de control

1. Realizar las podas necesarias en los rboles de cacao y rboles de sombra, a fin de mejorar las condiciones de aireacin y remocin del exceso de humedad. 2. Recolectar y quemar las escobas vegetativas antes de que sequen y antes de iniciarse las lluvias a fin de impedir que el hongo forme sus estructuras reproductivas. 3. Cosecha peridica y eliminacin de plantas enfermas o rboles foco.
4. Evitar el traslado de material de cacao de zonas afectadas a zonas libres

de la enfermedad.

Mal del machete mal de Choroni Ceratocystis fimbriata (Ellis Y Halsted)

Esta enfermedad se conoce tambin como "pudricin azul de la madera". Afecta las races, tallos y ramas. Est ntimamente asociada a coquitos perforadores del tallo, de la familia Scolytidae (Xyleborus). Si las plantas son atacadas en el tronco debajo de las ramas, presentarn marchites generalizada, amarillamiento repentino y total de las hojas, que en pocos das se enrollan sobre la nervadura principal y quedan adheridas a las ramas durante varios das hasta que caen (Capriles, s.f.).

Cuando el hongo ataca a nivel de ramas, ocurre el secamiento de stas con idnticos sntomas. En ambos casos se puede ver la necrosis de la madera, de color castao oscuro y zonas de gris azulado en franjas longitudinales (Capriles, s.f.).

Medidas de control 1. Cortar y quemar las plantas o ramas enfermas en el sitio. 2. Evitar heridas en las plantas y de ocurrir, protegerlas con pasta cicatrizante. 3. No podar plantas sanas sin desinfectar las herramientas. 4. Proteger las plantas vecinas con aplicaciones a la base de sus tallos, con una mezcla de insecticida +fungicida +adherente.

Antracnosis Colletotrichum gloeosporioides (Penzig) Sacc.

La enfermedad causa daos importantes en hojas y frutos. Ataca principalmente las hojas tiernas de los brotes jvenes, ocasionando manchas que pueden avanzar por las nervaduras hacia el tallo. En frutos jvenes se manifiesta por numerosos puntos necrticos, que pueden profundizar en la corteza, llegar a las almendras y detener el crecimiento. En frutos ms desarrollados se producen manchas ms grandes de diferentes formas, hundidas y de poca profundidad en la corteza. En condiciones de alta humedad y temperatura, sobre las lesiones se producen las estructuras de fructificacin del hongo (Caprles, s.f.). Medidas de control

1. Realizar podas a fin de mejorar las condiciones de aireacin y remocin del exceso de humedad.

2. Regular la sombra permanente evitando la excesiva exposicin de las plantas al sol. 3. Realizar poda de ramas afectadas por la enfermedad, recolecta y quema de frutos afectados.

Agallas Fusarium decencellulare (Brick) Anamorfo. Calonectria rigidiuscula (BerkyBr.)Sacc. Teleomorfo.

En cacao se forman diferentes tipos de hipertrofias (malformaciones) denominadas agallas o verrugas, en el tronco y en las ramas se conocen con los nombres de agallas de punto verde, abanico, perilla y floral. La agalla de punto verde son grupos de yemas en forma compacta que no logran desarrollarse. Las agallas florales se manifiestan como ramilletes de flores en los cojines florales, no producen frutos. La de perilla se manifiesta como hipertrofia en ramas y el tallo en forma de tumor (Capriles, 1981).

Medidas de control

1. Mantener el equilibrio de la sombra dentro de la plantacin. 2. Eliminar las plantas muy afectadas. 3. Eliminar las agallas de perilla mediante ciruga vegetal y aplicar pasta cicatrizante. 4. Hacer desinfeccin de las herramientas.

Muerte sbita y/ o Regresiva (Pudricin carbonosa de la mazorca) Lasiodiplodia theobromae (Pat) Griffy Maubl

La muerte sbita, repentina o regresiva consiste en una quemazn de los brotes tiernos y necrosis de las ramas o toda la planta. Inicialmente se observa una clorosis en las hojas ms jvenes, luego una necrosis en los bordes que se hace total y toma una coloracin marrn intensa. Las hojas necrosadas se hacen muy frgiles y caen dando la apariencia de muerte descendente. En frutos pequeos o medianos no es frecuente la enfermedad, pero en mazorcas a punto de cosecha causa una pudricin carbonosa oscura con abundante polvillo negro (conidios).En el tallo se manifiesta por una a varias manchas necrticas de color castao rojizo tornando a gris oscuro. La corteza se vuelve fibrosa y se separa con facilidad de la madera. Los daos severos se producen bajo condiciones de altas temperaturas, alta humedad relativa, perodo seco prolongado, ataque de insectos y presencia de heridas (Capriles, 1981). Medidas de control

1. Poda de mantenimiento y raleo del sombro, para permitir entrada de luz y aireacin de la plantacin, evitando los excesos de humedad. 2. Recoleccin y destruccin de mazorcas enfermas. 3. Proteccin de las heridas con pasta cicatrizante. 4. Desinfectar las herramientas cada vez que se pase de un rbol a otro.

6. Aspectos generales de los hongos Los hongos son organismos eucariotas hetertrofos que tienen un rol importante en el medio ambiente. Son responsables de la descomposicin de kl a materia orgnica, la produccin de antibiticos, micotoxinas y diversos compuestos bioactivos. Muchos son patgenos de plantas y animales y algunas especies sirven de alimento para los seres humanos. Los hongos

son capaces de establecer relaciones simbiticas con otros organismos, asocindose al tejido como parsitos o endfitos (Alexopoulus et al., 1996). Un hongo patgeno es aquel que causa lesiones y sintomatologa en los tejidos vegetales (Ulloa y Hanlin, 2000), causando daos considerables a los cultivos agrcolas e influyendo negativamente a la economa (Gold et al., 2001). En contraste, un hongo endfito es aquel que habita en los tejidos vegetales sin causar dao (Petrini, 1991; Malav 2005). Se ha documentado la presencia de uno o ms endfitos habitando diversas especies de plantas, formando una relacin mutualista donde la planta le ofrece albergue y nutrientes al hongo, mientras ste provee resistencia contra herbvoros, insectos hongos patgenos enfermedades y sequa (Lodge y Cantrell, 1995; Alexopoulus, 1996; Carlile, 2001; Clay y Schardi, 2002). Esta resistencia de la planta puede relacionarse a la produccin de toxinas y metabolitos secundarios por algunas especies endofticas (Lodge y Cantrell, 1995; Carlile, 2001; Clay y Schardi, 2002). Se ha demostrado que algunos de estos metabolitos secundarios (aminas, amidas, derivados de indol, esteroides y terpenoides, entre otros) tienen efecto antimicrobiales (Tan y Zou, 2001; Strobel y Daisy, 2003). Por ejemplo, Phomopsis produce fomosicalasina, un metabolito con accin inhibitoria contra Bacillus subtilis, Salmonella entrica, Staphylococcus aureus y Candida tropicales (Horn et al., 1995). La diversidad de hongos endfitos asociados a especies vegetales est relacionada con la edad de las hojas, localidad (ambientes terrestres o acuticos) y clima de la planta, ya sea en zonas templadas o tropicales (Frhlich et al, 2000; Macarthur y McGee, 2000; Arnold y Herre, 2003). Varias especies de endfitos pueden ser aisladas de una misma planta,

demostrando que no necesariamente hay especificidad entre los hongos endfitos y un gnero hospedero en particular (Petrini, 1986). Asimismo, han aislado endfitos de diversas familias de plantas, entre las que destacan Sapotaceae, Orchidaceae, Poaceae, Malvaceae, Arecaceae, entre otras (Lodge et al., 1996; Bayman et al., 1997; Schulthess y Faeth, 1998; Marshallm et al., 1999). 6.1. Divisin Ascomycota. 6.1.1. Aspectos generales Los ascomicetes son un grupo monofiltico (todos derivan del mismo antecesor comn), que engloba aproximadamente al 75% de los hongos conocidos. Aqu se encuentran la mayora de los hongos que, junto con un alga, forman los lquenes, y adems, de ellos derivan la mayora de los Deuteromicetes, que han perdido, o se desconoce, su reproduccin sexual. Tienen una fase dicaritica celular. En los hongos vistos hasta ahora, y la mayora de los seres vivos, tras la fusin del citoplasma de los dos gametos (plasmogamia), tiene lugar la fusin de sus ncleos haploides (cariogamia), para originar una clula con un ncleo diploide. Sin embargo, en estas dos divisiones, la cariogamia no es inmediata, por lo que tiene lugar una fase dicaritica (dos ncleos), que es breve en los ascomicetos y ms larga en los basidiomicetos (Rubio, 2004). El autor in comento, expone que la principal caracterstica que define a los ascomicetes es la presencia de ascas. Durante la fase dicariota, las hifas continan creciendo, formando un micelio dicaritico; cuando las condiciones son adecuadas, en la clula terminal de una hifa, se produce la cariogamia (la fusin de los dos ncleos haploides que contena), formndose entonces el cigoto, que ser la clula madre del asco.

Asexualmente se reproducen por gemacin, fisin, fragmentacin y desarrollo de conidios, que producen esporas. Sexualmente, por

conjugacin, gametangia y gametangiogamia. 6.1.2. Ciclo de vida El ciclo caracterstico de este grupo es el ciclo de vida haplo- caritico. En el que el estado dicaritico es muy conspicuo. Uno de los caracteres ms interesantes de los Ascomicetes y Basidiomicetes es la separacin temporal de la plasmogamia y la cariogamia, de tal manera que se forma un sistema de hifas dicariticas que puede durar mucho tiempo. Cuando por fin ocurre la cariogamia el cigoto sufre meiosis inmediatamente. As la nica clula diploide del ciclo de vida es el cigoto (Anexo Figura 6). Los ascomicetes se caracterizan por la formacin de un ascocarpo en forma de bastn llamado asco y por la formacin dentro del mismo de las ascosporas. Los ascos, slo con algunas excepciones, se forman dentro de cuerpos fructferos llamados ascocarpos, los cuales se presentan con cuatro morfologas fundamentales: Cleistotecio: Ascos completamente cerrados por el ascocarpo. Peritecios: Ascocarpos en forma de pera o botella que cuando inmaduro est cerrado pero al madurar forma un poro por donde escaparn las esporas. La pared que los envuelve se denomina peridio (en realidad el excpulo) que se abre apicalmente por un ostiolo. En el interior se ordenan los ascos sobre un himenio, Los ascos pueden estar acompaados de estructuras estriles en forma de filamentos llamados parfisis. Apotecio: Ascocarpo completamente abierto con forma de copa o disco. Los ascos se disponen en un himenio en forma de empalizada. Rodeado por un excpulo carnoso en forma de plato.

Ascostroma o pseudotecio: Los ascos se forman directamente dentro de cavidades hechas en un estroma (tejido somtico compacto de estructura compacta y acojinada). De acuerdo al tipo de ascoarpo que presenten los ascomicetes de la subclase Euascomycetidae se agrupa en tres tipos generales: Plectomycetes si el ascocarpo es un cleistotecio, Pyrenomycetes si el ascocarpo es un peritecio y Discomycetes si el ascocarpo es un apotecio. Estos hongos se reproducen muy frecuentemente de manera asexual por medio de: Conidiosporas: esporas asexuales que se desarrollan en el extremo de una hifa especial llamada conidiforo.

6.2. Caractersticas de algunos de los hongos encontrados como endfitos 6.2.1. Cladosporium Clasificacin Cientfica Reino Divisin Clase Subclase Orden Familia Gnero Fungi Ascomycota Dothideomycetes Dothideomycetidae Capnodiales Davidiellaceae Cladosporium

Aspectos generales Gnero que engloba a unas 40 especies, algunas de ellas fitopatgenas y la mayora saprofitas sobre vegetacin o sobre el suelo;

algunas de sus especies son capaces de atacar celulosa, pectina y lignina. Es un gnero de distribucin cosmopolita, siendo uno de los taxones ms aislado y abundante en los recuentos aerobiolgicos de todo el mundo. Es ampliamente citado como productor de asma y esporosis, e incluso algunas de sus especies actan como oportunistas y son capaces de intervenir en ciertos procesos micticos pulmonares, atacar la piel, producir

cromoblastomicosis y lesiones neurotrpicas (Rivas y Thomas, 2005). El autor contina, que aunque el mayor inters por estos hongos, desde el punto de vista sanitario, viene dado por la capacidad alerggena de sus conidios, que pueden alcanzar en la atmsfera, tanto en interiores como en exteriores de edificaciones, concentraciones muy altas. Segn los datos facilitados por la Unidad de Alergia del Hospital Reina Sofa de Crdoba, Cladosporium es el tercer alrgeno fngico en importancia tras Alternaria y Aspergillus Este gnero forma en medio de cultivo, una coloracin verde oliva, marrn o negro en algunos casos. Con una textura aterciopelada, un margen entero y con alta capacidad de esporulacin, los conidios de Cladosporium pueden aparecer encadenados o solitarios. Poseen un tamao aproximado de 3-7 x 2-4 , son reconocibles por las caractersticas de color y forma comentadas en la descripcin anterior y por la presencia de una cicatriz en la base (Rivas y Thomas, 2005). El premencionado autor expresa, su teleomorfo: Mycosphaerella, forma en medio de cultivo colonias de color olivceo y a veces grises o marrones; aterciopeladas, flocosas o pelosas; a veces presenta estromas. Sus conidiforos son macronematosos o semimacronematosos simples o poco ramificados, con una coloracin marrn o verdosa, y de superficie lisa o

ligeramente granulosa en algunas especies. Muchas de sus especies poseen ramoconidios con o sin septos. La clula conidigena es poliblstica, generalmente integrada y simpodial; da lugar a conidios que generalmente quedan en cadenas acrpetas, o a veces se presentan solitarios. Sobre este particular, Rivas y Thomas (2005) exponen que pueden ser de forma variada (elipsoidales, limoniformes, oblongos, esfricos,

subesfricos, fusiformes), con una cicatriz en la base y pueden ser unicelulares o poseer 1-3 septos transversales; poseen pared lisa, verrugosa o equinada, hialina a pigmentada, de color olivceo a marrn obscuro. 6.2.2. Curvularia Clasificacin cientfica Fungi Ascomycota Euascomycetes Pleosporomycetidae Pleosporales Pleosporaceae Curvularia

Reino Divisin Clase Subclase Orden Familia Gnero

Aspectos Generales Las especies de gneros Curvularia, se desarrollan sobre variados substratos y por lo general presentan patrones de distribucin geogrfica amplios como cosmopolita o pantropical, aunque algunos de sus

representantes pueden presentar una distribucin ms limitada (Ellis, 1966, 1971; Sivanesan, 1984a, 1987). En las plantas actan como patgenos, invasores secundarios o saprobios. Son muy conocidos como parsitos importantes de gramneas

silvestres

cultivadas

en

su

hbitat

fundamental.

Sin

embargo

ocasionalmente tambin pueden afectar otros grupos. Las enfermedades ms comunes que producen son manchas foliares, marchitamiento de hojas y plntulas, pudriciones de races y afectaciones de semillas y granos (Benoit y Mathur, 1970; Ellis, 1971; Chidanbaram et al., 1973; Sivanesan, 1984a, 1987; Sivanesan y Waller, 1986; Alcorn, 1988a; Farr et al., 1995; Kwasna, 1995). Es un patgeno facultativo, que puede causar manchas en hojas en diferentes plantas como en, habas, el algodn, el algodn, el arroz, la cebada, el trigo, el cacao, el maz, entre otros rubros. Sus sntomas principalmente se presentan en hojas desarrolladas donde se observa manchas de color marrn oscuro de formas irregulares en los bordes y el pice de 2 a 4 cm esta enfermedad no ocasiona prdidas en la produccin (MycoBank, 2000).

6.2.3. Lasiodiplodia

.Clasificacin cientfica Reino Divisin Subdivisin Clase Orden Familia Gnero Especies Fungi Eumycota Deuteromycotina Coelimycetes Sphaeropsidales Sphaeropsidaceae Lasiodiplodia theobromae pseudotheobromae

Aspectos generales El patgeno causante de este sntoma afecta prcticamente a una gran cantidad de especies de rboles frutales, a los que llega a invadir por un mal manejo agronmico del cultivo (estrs hdrico, deficiencias nutricionales), y por el descuido de las labores de poda que se realiza durante la conduccin del cultivo, produciendo daos como la muerte descendente de las ramas, que pueden incluso llagar a matar a la planta. El rango de hospedantes es bastante amplio como aguacate, mango, cacao, manzano, vid, rosal, entre otros, y as como en diferentes reas ecolgicas. Entre los sntomas se tiene que las plantas afectadas presentan secamiento y necrosis de ramas terminales en donde es posible observar muerte descendente as como defoliacin parcial y muerte del rbol. Para el control de la muerte descendente se considera la eliminacin de la rama mediante la labor "ciruga" y el uso de protector de heridas. Las aspersiones de fungicidas cpricos pueden tambin reducir la severidad (Alves et al., 2008). Las muestras de ramas secas que se trajeron de las plantaciones se sometieron a cultivos in vitro donde el hongo desarrollo colonias densas de color oscuro-grisceo y gris claro en el borde por su cara superior y los micelios que se levantaban como columnas. No se observ formacin de esclerocios. La observacin microscpica revel la presencia de conidios rectos, cilndricos, de extremos obtusos, hialinos (Alves et al., 2008). 6.2.4. Colletotrichum Clasificacin cientfica Reino Divisin Clase Subclase Fungi Ascomycota Sordariomycetes Sordariomycetidae

Orden Familia Gnero

Incertae sedis Glomerellaceae Colletotrichum

Aspectos generales

Este gnero se caracteriza por presentar organismos cosmopolitas y pocas veces tienen especificidad patognica en sus hospedantes. Presentan una gran variabilidad en caracteres morfolgicos de conidios y apresorios. Las enfermedades que causan han sido descriptas en un sinnmero de especies cultivadas y espontneas (Agrios 1995). sta enfermedad presenta sntomas en los frutos en estado de llenado y maduracin. Los sntomas que se observan son lesiones circulares de color marrn claro de 1 2 cm de dimetro, hundidas, Internamente los frutos presentaron una pudricin y frecuentemente es blanda. Luego esta va avanzando en la medida que el patgeno continu la colonizacin de nuevos tejidos, hasta las setas del hongo irrumpen a travs de la epidermis al formase los acrvulos en estos se observa setas rgidas, numerosas, negras, y conidiforos simples, rectos, hialinos, que cubre la superficie del estroma en un solo estrato. La antracnosis causada por Colletotrichum spp., afecta diferentes cultivos, como el gandul, la fresa, el mang, el cacao, la papaya, el aguacate, la manzana, la almendra, la lenteja, el algodn, el caf y el guineo, entre otras plantas. El gnero Colletotrichum fue descrito por Tode en 1790 bajo el nombre de Vermicularia, nombre que fue validado por Fries en el 1825 (Baxter et al., 1985). Ms tarde, Saccardo en 1884, transfiri a Vermicularia al gnero

Colletotrichum y aplic este nombre a los hongos habitantes de las hojas que eran similares a Colletotrichum (Baxter et al., 1985). Colletotrichum fue establecido como gnero por Corda en 1831, quien lo describi como un hongo caracterizado por producir cuerpos de fructificacin asexual llamados acrvulos setosos y conidias hialinas y fusiformes (Baxter et al., 1985). Colletotrichum ha sido redescrito bajo diferentes gneros, siendo los dos ms comunes Vermicularia y Gloeosporium Desm & Mont (Wharton, 2001). Han existido problemas para diferenciar a Colletotrichum de Gloeosporium. Inicialmente, en Gloeosporium su acrvulo glabroso era distintivo, pero ms tarde se descubri que este hongo poda desarrollar setas en algunos sustratos (Jeffries et al., 1990). Duke en el 1928, demostr que la presencia o ausencia de setas y su arreglo en el acrvulo son extremadamente variables y no son relevantes a nivel de gnero (Wharton, 2001). Von Arx (1957, 1970) redujo la confusin entre gneros al escribir monografas sobre Colletotrichum, en las que reduce cientos de taxones a 13 especies aceptadas. Von Arx (1970) describe el estado anamorfo de Glomerella, el gnero Colletotrichum, con acrvulos intra o subepidermales, con variaciones en tamao y forma, glabrosos o setosos. Las setas son oscuras u ocasionalmente casi hialinas que surgen de la base del acrvulo. Las conidias son elipsoidales, cilndricas y forman apresorios al germinar. Adems, describe para C. gloeosporioides acrvulos oscuros o claros, setosos o glabrosos. Las conidias son cilndricas o elipsoidales, redondeadas en los extremos, atenuadas o truncadas, hialinas y forman masas de esporas anaranjadas a rosadas. Una herramienta adecuada para la identificacin de Colletotrichum spp. es la medida de sus apresorios. Para muchos hongos fitopatgenos, el apresorio es la estructura ms importante en la invasin del hospedero. ste aumenta el rea de superficie y permite la adhesin del hongo a la planta

hospedera. Adems, provee la fuerza mecnica, las enzimas necesarias para la penetracin y promueve la sobrevivencia en condiciones adversas (Hutchison et al., 2000). Segn Buddie et al., (1999) en su estudio y en otros estudios citados por Buddie (Bruns et al., 1991; Grondona et al., 1997) se ha demostrado que Colletotrichum spp. tiene subdivisiones sistemticas y estos grupos pueden ser divididos en otros subniveles. Esta afirmacin est basada en el anlisis de distintas partes del genoma, que podran reflejar diferentes niveles de jerarqua taxonmica. El problema con la taxonoma de Colletotrichum spp. reside en que produce conidias secundarias provenientes de las conidias de germinacin inicial. Estas esporas secundarias generalmente son variables en tamao y dificultan la identificacin (Buddie et al., 1999). Debido a estos problemas se han utilizado una variedad de mtodos moleculares para discriminar entre especies de Colletotrichum ya que los criterios morfotaxonmicos no son precisos (Freeman et al., 1996). 6.2.5. Glomerella Clasificacin Cientfica Reino Divisin Clase Subclase Orden Familia Gnero Fungi Ascomycota Sordariomycetes Sordariomycetidae Incertae sedis Glomerellaceae Glomerella

Aspectos generales

Glomerella (Stonem.) Spaulding y Schrenk se reconoce como el estado teleomorfo de Colletotrichum, pero no se ha relacionado con otros aislamientos de este taxn (Jeffries et al., 1990). Para algunas formas de Colletotrichum no se ha encontrado el estado teleomorfo, pero pueden ser diferenciados morfolgicamente. Estas formas estn estrictamente limitadas a una planta hospedera especfica y tienen formas de crecimiento distintas en cultivo puro (Von Arx, 1970). Glomerella spp. es un ascomiceto que desarrolla un peritecio bien variable en estructura y se pueden encontrar muchas formas genticas diferentes, de fisiologa variable y especficos para algunos hospederos o sustratos (Von Arx, 1970). Presenta un ascocarpo de 85-300 m, marrn oscuro, con pocas ascas, clavadas y de pared fina, contenidas por hasta ocho ascosporas. Las ascosporas son truncadas, biseriadas y elipsoidales a fusiformes, hialinas, de pared lisa, mayormente con una medida de 10-21 x 4-6 m (Domsch et al., 1980). 6.2.6. Fusarium Clasificacin cientfica Reino Divisin Clase Subclase Orden Familia Gnero Fungi Ascomycota Sordariomycetes Hypocreomycetidae Hypocreales Nectriaceae Fusarium

Aspectos generales Fusarium, es una enfermedad que puede catalogarse como universal. Este es un hongo tpico de suelo, que en zonas clidas y hmedas causa

marchitamiento de follaje. Esta enfermedad es causada por un hongo presente en el suelo, en condiciones ambientales favorables para el desarrollo de la enfermedad son: suelos moderadamente cidos, sueltos y arenosos; temperatura elevada (ms de 25C) y lluvias suficientes para la evolucin normal de la planta. Se han observado en plantas, amarillamiento general de las hojas que luego estos se marchitan, y hay una defoliacin, los frutos cuajados son escasos, poco desarrollados y de maduracin defectuosa. Estos sntomas se observan por que el hongo penetra por las races y se localiza en los vasos leosos de stas y del tallo, impidiendo o dificultando la ascensin y circulacin de la savia, produciendo el oscurecimiento del tejido leoso. Y al momento de extraer la raz de la planta se observa una decoloracin algo rojizo opaco (MycoBank, 2000). 6.2.7. Pestalotiopsis Clasificacin cientfica Sper Reino Reino Divisin Subdivisin Clase Subclase Orden Familia Gnero Aspectos generales Eucariota Fungi Ascomycota Pezizomycotina Sordariomycetes Xylariomycetidae Xylariales Amphisphaeriaceae Pestalotiopsis

Produce una enfermedad fungosa considerada generalmente una enfermedad menor. Ataca el follaje que ha sido daado o debilitado por un clima desfavorable o condiciones de crecimiento. Generalmente, el follaje muerto est cerca de la base de la planta y donde el follaje es relativamente denso. Usualmente, la enfermedad comienza en la punta de la hoja y progresa hacia su base. El color del follaje va de verde a amarillento, luego se pone marrn oscuro que puede verse casi negro. La enfermedad puede matar las ramitas pequeas donde las hojas (en forma de agujas) infectadas murieron (Schuster, s.f.). Control El control es podar el follaje muerto y en caso necesario las ramitas pequeas cuanto antes en primavera. Reduzca la lesin de invierno reduciendo la deshidratacin. No permita que la nieve se acumule, permanezca o quede alrededor o encima de la base de la planta por ningn tiempo - especialmente cuando se derrite. Evite sobre plantar (amontonar) para permitir suficiente circulacin de luz solar y aire (Schuster, s.f.). 6.2.8. Penicillium Clasificacin Cientfica Reino Divisin Clase Subclase Orden Familia Gnero Fungi Ascomycota Leotiomycetes Leotiomycetidae Helotiales Sclerotiniaceae Penicillium

Aspectos generales

Los penicilios son mohos comunes que desarrollan sobre los ms diversos substratos: granos, paja, cueros, frutas, etc. Su identificacin se basa en las caractersticas morfolgicas que fue catica hasta que Pitt (1980) normaliz las condiciones de cultivo y Frisvad (1981) consider la formacin de los metabolitos secundarios en la descripcin de las especies. La importancia de estos mohos en la alimentacin humana y animal se debe a que, adems causar deterioro, producen toxinas (Pitt y Leistner, 1991). Este gnero se caracteriza por formar conidios en una estructura ramificada semejante a un pincel que termina en clulas conidigenas llamadas filides. El gnero Penicillim se caracteriza por formar verticilios. Si hay slo un verticilo de filides el pincel es monoverticilado. Las ramificaciones de un pincel poliverticilado son ramas, rmulas, mtulas y filides. Los conidios generados en filides suelen llamarse fialoconidios para indicar su origen. En la filide, al dividirse el ncleo, se extiende simultneamente el extremo apical que luego se estrangula separando a la espora recin formada. Se llama conectivo a la porcin de pared que une entre s a los conidios permitiendo la formacin de cadenas, y en algunas especies se aprecia claramente con el microscopio ptico (Webster, 1986). Los filamentos o hifas alcanzan un dimetro entre dos o tres micrmetros y tienen septos con un poro central que no es visible al microscopio ptico. Las paredes del estpite, las ramas o las mtulas pueden ser lisas, rugosas o equinuladas. La pared de las filides es siempre lisa. Las filides pueden tener forma de nfora o bien ser casi cilndricas con la porcin apical en forma de cono. El tamao mximo de las filides es de 15 mm y la parte terminal no supera los 3 mm de largo. Los conidios son esfricos o elipsoidales, unicelulares, hialinos que en masa se ven de color verde, verde azulado, verde aceituna o gris. La pared de los conidios es lisa o rugosa segn las especies (Webster, 1986).

Las cepas de Penicillium con reproduccin sexuada corresponden a los gneros teleomrficos Eupenicillium que forma cleistotecios con pseudoparnquima constitudo por clulas de pared engrosada, y

Talaromyces que presenta los ascos rodeados de hifas entrelazadas formando la delgada pared del gimnotecio (Pitt y Hocking, 1997). Eupenicillium y Talaromyces tienen adems otros anamorfos en los gneros Torulomyces el primero y Geosmithia, Merimbla y Paecilomyces el segundo (Pitt et al. 2000). 6.2.9. Phomopsis

Clasificacin Cientfica Reino Divisin Clase Subclase Orden Familia Gnero Aspectos generales Este gnero posee micelio inmerso, ramificado, septado, hialinos o de color marrn plido. Presenta picnidio conidiomata sumergido o semisumergido. Algunas veces presenta erupciones uniloculares de color marrn, globoso, disperso o agregado. Ocasionalmente confluente con paredes delgadas. Textura angular, plida a marrn medio. Apertura simple o compleja del picnidio, centrada, sin papilas. Los Conidiforos estn slo presentes en dos especies de este gnero, los cuales pueden ser filiformes, septados, ramificados irregularmente, ramificada o con ramificaciones cortas. Las clulas conidigenas son enteroblsticas, con filides integradas o Fungi Ascomycota Sordariomycetes Sordariomycetidae Diaporthales Diaporthaceae Phomopsis

disgregadas

con

cuellos

cilndricos

(doliiformes)

semicilndricos

(ampuliformes), stos son lisos de rpida apertura. La pared celular es marcadamente engrosada. Los conidios son hialinos, aseptados o pueden presentar un septo, las paredes delgadas a menudo presentan gtulas, elipsoidales, cilndricas, fusiformes, periformes o globosas (Sutton, 1980). Estos hongos tienen la caracterstica de formar -conidios, ovoidales, piriformes, o limoniformes, capaces de producir las primeras hifas de la colonia, hifas frtiles. Y producen tambin -conidios, filiformes, o en forma de bastones, capaces de producir hifas, usualmente son las hifas presentes en la reproduccin asexual.

7. Identificacin molecular de hongos 7.1. Extraccin de ADN La extraccin de ADN se realiza siguiendo ciertos protocolos de extraccin, normalmente se usa el que de mejores resultados a menor costo. Se toma una pequea porcin de micelio, evitando en lo posible de arrastrar medio de cultivo, y se coloca en un tubo de ensayo de 1,5 ml, con 1000 l de Buffer de lisis, se macera y se lleva a la nevera a -80 C. Al da siguiente se sacan las muestras de -80 C y se someten a un choque trmico, llevando las muestras al Thermomixer a 55C por un periodo de 5 min. Una vez que se sometan al choque trmico se centrifugan y se comienza a aplicar el Protocolo de Extraccin deseado. Una vez realizado el protocolo de extraccin, se procede a evaluar la calidad del ADN, haciendo la lectura del mismo en un gel de agarosa al 1%, y llevndola al escner para ser visualizado. Es importante que el protocolo

de extraccin se realice adecuadamente, porque de lo contrario, cuando se realice la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) no amplificar el ADN. 7.2. Polymerase Chain Reaction (PCR) La reaccin en cadena de la polimerasa, conocida como PCR por sus siglas en ingls (Polymerase Chain Reaction), es una tcnica de biologa molecular desarrollada en 1986 por Kary Mullis, cuyo objetivo es obtener un gran nmero de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un mnimo; en teora basta partir de una nica copia de ese fragmento original, o molde (Watson et al., 2004). Esta tcnica sirve para amplificar un fragmento de ADN; su utilidad es que tras la amplificacin, resulta mucho ms fcil identificar con una muy alta probabilidad virus, hongos o bacterias causantes de una enfermedad, identificar personas (Cadveres) o hacer investigacin cientfica sobre el ADN amplificado. Estos usos derivados de la amplificacin han hecho que se convierta en una tcnica muy extendida, con el consiguiente abaratamiento del equipo necesario para llevarla a cabo (Watson et al., 2004). Esta tcnica se fundamenta en la propiedad natural de las ADN polimerasas para replicar hebras de ADN, para lo cual emplea ciclos de altas y bajas temperaturas alternadas para separar las hebras de ADN recin formadas entre s tras cada fase de replicacin y, a continuacin, dejar que vuelvan a unirse a polimerasas para que vuelvan a duplicarlas (Watson et al., 2004). Por lo general, la PCR es una tcnica comn y normalmente indispensable en laboratorios de investigacin mdica y biolgica para una gran variedad de aplicaciones. Entre ellas se incluyen la clonacin de ADN para la secuenciacin, la filogenia basada en ADN, el anlisis funcional de genes, el diagnstico de trastornos hereditarios, la identificacin de huellas

genticas (usada en tcnicas forenses y pruebas de paternidad) y la deteccin y diagnstico de enfermedades infecciosas (Watson et al., 2004). Hoy, todo el proceso de la PCR est automatizado mediante un aparato llamado termociclador, que permite calentar y enfriar los tubos de reaccin para controlar la temperatura necesaria para cada etapa de la reaccin. Muchos termocicladores modernos hacen uso del efecto Peltier, que permite tanto calentar como enfriar los tubos simplemente invirtiendo la corriente elctrica. Los tubos usados para PCR tienen una pared muy fina, lo que favorece una buena conductividad trmica, permitiendo que se alcance rpidamente el equilibrio trmico. Casi todos los termocicladores tienen un sistema que calienta la tapa de cierre con el fin de evitar la condensacin sobre los tubos de reaccin. Los termocicladores ms antiguos que carecan de este sistema, solucionaban el problema de la condensacin con una capa de aceite en la parte superior de la mezcla de reaccin o con un poco de cera dentro de los tubos (Mullis, 1990). 7.2.1. Ciclo de amplificacin El proceso de PCR por lo general consiste en una serie de 20 a 35 cambios repetidos de temperatura llamados ciclos; cada ciclo suele consistir en 2-3 pasos a diferentes temperaturas. La PCR comn se realiza con ciclos que tienen tres pasos de temperatura. Los pasos de ciclos a menudo estn precedidos por un choque trmico (llamado "hold") a alta temperatura (> 90 C), y seguido por otro hold al final del proceso para la extensin de producto final o el breve almacenaje. Las temperaturas usadas y el tiempo aplicado en cada ciclo dependen de gran variedad de parmetros. stos incluyen la enzima usada para la sntesis de ADN, la concentracin de iones divalentes y dNTPs en la reaccin, y la temperatura de unin de los cebadores, as como la longitud del ADN que se desea amplificar (Mullis, 1990).

Iniciacin Este paso consiste en llevar la reaccin hasta una temperatura de 94-96 C ( 98 C si se est usando una polimerasa termoestable extrema), que se mantiene durante 1-9 minutos. Esto slo es necesario para ADN polimerasas que requieran activacin por calor (Mullis, 1990).

Desnaturalizacin En primer lugar, se desnaturaliza el ADN (se separan las dos hebras de las cuales est constituido). Este paso puede realizarse de diferentes modos, siendo el calentamiento (94 C- 95 C) de la muestra la forma ms habitual. La temperatura a la cual se decide realizar la desnaturalizacin depende, por ejemplo, de la proporcin de Guanina+Citosina que tenga la hebra, como tambin del largo de la misma. Otros mtodos, raramente empleados en la tcnica de la PCR, seran la adicin de sales o agentes qumicos capaces de realizar la desnaturalizacin (Mullis, 1990).

Alineamiento/Unin del cebador A continuacin se producir la hibridacin del cebador, es decir, el cebador se unir a su secuencia complementaria en el ADN molde. Para ello es necesario bajar la temperatura a 50-65 C durante 20-40 segundos (segn el caso), permitiendo as el alineamiento. Los puentes de hidrgeno estables entre las cadenas de ADN (unin ADN-ADN) slo se forman cuando la secuencia del cebador es muy similar a la secuencia del ADN molde. La polimerasa une el hbrido de la cadena molde y el cebador, y empieza a

sintetizar ADN. Los cebadores actuarn como lmites de la regin de la molcula que va a ser amplificada (Mullis, 1990).

Extensin/Elongacin de la cadena Acta la ADN polimerasa, tomando el ADN molde para sintetizar la cadena complementaria y partiendo del cebador como soporte inicial necesario para la sntesis de nuevo ADN. La polimerasa sintetiza una nueva hebra de ADN complementaria a la hebra molde aadiendo los dNTP's complementarios en direccin 5' 3', uniendo el grupo 5'- fosfato de los dNTPs con el grupo 3'- hidroxilo del final de la hebra de ADN creciente (la cual se extiende). La temperatura para este paso depende de la ADN polimerasa que usemos. Para la Taq polimerasa, la temperatura de mxima actividad est en 75 C-80 C (comnmente 72 C). El tiempo de extensin depende tanto de la ADN polimerasa usada como de la longitud del fragmento de ADN que se va a amplificar. Hay una regla comnmente usada: en su temperatura ptima, la polimerasa de ADN polimerizar mil bases en un minuto (Mullis, 1990).

Elongacin final Etapa nica que se lleva a cabo a una temperatura de 70 C-74 C durante 5-15 minutos tras el ltimo ciclo de PCR. Con ella se asegura que cualquier ADN de cadena simple restante sea totalmente ampliado (Mullis, 1990). Conservacin Este paso se lleva a cabo a 4 C-15 C durante un tiempo indefinido para conservar la reaccin a corto plazo. La PCR normalmente se realiza con

un volumen de reaccin de 15-100 L, en pequeos tubos de 0.2-0.5 ml que se colocan en el termociclador (Mullis, 1990). Para verificar que la PCR ha generado el fragmento de ADN previsto, se emplean tcnicas de electroforesis, que separan los fragmentos de ADN generados de acuerdo a su carga, esto es, longitud, y, en menor medida y dependiendo de la matriz empleada, a su tamao: tpicamente se emplean la electroforesis en gel de agarosa, para fragmentos grandes; en acrilamida, para los ms pequeos; y, de forma ms rpida y aplicable a la PCR asociada a marcaje fluorescente, la electroforesis capilar. El/los tamao/s de los productos de la PCR vienen determinados por un marcador de peso molecular de ADN, el cual contiene fragmentos de ADN de tamao conocido, y que se corre en el gel junto con los productos de PCR (Mullis, 1990).

CAPTULO III. ACTIVIDADES REALIZADAS

1. Descripcin de las actividades realizadas por semana. Semana 1 Se realiz el reconocimiento de los departamentos o laboratorios que pertenecen al rea de Agricultura y Soberana Alimentaria, instruccin sobre el trabajo en laboratorio, en el que especficamente la instruccin fue dada para los laboratorios de Biologa Molecular y Fitopatologa Molecular. El laboratorio de Fitopatologa cuenta con equipos como Nevera de 4 C, Autoclave manual, centrifugadora eppendorft, campanas de flujo laminar, estufas digitales, agitadores mecnicos, agitadores con reguladores de temperaturas, baos de Mara, materiales de vidrio y plsticos necesarios en los laboratorios y reactivos qumicos. Para lo cual, se recibi instruccin de bioseguridad necesaria para evitar accidentes en el laboratorio, as como tambin hacer uso adecuado y eficiente de reactivos, materiales y equipos. El laboratorio de Biologa Molecular cuenta con equipos como Nevera de -80 C, dos computadoras, de las cuales una de ellas tiene acoplada un scanner Typhon 9410, que sirve para hacer la lectura de los geles de agarosa y poliacrilamida con ADN, cmaras de electroforesis, agitadores magnticos trmicos, pHmetro, balanza digital, estufa, autoclave digital, microondas, materiales de vidrio y plsticos necesarios y reactivos qumicos, para lo cual se recibi instruccin de uso para cada uno de stos. En ste laboratorio existen dos laboratorios dependientes, uno para PCR que cuenta con cuatro cmaras de flujo laminar, dos neveras de -20 C, cuatro termocicladores, una estufa, dos agitadores elctricos, y el banco de materiales empleados como tubos de ensayo de 1,5 y 2 ml, y puntas para

pipetas de diversos volmenes. Y el laboratorio de Extraccin de ADN, que cuenta con tres neveras dos de -20 C y una de 4C, una campana de flujo de gases, dos baos de Mara, dos centrifugadoras, un speed vag, tres thermomixers, y un rea para trabajar con poliacrilamida, y una bombona de nitrgeno de 200 L. Para la utilizacin de estos equipos en estos laboratorios tambin se recibi instruccin de uso, siguiendo las normas de bioseguridad. Durante esta primera semana se hizo extraccin de ADN de hongos fitopatgenos siguiendo el protocolo de extraccin Rapid DNA Extraction Freeze/ Thaw, lo cual se aplico para 54 aislados. Se actualiz la base de datos, donde estn contenidas las muestras ingresadas procedentes de los Estados Mrida y Zulia, los cual forma parte de la organizacin del cepario que se encuentra en el Laboratorio de Fitopatologa Molecular; tambin se realiz un inventario de las cepas, verificando los cdigos y si contienen Castellani o no, para mantener actualizada la base de datos. Se prepararon geles de agarosa al 1% (4g. Agarose/500 ml de agua destilada), para poder colocar a correr el ADN en la cmara de electroforesis por unos 40 min. Y as llevarlo al scanner Typhon 9410 para verificar la existencia u calidad del ADN extrado. Se llenaron tubos de 2 ml, de plstico, con una solucin salina (NaCl) al 0,9%, con el fin de poder realizar la tcnica de conservacin de hongos Castellani. Cada cepa tendr Castellani por triplicado para evitar en la mayor posibilidad que se pierda la cepa por contaminacin, muerte de la cepa u otro factor.

Semana 2 Una vez obtenido el gel de calidad de ADN, que se extrajo la semana 1, se procede a realizar una PCR (Polimerase Chain Reactions), Se le hicieron PCR a las muestras que mejor calidad reflejaran en el gel de calidad. De estas muestras, slo 20 fueron las que se le realiz el protocolo de PCR, una vez que se amplificara la reaccin, se procedi a hacer la purificacin de productos de PCR, para luego enviar a secuenciar. Las actividades de biologa molecular se realizaron mientras los tutores institucionales nos asignaban las tareas. Una vez asignada la tarea del laboratorio de Fitopatologa, se inici un inventario de las cepas de hongos endfitos que existen en el laboratorio, con el fin de comenzar a cumplir con el objetivo planteado, de caracterizar morfolgicamente a los hongos endfitos precedentes de plantas de cacao. Se buscaron las cepas que haban sido aisladas de hojas y frutos de plantas de cacao procedentes del Estado Miranda, lo cual un gran nmero de ellas se encontraba en Castellani, por lo que slo haca falta de activar las cepas (Se describe en la metodologas aplicadas), y algunas de ellas ya se encontraban sembradas en placas con papa dextrose agar (PDA) y agar malta (AM), para lo cual solo hizo falta repicarlas (Se describe en las metodologas aplicadas).

Semana 3 Se activaron las cepas que se encontraban en Castellani y se repicaron las que estaban sembradas en las placas con los medios de cultivos, en la campana de flujo laminar, bajo las condiciones de asepsia necesarias para evitar cualquier tipo de contaminacin en la colonia de hongos que crecer.

Todas estas cepas se activaron en placas de plstico con medio de cultivo AM al 2%, y se espero a que crecieran las colonias por una semana aproximadamente.

Semana 4 Se analiz el crecimiento de las colonias que se activaron en AM al 2%, verificando para cada caso, si la colonia de hongos original creci homogneamente o si existe algn agente externo a la colonia original, de ser as, se apartan para nuevamente hacer un repique hasta conseguir una colonia de hongos pura. Una vez que la colonia se encuentra pura, se procede a hacer repiques por triplicado de esas cepas, para comenzar con la caracterizacin macromorfolgica y micromorfolgica de las cepas que se repicaron, (Se describe con ms detalle en las metodologas aplicadas).

Semana 5 Se hizo el repique triplicado en medio de cultivo PDA, de slo 30 cepas de colonias que estuviesen puras, lo que representa el primer lote. A cada cepa se le evaluaron 12 caracteres para la evaluacin de la macromorfologa (Detallados en las metodologas aplicadas), por una semana, haciendo la medicin del crecimiento de la colonia diario. El ltimo da de esta semana, se tomaron las anotaciones finales para este primer grupo, lo cual son datos principales para la elaboracin de una base de datos que contengan todas estas caractersticas y que pueda servir de biblioteca para consultas posteriores del personal de IDEA. Las placas con las cepas se guardaron esperando a que formaran cuerpos fructferos para as realizar la caracterizacin micromorfolgica.

Semana 6 Se hizo el repique por triplicado de las cepas que conformaron el segundo lote, que consta de 33 cepas. Los cuales se estudiaron 12 caracteres para la evaluacin de la macromorfologa (Detallados en las metodologas aplicadas), durante toda la semana. Al ltimo da de esta semana se realizaron las anotaciones finales para este grupo, y se procede a actualizar la base de datos con este nuevo ingreso. Las cepas, se guardan para realizar posteriormente la

caracterizacin micromorfolgica.

Semana 7 Se realizaron los ltimos repiques de las cepas por triplicado, en medio de cultivo PDA, que consta de 41 aislados. Para los cuales se estudiaron 12 caracteres para la evaluacin macromorfolgica (Detallados en metodologas aplicadas), durante toda la semana. Una vez obtenida la informacin final, se actualiz la base de datos, y se guardaron las placas para hacer la evaluacin micromorfolgica de los hongos.

Semana 8 Durante esta semana se realizaron Castellanis de todos esos aislados que se evaluaron durante esas tres semanas, y para esto slo se escogieron los representantes de cada uno ms puros, con el fin de almacenar y conservar las cepas sin ningn tipo de contaminacin. Se realiz tambin, la evaluacin micromorfolgica de los aislados que ya tenan formados los conidios, los conidiforos, picnidios, peritecios, entre

otros cuerpos, con el fin de realizar la identificacin de gneros de stos hongos endfitos. Durante la evaluacin, se pudo notar que muchos de los aislados, no presentaron estructuras de reproduccin, por lo que se realizaron otras metodologas como microcultivos, y la utilizacin de otros medios de cultivos, los cuales han sido detallados en las metodologas aplicadas de este informe.

Semana 9 Una vez realizadas todas las caracterizaciones, se hicieron grupos por morfotipos semejantes, creando un total de 24 grupos con macromorfologas distintas entre estos, y representando cada grupo un gnero de hongos. Durante esta semana, se prepararon los medios de cultivo Czapeck (Dox), Alfacel y Acculas de Pino en Agar agua (Descritas en las metodologas aplicadas), la preparacin de estos medios requieren de diversos materiales que se tuvieron que buscar en otras reas del instituto, por lo que perdimos mucho tiempo en la preparacin. Una vez preparados los medios, se hicieron los repiques de representantes de los grupos con mayor pureza, y se dejaron crecer por un periodo de tres semanas aproximadamente.

Semana 10 Se realizaron extracciones de ADN, mientras crecan las cepas en los medios de cultivos, de todos los aislados que se trabajaron. Luego se tomaron siete muestras de siete grupos que se haban descritos micromorfolgicamente, para realizarles PCR.

Semana 11 Se realiz PCR para siete aislados, pertenecientes a siete grupos morfolgicos diferentes, con el fin de comprobar los resultados obtenidos con la caracterizacin macro y micromorfolgica. Se realiz una repeticin de PCR para estos individuos, ya que no se obtuvo ninguna amplificacin de la cadena de la polimerasa. Luego de la repeticin, se hicieron pruebas de PCR con dosis diferentes, para determinar la causa de los resultados negativos que se estaban obteniendo. Lamentablemente, no se pudo determinar la causa de estos resultados, por lo que esas pruebas, quedaron a disposicin del personal del IDEA, quienes realizaran estas pruebas posteriormente y podrn comparar los resultados moleculares con los resultados morfolgicos.

2. Metodologas aplicadas

2.1. poca y lugar de muestreo La poca de muestreo fue dada en diferentes temporadas, quedando las muestras para el experimento esterilizadas y conservadas en la nevera a 20 C. Otras de las muestras slo fueron activadas ya que se encontraban bajo la tcnica de conservacin llamada Castellani, en la que slo hizo falta sembrarlas en Agar malta al 2% (AM; 0.67 g AM, 15 g de agar agar, por cada L de agua destilada) Para su posterior anlisis en el medio de cultivo papa dextrosa agar (PDA) (39 g de PDA/L agua destilada). Una vez activados los aislados, se repicaron en placas de Petri de plstico (8,7 cm de D aproximadamente), con PDA y as analizar los caracteres macro y micromorfolgicos de las colonias.

Los aislados fueron tomados de plantas de cacao, provenientes del banco de germoplasma de la estacin experimental Padrn, ubicado en la localidad de Tapipa del municipio Acevedo del Estado Miranda, y slo un pequeo grupo de estos aislados son de la localidad de Cao Grulla del municipio Autana del Estado Amazonas.

2.2. Coleccin de las muestras Las muestras se tomaron de plantas de cacao (Theobroma cacao L.), de las variedades Curiara, Torno y Santa Cruz 10, tomando para cada variedad 4 plantas y 3-4 hojas por cada planta de cada variedad, teniendo un aproximado de 36 a 48 hojas, y se tomaron 3 frutos de cada planta de cacao proveniente de Amazonas, teniendo un aproximado de 40 frutos. Se tomaron hojas y frutos sanos, que no presentaran ningn tipo de sintomatologa (Manchas foliares, lesiones, manchas clorticas o necrticas), con el fin de determinar que efectivamente se tratara de hongos endfitos y no de patgenos, al momento de hacer los aislados.

2.3. Procesamiento de las muestras Tanto las hojas como los frutos, fueron desinfectados superficialmente con una solucin acuosa con hipoclorito de sodio al 2.5 % v/v, luego fueron retenidas por 1 min aproximadamente en etanol al 70% v/v, para luego ser enjuagadas en agua destilada (1 min cada uno), con el propsito de eliminar todo tipo de organismo epfitos asociados al tejido vegetal.

Luego de la operacin de esterilizacin, se procedi a dejar secar en la cmara de flujo laminar, para luego escoger las partes de los rganos que se van a sembrar en PDA. Las hojas fueron seccionadas con un bistur esterilizado previamente, tomando el nervio de las hojas, el limbo, chupn- nervio y chupn-limbo. Para el fruto simplemente se tomaron del endocarpo, mesocarpo y exocarpo, tanto del lado derecho, como del lado izquierdo, con el fin de tomar una muestra para llevarla a la placa de petri con PDA.

2.4. Clasificacin de las muestras segn su origen Los aislados se tomaron de partes areas (Hojas y frutos) de las plantas de cacao de las variedades Curiara, Santa Cruz 10 y Torno. De las hojas se tomaron, las zonas del nervio y el limbo, adems de tomar a los chupones las mismas zonas. Del fruto se tomaron muestras del endocarpo, mesocarpo y exocarpo. Todas estas muestras fueron identificadas con la letra E seguido de un nmero, para facilitar el trabajo. En el cuadro 2, se muestran todos los aislados con sus cdigos, y lugar de origen.

2.5. Purificacin y conservacin de los aislados Al finalizar el inventario del cepario, se realiz la activacin de los aislados en AM, con el fin de determinar la pureza de las colonias que en ella crecieran. Se mantuvieron bajo condiciones de asepsia y se incubaron a temperatura ambiente del laboratorio (24 C aproximadamente) en oscuridad. Despus del crecimiento de las colonias, se evaluaron que las placas tuvieran una morfologa fngica homognea, lo cual es indicativo de que la

colonia no posee ningn otro hongo acompandolo ni ningn otro microorganismo como bacterias o caros. Una vez determinada la pureza de la colonia, se repicaron por triplicado en placas con PDA, para que la colonia expresara la mayor cantidad de caracteres morfolgicos posibles, como color de la colonia, crecimiento, estructuras entre otras caractersticas, y as poder realizar la identificacin macromorfolgica y micromorfolgica.

2.6. Caracterizacin macromorfolgica La totalidad de los aislados fue de 104, la caracterizacin se realiz de la siguiente forma: Una vez desarrolladas las colonias, se tomaron discos de 5 mm de dimetro en AM 2%, y se realizaron repiques de cada cepa en PDA (por triplicado), para evaluar tanto las caractersticas macromorfolgicas como micromorfolgicas. Se mantuvieron a temperatura ambiente del laboratorio 24 C, durante 6 das, en cajas de Petri (8,7 cm D), durante 6 das, en la que la mayora de las colonias ya haban alcanzado el borde la placa. La caracterizacin macromorfologica de la colonia, se realizo, cuando la colonia expreso su potencial, antes de llegar al borde de la placa, porque de lo contrario, se dificultara determinar ciertos caracteres

macromorfolgicos como lo es el margen de la colonia, o si el micelio es superficial o inmerso en el medio. Se hizo una caracterizacin por lotes, conteniendo el primero 30 aislados, el segundo lote con 33 aislados y el tercero 41 aislados; teniendo una diferencia de una semana por cada lote, haciendo una caracterizacin exhaustiva diariamente, basndonos en parmetros morfolgicos (Anexo
cuadro 3).

Para todos los casos, se evaluaron las caractersticas de las colonias slo en medio de cultivo PDA.

2.7. El diseo experimental Fue completamente aleatorizado donde cada aislamiento, constituy un tratamiento con tres rplicas (placas identificadas como P1, P2 y P3). Las caractersticas de a-j se determinaron en la observacin del anverso y reverso de las placas antes de que el crecimiento de la colonia llegue al borde de esta, mientras que el k se determin por 6 das, tomando la medida del dimetro de la colonia con una regla graduada, cada 24 h. Este dimetro se realiz trazando en el reverso de las placas una lnea que pase por el centro del disco sembrado, una vez que la colonia lleg al borde de la placa se promedi el dimetro por da. Luego de hacer caracterizacin macromorfolgica de los aislados, se hicieron grupos por igualdad de caractersticas (Anexo Figura 7).

2.8. Tcnicas de conservacin de los hongos La tcnica empleada para conservar las cepas que se trabajaron en los lotes es la tcnica de Castellani, que consiste en dividir un cuarto de la colonia, y a su vez este cuarto de colonia se subdivide en pequeos cuadritos para luego sumergirlos en solucin salina de NaCl al 0,9 %, y mantenerlos en tubos de ensayo de 2 ml. Una vez sumergidos los cuadritos de la colonia en los tubos de ensayo, se sellan y almacenan en un lugar seguro.

2.9. Caracterizacin micromorfolgica

Se escogieron aislados de distintos grupos morfolgicos caracterizados anteriormente para su identificacin a nivel de gnero y/o especies segn autores. Se tomarn en cuenta solo un pequeo grupo de hongos endfitos que posean caractersticas macromorfolgicas diferentes para hacer la identificacin. De stos, se tomar el representante ms resaltante dentro de cada grupo para evaluar las estructuras de reproduccin o soporte que la cepa haya producido. Para esta prueba se emplearon diversos medios de cultivos, para evaluar el comportamiento de la cepa en diferentes medios, adems de estimular la esporulacin de aquellos aislados que en un tiempo de 3 semanas no lo hayan realizado. Estos medios empleados son los siguientes: - celulosa (Alfacel; -celulosa 20g. (Papel de filtro esterilizado), MgSO4 7H2O 1g., KH2PO4 1.5 g., NaNO3 1 g., leche de coco 50 ml, agar agar 15 g por cada 1000 ml de agua destilada), Czapeck (Dox) (sacarosa 30 g., MgSO4 0.5 g., KH2PO4 1 g., NaNO3 2g., KCl 0.5 g., FeSO4 0.01 g., Agar 20 g. por cada 1000 ml de agua destilada), y Acculas de pino en Agar agua (Agar agar 15g. por cada 1000 ml de agua destilada, y acculas de pino) (Anexo Figura 8). En cada una de estas, solo se dejaron crecer con el fin de poder visualizar sus estructuras en el microscopio. Una vez realizada la caracterizacin macromorfolgica, se tom una pequea muestra de la colonia de aquellos aislados que expresaron sus estructuras de reproduccin como esporas, picnidios, ascocarpos, conidiforos, clulas conidigenas, entre otros, y que en algunos casos expresaron estructuras especializadas como apresorios. Para sta caracterizacin, se hicieron montajes en diversos medios de montajes, como lactofucsina, glicerina, azul de tripn, gelatina de glicerina, goma arbiga, lactofenol y agua glicerina. Esto con el fin de evaluar, con cul

de estos, se tiene una mejor visualizacin de las estructuras una vez llevadas al microscopio. Se empleo una modificacin de la tcnica Ridell, para evaluar el microcultivo con slo cuatro aislados y as obtener ciertas estructuras de reproduccin y de soporte, los cuales fueron los aislados E5, E10, E39 y E146. sta tcnica consiste en tomar de una placa con medio de cultivo un cuadrito de ese medio y colocarlo encima del medio de cultivo y sobre ste se coloca un cubre objeto, luego alrededor de stos se hace la siembra del hongo (Anexo Figura 9).

2.10. Extraccin de ADN Luego de realizar la tcnica de Castellani, a los aislados que cubrieran con las caractersticas idneas, se tom una parte del tejido micelial y se coloca en un tubo de ensayo de 1,5 ml que contiene Buffer de lisis, una vez colocado el tejido dentro del tubo, se procede a macerar y as obtener una solucin homognea. Luego de esto, se mantienen a 80 C, por un da para realizar el protocolo de extraccin. Se les hizo la extraccin de ADN a 96 muestras, siguiendo el protocolo de extraccin Rapid DNA Extraction Freeze/ Thaw, que consiste en lo siguiente: 1. Una vez sometida la muestra al choque trmico se colocan a centrifugar por 15 min. 2. Luego transferir 700 L del ADN a un nuevo tubo eppendorft de 1,5 ml. 3. Agregar 490 L de PEG/NaCl y dejar reposar a temperatura del laboratorio por 1 h.

4. Luego colocar a centrifugar por 15 min. Luego sacar las muestras de la centrifuga y vaciar el tubo. 5. Agregar 400 L de Tris 8.0 (10mM) a cada cepa, 8 L de NaCl 0,1 M y 800 L de etanol al 95 %, luego dejar reposar a temperatura del laboratorio por 1h. 6. Centrifugar por 5 min. vaciar el tubo completamente. 7. Llevar las muestras al speedvac por 15 min. Hasta dejar los tubos totalmente secos. 8. Agregar a cada muestra 60 L de Buffer TE (10mM) pH 8 y dejar reposar a temperatura de laboratorio por 20 min. Y luego almacenar a 4 C. 9. Utilizar 2 L de cada muestra con Buffer de carga, para hacer la lectura en el scanner.

Una vez aplicado el protocolo que se emplea en el laboratorio, las muestras se conservan a 4 C, para luego comenzar a realizar la PCR y posteriormente la purificacin para luego llevarlas a secuenciar.

2.11. PCR (Reaccin en cadena de la polimerasa) Este se aplica mediante un protocolo de amplificacin que en el laboratorio se lleva a cabo empleando una MIX con un volumen total de 25 L, la cual contiene unos primers que son los que van a realizar la secuenciacin, entre estos primers se tienen: ADN, H2O, Buffer de PCR 5X, MgCl 25mM, dNTPS 10 mM, Taq Polimerasa, ITS1 uM, ITS 4 uM, lo cual permite realizar la amplificacin de manera ms sencilla, claro est que este no garantiza la amplificacin de las muestras.

Los materiales a utilizar en esta prctica son fundamentalmente, tubos de ensayo de 0.5 ml con tapas, reactivos antes mencionados, pipetas graduadas de 1000 L, 200 L, 20 L y 2.5 L. Todos estos materiales, deben ser manipulados con guantes quirrgicos y bata. Los primeros se pueden usar en diversas concentraciones de acuerdo a los intereses del operador. Durante la realizacin de la MIX, es importante tomar en cuenta ciertos detalles que son de vital importancia para que la amplificacin se lleve a cabo, entre ellas se tienen: 1. Al total de muestras se le agregan dos ms, con el fin de evitar errores de volmenes por mal pipeteo. 2. La aplicacin de la Taq polimerasa se debe hacer una vez que los dems primers estn en la MIX, ya que sta se inactiva con la luz. 3. Una vez que la MIX est preparada, se debe hacer la aplicacin de sta sobre el ADN puro o diluido, dependiendo del caso, sin tardar, ya que el efecto de la Taq polimerasa podra ser inhibido.

Luego de realizar la aplicacin de la MIX, se colocan las muestras en el termociclador para que realice todos los procesos de amplificacin de PCR (desnaturalizacin, alineacin, elongacin y conservacin), lo cual se programa para que cumpla con 40 ciclos a diversas temperaturas, comenzando con la desnaturalizacin a 94 C, la alineacin se alterna con temperaturas que van desde 94 C y 58 C, luego la elongacin se realiza a 72 C y por ltimo la conservacin que se realiza a 4 C. Claro est que depende de lo que se requiera, estas temperaturas son modificables. Todo el proceso en el termiciclador puede tardar de 1 H a 3 horas dependiendo de la graduacin del tiempo con la que se programe el termociclador.

Luego de haber obtenido el producto de PCR, se lee en un gel de agarosa al 1%, para evaluar la amplificacin, aquellas muestras que se reflejan una banda de color oscuro, puede ir al siguiente paso que es la purificacin de ese producto, que ser objeto de estudio para otro proyecto.

CAPITULO IV RESULTADOS Y DISCUSIONES

1. Caracterizacin Macromorfolgica

Luego de realizar por tres semanas la evaluacin de las cepas, se hicieron agrupaciones por caracteres de morfologa semejantes ( Anexo,
Figura 10), los cuales fueron aislados en medio de cultivo artificial PDA,

formando un total de 17 grupos (Anexo Figura 11), describindose del siguiente modo:

Grupo 1 Presenta un color blanco de colonia en el anverso, mientras que en el reverso se torno de un color beige, que a medida que la colonia va madurando se oscurece. Posee una superficie de la colonia cncava opaca, de forma regular circular, con un margen entero, con micelio elevado, superficial e inmerso en el medio, de textura predominantemente algodonosa, sin tincin en el medio, ni produccin de exudados mientras la colonia est en etapa juvenil, presencia de anillos en algunos casos, los cuales son de color verde oliva, y dichos anillos son enteros, es decir, que son aros completos (Anexo, Figura12). El crecimiento de la colonia es medio, de forma lineal (Anexo, Grfica 1). El algunos casos hubo presencia de masas conidiales de color naranja. De acuerdo a las caractersticas mencionadas, los autores ubican stas caractersticas como la de hongos del gnero Colletotrichum el anamorfo de Glomerella (Sutton, 1980).

Grupo 2. Presenta un color verde oliva en el anverso de la colonia, mientras que en el reverso se torno de una tonalidad ms oscura, que conserva su color durante todo su ciclo de vida, posee una superficie un poco cncava de aspecto opaco, de forma circular, con un margen entero, de micelio poco elevado, con hifas superficiales e inmersas en el medio de cultivo, de textura pulverilenta, sin tincin en el medio y sin producir ni exudados ni anillos en la colonia (Anexo, Figura 13). El crecimiento de la colonia lineal y lento (Anexo,
Grfica 2). De acuerdo a stas caractersticas, los autores la pueden clasificar

en diversos gneros como Penicillium, Cladosporium, entre otros. (Ellis, 1971).

Grupo 3. Presenta una colonia de color verde plido, con un centro verde oliva en el anverso, mientras que el reverso se observa de color verde oliva oscuro, que va oscureciendo a medida que la colonia va madurando. Su superficie es cncavo de aspecto opaco, de forma regular circular, teniendo la colonia un margen entero, de micelio elevado, con hifas superficiales e inmersas que no tien el medio de cultivo, de textura lanosa, sin presentar exudado en gran parte del ciclo de vida del hongo, con presencia de anillos completos de color verde claro (Anexo, Figura 14), el crecimiento de la colonia es lineal medio acelerado (Anexo, Grfica 3). Segn los datos descritos, los autores identifican estas caractersticas en el gnero Curvularia (Ellis, 1971).

Grupo 4. La colonia presenta un color rosado intenso tanto en anverso como en reverso, que a medida que la colonia madura el color se intensifica, su superficie es casi plana de aspecto opaco, de forma regular circular, teniendo un margen de colonia entero, de micelio poco elevado superficial e inmerso en el medio de cultivo sin presentar tincin, de textura lanosa, y sin presencia de exudado en la colonia, algunos casos presentan anillos color amarillo plido a blancos (Anexo, Figura 15), su crecimiento es lineal y medio acelerado (Anexo, Grfica 4). De acuerdo a las caractersticas mencionadas, los autores clasifican a estos hongos con el gnero Fusarium (MycoBank, 2000).

Grupo 5. La colonia presenta una coloracin verde oliva en el anverso, y en el reverso un color verde oliva plido, que permanece igual durante todo el ciclo de vida del hongo. Tiene una superficie casi plana de aspecto opaco, de forma circular, el margen de la colonia es crenado, de micelio poco elevado. Las hifas son superficiales e inmersas en el medio de cultivo sin presentar tincin, su textura es pulverilenta y no hay presencia de exudados, presentan anillos concntricos de color verde claro (Anexo, Figura 16), el crecimiento de la colonia es lineal y muy lento (Anexo, Grfica 5). De acuerdo con stas caractersticas, Mycobank (2000), ubica a los hongos con estas caractersticas en el gnero Penicillium.

Grupo 6. Los hongos que pertenecen a este grupo presentan una coloracin blanco en el anverso, pero a medida que pasa el tiempo se torna de un color amarillo pardo, mientras que el reverso de la colonia present una coloracin amarillo medio, que a medida que la colonia va madurando se torna ms oscura, en algunos casos se torna ocre. Tiene una superficie un poco cncava de aspecto opaco, con forma regular circular, el margen de la colonia es ondeado, de micelio es elevado y presenta hifas superficiales e inmersas en el medio. Su textura es flocosa, presenta anillos completos poco visibles, no hay presencia de exudados ni hay tincin del medio de cultivo (Anexo, Figura 17), el crecimiento de la colonia es lineal y poco acelerado (Anexo, Grfica 6). Todas las caractersticas de estos hongos, los autores las ubican en el gnero Pestalotiopsis (Watanabe, 1994).

Grupo 7. Las colonias de estos hongos presentan un color gris olivceo tanto en el anverso como en el reverso, mientras que la colonia madura ese color se va oscureciendo hasta llegar a un color verde oscuro a negro, y en algunos casos, se torna negro - azulado en el reverso de la colonia. Tiene una superficie cncava de aspecto opaco; la colonia tiene forma regular circular, con un margen ondeado, el micelio es elevado y las hifas estn dispuestas superficial e inmersamente en el medio. Tienen una textura

predominantemente lanosa, aunque hay casos que se presenta flocosa, no presenta anillos ni exudado en la colonia, tampoco tie el medio al menos en etapa juvenil (Anexo, Figura 18), el crecimiento de la colonia es lineal acelerado (Anexo, Grfica 7).

Al comparar estos datos con la bibliografa, se puede decir que estas son caractersticas del gnero Lasiodiplodia (Alves et al., 2008). Grupo 8. Los hongos pertenecientes a este grupo presentan una coloracin de blanca a hialina tanto en el anverso como en el reverso de la colonia, tiene una superficie casi plana de aspecto opaco, de forma circular, con un margen entero. El micelio es poco elevado y la disposicin de las hifas est superficial e inmerso, tienen una textura lanosa, presenta anillos completos, formados por conidios o cuerpos fructferos de color negro, no presentan exudado ni tincin del medio del cultivo (Anexo, Figura 19), el crecimiento de la colonia es lineal medio acelerado (Anexo, Grfica 8). A ciencia cierta no se puede definir ningn gnero con estas caractersticas, sin embargo, algunos autores ha identificado a estas cepas como hongos del gnero Glomerella el teleomorfo de Colletotrichum (Sutton, 1980).

Grupo 9. Estos hongos presentaron una colonia de color verde oliva tanto en anverso como en reverso, oscurecindose a medida que la colonia madura, tiene una superficie cncava de aspecto opaco, con forma regular circular y un margen filamentoso. El micelio es elevado y las hifas estn dispuestas superficial e inmersas en el medio de cultivo. Tiene una textura lanosa, presenta anillos pocos visibles del mismo color de la colonia, no presenta exudado ni tie al medio de cultivo (Anexo, Figura 20), el crecimiento de la colonia es lineal medio acelerado (Anexo, Grfica 9).

Grupo 10. Las colonias de estos hongos presentan una coloracin de blancas a hialinas en el anverso y reverso durante la etapa juvenil, a medida que pasa el tiempo, las colonias se oscurecen y en muchos casos forman cuerpos carbonosos de color negro. La superficie de la colonia es opaca, con forma circular y margen ondeado. El micelio es elevado, y las hifas se disponen superficial e inmersamente en el medio de cultivo. Tienen una textura Lanosa, no presentan exudado en la colonia mientras la colonia es joven, presentan anillos formando zonas (Anillos zonados) de color ocre, el medio de cultivo mantiene su coloracin original mientras que la colonia es joven, una vez comienza a madurar, el medio se tie de color amarillo intenso a mostaza (Anexo, Figura 21), el crecimiento de la colonia es lineal, medio acelerado (Anexo, Grfica 10).

Grupo 11. Estos hongos presentan un color blanco de colonia tanto en anverso como en reverso, su superficie es opaca, la colonia tiene forma circular y un margen ondeado. El micelio es elevado, con disposicin de hifas superficial e inmersa en el medio de cultivo. Poseen una textura imbricada, y no presentan ni exudados ni tincin del medio de cultivo, anillos visibles formando zonas (Anillos zonados) (Anexo, Figura 22), el crecimiento de la colonia es lineal y medio acelerado (Anexo, Grfica 11).

Grupo 12. Estas colonias presentan una coloracin rosa viejo en el anverso, mientras que en el reverso, presentan un color verde oliva, sta coloracin se mantiene igual en todo el ciclo de vida del hongo. La superficie de la colonia

es opaca, con forma circular y de margen crenado. El micelio es poco elevado, y las hifas se disponen superficiales e inmersas en el medio de cultivo. La textura de la colonia es pulverulenta, no presenta exudado, no tien el medio, y presenta anillos completos de color blanco (Anexo, Figura
23), el crecimiento de la colonia es lineal y de lento crecimiento ( Anexo, Grfica 12).

Grupo 13. Los hongos que estn en este grupo, presentan una colonia de color beige claro en el anverso, mientras que el reverso es de una tonalidad ms oscura. La superficie de la colonia es opaca, de forma circular y con un margen ondeado. El micelio elevado y la disposicin de las hifas son superficiales e inmersos en el medio de cultivo. La textura de la colonia es lanosa, y no presenta anillos, ni exudado, tampoco la colonia tie el medio de cultivo (Anexo, Figura 24), el crecimiento de la colonia es lineal, medio acelerado (Anexo, Grfica 13).

Grupo 14. Este grupo est formado por hongos que poseen un micelio de color blanco a hialino en el anverso, mientras que en el reverso presentan una coloracin amarillo plido a blanco. Estos colores oscurecen a medida que la colonia va madurando. Posee una superficie opaca, de forma circular y de margen de colonia filamentosa, presentando elevacin del micelio, y dispone de hifas superficiales e inmersas en el medio de cultivo. La textura de la colonia es lanosa, no presenta ni anillos, ni exudado en la colonia, tampoco tie el medio (Anexo, Figura 25). El crecimiento de la colonia es lineal, de aceleracin media (Anexo, Grfica 14).

Grupo 15. La colonia de este grupo presenta, una coloracin de colonia verde oliva plido, tanto en anverso, como en reverso. La colonia posee una superficie opaca, de forma circular y un margen de colonia entero. Tiene una disposicin de micelio superficial e inmerso y presenta hifas areas elevadas. La textura de la colonia es algodonosa, y no hay presencia de anillos, exudados ni tincin del medio de cultivo (Anexo, Figura 26). El crecimiento de la colonia es lineal, con aceleracin de crecimiento muy lenta ( Anexo, Grfica
15).

Grupo 16. Estos hongos presentan una colonia de color blanco, con un centro un poco ms oscuro tornndose color crema en el anverso, y en el reverso, tiene una coloracin amarilla plida, que al cabo de tres semanas se oscurecer tornndose de un color pardo. La superficie de la colonia es de aspecto opaco, de forma circular y un margen de colonia filamentosa. Dispone de un micelio areo elevado e hifas superficiales e inmersas en el medio de cultivo. Tiene una textura lanosa, y no presentaron ni anillos ni exudados. El medio de cultivo se tie luego de tres semanas, cuando la colonia comienza a madurar (Anexo, Figura 27). El crecimiento de la colonia es lineal, con una aceleracin de crecimiento media (Anexo, Grfica 16).

Grupo 17. Los hongos de este grupo presentan, una coloracin blanca, con un centro color rosa, de la colonia en el anverso, y en el reverso, presentan una coloracin de colonia, de verde plido a amarillo ocre, que se mantiene hasta el final del ciclo de la colonia. Tiene una superficie de aspecto opaco, de

forma circular y un margen de colonia entero. Dispone de un micelio areo elevado y tiene hifas superficiales e inmersas en el medio de cultivo. La textura es algodonosa, y no posee anillos, exudados ni tincin en el medio de cultivo (Anexo, Figura 28). El crecimiento de la colonia es lineal, con una velocidad de crecimiento muy lento (Anexo, Grfica17). Cabe destacar que aunque a ciencia cierta estas caractersticas no son determinantes para clasificar a los hongos en algn gnero, el contraste con diversos autores permiten realizar una estimacin de algunos de ellos con estas caractersticas. Los grupos del 10 al 17, de acuerdo a los diversos autores presentan caractersticas de diversos gneros, es por esto que para poder clasificar a estos hongos es necesario realizar la caracterizacin macromorfolgica, y una vez realizada la evaluacin de las estructuras reproductivas, se pueden comparar con la literatura para ubicar a estos hongos en un grupo, quedando cada grupo, como representante de un gnero en especfico.

2. Caracterizacin Micromorfolgica. Una vez que se estudiaron las caractersticas morfolgicas macro, se procedi a realizar el estudio de las microestructuras, ya que son la clave fundamental para la clasificacin taxonmica de los hongos. Dentro de las microestructuras que se estudiaron para la clasificacin de los hongos se encuentran; picnidios, conidios, conidiforos, clulas conidigenas, parfisis, peritecios, apresorios, entre otros. Esta evaluacin se realiz tomando el representante ms resaltante de cada grupo, y as realizar los frotis en diversos medios de cultivo como Lactofenol, Lactofucsina, Azul de tripn en lactofenol, glicerina, goma

arbiga, gelatina de glicerina, y en algunos casos en agua destilada. Teniendo como resultado lo siguiente: Grupo 1. Este grupo de hongos se tom como representante al aislado E10, que presenta, apresorios irregulares (Anexo, Figura 29-A), conidios cilndricos de tamao 11 x 4 m (Anexo, Figura 29-B), clulas conidigenas (Anexo, Figura
29-C); que al ser contrastadas con la literatura, permite clasificar a este grupo

de hongos en el gnero Colletotrichum (Sutton, 1983). El mejor medio de montaje para la observacin de estas estructuras es Lactofucsina, ya que tie las estructuras hialinas y no las colapsa. Grupo 2. El representante de este grupo, el cual fue el aislado E131, presenta un ramoconidio sin septos (Anexo, Figura 30-A), con cadenas de conidios limoniformes y conidios libres limoniformes hialinas (Anexo, Figura 30-B), que al contrastarlo con la bibliografa, se clasifica este grupo en el gnero Cladosporium (Ellis, 1971). El mejor medio de montaje para la observacin de estas estructuras fue Lactofucsina, ya que tie las estructuras hialinas in colapsarlas. Grupo 3. En este grupo, representado por el aislado E106, se observan ramoconidios septados, con conidios en el pice (Anexo, Figura 31-A), Los conidios poseen 4 septos, son de forma lunar, aunque algunas son fusiformes (Anexo, Figura 31-B), y presencia de una cicatriz en el pice basal del conidio, que surge por el desprendimiento del mismo del ramoconidio (Anexo, Figura 31-C). Una vez realizado el contraste con la literatura, se ubica a este hongo en el gnero Curvularia (Ellis, 1971). El mejor medio de

montaje para estas estructuras fue Lactofucsina y glicerina, ya que permiten observar las estructuras sin problemas de colapso Grupo 4. En este grupos es representado por el aislado E73, slo se observaron conidios alargados, con siete septos, filiformes (Anexo, Figura 32). De acuerdo con la literatura, estas caractersticas corresponden con el gnero Fusarium, adems que las caractersticas de los macroconidios, permiten establecer la especie para este Fusarium, identificndolo como F. decemcellulare (MycoBank, 2000). El medio de montaje que dio mejores resultados en las observaciones de los conidios fue el azul de tripn en Lactofenol, permitiendo una clara visualizacin de las estructuras reproductivas. Grupo 5. Los hongos pertenecientes a este grupo, representados por el aislado E5, presenta un conidiforo ramificado o simple (Anexo, Figura 33-A), conidios redondos, de pared lisa, sin presentar gtulas ni septos (Anexo, Figura 33-B). Estas caractersticas, de acuerdo a los autores, son tpicas de hongos que pertenecen al gnero Penicillium (Webster 1986). El medio de montaje con el que se obtuvo un mejor comportamiento fue Lactofucsina, permitiendo la observacin de las microestructuras con claridad. Grupo 6. Para este grupo, representado por el aislado E163, se observaron conidios con cuatro septos, y apndices filiformes en los pices, tres en el pice apical y uno en el pice basal (Anexo, Figura 34-A y Figura 34-B). Los conidios presentan formas fusiformes normalmente. Present clulas conidigenas (Anexo, Figura 34-C), de color verde oliva al igual que los conidios, por lo que el medio de montaje empleado fue gelatina de glicerina, aunque en Lactofucsina tuvieron un buen comportamiento (Schuster, s.f.).

Grupo 7. Este hongo, representado por el aislado E146, presenta conidios piriformes, ovalados y truncados en el pice, presentando tanto conidios maduros como inmaduros (Anexo, Figura 35-A y Figura 35-B), parfisis que surgen de lo que se conocen como picnidios (Anexo, Figura 35-C), dichas parfisis son septadas, y filiformes; tambin se observaron clulas conidigenas (Anexo, Figura 35-D). De acuerdo a stas caractersticas, al contrastarlas con la literatura, se puede decir, que estos hongos pertenecen al gnero Lasiodiplodia, y adems, la especie de este gnero es L. theobromae, ya que las caractersticas de los conidios y las parfisis concuerdan con las caractersticas de esta especie (Alves et al., 2008). El medio de montaje empleado para estas estructuras fue de Lactofucsina, aunque tambin en azul de tripn se pudo tener buena visualizacin de las estructuras Grupo 8. El aislado representante de este grupo es el E58, que presenta ascocarpos o peritecios maduros de color marrn oscuro (Anexo, Figura 36-A), de las cuales derivan las ascas hialinas (Anexo, Figura 36-B), y que a su vez estn contenidas en su interior ocho ascosporas hialinas (Anexo, Figura 36C), poseen una pared lisa. stas caractersticas son tpicas del Teleomorfo del gnero Colletotrichum, el cual lleva por nombre Glomerella, se pudo determinar por las caractersticas que en la literatura contrastan. (Domsch et al., 1980). El medio de cultivo empleado fue el de glicerina, ya que permite observar las estructuras con claridad.

Grupo 9. El representante de este grupo, es el aislado E7, que presenta conidios totalmente negros, de pared lisa, circulares, con un halo en la base del conidio, lo cual refleja a la clula conidigena (Anexo, Figura 37-A). Al contrastar con los autores stos conidios con caractersticos del gnero Nigrospora (MycoBank, 2000). El medio de montaje que se utiliz fue el de goma arbiga y gelatina de glicerina. Ambos dieron buenos resultados, aunque la goma arbiga es muy densa y tiende a colapsar las estructuras. Grupo 10. El representante de este grupo es el aislado E21, que en medio de cultivo Alfacel present, picnidios (Anexo, Figura 38-A) que contienen - conidios, los cuales son cilndricos, un poco ovoides en algunos casos piriformes, hialinas con presencia de gtulas y de pared lisa (Anexo, Figura 38-B), y - conidios, los cuales son filiformes, o en forma de pequeos bastoncitos, hialinos (Anexo, Figura 38-C). Todas estas caractersticas al contrastarla con los autores, se tiene que estos hongos pertenecen al gnero Phomopsis (Sutton, 1980). Los grupos del 11 al 17, no presentaron estructuras reproductivas durante el tiempo de evaluacin, sin embargo, para poder determinar los gneros de estos grupos, se realizaron ensayos en diferentes medios de cultivos, como el Czapeck (Dox), Alfacel y Acculas de pino en Agar. Debido a que el periodo de pasantas es muy corto, no se pudo realizar la evaluacin de las estructuras reproductivas y especializadas de los ltimos grupos, tenindose slo la evaluacin del grupo 10, el cual arroj el resultado descrito anteriormente. De acuerdo a los anlisis del ensayo, el medio de cultivo que mejores resultados se obtuvo es en el Alfacel, ya que estimula la esporulacin en

menos tiempo que el PDA, y los dems cultivos. Otro de los medios de cultivos en que se obtuvieron buenos resultados, fue en Czapeck (Dox), el cual estimula tanto el crecimiento como la esporulacin de las cepas. Cabe destacar que existe una notable diferencia morfolgica de la colonia, en los diferentes medios de cultivos, teniendo lo que se conoce como pleomorfismo, el cual se define como las diferencias que existen en la morfologa de la colonia, debido a diversos factores externos que condicionan stas diferencias, los cuales pueden ser el medio de cultivo, la temperatura, la radiacin de luz, entre otras. En el cuadro 4, se presentan los diversos grupos, con los aislados que de acuerdo a la caracterizacin macromorfolgica se agruparon, describiendo el aislado, el grupo al que pertenece, el gnero, la especie en los casos, el hospedero, y el origen del aislado.

3. Extraccin de ADN. Mientras se realizaba el ensayo con los medios de cultivos, Se realiz la tcnica de Castellani con cepas sembradas en PDA de algunos aislados y se extrajo tejido micelial, obteniendo un resultado homogneo, en el que en casi todas hay presencia de ADN y de buena calidad, lo que permiti realizar la evaluacin para la realizacin de la PCR. Esta prctica se le realiz a 25 muestras primeramente (Anexo, Figura 39), y luego se le realiz a 66 muestras que restaban (Anexo, Figura 40). 4. PCR. Luego de analizar las muestras con ADN, se realizaron PCR para las muestras E3; E8; E9; E74 y E102, sin dilucin con 1 y 2 L respectivamente de ADN. Adems se hicieron diluciones de 1/10 y de de las muestras E10; E34; E40; E58; E67 y E79.

Luego de haber montado el gel de agarosa 1%, en el Typhon, se hizo la lectura, y no se obtuvo ningn resultado. Teniendo que realizar la prctica nuevamente. En una segunda oportunidad, se le realiz la PCR a las muestras E10; E17; E58; E80; E131; E163 y E39, tomando para la MIX, 2 y 3 L de ADN, sin ninguna dilucin, el resultado fue el siguiente: Se obtuvo amplificacin en las muestras E17; E80 y E163 con 3 L de ADN, y E80; E131 y E39 con 2 L de ADN (Anexo, Figura 41). De acuerdo a este resultado, se tom a la muestra E17, como el control positivo (+), de modo que sirva de gua para las amplificaciones que se den. Se volvi a realizar otra prctica, tomando las muestras E17 (+); E10 con 1,5 y 2,5 L de ADN; E58 con 1,5 y 2,5 L de ADN; E163 y E39 con 2,5 L de ADN, para este caso, no se hizo ninguna dilucin de las muestras. El resultado fue que en la prctica no hubo amplificacin del producto. Se realiz un ltimo experimento, con gradientes de temperaturas y con variacin en la concentracin de MgCl, usando las mismas muestras pero con cantidades de ADN diferentes, quedando dispuestas del siguiente moso: Las muestras E17; E80 y E163 sin dilucin con 3 L de ADN cada una, mientras que la muestra E39 se us con 2 L de ADN, para el gradiente existen dos condiciones, una con una concentracin de 1,5 mM de MgCl y la condicin 2 con una concentracin de 2 mM de MgCl. Y el gradiente de temperatura es de 61 C, 60 C y 59 C. Se obtuvo como resultado que a 61 C, slo hubo amplificacin en la muestra E17 pero poco visible en ambas condiciones. A 60 C, las muestras E17 y E80 amplificaron, siendo la E17 la ms notable, slo para la condicin 1, para la condicin dos la muestra E80 es a nica que amplific y se puede

leer con facilidad. A 59 C, slo amplificaron las muestras E17 y E80, para ambas condiciones, teniendo una lectura visible de la amplificacin. Debido a que se perdi mucho tiempo en la amplificacin del ADN, a travs de la prctica de PCR, las pocas muestras que lograron amplificar no se pudieron purificar para su posterior secuenciacin, es por esto que el experimento qued incompleto ya que la falta de tiempo impidi que se continuara con el mismo. Es justamente estas razones lo que hace que la biologa molecular sea un poco ms compleja que la caracterizacin morfolgica, pero sin duda es ms precisa cuando no existen factores externos que modifiquen los resultados

CONCLUSIONES

De acuerdo a los resultados obtenidos, se concluye lo siguiente:

Las caractersticas macromorfolgicas, permiten predecir el gnero de un hongo, ms no te garantiza el 100 % de esa prediccin, ya que muchas de estas caractersticas morfolgicas pueden presentarse semejantes en varios gneros dificultando as la clasificacin taxonmica. La macromorfologa slo permite dar el primer paso para la clasificacin taxonmica. Se identificaron a travs de la macromorfologa, los gneros Colletotrichum, Fusarium y Lasiodiplodia, correspondientes a los grupos 1, 4 y 7 respectivamente. Las microestructuras, son las que permiten con certeza realizar una clasificacin taxonmica, el anlisis de estructuras reproductivas y otras estructuras especializadas, permitieron identificar 10 grupos de hongos endfitos, con los gneros; en el grupo 1 Colletotrichum, en el grupo 2 Cladosporium, en el grupo 3 Curvularia, en el grupo 4 Fusarium, en el grupo 5 Penicillium, en el grupo 6 Pestalotiopsis, en el grupo 7 Lasiodiplodia, en el grupo 8 Glomerella, en el grupo 9 Nigrospora y en el grupo 10 Phomopsis. Los diversos medios de cultivos y de montajes, son una herramienta importante para el logro de esta identificacin, ya que dependiendo del medio de cultivo, el hongo puede expresar su potencial que permitan su identificacin. Los medios de cultivos empleados para la realizacin de sta caracterizacin fueron PDA, AM 2%, Alfacel, Czapeck (CZ) y Acculas

de Pino en agar. Teniendo mejores resultados para la mayora de los hongos, en PDA y Alfacel, que de acuerdo a esto, los aislados tuvieron mejor adaptacin. Los medios de cultivos AM 2% y Acculas de Pino, son medios pobres en nutricin, y se emplearon con la finalidad de demostrar que los hongos ante un estrs nutricional, son obligados a formar cuerpos fructferos para poder subsistir, sin embargo, esto no fue as, no todos los hongos tienen el mismo comportamiento en los medios de cultivos, pocos gneros pueden soportar este estrs como el caso del gnero Lasiodiplodia. La identificacin molecular, es muy precisa y permite dar una clasificacin especfica de los hongos. A travs del genoma del hongo es posible caracterizarlo hallando no slo el gnero sino tambin la especie del mismo. La biologa molecular se ha convertido en una herramienta clave para la taxonoma por tener estas caractersticas precisin. Para la realizacin de estas prcticas moleculares, es necesario ser muy cuidadoso, y metdico, ya que cualquier mala praxis, puede anular los resultados de identificacin. Es muy probable, que este factor haya sido la razn de los resultados nulos que se obtuvieron en este experimento. Otras razones que pueden estar implicadas en stos resultados, puede ser que los reactivos estuviesen

contaminados, que haya un error de pipeteo de los reactivos, que la cantidad y calidad de ADN no era suficiente para la amplificacin o que sencillamente, la maceracin del tejido micelial en buffer de lisis no haya sido la necesaria.

 Todava no se conocen con exactitud los mecanismos de accin que ejercen los hongos endfitos sobre las plantas de cacao, sin embargo, si se pudo confirmar que estos hongos, viven dentro de las plantas sin presentar sntomas en ellas, y que en el momento en que la planta comienza a debilitarse o a morir, stos son los primeros en convertirse en saprfitos y/o patgenos. .

RECOMENDACIONES

De acuerdo a las experiencias vividas durante el periodo de pasantas y a las conclusiones de los resultados se recomienda lo siguiente: Para todos los casos, se recomienda que el periodo de pasantas sea un poco ms largo, ya que el corto tiempo de stas, es una de las razones por las que no se obtuvieron ms y mejores resultados en los experimentos. Se recomienda estudiar ms caracteres morfolgicos que permitan con ms precisin la identificacin de los hongos. Pero para esto, es necesario otros medios de cultivos, ms tiempo de trabajo de laboratorio y ms investigacin por parte del estudiante, que sirva de refuerzo para evaluar las caractersticas morfolgicas y moleculares. Se recomienda hacer mejor preparacin de los estudiantes en el campo de la fitopatologa, ya que cada vez ms se reportan enfermedades en los cultivos causados por hongos, que acarrea en grandes prdidas econmicas para los productores y de alimentos que garanticen la soberana alimentaria del pas. Se recomienda seguir realizando estudios sobre este tipo de hongos, ya que de confirmarse los mecanismos de accin que ejercen stos hongos sobre los diversos cultivos, se lograra aumentar los rendimientos del cultivo sin causar un impacto ambiental.

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ANEXOS
Cuadro 1. Clasificacin taxonmica del cacao.

Clasificacin Cientfica Reino Subreino Divisin Clase Subclase Orden Familia Subfamilia Tribu Gnero Especie Plantae Tracheobionta Magnioliophyta Magnoliopsida Dilleniidae Malvales Malvaceae Byttnerioideae Theobromae Theobroma T. cacao

Cuadro 2. Clasificacin de las muestras segn su origen

Aislado
E- 1 E- 2 E- 3 E- 4 E- 5 E- 7 E- 8 E- 9 E- 10 E- 11 E- 12 E- 17

Hospedero Cacao Cacao Cacao Cacao Cacao Cacao Cacao Cacao Cacao Cacao Cacao Cacao

rganos Hoja - Limbo Hoja - Limbo Hoja - Limbo Hoja - Nervio Hoja - Nervio Hoja - Nervio Hoja - Nervio Hoja - Nervio Hoja - Nervio Hoja - Limbo Hoja - Limbo Hoja - Limbo

Estado Miranda Miranda Miranda Miranda Miranda Miranda Miranda Miranda Miranda Miranda Miranda Miranda

E- 21 E- 27 E- 35 E- 36 E- 37 E- 38 E- 39 E- 40 E- 41 E- 42 E- 58 E- 60 E- 61 E- 62 E- 64 E- 65 E- 66 E- 67 E- 68 E- 69 E-70 E- 73 E- 74 E- 75 E- 76 E- 77 E- 78 E- 79 E- 80 E- 82 E- 87 E- 102 E- 103 E- 104

Cacao Cacao Cacao Cacao Cacao Cacao Cacao Cacao Cacao Cacao Cacao Cacao Cacao Cacao Cacao Cacao Cacao Cacao Cacao Cacao Cacao Cacao Cacao Cacao Cacao Cacao Cacao Cacao Cacao Cacao Cacao Cacao Cacao Cacao

Hoja - Limbo Hoja Hoja - Limbo Hoja - Limbo Hoja - Nervio Hoja - Nervio Hoja - Nervio Hoja - Nervio Hoja - Nervio Hoja - Nervio Hoja - Limbo Hoja - Limbo Hoja - Limbo Hoja - Nervio Hoja - Nervio Hoja - Nervio Hoja - Nervio Hoja - Nervio Hoja - Nervio Hoja - Limbo Hoja - Limbo Hoja - Limbo Hoja - Limbo Hoja - Limbo Hoja - Limbo Hoja - Limbo Chupn - Nervio Chupn - Nervio Chupn - Nervio Chupn - Limbo Chupn - Limbo Fruto Fruto Fruto

Miranda Miranda Miranda Miranda Miranda Miranda Miranda Miranda Miranda Miranda Miranda Miranda Miranda Miranda Miranda Miranda Miranda Miranda Miranda Miranda Miranda Miranda Miranda Miranda Miranda Miranda Miranda Miranda Miranda Miranda Miranda Miranda Miranda Miranda

E- 105 E- 106 E- 107 E- 108 E- 110 E- 111 E- 112 E- 113 E- 114 E- 115 E- 118 E- 120 E- 122 E- 123 E- 125 E- 126 E- 127 E- 128 E- 129 E- 130 E- 131 E- 132 E- 134 E- 136 E- 137 E- 138 E- 139 E- 140 E- 142 E-143 E- 144 E-145 E- 146 E- 147

Cacao Cacao Cacao Cacao Cacao Cacao Cacao Cacao Cacao Cacao Cacao Cacao Cacao Cacao Cacao Cacao Cacao Cacao Cacao Cacao Cacao Cacao Cacao Cacao Cacao Cacao Cacao Cacao Cacao Cacao Cacao Cacao Cacao Cacao

Fruto Fruto Fruto Fruto Fruto Fruto Fruto Fruto Fruto Fruto Fruto Fruto Fruto Fruto Fruto Fruto Fruto Fruto Fruto Fruto Fruto Fruto Fruto Fruto Fruto Fruto Fruto Fruto Fruto Fruto Fruto Fruto Fruto Fruto

Miranda Miranda Miranda Miranda Miranda Miranda Miranda Miranda Miranda Miranda Miranda Miranda Miranda Miranda Miranda Miranda Miranda Miranda Miranda Miranda Miranda Miranda Miranda Miranda Miranda Miranda Miranda Miranda Miranda Miranda Miranda Miranda Miranda Miranda

E- 148 E- 149 E- 150 E- 151 E-153 E- 155 E- 156 E- 157 E-158 E- 159 E-160 E- 161 E- 162 E- 163 E- 164 E- 165 E- 166 E- 167

Cacao Cacao Cacao Cacao Cacao Cacao Cacao Cacao Cacao Cacao Cacao Cacao Cacao Cacao Cacao Cacao Cacao Cacao

Fruto Fruto Fruto Fruto Fruto Fruto Fruto Fruto Fruto Fruto Fruto Fruto Fruto Fruto Fruto Fruto Fruto Fruto

Miranda Miranda Miranda Miranda Miranda Miranda Miranda Amazonas Amazonas Amazonas Amazonas Amazonas Amazonas Amazonas Amazonas Amazonas Amazonas Amazonas

Caractersticas de la flor del cacaotero:

Caractersticas

Descripcin De acuerdo a la cartilla de colores (Colour Identification Chart, Flora of British fungi, del Royal Botanic Garden Edinburgh) . De acuerdo a la cartilla de colores . Opaca o brillante. Regular o irregular. Entero, filamentoso, ondeado, ondulado, crenado, lobulado o lobado, rizoide. Elevada, medio elevada y poco elevada. Algodonosa, lanosa, imbricada, arenosa, pulverulenta, flocosa, aterciopelada. Superficial, inmerso o ambas. Color de acuerdo a la cartilla de colores. Si o No. Si o No.

a). Color de anverso de la colonia.

b). Color del reverso de la colonia c). Superficie de la colonia d). Forma de la colonia d). Margen de la colonia

e). Elevacin de la colonia

f). Textura de la colonia g) Disposicin del micelio h) Tincin del medio de cultivo i). Presencia de anillos j). Produccin de Exudado en la colonia, gotas en la superficie. k). Dimetro promedio de la
colonia, considerando dos dimetros particulares en la colonia.

mm cada 24 h.