Cronobiología Medicina

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TEMA 4. ORGANIZACIÓN DEL SISTEMA CIRCADIANO HUMANO. Estructura general . Núcleos supraquiasmáticos. Relojes moleculares.
1.-INTRODUCCIÓN Como se vio en el capítulo anterior, los ritmos biológicos tienen dos propiedades

fundamentales: carácter endógeno y capacidad de sincronización; por tanto, el sistema circadiano (conjunto de estructuras encargadas de generar y regular los ritmos circadianos de un organismo) debe estar compuesto por los siguientes elementos formales (Figura 1): -marcapasos, o generadores autónomos de los ritmos. marcapasos produciendo su sincronización.
EFECTORES VÍAS DE ACOPLAMIENTO

-sensores que detectan cambios ambientales o internos y envían la información a los -efectores, todos que son

MARCAPASOS
VÍAS DE ENCARRILAMIENTO

tejidos y células que
dmNSQ

los

órganos,

modificando

responden su

LUZ

OJO

vlNSQ

actividad en respuesta a las señales emitidas
PINEAL

por los marcapasos. La

ENCARRILAMIENTO

capacidad ritmos

del sistema circadiano
GENERACIÓN DE RITMOS RITMOS CIRCADIANOS

de

Figura 1. Esquema de la organización del sistema circadiano. vlNSQ= núcleo supraquiasmático ventrolateral; dmNSQ= núcleo supraquiasmático dorsomedial.

endógenos implica que poseer

generar

los organismos deben marcapasos

endógenos capaces de generar autónomamente los ritmos biológicos.

grupos

En 1972, dos

investigadores: Moore Zuker

de

& Erlich y Stephan y sendos en trabajos publican en

los que proponen que supraquiasmáticos de hipotálamo
Figura 2.-Sección frontal a través del hipotálamo de rata mostrando los núleos c supraquiasmáticos (flechas) sobre el quiasma óptico (OC) (Tomado Inouye y de Kawamura, 1979)

los

núcleos (NSQ) más de

reside el marcapasos circadiano importante

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mamíferos. La lesión completa de NSQ por estereotaxia en roedores elimina los ritmos etc. Aunque no engordaban ni nada, por lo que la constancia de los valores medios de los comen la misma cantidad y realizan una actividad similar. Además, mueren antes.

circadianos de alimentación, actividad motora, bebida, ciclo estral, temperatura, cortisol, ritmos se mantiene. Es decir, que los animales duermen el mismo nº de horas en 24 h,

Moore y Elrich marcaron la vía de la retina al NSQ (tracto retino-hipotalámico) inyectando la peroxidasa del rábano o la toxina del cólera en la retina para dibujar la vía nerviosa desde la terminación a la neurona. Es decir, que estas sustancias viajan retrógadamente. 2.- LOCALIZACIÓN DE LOS NÚCLEOS SUPRAQUIASMÁTICOS. Los núcleos supraquiasmáticos (NSQ) son dos núcleos simétricos, ovalados,

situados en la parte ventral de hipotálamo y dorsalmente con respecto al quiasma óptico por 8000 neuronas y en humanos por 16000. Tiene tan sólo 1mm de diámetro. También

(lugar de entrecruzamiento de las fibras de un ojo con las del otro). En ratas está formado existe en aves y reptiles. Los dos núcleos están conectados por numerosos circuitos locales y actúan funcionalmente como una única estructura. Teniendo en cuenta criterios anatómicos y neuroquímicos es posible diferenciar dos zonas en los NSQ: la zona anticuerpo contra el neurotransmisor, VIP, veremos que el área ventrolateral presenta mayor radiactividad. En cambio, la dorsomedial está más radiactiva cuando ponemos un anticuerpo contra vasopresina. Es el verdadero reloj, generando ritmos in vitro.

dorsomedial y la ventrolateral. Si usamos técnicas inmunocitoquímicas, usando un

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NEURONAS PRODUCTORAS DE VIP NEURONAS PRODUCTORAS DE VASOPRESINA

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La zona dorsomedial actúa como un verdadero en

generando ritmos de actividad
dmNSQ

marcapasos,

nerviosa

ambientales constantes, por el
Area ventrolateral vlNSQ Area dorsomedial

condiciones

contrario la zona ventrolateral es la que recibe las entradas procedentes de la retina y no es capaz condiciones constantes. de generar ritmos

Figura 3.-Citoarquitectura del núcleo supraquiasmático de rata. En el área dorsomedial abundan las neuronas productoras de VP ( vasopresina ) mientras que en el área ventrolateral predominan las productoras de VIP. El área ventrolateral recibe las conexiones del tracto retinohipotalámico . El área dorsomedial es la responsable de la actividad marcapasos.

ambientales

en

3.-CONEXIONES ANATÓMICAS DE LOS NSQ. 3.1.- Vías aferentes: Mediante técnicas de marcaje retrógrado y anterógrado se han aferentes se han marcado en rojo, mientras que las eferentes lo han sido en azul.

trazado las vías aferentes (hacia los NSQ) y eferentes (salidas desde los NSQ). Las vías

Los conos y bastones se neuronas, éstas con
RAFE
Figura 4.-Vista longitudinal del cerebro de la rata ilustrando las conexio nes nerviosas del núcleo supraquiasmático. RHT= tracto retinohipotalámico, procedente de la retina; GHT= tractogeniculohipotalámico procedente del núcleo geniculado lateral del tálamo (estría intergenicular= IGL) y conexión procedente delrafe. En el mismo dibujo se han representado las salidas principales:sPVz= zona subparaventricular de hipotálamo; DMH= núcleo dorsomedial de hipotálamo; PVT= núcleo paraventricular del tálamo.

3.1.1.- Tracto retinohipotalámico.
comunican hacen una y

al

sinapsis estas

final

con

ganglionar.

envían la información a la corteza visual (en la zona que se occipital) forme para

Y

neurona

imagen. Pero hay un tipo de células ganglionares que son directamente fotosensibles. Y estas son las que envían información al NSQ. Por tanto está formado por un pequeño grupo de axones procedentes de células ganglionares de la retina que se proyectan

la

fundamentalmente al área ventrolateral del NSQ. Este tracto es absolutamente necesario y suficiente para la existencia de sincronización a la luz. Por eso los ciegos con lesiones en el tracto visual pueden estar sincronizados a la luz. Los principales neurotransmisores de esta vía son el glutamato (muy tóxico) y VIP, que son segregados por la célula ganglionar. Su interacción con receptores de membrana de las neuronas de los NSQ producen

cambios en la concentración de Ca, que activa unas proteinkinasas, induciendo

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modificaciones en la expresión de genes reloj, con la consiguiente sincronización de los ritmos neuronales al ciclo LD. El pigmento de las células ganglionares especiales no es rodopsina (como en conos y variaciones en la intensidad de luz. Y su reacción es muy lenta.

bastones), sino melanopsina. La célula ganglionar no reacciona a imágines, sino a

provienen del núcleo geniculado lateral. Estos núcleos también reciben intergenicular, lugar donde arranca el tracto geniculohipotalámico.

3.1.2.- Tracto geniculohipotalámico. Está formado por los axones de neuronas que

bilaterales de la retina informando de la luz y están conectados por la estría neurotransmisor es el neuropéptido Y. Esta vía se activa con las transiciones L-D y D-L. Su

conexiones principal

se llaman rafe medio, relacionadas con el sueño y el dolor, y se une al NSQ. Su principal sincronizan otros factores (ejercicio, comidas, etc)

3.1.3.- Vías procedentes de núcleos del rafe. En el tronco encefálico hay unas zonas que

neurotransmisor es la serotonina. Parece que es una vía no fótica, a través de la cual se

3.1.4.- Núcleo geniculado lateral: está dentro del tálamo. Se conecta con el NSQ por otra
vía. Esta vía se puede cortar y aparentemente no ocurre nada, así que es secundaria.

3.2.- Vías eferentes.

3.2.1.-Eferencias dentro del mismo hipotálamo.
Existen amplias conexiones nerviosas entre los NSQ y el resto de núcleos

hipotalámicos. Destacan especialmente las conexiones con el núcleo paraventricular, del cual salen eferencias hacia la glándula pineal, haciendo relevo en el ganglio cervical superior. También hay conexiones con el área preóptica y área retroquiasmática y el núcleo dorsomedial.

En el hipotálamo hay núcleos que regulan muchas funciones vegetativas. Estas eferencias no son necesarias para regular los ritmos de curso libre.

3.2.2.- Eferencias fuera de hipotálamo.
Al núcleo paraventricular del tálamo, al sistema límbico y al núcleo geniculado

lateral.

necesarias para la generación de ritmos por los NSQ.

A pesar de la gran cantidad de eferencias las conexiones nerviosas no son

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3.3.- Neurotransmisores. GABA. Presente en todas las neuronas. Péptidos de la zona ventrolateral que desaparece en DD. Péptido intestinal vasoactivo (VIP). Presenta un ritmo con máximo nocturno

Péptidos de la zona dorsomedial Vasopresina (VP). Presenta un ritmo circadiano endógeno, en DD. La mayoría de las neuronas de NSQ son productoras de GABA, un neurotransmisor inhibidor ampliamente extendido en otras regiones del cerebro (es un depresor). vasoactivo), mientras que el área dorsomedial produce VP (vasopresina). 4.- ORGANIZACIÓN DEL SISTEMA CIRCADIANO La luz se conecta con el ojo, y éste con el tracto retrohipotalámico (encarrilamiento), y éste con el marcapasos (NSQ), con la zona ventrolateral, que se encarga de generar ritmos. Y luego hay vías de acoplamiento. NSQ: liberan muchas sustancias para generar oscuridad. Específicamente, el área ventrolateral de los NSQ produce VIP (péptido intestinal

ritmos. La pineal distribuye las órdenes de los NSQ. Envía melatonina, dando señales de El sistema circadiano de mamíferos está formado por todas aquellas estructuras que intervienen en la generación y sincronización de los ritmos circadianos. Está compuesto por la retina que conecta por células ganglionares portadoras de melanopsina siendo el cual hace que entre Calcio activándose Tirosinquinasas que fosforilan CREB y se

fotosensibles con NSQ (principalmente el TRH por VIP y Glutamato por el receptor NMDA, expresan más los genes reloj y secundariamente el TGH). Los NSQ constituyen el marcapasos circadiano principal. Este se encarga de regular unos pocos ritmos básicos como el ritmo de sueño-vigilia, el de temperatura y actividad motora. Colaborando con esta actividad se encuentra la glándula pineal que genera el ritmo de melatonina y difunde por el organismo el mensaje de oscuridad química. Recientemente se ha demostrado que la mayoría de los tejidos poseen osciladores secundarios que son gobernados por NSQ al sueño vigilia.

parecer mediante mecanismos indirectos como los ciclos de temperatura o el ritmo de Las estructuras que generan ritmos se llaman efectores. acoplados al NSQ pero también funcionan aislados.

Casi todos los tejidos tienen marcapasos secundarios, que normalmente funcionan

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5.- PRUEBAS QUE DEMUESTRAN EL CARÁCTER DE MARCAPASOS CIRCADIANO PRINCIPAL EN MAMÍFEROS.

R IT M O S D E AC T IV ID A D EL É C T R IC A D E L A S N EU R O N A S D E L N Ú C L E O S U PR A Q U IAS M Á T IC O M A N T EN ID A S IN V IT R O

4.1.- La lesión de NSQ produce en la mayoría de los ritmos circadianos. arritmicidad

4.2.- Las neuronas de

los NSQ mantenidas in

vitro son capaces de
generar curso libre ritmos (tienen de

Figura 5.- Frecuencia de potenciales de acción de neuronas de NSQ de rata mantenidas in vitro.

picos a las 18, las 12,

por lo que tienen un

periodo menor de 24

horas) de potenciales de acción durante varios días seguidos.
determina la frecuencia de potenciales de acción

En la figura 5 se pueden ver los resultados de un experimento en el que se espontánea de un

núcleo

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supraquiasmático de rata. El periodo del ritmo de actividad nerviosa es inferior a 24 h y se mantiene, al menos, durante 4 días seguidos.

4.3.- Cada neurona individual de los NSQ es en sí misma un marcapasos (oscilador), pudiendo generar ritmos de actividad nerviosa con independencia de las demás neuronas.

5.-¿Es verdaderamente un marcapasos el NSQ?: Estudios in vitro
PERIODOGRAMA DE LA ACTIVIDAD ELÉCTRICA DE UNA NEURONA INDIVIDUAL MANTENIDA IN V ITRO. CADA NEURONA ES EN SI UN OSCILADOR CIRCADIANO, AUNQUE PARECEN FORMAR CLUSTERS CONECTADOS

4.4.- El transplante de NSQ a un animal cuyos NSQs se han lesionado previamente, le transfiere características las

propias, en cuanto a

sus ritmos biológicos,

wild

Mut. tau

trasplante
lesiónSCN

del

experimentos sido concluyentes trasplantar donantes

donante.

Estos

especialmente NSQ de

han al

Tiempo (días)

trasplante

tau

inferior pocas

(periodo a

mutantes h)

demostrar aparecen animal

24

muy

que

Figura 6.- Efectos del trasplante de NSQ procedente de un hamster mutante tau (periodo inferior a 24 h) sobre el ritmo de actividad motora de un receptor cuyos NSQ han sido lesionados previamente.

receptor

en

semanas un de

en

y

fenotipo salvaje, las características

del

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mutante (Figura 6). Es decir, recupera sus ritmos pero con las características del mutante luz, porque las conexiones nerviosas no se han desarrollado suficientemente.

tau. Lo que ocurre es que normalmente después de un transplante no se sincroniza a la

DD

Los NSQ transplantados en el capaces de generar ritmos de animales los curso receptores libre en los en tercer ventrículo son

muy poco tiempo. Además, suceptibles
Figura 7.- Efecto del trasplante de NSQ sobre la recuperación del ritmo de bebida de una rata previamente lesionada. El trasplante recuperó los ritmos circadianos tanto en LD como en DD. El ritmo de curso libre al final del experimento parte de una fase previamente sincronizada por el ciclo LD. Lo que indica la existencia de una verdadera sincronización. Tomado de Esseveldt y cols. 2000. Brain Res. Reviews , 33:34 -77.

animales

LD

sincronizados por la luz igual que los controles no trasplantados. Es muy probable que las sean

de

son

ser

DD

conexiones de los NSQ no necesarias para regenerar los ritmos y la capacidad absolutamente

de sincronización, dado que el trasplante de NSQ encapsulados, y por tanto incapaces de regenerar las conexiones nerviosas, puede devolver los ritmos circadianos a los animales receptores.

5.RESTAURACIÓN DEL RITMO DE ACTIVIDAD MOTORA TRAS EL TRASPLANTE DE NSQ ENCAPSULADOS

Microfotografía del trasplante de un NSQ encapsulado (g). Un hámster mutante tau con periodo de 21,4 h se vuelve arrítmico tras lesión de sus NSQ, más tarde recibe un trasplante de un NSQ encapsulado procedente de un hámster normal. Observe la recuperación de un ritmo de 24 h de la actividad motora. La restauración del ritmo de actividad motora indica que las conexiones nerviosas no son imprescindibles para que los NSQ controlen los ritmos circadianos, sin embargo, otros ritmos si requieren de conexiones.

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6.- RELOJES MOLECULARES.

RELOJ MOLECULAR DROSOPHILA MELANOGASTER:

RELOJ MOLECULAR DE Drosophila melanogaster
DOUBLE TIM

TIM-PER

CYCLE CLOCK

criptocromos

En oscuridad se forman grandes cantidades de proteínas PER y TIM, estas forman dímeros estables. Los monómeros son rápidamente destruidos por la enzima DOUBLE TIME

funcionamiento del marcapasos circadiano. Las proteínas CLOCK y CYCLE son factores de transcripción que favorecen la transcripción de los genes per y tim en las proteínas PER y TIM. En el citoplasma TIM y PER forman heterodímeros que son resistentes a la degradación por enzimas como DOUBLE TIM.

El reloj molecular de Drosophila constituye un modelo sencillo que permite entender el

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RELOJ MOLECULAR DE Drosophila melanogaster

Fosforilación de per

RELOJ MOLECULAR DE Drosophila melanogaster

Los dímeros PER-TIM entran en el núcleo y bloquean la transcripción de los genes per y tim.

Cuando la oscuridad progresa, los dímeros PER-TIM entran en el núcleo e inhiben el expresión de per y tim funcionamiento de los genes clock y cycle

lo que induce a su vez un descenso en la

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RELOJ MOLECULAR DE Drosophila melanogaster

Los dímeros PER-TIM entran en el núcleo y bloquean la transcripción de los genes per y tim.

Cuando desciende la proteina PER y TIM desaparece el feedback negativo y comienza de luz.

nuevo la recuperación de sus niveles. Esto ocurre al final de la oscuridad y comienzo de la

RELOJ MOLECULAR DE Drosophila melanogaster

La luz destruye la proteína TIM (por activación de criptocromos) y más tarde desaparece la proteína PER por acción enzimática.

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La luz sincroniza rápidamente el reloj ya que destruye la proteina TIM, lo que desestabiliza a PER y esta puede ser degradada.

RELOJ MOLECULAR DE Drosophila melanogaster

Con la llegada de la oscuridad comenzará un nuevo ciclo

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RESUMEN DEL RELOJ MOLECULAR DE DROSOPHILA

década

En la última producido se han

continuos del

en el conocimiento molecular implicado y génesis de sustrato

avances

en la sincronización ritmos en
CCG

circadianos

los

organismos, hasta
PROTEINAS CCG

diferentes

la mosca de la fruta

desde

los

Afortunadamente,

mamíferos.

básicos

mecanismos que la

ritmicidad se han conservado con muy pocas modificaciones a lo largo de la filogenia.

explican

que la luz activa en la retina unas células ganglionares que son directamente

En relación con la sincronización a la luz, se ha descubierto muy recientemente

fotosensibles, al parecer el pigmento implicado es la melanopsina. Este tipo de células ganglionares no interviene en la visión de imágenes, estando únicamente especializadas en la detección de niveles de iluminación. Sus axones forman el tracto retinohipotalámico. La liberación de glutamato y VIP altera la expresión de genes reloj en NSQ.

implicados y el mecanismo fundamental de funcionamiento son en parte comunes a ambas especies, comenzaremos describiendo el reloj de Drosophila (Figura 8).

circadiano de Drosophila melanogaster y en menor medida del ratón. Dado que los genes

También se conoce, relativamente bien el funcionamiento del marcapasos

cromosoma X y presenta varios alelos mutantes (pers, tau= 19 h; perL, tau= 29 h y per0, arrítmico). El gen per de Drosophila se expresa de un modo circadiano y el producto de su implicado en el control de la ritmicidad circadiana, el gen tim síntesis, la proteína PER inhibe su propia transcripción. En 1994 se descubrió otro gen (de timeless) en el

mosca de la fruta, fue denominado gen per, (de period). Se encuentra localizado en el

Hace unos 30 años se descubrió el primer gen relacionado con los ritmos en la

cromosoma 2 de Drosophila; al igual que per, el RNAm de tim se acumula rítmicamente y noche, generando las proteínas PER y TIM. La proteína PER es fosforilada y degradada por su ritmicidad es dependiente de TIM y de PER. Los genes tim y per se expresan durante la

la proteína DOUBLETIME. A su vez la proteína TIM es degradada por la luz y también por un CRIPTOCROMOS (pigmento que se activa por la luz). Sin embargo, la formación de

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dímeros TIM-PER protege a ambos de su degradación. Estos dímeros entran dentro del núcleo y se unen a los factores de transcripción CLOCK-CYCLE impidiendo la expresión de CRIPTOCROMOS y por la luz misma, siendo suceptible PER de degradación por

tim y per al separarlos del promotor. Cuando llega la luz, TIM es degradado por
DOUBLETIME, con lo que dejan de inhibir su propia transcripción, uniéndose CLOCKCYCLE a su promotor, y todo comienza de nuevo. Es cíclico, un reloj, y el período es de más o menos 24 horas.

Las fluctuaciones de la proteína PER son capaces de afectar a la transcripción de otros genes (CCG, clock controlled genes) que son los responsables de los ritmos circadianos de diferentes funciones (producen hormonas, neurotransmisores, etc)

Cualquier pequeña mutación en los genes hace que cambie el período, al cambiar la 24 horas sería el que afectase a PER, haciéndola más resistente a la degradación.

afinidad de las proteínas. Por ejemplo, una mutación que provocaría un ritmo de más de

CONSECUENCIAS DEL RELOJ DROSOPHILA MELANOGASTER: Si no saliera el sol, ¿Qué ocurriría?

Hay factores que de forma espontánea eliminan per y tim, pero se nota más su acción cuando no se están expresando per y tim. El sol activa el criptocromo y éste degrada a tim. Esto ocasiona un ciclo en la cantidad de per y tim. Y en el caso de per, la distancia (cuando éste no está expuesto a un ciclo de luz-oscuridad)

entre dos máximos en la concentración de per es igual al período de curso libre del animal

DBT (doubletime): la mutación que se encontró en drosophila es que al mutar esa proteína y bajar su actividad, todo se expande 8 en verde). Mantiene alto el nivel d per durante más tiempo. Y por tanto, se alarga el ciclo.

Clock/cicle: si se ven afectados, no se pueden unir al promotor y ya no hay ciclo (el animal se vuelve arrítmico).

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PULSO DE LUZ: si aplicamos un pulso de luz al final de un período, se produce un descenso brusco de per, y un adelanto de fase (en naranja). subir. Se produce un adelanto de fase (en rosa) Si se lo damos antes del período, hay una bajada rápida de per, y en seguida empieza a

El punto clave es la mitad de la noche. Dependiendo de dónde demos el pulso con respecto a ese punto se producirá un adelanto o un retraso.

primera mutación de un ritmos circadianos fue descrita en 1989, por M. mutación sido Menaker,

En mamíferos, la

gen relacionada con los

hámster; sin embargo, ha
CLOCK BMAL1

tau

del

la

ratón el más estudiado genético. trabajo gen En

el

reloj

del

desde el punto de vista Takahashi publica 1994 un

describiendo el primer ratón, capaz mutante el de gen en

en

Science
el

circadianos (+/+, tau= 23,3 h; +/Clock, tau = 24,4 h y Clock/Clock, tau= 27,3 h). Con

periodo de los ritmos

alargar

Clock,
el

respecto a Drosophila, las principales diferencias estriban en que en lugar de un gen per

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existen al menos tres genes per, per1, per2 y per3 , dos genes criptocromos (cry1 y cry2) y cry . Los dímeros TIM-CRY, PER-PER y PER-CRY bloquean a BMAL1 y a CLOCK. La proteína que degrada per es CKI epsilon. y el gen bmal1 y el gen clock. Las proteinas CLOCK y BMAL1 regulan la expresión de per

RELOJ MOLECULAR EN NEURONAS DEL NSQ DE RATÓN

Expresión de los tres genes Period en el núcleo supraquiasmático de ratón mantenido en LD 12:12, ZT0= encendido de la luz
Takahashi,1999

determinada mediante hibiridación in situ en cuatro momentos circadianos diferentes (CT6, CT12, CT18 y CT24). Observe como varía la expresión zonalmente dentro del NSQ. RELOJ MOLECULAR EN NEURONAS DEL NSQ DE RATÓN:

Las autorradiografías muestran la variación de la expresión de los tres genes per,

Para saber si en los NSQ se está expresando un gen, se usa hibridación in situ. Hacemos una copia complementaria del mensajero del gen que queremos saber si se expresa.Esa copia complementaria la unimos a un elemento radiactivo. Ahora la aplicamos a un corte de cerebro donde existe ARNm. Coloco una película encima y la revelo y a mayor coloración d la placa y sabemos cuánto per hay. www.holidaylectures.org/WEBCAST

expresión, mayor radiactividad en la película. Se puede cuantificar en función de la

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