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Los ensayos enzimáticos son métodos de laboratorio para medir actividades enzimáticas.

Son vitales para el estudio de las cinéticas enzimáticas y la inhibición enzimática. Unidades enzimáticas Las cantidades de enzima pueden ser expresadas en moles, como las de cualquier otro compuesto químico, o pueden ser cuantificadas en términos de actividad enzimática. La actividad enzimática es una medida de la cantidad de enzima activa presente y del nivel de actividad de la misma, por lo que la medida de la actividad es dependiente de las condiciones, que deben ser especificadas cuando se dan valores de actividad. La actividad expresa la cantidad de sustrato convertido por unidad de tiempo, teniendo en cuenta el volumen de reacción. En el Sistema Internacional de Unidades la unidad para la actividad catalítica es el katal (kat), pero es una unidad demasiado grande y suele usarse la unidad de actividad enzimática (UI). • 1 kat = 1 mol sustrato convertido x s-1 = 6 x 107 UI • 1 UI = 1 μmol sustrato convertido x min-1 = 16,67 nkat Otra unidad comúnmente usada es la actividad específica. Ésta se refiere a la actividad de una enzima por miligramo (mg) de proteína, y se suele expresar en: μmol x min-1 x mg-1). La actividad específica da una idea de la pureza de la enzima. Tipos de ensayo Según la fase de la reacción estudiada Todos los ensayos enzimáticos miden el sustrato consumido o el producto generado en la reacción durante un tiempo. Existe un gran número de métodos diferentes para medir la concentración de sustratos y productos, y muchas enzimas pueden ser ensayadas de diferentes maneras. Habitualmente en bioquímica se estudian las reacciones catalizadas por enzima usando cuatro tipos de experimentos:1 1. Medida de la velocidad inicial. Cuando una enzima se mezcla con un gran exceso de sustrato (a concentración saturante), el complejo intermedio enzimasustrato se genera en una rápida fase inicial transitoria. Después, la reacción llega a una cinética constante durante la cual el complejo enzima-sustrato se mantiene prácticamente en cantidades invariables en el tiempo y la velocidad de reacción es constante. La velocidad se mide en un corto periodo después de lograr un estado cuasi-constante, que se detecta típicamente monitorizando la acumulación de producto durante el tiempo. Como las mediciones se efectúan en un periodo muy corto y por la concentración saturante de sustrato, puede considerarse que el sustrato libre es igual al sustrato inicial y que la velocidad medida es la máxima que la enzima puede alcanzar en las condiciones de reacción dadas, porque no se están dando reacciones inversas o degradación enzimática. Estas mediciones son las más simples de realizar y analizar al estar relativamente libres de complicaciones, y por tanto éste el tipo de ensayo más usado en cinética enzimática. 2. Medida del progreso de la curva. En estos experimentos los parámetros cinéticos se determinan a partir de expresiones de las concentraciones de las diferentes especies como funciones del tiempo. La concentración del sustrato o del producto se mide en momentos posteriores a la rápida fase inicial y durante un tiempo lo suficientemente largo que permita a la reacción acercarse al equilibrio. Este tipo de ensayos se intenta evitar por el error matemático que se puede introducir y es cada vez menos practicado, pero fue muy ampliamente utilizado en los primeros periodos del estudio de la cinética enzimática. 3. Medida de la fase transitoria. En estos experimentos se observa el comportamiento de la reacción durante la rápida fase inicial transitoria en la que el complejo molecular intermedio llega a un periodo cinético constante.

Hay muchos tipos diferentes. a) Espectrofotométricos En los ensayos espectrofotométricos puede seguirse el curso de una reacción observando cómo cambia la luz absorbida por la solución en la que se está dando la reacción. Cuando la luz absorbida se encuentra en el espectro visible es posible observar un cambio en el color de la muestra. usando la Glucosa-6-fosfato deshidrogenasa. estos experimentos son relativamente insensibles a detalles mecanísticos y por lo tanto no suelen usarse para la identificación de mecanismos de reacción. Para poder utilizar un ensayo de este tipo debe haber entre los sustratos o los productos alguno que absorba luz a una longitud de onda determinada. sin necesitar trabajo adicional. y se estudia cómo regresa la mezcla al equilibrio. En éste. Así. la actividad de una oxidorreductasa que use NADH como coenzima puede ser monitorizada siguiendo el descenso de la absorbancia a 340 nm a medida que se consume el NADH. También es usual el uso de la luz ultravioleta (luz UV). 4. El análisis de estos experimentos requiere que la reacción sea reversible. en los que el método ofrece una lectura continua de la actividad monitorizando a tiempo real el sustrato consumido o el producto generado. Además.Éstos son los ensayos más difíciles de realizar porque requieren el uso de técnicas de mezclado y medición realmente rápidas. 1. Incluso cuando la reacción enzimática a estudiar no provoca ningún cambio de absorbancia o ésta no es específica. en los que la reacción se detiene en un punto y se mide la concentración de los sustratos o los productos. y que sea la única molécula de la mezcla de reacción que lo hace a la misma. se puede observar el aumento o la disminución de la absorbancia a dicha longitud de onda. Por otra parte existen ensayos discontinuos. la presión o el pH. Ensayos directos y acoplados Figura 1: Ensayo acoplado para medir la actividad de la hexoquinasa. especialmente porque sirve para monitorizar reacciones en las que participan NADH y NADPH. coenzimas que participan en infinidad de reacciones bioquímicas y que absorben luz UV en forma reducida (NADH y NADPH) pero no en forma oxidada (NAD+ y NADP+). Por una parte están los ensayos continuos. por ejemplo cambiando la temperatura. al obtener simplemente con el ensayo la velocidad de la reacción. y entonces hablamos de método colorimétrico. de esta forma. el producto de la reacción a estudiar se usa como sustrato de una segunda reacción. 1. En estos experimentos se perturba una mezcla de enzima. Ensayos continuos Son los más convenientes. Experimentos en la fase de equilibrio. que ha de ser de fácil . Según el seguimiento de la reacción Los ensayos enzimáticos pueden dividirse en dos grupos según la manera en que se sigue la medición. pueden usarse ensayo espectrofotométricos para la enzima realizando un ensayo acoplado. sustrato y producto que ha alcanzado el equilibrio químico.

pero pueden sufrir más interferencias por impurezas presentes en el medio o por la inestabilidad que muchos compuestos fluorescentes presentan al ser expuestos a la luz. que puede medirse acoplando la producción de glucosa-6-fosfato a la producción de NADPH usando la Glucosa-6-fosfato deshidrogenasa. por tanto. 1. como por ejemplo el 4-metilumbeliferil-β-D-glucurónido para ensayar la βgalactosidasa. En este caso. ya que son más específicos al tener que utilizar dos longitudes de onda en lugar de una. y las de reducción por el aumento. el uso de las coenzimas NADH y NADPH. las formas reducidas son fluorescentes y las oxidadas no. Algunas reacciones enzimáticas producen luz y ésta puede ser medida para detectar la formación de producto. ya que muchísimas reacciones llevan asociado algún cambio de calor y utilizando un microcalorímetro no es necesario utilizar grandes cantidades de enzima o sustrato.seguimiento y cuyos otros sustratos. coenzimas y enzimas deben encontrarse a concentraciones saturantes para que la velocidad de la segunda reacción sea la máxima. ser seguidas por el descenso de la intensidad de fluorescencia. en la figura 1 puede verse el esquema de un ensayo acoplado para la hexoquinasa. 1. Estos tipos de ensayo pueden ser extremadamente sensibles. porque no toda la luz emitida por la reacción será detectada. Por ejemplo. d) Quimioluminiscencia La quimioluminiscencia es la emisión de luz por una reacción química. . Estos ensayos son generalmente mucho más sensibles que los espectrométricos. Estos ensayos pueden ser usados para medir reacciones imposibles de medir con otros métodos. Las reacciones de oxidación pueden. Un ejemplo de estos ensayos es. También existen sustratos sintéticos que liberan un fluoróforo en reacciones catalizadas por enzima. b) Fluorimétricos En el fenómeno de la fluorescencia una molécula emite luz de una longitud de onda determinada tras absorber luz a otra longitud de onda. ya que la luz producida puede ser registrada en una película fotográfica por días e incluso semanas. 1. Quimioluminiscencia del luminol. c) Calorimétricos La calorimetría es la medida del calor liberado o absorbido por una reacción química. Los ensayos fluorimétricos usan la diferencia en la fluorescencia entre producto y sustrato para medir la reacción enzimática. pero al mismo tiempo son de difícil cuantificación. una vez más. Estos ensayos son muy generales.

la temperatura media del organismo del ser humano es 37 °C. Los iones interfieren con los débiles enlaces iónicos de las proteínas. la velocidad sería alta a altas temperaturas. la idea de de una velocidad "óptima" para una reacción enzimática es engañosa. a) Radiométricos En los ensayos radiométricos se mide la incorporación de radiactividad en los sustratos o su liberación desde sustratos. enzymatic chemiluminiscence) es un método común para detectar anticuerpos en el western blot. Sin embargo. Todas las enzimas trabajan en un rango de temperaturas específicas del organismo al que pertenecen. Las enzimas típicas son activas en concentraciones salinas de 1 a 500 mM. Aunque esta aproximación puede requerir grandes cantidades de material de partida. 2. 2.La detección de la peroxidasa de rábano por quimioluminiscencia enzimática (ECL. . Como los isótopos radiactivos permiten el marcaje de un sólo átomo de un sustrato. • pH. la pepsina estomacal tiene un pH óptimo de 2 y la tripsina de 8. Así. Ensayos discontinuos En un ensayo discontinuo se toman muestras de una reacción enzimática en intervalos y se mide en ellas la cantidad de producto formado o sustrato consumido. Los radioisótopos más usados en estos ensayos son 14C. En estos procedimientos la radiactividad es normalmente medida en contadores de centelleo. En cambio. todas tienen un pH óptimo. ya que la velocidad observada a cualquier temperatura es el producto de dos velocidades. su sensibilidad puede incrementarse mediante marcaje radiactivo de los sustratos o los productos. Los aumentos de temperatura generalmente provocan un incremento de la velocidad de reacción. la velocidad de reacción y la velocidad de desnaturalización. 32P. estos ensayos son extremadamente sensibles y específicos. 35S y 125I. las enzimas humanas comienzan a desnaturalizarse rápidamente a partir de los 40 °C. las enzimas de las arqueas termófilas. y usando un ensayo para cuantificar la formación de producto ésta sería baja a esas temperaturas. Son frecuentemente utilizados en bioquímica y son a menudo la única manera de medir una reacción específica en extractos crudos (mezclas complejas de las enzimas liberadas al lisar células). El pH puede detener la actividad enzimática al provocar la desnaturalización de la estructura proteica rompiendo enlaces iónicos y puentes de hidrógeno. La mayoría de las enzimas no pueden tolerar concentraciones de sal extremadamente altas. b) Cromatográficos En los ensayos cromatográficos se mide la formación de producto separando los componentes de la mezcla de reacción por cromatografía. Otro ejemplo de quimioluminiscencia es la luciferasa. • Temperatura. Si se usase un ensayo para medir esta segunda actividad por segundo. sin embargo. Normalmente se lleva a cabo mediante HPLC. La mayoría de las enzimas son sensibles al pH y tiene un rango específico en el que se detecta actividad. Existen excepciones como las enzimas de las algas y bacterias halófilas. La temperatura óptima de las enzimas humanas se encuentra generalmente entre los 35 y los 40 °C. La mayoría de las enzimas funcionan entre un pH 6 y 8. enzima presente en las luciérnagas que produce luz de forma natural a partir de su sustrato. son estables hasta a 100 °C. 2. Esto se debe a alteraciones de la estructura de la proteína debidas a la interrupción de uniones iónicas que resultan en la estabilización de la estructura tridimensional de la enzima. que se encuentran en manantiales calientes. luciferina. Factores que afectan al ensayo: • Fuerza osmótica.

sea cual sea la cantidad añadida. el límite de saturación limita la velocidad. Aumentando la concentración de sustrato aumenta la velocidad de la reacción o actividad enzimática. Una enzima está saturada cuando los sitios activos de todas las moléculas están ocupados la mayoría del tiempo. En un gráfico la velocidad de reacción habría alcanzado una meseta. Sin embargo.• Saturación del sustrato. . A partir del punto de saturación la reacción no puede acelerarse mediante adición de sustrato.