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Curso de verano

Biología Forense

La Rábida, 1 al 5 de agosto de 2005

Directores
Dra. Pilar Sanz Nicolás
Dr. Manuel López soto
LAS CIENCIAS FORENSES EN ESPAÑA. INTCF, IML, LABORATORIOS DE
POLICÍA CIENTÍFICA Y GUARDIA CIVIL

PILAR SANZ NICOLÁS


Directora de Departamento de Sevilla del Instituto Nacional de Toxicología
y Ciencias Forenses.

La definición más sencilla de Ciencia Forense, de acuerdo con la


Forensic Science Society del Reino Unido, es la que la considera como la
aplicación de los conocimientos científicos a cuestiones legales. Cuestiones
legales que puedan requerir la intervención de un científico son todos los
sucesos que necesitan la decisión de un juez o un jurado y en los que hay que
investigar causas que excedan de los conocimientos que aporta el derecho (un
robo, una falsificación de documentos, el derrumbamiento de un edificio, un
vertido a un río, una homicidio...).
Expertos de cualquier rama del conocimiento pueden ser llamados a
colaborar con la justicia. En ese mismo momento pasan a ser expertos
forenses. Recogerán información de las personas que han intervenido en el
suceso, del lugar en que ha ocurrido o de los objetos relacionados, para aportar
datos objetivos que ayuden a esclarecer el caso judicial. El biólogo forense
recogerá esa información de pistas biológicas (fluidos corporales, restos
humanos o animales, vegetales) que han ido quedando sobre los propios
implicados y en el lugar de los hechos o los objetos. Las analiza, las identifica,
las individualiza y colabora así a aclarar los hechos.
Los biólogos forenses intervienen en casos civiles, como son los
estudios de parentesco (por ejemplo filiaciones: reconocimiento o impugnación
de paternidad), en casos penales como puede ser un robo en el que el ladrón
se ha herido y ha dejado su sangre en un cristal, o en casos criminales
(homicidios, agresiones sexuales) y en desastres en masa (accidentales o
terroristas).
En la investigación de delitos (investigación de la escena del crimen,
CSI) intervienen muy distintos tipos de profesionales. Al lugar de los hechos
acuden distintos cuerpos policiales (local, nacional, guardia civil); también
puede ser necesaria la presencia de bomberos, si hay un incendio, una
inundación o cualquier otro percance que los requiera, del 061 y otros grupos
asistenciales si hay heridos o muertos. El primero que se entera avisa a la
policía y se pone el hecho en conocimiento del Juzgado de Guardia. Si hay
personas heridas o fallecidas acude el médico forense. También puede ocurrir
que una víctima de cualquier tipo de agresión acuda directamente a la policía,
al hospital o al Juzgado a poner la denuncia.
Esquemáticamente, el médico forense se encarga del reconocimiento de
las personas o de la autopsia en su caso, la policía inspecciona el lugar de los
hechos y busca al delincuente (que también puede ser atendido por el médico
forense). Tanto unos como otros, en el desempeño de su función, recogen
cuantos vestigios y objetos presenten interés y los envían al laboratorio para su
análisis.
Tanto Policía Nacional como Guardia Civil disponen de laboratorios
propios y los Médicos Forenses, actualmente organizados en Institutos de
Medicina Legal provinciales o regionales (según autonomías; algunos de ellos
disponen también de laboratorios), mandan las muestras al Instituto Nacional
de Toxicología y Ciencias Forenses (INTCF). Existen en España tres
Departamentos del INTCF, dependientes del Ministerio de Justicia, en Madrid,
Barcelona y Sevilla y una Delegación en Tenerife. No obstante esta
multiplicidad de laboratorios con funciones muy parecidas, pertenecientes a
distintos Ministerios, intercambian a menudo muestras e información.

Los laboratorios forenses realizan pruebas periciales y emiten informes


forenses.
LA PRUEBA PERICIAL EN LA RESOLUCIÓN DE DELITOS

PILAR SANZ NICOLÁS


Directora de Departamento de Sevilla del Instituto Nacional de Toxicología
y Ciencias Forenses.

La Administración de Justicia tiene una doble misión; por una parte el


conocimiento de la Ley y por otra la consideración de los hechos a los que se
aplica. En esta segunda misión, si se sobrepasa el conocimiento que
proporciona el Derecho es necesario recurrir a la prueba pericial.
“El Juez acordará el informe pericial cuando, para conocer o apreciar
algún hecho o circunstancia importante en el sumario, fuesen necesarios o
convenientes conocimientos científicos o artísticos” (Artículo 456 de la Ley de
Enjuiciamiento Criminal). Las pruebas periciales al ser actos jurídicos se rigen
por leyes, la de Enjuiciamiento Civil para los casos civiles (para nosotros los
estudios de filiación) y por la ley de Enjuiciamiento Criminal (LEC), donde están
definidos perfectamente todos los momentos y circunstancias de la prueba:
- La recogida y conservación de los vestigios o pruebas materiales
- Como debe describirse el lugar del delito y los objetos que se
encuentren.
- Como deben recogerse los vestigios o huellas para garantizar su
autenticidad
- En que circunstancias se recurre a la colaboración de peritos.
Es una ley que data de 1882 y aunque ha sufrido numerosas
modificaciones, la última en 2003, todavía conserva un lenguaje decimonónico
y habla de Ministerio de Gracia y Justicia como se denominaba antes. Cuando
habla de pruebas periciales se refiere normalmente a análisis de sustancias
químicas, y alguna vez cita los análisis biológicos. En la modificación última se
incluye un apartado dedicado al ADN.
El Perito se define como la persona no-jurista con conocimientos
especiales (“experto”), que informa al Juez sobre puntos litigiosos y el Perito
Biólogo es por tanto el facultativo especializado en Biología que proporciona
conocimientos y experiencias conforme a su profesión y emite dictámenes no
jurídicos. La Biología forense es muy amplia, abarca muchos aspectos y en el
Laboratorio de Biología Forense lo mismo hay que identificar plantas que setas,
realizar estudios microbiológicos, buscar diatomeas en sangre o tejidos de
personas ahogadas, identificar alimentos en un contenido gástrico, pero el
grueso del trabajo lo constituyen los estudios de parentescos y la
individualización de vestigios en casos penales o criminales. La herramienta de
elección es la individualización genética por lo que los laboratorios de Biología
Forense actuales están altamente especializados en Genética Molecular.
De acuerdo con la LEC, los Peritos pueden ser titulares (con titulación
académica) o no titulares y a su vez los Titulares pueden ser oficiales o no
oficiales. Los Peritos oficiales son funcionarios de un organismo estatal como el
INTCF.
Normalmente los jueces prefieren peritos titulares y, siempre que los
haya, oficiales y la LEC exige que la prueba pericial se lleve a cabo por dos
peritos.
En resumen, la prueba pericial es el “examen” de las pruebas por un
experto aunque la LEC se refiere a ella como reconocimiento o acto pericial,
porque presupone (pensemos en el siglo XIX) que se realiza en el transcurso
del juicio oral. Como es lógico los recursos técnicos que se aplican hace que el
“acto pericial” biológico se lleve a cabo en laboratorios especializados donde el
perito. por orden del Juez Instructor y a través del Instituto de Medicina Legal,
hace los análisis y emite los informes.

La prueba pericial auxilia a la administración de justicia, es eficaz y a


menudo decisiva (exclusión de una paternidad), pero no es vinculante, es decir
que no es obligatorio que jueces y tribunales se atengan a ella y resuelven
libremente de acuerdo con todos los demás datos y circunstancias del hecho.
MESA REDONDA

ACTUACION EN EL ESCENARIO DEL CRIMEN. POLICIA JUDICIAL.


LA INSPECCION OCULAR: BUSQUEDA Y RECOGIDA DE INDICIOS.
LA VICTIMA. EL AGRESOR.

MARIANO PERELLÓ RIUS


Laboratorio Biología/ADN de la Brigada Provincial de Policía Científica de
la Jefatura Superior de Policía de Andalucía Occidental.

INTRODUCCION: LA POLICIA CIENTIFICA

Se enuncia cual es la misión asignada a las unidades de Policía


Científica dentro de la estructura básica de la Dirección General de la Policía
así como las funciones desarrolladas por las mismas en la práctica habitual.
Breve explicación de cómo se incardina la actuación de la Policía
Científica en la investigación policial de un hecho delictivo.

LA INSPECCION OCULAR TECNICO-POLICIAL: OBJETIVO, FASES Y


MEDIOS

Definición genérica de la Inspección Ocular Técnico-Policial y su


concreción dentro del campo de actuación de la Biología Forense.
Antes de proceder a la Inspección Ocular propiamente dicha, es
preceptiva la realización de unas Actuaciones previas que abarcan tanto la
asistencia a la víctima como el aislamiento de la zona.
La Inspección Ocular tiene un triple objetivo: Comprobar la realidad del
delito y servir de base a la investigación (saber que hecho delictivo ha
ocurrido), Evidenciar los medios empleados (como se ha producido el delito)
e Identificar a los autores.
La investigación pericial de los indicios en general, y de los biológicos en
particular, consta de tres etapas:
- Búsqueda en la escena del delito.
- Recogida y envío al Laboratorio de los indicios.
- Investigación analítica de los mismos.
Es de capital importancia señalar que el resultado final de “la prueba del
ADN” va a depender en gran medida de la correcta ejecución de los procesos
de recogida y envío de muestras al laboratorio; y además, la admisibilidad de
dicha prueba en los Tribunales de Justicia también vendrá condicionada por el
cumplimiento de la cadena de custodia.

En cuanto a los medios que habitualmente se emplean en el examen del


lugar de los hechos, a efectos de la búsqueda y recogida de indicios biológicos
podemos englobarlos en dos apartados:
- Medios que facilitan la búsqueda y localización de los indicios
(reactivos químicos y equipos de iluminación).
- Medios empleados para la recogida de muestras (maletines de
Inspecciones Oculares y Kits de recogida).

BUSQUEDA DE INDICIOS BIOLOGICOS

Como introducción se enumeraran cuales son los indicios biológicos más


frecuentes en los Laboratorios Forenses.
La metodología a seguir en la búsqueda vendrá condicionada por las
circunstancias particulares de cada caso en concreto; si bien es muy
conveniente efectuar una interpretación “in situ” de los indicios antes de
manipular nada, ya que una correcta valoración de los mismos exige su estudio
dentro del contexto del lugar en que se ha producido el delito.
La búsqueda en sí debe de ser minuciosa, ordenada y sistemática,
extremando las precauciones para no pasar por alto algún indicio o destruirlo
inadvertidamente; siendo muy recomendable seguir los métodos de dividir la
escena en cuadrículas, que se irán examinando sucesivamente, o bien en
círculos concéntricos, tomando como centro el lugar que consideremos más
importante, por ejemplo, la ubicación del cadáver.
En cualquier caso, antes de proceder a la recogida, se debe documentar
la localización de todos los indicios biológicos que se vayan a recoger mediante
esquemas, fotografías o vídeo, lo cual nos podrá servir para poder plantear una
hipótesis sobre los hechos.
En cuanto a los lugares de búsqueda, vendrán condicionados por las
circunstancias particulares de cada caso en concreto. A título de ejemplo, se
describirá como se procedería en los casos más comunes (lugar cerrado,
abierto, vehículos, víctima y agresor).

RECOGIDA DE INDICIOS BIOLOGICOS

Durante el proceso de recogida es muy conveniente adoptar una serie


de precauciones que abarcan un doble ámbito: La protección del personal
encargado de la recogida y la protección de las muestras (esta última para
evitar distintos procesos que puedan afectar a su integridad, fundamentalmente
la posible contaminación de las mismas).
Como complemento a la práctica de la Inspección Ocular, en muchos
casos se efectúa la toma de las denominadas muestras de referencia o
indubitadas, que serían aquellas de las que sabemos de qué persona
proceden (víctima, sospechoso, cadáver) para su cotejo con las evidencias
recogidas en el lugar del delito (muestras dubitadas).
En lo referente a la recogida de indicios biológicos en el lugar de los
hechos, se enumerarán las normas básicas a seguir para efectuar una correcta
recogida de los indicios, con ejemplos de la casuística mas frecuente (manchas
en soportes pequeños y de fácil transporte, en soportes no transportables,
soportes absorbentes y no absorbentes, indicios húmedos, líquidos, pelos, etc.)
MESA REDONDA

ACTUACIÓN EN EL ESCENARIO DEL CRIMEN. POLICÍA JUDICIAL.


INSPECCIÓN OCULAR: BÚSQUEDA Y RECOGIDA DE INDICIOS
LA VÍCTIMA. EL AGRESOR

FÉLIX SÁNCHEZ UGENA


Director del Instituto de Medicina Legal de Badajoz.

La existencia de una persona fallecida en condiciones extrañas o de


forma violenta, supone un acontecimiento desde el punto de vista Policial y
Judicial que pone en marcha un dispositivo específico encaminado a esclarecer
las causas y circunstancias de ese fallecimiento.

Entre las actuaciones previstas está la práctica de la autopsia Médico


Legal, conforme a lo establecido en la Ley de Enjuiciamiento Criminal (Art. 343)
La autopsia judicial no se limita al examen interno del cadáver como
podría pensarse, sino que comprende una serie de pasos bien diferenciados y
de gran trascendencia cada uno de ellos, a saber:
- Inspección ocular y levantamiento del cadáver.
- Examen externo y examen interno del cadáver.
- Pruebas y estudios de laboratorio complementarios.

EL LEVANTAMIENTO DEL CADÁVER


Se trata de una actuación judicial por la que se constituye en el lugar de
los hechos la Comisión Judicial, formada por el Juez, el Secretario, el Médico
Forense y el Agente Judicial. Una vez practicada, el Juez ordena el
LEVANTAMIENTO DEL CADÁVER y su traslado al lugar donde vaya a
realizarse la autopsia.
La diligencia de inspección ocular y levantamiento del cadáver es de
extraordinario interés médico forense ya que como dice el profesor Gisbert un
examen a la ligera del cadáver en el lugar de los hechos puede invalidar y
hacer ineficaz la más minuciosa y perfecta de las autopsias.

En primer lugar, se trata de proceder al examen del cuerpo para


comprobar la realidad de la muerte, el momento estimado del fallecimiento y el
posible origen (natural o violento) de la misma. A continuación habrá que
recoger aquellos datos e indicios que nos permitan la posibilidad de reconstruir
los hechos, una aproximación a la causa, circunstancias de la muerte y la
posible intervención de terceros.
Para ello se tomará nota de los siguientes datos: posición del cuerpo y
relaciones con el entorno, examen somero de las ropas, apreciación de
lesiones de forma general, búsqueda y recogida de indicios biológicos y no
biológicos y cualquier otra circunstancia de interés. Es fundamental apoyar la
recogida de estos elementos con croquis, esquemas, fotografías o videos.

Ciñéndonos al tema que nos ocupa es evidente que en el estudio


biológico forense de un determinado caso nosotros somos el primer eslabón de
la cadena. De nada sirve un extraordinario laboratorio, con los mejores
recursos humanos y materiales, sí el médico forense no sabe que indicios
buscar, como los tiene que recoger y conservar y enviar y que tiene que
solicitar al laboratorio.

VESTIGIOS DE INTERÉS MÉDICO LEGAL

BIOLÓGICOS NO BIOLÓGICOS
- Sangre - Ropas
- Semen - Balas, tacos, perdigones
- Restos - Fibras diversas.
- Tejidos - Restos de pintura
- Uñas - Fragmentos de vidrio
- Mordeduras / saliva - Tierra
-Otros - Otros

CONSERVACIÓN DE LOS VESTIGIOS

A.- DURANTE EL TRASLADO B.- EN EL DEPÓSITO

- Evitar pérdidas y contaminaciones. - Mínima manipulación.


- Proteger las manos - No retirar envoltorio.
- Envolver el cuerpo. - No desnudar ni lavar.
- No obtener la necrorreseña.
RECUPERACIÓN DE LOS VESTIGIOS

I.- EXAMEN CUIDADOSO DEL CUERPO

- Búsqueda de elementos adheridos en ropa / piel.


- Toma de muestras de sangre.
- Toma de muestras de uñas
- Toma de muestra de boca / ano / vagina.
II.- RECOGIDA DE VESTIGIOS BIOLÓGICOS

III.- RECOGIDA DE VESTIGIOS NO BIOLÓGICOS

RECONOCIMIENTO Y RECOGIDA DE MUESTRAS DEL POSIBLE AUTOR

INSPECCIÓN GENERAL. Encaminada a la búsqueda de lesiones o signos de


lucha o defensa, que puedan orientarse hacia su participación en los hechos.

RECOGIDAS DE INDICIOS.
Ropas que llevaba en el momento de la agresión.
Muestras de pelos: cabellos, barba, bigote, vello púbico...
Muestras de sangre y/o saliva.
Hisopo lavado de glande.

OTROS PROBLEMAS MÉDICO LEGALES QUE NOS PUEDE RESOLVER


LA BIOLOGÍA FORENSE

− INVESTIGACIÓN BIOLÓGICA DEL PARENTESCO.


− INDIVIDUALIZACIÓN DE RESTOS HUMANOS.

− IDENTIFICACIÓN DE RESTOS ÓSEOS.

− ESTUDIO BIOLÓGICOS DE LA MUERTE POR SUMERSIÓN.


ENVÍO DE MUESTRAS AL LABORATORIO FORENSE

VICTORIA PRIETO RUIZ-CANELA


Facultativo del Servicio de Biología. Instituto Nacional de Toxicología y
Ciencias Forenses. Departamento de Sevilla

El estado actual de las técnicas de identificación genética hace posible el


análisis de cantidades trazas de restos biológicos y la convierten en una
herramienta imprescindible en la investigación de vestigios biológicos de
interés forense. Desde una colilla dejada en el lugar del crimen, un pelo o unos
escasos restos epiteliales restantes en unas uñas tras un arañazo son hoy
valiosas “pruebas” que pueden por si solas arrojar la información suficiente
para identificar a un sospechoso.

Sin embargo, paralelamente al aumento de sensibilidad en las técnicas


de detección de ADN, ha crecido el riesgo de contaminaciones exógenas de las
que puede derivarse el fracaso de la investigación. Además, una mala praxis
en la toma de muestras o el incumplimiento de la cadena de custodia puede
incurrir en la invalidación de la prueba ante los Tribunales.

Conscientes de estos riesgos, se han realizado desde hace tiempo


muchos esfuerzos encaminados a mejorar las condiciones de recogida de
indicios, su preservación y envío al laboratorio, como son la elaboración de
recomendaciones y normas para la recogida de muestras, diseño de protocolos
de actuación en su recogida y formularios que permitan sintetizar toda la
información referente a una muestra concreta.

En el año 1996, el Instituto Nacional de Toxicología y Ciencias Forenses


(INTCF) elaboró unas “Normas para la preparación y remisión de muestras
objeto de análisis por el Instituto de Toxicología”, que se publicaron en el BOE
nº 308 de 23 de diciembre de 1996 (Orden de 8 de noviembre de 1996) que
contiene, entre otros apartados, información sobre el tipo de muestras que
deben estudiarse, cómo deben enviarse y los formularios que deben
cumplimentarse cuando se solicitan análisis genéticos. Estas normas se
encuentran hoy en revisión para adaptarlas a las nuevas técnicas y se espera
su pronta publicación en el BOE.

Por otro lado, dentro del GEP-ISFG (Grupo Español y Portugués de la


Sociedad Internacional de Genética Forense) se elaboró un documento de
“Recomendaciones para la recogida y envío de muestras con fines de
identificación genética” en el año 1999, cuya misión es la de difundir buenas
practicas en la toma y manejo de muestras que permitan garantizar la
autenticidad e integridad de las mismas, así como asegurar el cumplimiento de
la cadena de custodia. Este documento se aprobó en la reunión del GEP-ISFG
del 2000 y fue publicado por el Ministerio de Justicia en el 2001 y difundido
entre todos los Médicos Forenses del Estado.

No existe aún en España una normativa oficial para la recogida de


muestras, aunque esperamos que se derive de actuales proyectos tales como
los de la ley de bases de datos de ADN y los procesos de acreditación de los
laboratorios forenses.

Entre los puntos más importantes que observaremos en relación con el


envío de muestras al laboratorio forense destacaremos las precauciones
destinadas a la protección del personal, las precauciones destinadas a la
protección de las muestras, la documentación necesaria y la toma de muestras.

1. Precauciones destinadas a la protección del personal.


En la manipulación de evidencias biológicas será necesario tomar
precauciones universales asumiendo que cualquier muestra puede ser
infecciosa: uso de guantes, mascarilla, bata u otra ropa protectora; prohibición
del consumo de bebidas, comidas y tabaco; uso de material desechable
siempre que sea posible y uso de contenedores específicos para residuos
biológicos; vacunación del personal (hepatitis, tétanos, etc.).

2. Precauciones destinadas a la protección de las muestras.


Todo lo expuesto anteriormente tiene cabida también en cuanto a la
protección de la muestra, que debe ser protegida tanto de la contaminación
biológica por otro material genético ajeno al de la evidencia como de la
degradación por una incorrecta manipulación de la misma.
La prevención de contaminaciones biológicas de la muestra debe
contemplarse en todos los estadíos de recogida, procesado previo y análisis de
las muestras y en este sentido la primera regla de oro a observar será: Nunca,
bajo ninguna circunstancia, se permitirá al sospechoso ocupar el mismo área
de la víctima (o viceversa) hasta que todas las evidencias se hayan recogido.
Esto incluye vehículos, salas de espera, salas de interrogatorio, etc. La misma
regla cuenta para el envío de muestras dubitadas e indubitadas que jamás
deben compartir el mismo embalaje, e incluso en el laboratorio durante el
alicuotado y procesado de las muestras debe observarse una separación
espacial y temporal entre evidencias y muestras indubitadas.
Además, deben preservarse las evidencias de la exposición a condiciones
medioambientales adversas que podrían favorecer la proliferación microbiana,
utilizar embalajes de papel con preferencia al plástico y nunca añadir
conservantes del tipo del formol.

3. Documentación necesaria.
- Formularios de envío de muestras en casos de interés criminal y de
investigación de la paternidad, especificando el tipo de estudio solicitado.
- Datos de identificación de la muestra.
- Cadena de custodia: nombre y firma del personal que recoge la muestra,
fecha y hora, y condiciones de almacenamiento hasta su envío. Fecha de
envío y medio de transporte utilizado.
- Documentos adicionales: informe preliminar de autopsia, antecedentes
clínicos, fotografías de la localización de los indicios, etc.

4. Toma de muestras.
- Muestras de referencia en personas vivas: sangre, saliva, pelos.
- Muestras de referencia en cadáveres: sangre, saliva, pelos.
- Muestras de referencia en cadáveres en avanzado estado de putrefacción
o esqueletizados: dientes, hueso largo.
- Otras posibles muestras de referencia: biopsias, preparaciones
histológicas, objetos personales del fallecido.... .
- Indicios biológicos: recoger en función de la naturaleza del indicio y del
soporte sobre el que se presenta. Empaquetar cada indicio por separado.
CRITERIOS DE ORGANIZACIÓN Y CALIDAD

PILAR SANZ NICOLÁS


Directora de Departamento de Sevilla del Instituto Nacional de Toxicología
y Ciencias Forenses.

El Laboratorio Forense reúne una serie de requisitos que lo hacen muy


diferente de otros tipos a los que estamos más acostumbrados como son los de
centros de investigación, universitarios o incluso los de algunas empresas.
Estos requisitos se refieren al propio tipo de trabajo, que por ser judicial
está sujeto a absoluta confidencialidad. El perito también tiene que reunir una
serie de requisitos, independientemente de su preparación técnica, y no puede
participar en una pericia si existen relaciones de parentesco, consanguíneo o
de afinidad, o amistad o enemistad, con el acusado o la víctima, tampoco si
tiene algún tipo de interés en la causa judicial. Y por último una de las
diferencias más importantes en el trabajo pericial lo constituyen las propias
muestras, sobre todo en los casos criminales.
Por tratarse de pruebas para el esclarecimiento de un delito, se les
denomina vestigios, suelen ser únicas, las más de las veces irrepetibles (salvo
las muestras de referencia que se toman a un acusado o a una víctima viva),
son limitadas y muy frecuentemente muy escasas, sobre todo desde que
disponemos de la tecnología del ADN y podemos analizar muestras mínimas.
Todo ello exige por parte del experimentador (facultativo o auxiliar de
laboratorio) altas dosis de cuidado y responsabilidad. Pero además, como
necesariamente tienen que estar perfectamente autentificadas, es obligatorio
conservar al menos una parte para futuros análisis y muchos de los objetos son
también piezas de convicción que hay que aportar al momento del juicio (un
arma, unas ropas), es necesario tener rigurosamente establecida y controlada
la cadena de custodia.
La cadena de custodia no debe presentar ni una sola discontinuidad;
debe en todo momento estar documentada la localización exacta de las
muestras originales, de las muestras de análisis, sus alícuotas y extractos.
Esta custodia abarca desde la entrega al Centro por el transportista, la entrega
al laboratorio, la conservación hasta el momento del análisis y durante el
mismo y la custodia postanálisis hasta la devolución de las muestras originales
al Juzgado cuando procede o su destrucción. Todos los cambios de ubicación
o de mano deben estar registrados y los posibles envíos al exterior
documentados (devoluciones al Juzgado o envío a otros Laboratorios para
ampliación de análisis).
El informe escrito está también estipulado y la LEC exige que conste una
descripción detallada de las muestras y de su estado, una relación detallada de
los análisis y de los resultados. Esto y la necesaria rigurosidad de los estudios
hace que se disponga de protocolos normalizados de trabajo para todas las
operaciones del laboratorio, de hojas de recogida de datos en los que se
consignan todas las circunstancias de cada ensayo y sus resultados y que
estos estén contrastados por los dos peritos que firman el informe. El
laboratorio forense debe estar por tanto sometido a medidas de control de la
calidad basadas en la norma internacional ISO17025 y a la larga tendrá que
estar acreditado.
Por último y como ya se ha dicho al comentar la necesidad de conservar
una parte de las muestras originales, las pruebas periciales pueden estar
sometidas a contraanálisis por otros peritos, para confirmar resultados no
aceptados por alguna de las partes (acusación o defensa). Por ese motivo y
para que los análisis puedan ser comparativos, los laboratorios forenses deben
utilizar Métodos Normalizados Oficiales desarrollados por Centros de
Referencia y regirse por normativas de carácter internacional. En el caso de la
Genética Forense estas normas las dicta la Sociedad Internacional de Genética
Forense a los que todos los miembros de los laboratorios de Biología Forense
de España pertenecemos. Para revalidar la calidad de nuestras pericias
realizamos además controles de calidad internos y ejercicios anuales
interlaboratorios.
TIPOS DE ESTUDIOS EN UN LABORATORIO DE BIOLOGÍA FORENSE

VICTORIA PRIETO RUIZ-CANELA


Facultativo del Servicio de Biología. Instituto Nacional de Toxicología y
Ciencias Forenses. Departamento de Sevilla

Si nos dejásemos llevar por nuestra imaginación, uno pensaría que no


hay nada imposible para un laboratorio de biología, en este caso forense, y
esto es porque la visión que la sociedad recibe de la biología moderna suele
ser a menudo una simplificación llena de falsedades procedentes del
sensacionalismo periodístico y de la ciencia-ficción. A pesar de los avances
tecnológicos, aún quedan cuestiones por resolver, tales como la data exacta de
una mancha, por ejemplo. Los tipos de estudios solicitados más
frecuentemente en un laboratorio de biología forense son:

Estudios de filiación: el caso más simple sería la investigación


biológica de la paternidad o maternidad en un trío hijo-madre-padre o bien
contando únicamente con el progenitor cuestionado y el hijo. Las
complicaciones aparecen cuando no es posible contar con el progenitor
cuestionado por fallecimiento, siendo necesario en tal caso recurrir al análisis
de otras muestras biológicas del fallecido, al análisis de familiares directos de
éste que permitan reconstruir su genotipo o incluso a la exhumación del
cadáver.

Estudios de identificación de restos cadavéricos: se realiza mediante


el análisis biológico de maternidad o paternidad o en su defecto análisis de
otros familiares que compartan la línea materna o paterna. También puede
recurrirse al análisis de otras muestras biológicas del fallecido o de objetos
personales del mismo.

Identificación de indicios biológicos de interés criminal: son el tipo


de análisis más solicitado en el laboratorio de biología forense. Todos los
indicios recogidos sobre la víctima, el sospechoso o el lugar de los hechos
deben ser objeto de un minucioso y exhaustivo estudio que permita localizar,
conocer o confirmar la naturaleza de los indicios, que variaran en función de las
características del suceso investigado. Los vestigios biológicos más frecuentes
son los restos de sangre, fluidos seminales, fluidos vaginales, saliva, pelos y
restos orgánicos en uñas. Otro tipo de restos biológicos menos frecuentes son
la orina, las heces, la caspa, las uñas... . En el próximo tema de este curso
tendremos ocasión de conocer en detalle cuales son los métodos de detección
de estos indicios en función de sus características, los tipos de soporte más
frecuentes sobre los que se encuentran así como sus posibilidades de
individualización.

Identificación de especie: determinados restos hallados casualmente


pueden ser indicios de hechos delictivos que puedan ser causa para abrir una
investigación. La solicitud de identificación de especie suele ir frecuentemente
ligada al hallazgo de restos óseos muy fragmentados o cualquier otro resto
orgánico del que pueda sospecharse un origen humano.

Estudios complementarios en casos de muerte por sumersión-


asfixia: siempre que se recupera un cadáver del agua o cuando se sospecha
que la causa de la muerte puede haber sido la sumersión, será necesario
confirmar los datos macroscópicos obtenidos en la autopsia mediante estudio
anatomopatológico y considerar otros datos tales como la existencia de
hidremia ( hemodilución de la sangre del ventrículo izquierdo respecto de la del
derecho) y la existencia de elementos formes en las vísceras del cadáver que
deben compararse, siempre que sea posible, con las del líquido de sumersión.

Estudios bioquímicos en casos de muertes súbitas e


intoxicaciones: En casos de shock anafiláctico, los marcadores biológicos que
se investigan son la histamina, la triptasa y la IgE total y la específica. En casos
de muerte súbita interesa la determinación de glucosa, urea, creatinina y
cloruros. En casos de intoxicación por organofosforados y carbamatos se
procederá a la determinación de acetilcolinesterasas y/o pseudocolinesterasas.

Identificación de setas y plantas superiores en casos de


intoxicación: cuando se sospecha una intoxicación debida a setas o plantas
tóxicas es necesario la identificación del elemento tóxico para confirmar si es el
responsable de los síntomas observados. La confirmación del origen de la
intoxicación servirá para adecuar el tratamiento médico al tóxico concreto en
función de su naturaleza. A tal fin, deben enviarse al laboratorio los
especimenes completos responsables de la intoxicación, si se cuenta con ellos,
o restos cocinados o de contenido gástrico. Es posible identificar restos de
setas en contenido gástrico o en otras muestras utilizando técnicas de ADN,
como veremos a lo largo de este curso.

Estudios microbiológicos en muestras postmortem en casos de


etiología no aclarada: en el caso concreto del INTCF se realizan únicamente
en el Departamento de Madrid y su finalidad es intentar arrojar algo de luz en
aquellos casos de muertes de etiología desconocida en los que se sospeche un
origen infeccioso. Si durante el curso de la investigación se detecta algún
patógeno de reconocida alarma social tal como el meningococo, en
colaboración con otros centros de referencia se procederá a informar a la
consejería de salud correspondiente y a la puesta en marcha de los
dispositivos de control epidemiológico.

Estudio del contenido gástrico: en algunos casos, conocer el estado


de la digestión así como la naturaleza de la última comida puede aportar datos
en una investigación. A menudo, la integridad de los fragmentos de alimento
hallados en un contenido gástrico podría indicar un período corto de digestión,
sin embargo, este dato no puede correlacionarse con una ingesta inmediata al
momento de la muerte ya que pueden confluir muchos factores que hacen esta
correlación muy inexacta. Los estados emocionales del individuo así como la
propia naturaleza de los alimentos influyen en el tiempo de digestión y
permanencia de los alimentos en el estómago.
IDENTIFICACIÓN DE INDICIOS

VICTORIA PRIETO RUIZ-CANELA


Facultativo del Servicio de Biología. Instituto Nacional de Toxicología y
Ciencias Forenses. Departamento de Sevilla

Los tipos de indicios más comúnmente estudiados en el laboratorio de


biología forense son los restos de sangre, semen, fluidos vaginales, saliva y
pelos, que se presentan sobre una amplia variedad de soportes. Casi todos
tienen en común que son escasos, están degradados o contaminados y son
únicos e irrepetibles. La localización de una determinada evidencia de asiste a
menudo con el uso de una fuente de luz forense que nos permite la utilización
de diversas longitudes de onda y diversos filtros para detectar la fluorescencia
típica de los fluidos orgánicos. En nuestro laboratorio contamos con una de
estas fuentes (MCS-400 de Spex Forensics) basadas en el uso de distintos
filtros, que han ido reemplazando a las fuentes laser por sus ventajas en el
campo forense. Tras ser localizado, realizaremos una serie de pruebas
preliminares, específicas para cada tipo de indicio, con las que estableceremos
el diagnóstico de orientación o de certeza sobre la naturaleza del indicio.

Sangre: es un tipo de indicio fácilmente reconocible sobre determinados


soportes. Existe una amplia variedad de tests de diagnóstico previo que ponen
de relieve su presencia (luminol, benzidina, fenolftaleina, o-toloidina, guayacol,
verde leucomalaquita...). Los tipos de soporte más comunes sobre los que se
presenta son ropas, armas, uñas, en el lugar de los hechos (tierra, suelo,
piedras, paredes..). El estudio de la morfología de las manchas en la escena
del delito proporciona información a cerca de cómo se produjeron los hechos.

Semen: el principal componente celular del semen es el


espermatozoide, célula especializada flagelada que suele medir entre 50 y 55
µm, distinguiéndose básicamente dos partes: cabeza y cola. Su número puede
variar entre 50 x 106 y 150 x 106 por mililitro de eyaculado, con una media de
unos 100 x 106/ml en individuos normospermos. El volumen de eyaculado
también varía entre unos 2 ml y 6 ml con un valor medio de unos 3,5 ml. Existe
una gran variabilidad en estos datos no sólo entre individuos, sino también
dentro del mismo individuo según la edad o entre distintos eyaculados. Además
de los espermatozoides, en el semen podemos encontrar otros elementos
formes tales como leucocitos y células epiteliales del tracto urinario aunque en
número mucho menor. Así, si en un individuo normospermo podemos esperar
unos 450 µg de ADN/ml de eyaculado, en un individuo azoospérmico
esperaremos unos 30 µg, esto es, sólo un 6,3% del normal.
Otros rasgos característicos del semen son su pH básico (8,3) y su
capacidad de fluorescer en la región visible del espectro cuando es irradiado
con luz ultravioleta. La presencia característica de altas concentraciones de
fosfatasa ácida y de una proteína específica (proteína P30 ó PSA) serán rasgos
que se utilicen en el diagnóstico previo ( test presuntivos) en la investigación de
restos de semen. Las técnicas de confirmación implican la observación de
espermatozoides en preparaciones microscópicas realizadas a partir de las
muestras a analizar.

Fluidos vaginales: las células del epitelio vaginal sintetizan glucógeno


bajo la acción de los estrógenos. La identificación de estos restos se basa en
esta particularidad (Reacción de PAS (+) Periodic Acid-Schiff) así como en la
presencia de flora bacteriana característica (bacilos de Döderlein). Sin
embargo, este carácter glucogenogénico está ausente en mujeres
amenárquicas (aunque las terapias con estrógenos pueden afectar esto) y
sufre variaciones durante el ciclo menstrual, alcanzándose los niveles más
altos de glucógeno durante la ovulación. Estas células no son exclusivas del
epitelio vaginal ya que se encuentran también en menor cantidad en la boca y
en el tracto uretral de hombres (en concreto en la fosa navicular). Por tanto, el
hallazgo de unas pocas células puede ser comprometido, hecho que se da a
veces cuando se solicita la localización de células procedentes del epitelio
vaginal en un hisopo penil.

Saliva: a menudo estos restos se hallan en cantidades mínimas, por lo


que es comprometido decidir entre la identificación del tipo de vestigio o la
obtención del perfil de ADN. Los humanos producimos entre 1 y 1,5 litros de
saliva al día y, acompañando a la saliva, se encuentran las células
descamadas del epitelio bucal que serán el sustrato para la extracción de ADN
en estos restos. Las pruebas de orientación se basan en la detección de
actividad alfa-amilasa. Esta enzima no es específica de la saliva, se encuentra
también en el páncreas, en el sudor, en la leche materna, en el semen y en los
fluidos vaginales. Puede considerarse un buen marcador para la presencia de
saliva ya que sus niveles son 50 veces más altos en saliva que en el resto de
fluidos orgánicos. Las amilasas se encuentran también en animales (tipo alfa-
amilasas) y en plantas (tipo beta-amilasas). Para la confirmación de presencia
de restos de saliva deberán observarse células del epitelio bucal en los
extractos de las muestras. Los soportes más comunes son colillas, sellos,
sobres, mordazas, mordeduras, manchas en ropas, chicles, vasos... .

Pelos: en los mamíferos, el pelo atraviesa tres fases en su ciclo de


crecimiento, anágena, catágena y telógena. La fase anágena es la fase de
crecimiento activo del pelo, en ella las células del folículo se multiplican por
mitosis y forman el pelo al queratinizarse completamente. Un cabello humano
crece a un ritmo aproximado de 0.35 mm por día. La fase catágena es una
transición entre el estado de crecimiento activo y el estado de no crecimiento.
En la fase telógena, ha cesado la actividad del folículo.
Una cabeza humana tiene aproximadamente entre 100.000 y 150.000
folículos pilosos, de los cuales entre el 80 y el 90% estarán en fase anágena y
entre el 10 y el 20% en fase catágena o telógena. En nuestra actividad diaria,
los humanos perdemos entre 50 y 100 pelos. A menudo un perito es
consultado sobre la cuestión de sí un determinado pelo hallado en la escena de
un crimen puede haber sido arrancado o simplemente cayó allí. Si el pelo fue
arrancado por la fuerza muy probablemente quedará tejido folicular adherido a
la base del pelo, sin embargo es posible arrancar pelos que estuviesen en fase
telógena o que no cuenten con ningún tejido adherido a la base. Por tanto, la
ausencia de tejido folicular no prueba necesariamente que el pelo fuese caído y
no arrancado. A diferencia de los cabellos, los pelos púbicos pasan más tiempo
en fase telógena que en anágena. La mayoría de los pelos que encontraremos
en casos de agresión sexual serán telógenos. De entre todas las evidencias,
los pelos son los más susceptibles de transferencias secundarias.
Restos en uñas: una excoriación leve en la piel, cuyas señales
desaparezcan a las 24 horas, puede dejar restos epidérmicos en las uñas
suficientes para obtener un perfil de ADN por PCR.
Un estudio realizado entre voluntarios que se produjeron excoriaciones
leves y superficiales que desaparecieron dentro de las 24 horas posteriores al
experimento concluyó que: los dedos índice y medio producen los arañazos
más largos y profundos; a igual fuerza aplicada, en los arañazos sobre
regiones de piel más suave tales como el cuello o zona superior del brazo se
recuperaron restos epidérmicos pero no así en zonas de piel muy curtidas
como el antebrazo; se encontró una correlación entre la fuerza aplicada y la
cantidad de ADN recuperado.

Otros tipos de indicios menos frecuentes en el laboratorio: a veces


se solicita al laboratorio el análisis de restos que, aunque no son habituales,
pueden aportar datos importantes a la investigación de un caso determinado.
Entre estos restos podemos citar:
Restos de orina: La identificación de la orina se basa en la detección de
iones o compuestos orgánicos que se hallan más concentrados en orina que en
otros fluidos fisiológicos, tales como la urea o creatinina, también presentes en
sudor, sangre, saliva, semen... pero en menor concentración. Contiene células
epiteliales del tracto urinario, así como leucocitos y eritrocitos, muy diluidas en
la orina, por lo que la esperanza de recuperar ADN a partir de manchas de
orina es muy baja. Además, la flora bacteriana propia de la orina acelera los
procesos de degradación en la muestra.
Heces: La identificación de restos fecales se basa en la presencia de
pigmentos biliares y de restos alimenticios no digeridos. Son un pésimo
sustrato para la extracción de ADN. No es posible el estudio de ADN nuclear en
estos restos debido a la extrema degradación y a su contaminación natural
(aproximadamente la tercera parte del peso seco de las heces son bacterias).
Sin embargo, si se han conseguido resultados en ADN mitocondrial, en
concreto la región HV1, partiendo de 10 mg de heces frescas.
Otros restos también analizados en el laboratorio son secreciones
nasales, uñas, restos de tejido, caspa...
TECNOLOGÍA DEL ADN EN EL PROCESADO DE MUESTRAS FORENSES

MANUEL LÓPEZ SOTO


Facultativo del Servicio de Biología. Instituto Nacional de Toxicología y
Ciencias Forenses. Departamento de Sevilla.

De todas las partes que comprende una investigación criminal, ésta que
a continuación desarrollaremos, pondrá de manifiesto la capacidad pericial y
profesional del laboratorio de biología forense. De forma general y una vez que
tenemos seleccionadas las muestras objeto de análisis, todo el proceso
analítico se puede dividir en tres grandes bloques: EXTRACCIÓN de ADN,
AMPLIFICACIÓN (PCR) y DETECCIÓN.

Extracción de ADN
Posiblemente, de los tres bloques citados anteriormente, la extracción
constituya el paso más crítico, ya que cualquier manipulación errónea de la
muestra en esta etapa inicial del proceso puede conducirnos a su descarte,
siendo en algunos casos, el único indicio biológico de que se dispone para
resolver un delito.
Cualquier laboratorio forense debe contar con diferentes métodos de
extracción que permitan obtener en cantidad y calidad suficiente ADN de la
enorme variabilidad muestral que recibe. Los métodos de extracción se pueden
dividir en tres grupos:
a) Aquel que comprende una digestión, una extracción orgánica y una
purificación-concentración o, como alternativa, una precipitación con
etanol. Se utiliza para la mayoría de las muestras biológicas de
interés forense.
b) Aquel que comprende una etapa de digestión seguida de una
precipitación con etanol. Se usa, principalmente, para obtener mucha
cantidad de ADN a partir de sangre en buen estado.
c) Aquel que comprende solo una extracción directa mediante
membranas especiales o bolas de sílice o similares. Su uso se limita
normalmente a muestras de sangre líquida.

Centrándonos en el primer método de extracción, y en concreto en la


digestión lo que se consigue con ella es romper toda la estructura celular, es
decir, se alteran todos los sistemas membranosos de la célula así como todas
las estructuras en las que estén implicadas proteínas (nucleosomas,
citoesqueleto celular, etc.), dejando el ADN libre. Para ello, se utiliza un
tampón de lisis con detergente (SDS) para solubilizar los lípidos y una enzima
proteolítica (Proteinasa K) para lisar las proteínas.
Una vez que se encuentran todos los componentes celulares libres entre
sí, pasamos al proceso de extracción propiamente dicho, donde se recuperará
el ADN de todo ese “caldo molecular”. El método más extendido de todos es el
de extracción orgánica con fenol cloroformo isoamílico (FCI). Al mezclar esta
solución de FCI con el lisado celular obtenido de la etapa de digestión se
genera una emulsión, que después de un centrifugado, permitirá separar el
ADN de todo el material celular, aunque a veces junto con el ADN se separen
otras moléculas que ser una fuente potencial de inhibidotes para el proceso de
amplificación. Seguidamente, se añade N-butanol para eliminar los posibles
restos de fenol que pudieran haber quedado en la solución acuosa. A
continuación, esta solución acuosa se pasa por unidades de microfiltración-
purificación para obtener un ADN lo más “limpio” posible, óptimo para el
proceso de amplificación. Alternativamente a esta última etapa podremos llevar
a cabo una precipitación con etanol.
Como ejemplo de métodos de extracción directa expondremos la
extracción con Chelex y con columnas GFx, entre otros.
Por último, realizaremos un recorrido por los distintos tipos de muestras
que llegan al laboratorio y por los métodos de extracción que se aconseja
aplicar en cada caso. Además, se abordará brevemente la cuantificación del
ADN humano y sus diferentes métodos.
Amplificación de ADN
Sin lugar a dudas, posiblemente el desarrollo de esta tecnología de la
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) y su aplicación a la biología
molecular ha permitido que este campo de la ciencia se haya desarrollado a un
ritmo espectacular. El proceso en sí mismo es muy sencillo; utilizando solo
unos cuantos “ingredientes” se puede multiplicar (en millones de copias)
cualquier fragmento de ADN que queramos. Desde el punto de vista molecular
se requiere exclusivamente dNTPs, Cl2Mg, cebadores, polimerasa
termorresistente, agua y el molde de ADN que se quiera multiplicar. El proceso
de amplificación se puede dividir en tres etapas:
a) Desnaturalización del ADN a 95ºC
b) Annealing o unión de los cebadores al molde de ADN
c) Extensión, es decir, la polimerasa empieza a fabricar la nueva
cadena de ADN.
Como requerimiento instrumental se necesitará un Termociclador.
En definitiva, la PCR constituye un método fiable, sencillo, rápido y
económico.

Sistemas de detección de ADN


Hace unos años, la gran mayoría de los laboratorios de genética
molecular utilizaba como principal sistema de detección, geles de poliacrilamida
seguidos de una tinción con plata. Sin embargo, con el desarrollo de los
secuenciadores automáticos, que combinan química y fluorescencia tanto en
su formato de gel como de capilar, no solo se ha mejorado en gran medida la
calidad y la rapidez en la detección de un producto amplificado, sino que
además ha permitido incluso analizar simultáneamente fragmentos de ADN del
mismo peso molecular. Dentro de los secuenciadores automáticos parece que
ha tomado ventaja en el mercado el de capilar respecto al de gel entre otras
razones porque requiere una menor manipulación de la muestra y permite
reanalizarla sin tener que volver a prepararla. En la actualidad existen varios
modelos de secuenciadores del formato de capilar: uno, cuatro, dieciséis y
noventa y seis capilares.
APLICACIÓN FORENSE DE MICROSATÉLITES AUTOSÓMICOS

MARÍA JOSÉ FARFÁN Espuny


Jefa del Servicio de Biología. Instituto Nacional de Toxicología y Ciencias
Forenses. Departamento de Sevilla

La primera aplicación de la tecnología del ADN a la resolución de un


caso judicial data de 1985, cuando las autoridades británicas exigieron una
prueba biológica de filiación en un asunto de inmigración en el que con la
batería de ensayos disponibles en ese momento se pudo deducir que el joven
ghanés investigado pertenecía al entorno familiar de su supuesta madre, pero
no se podía resolver si era su hijo biológico o su sobrino. Para resolver el caso
se solicitó la colaboración de Alec Jeffreys que acababa de publicar la
posibilidad de aplicar el análisis de determinadas regiones repetitivas y muy
polimórficas del ADN a cuestiones de identificación humana, incluidos los
estudios de filiación. Mediante el análisis de la huella genética del joven y de
sus presuntos madre y tres hermanos pudo confirmarse la maternidad.

Desde entonces, la tecnología del ADN ha experimentado un


espectacular avance del que se ha visto beneficiada enormemente la Genética
Forense. Actualmente la “prueba del ADN” constituye una pericia de enorme
trascendencia en muchos casos judiciales lo cual ha supuesto en los últimos
años un incremento considerable en la intervención de este tipo de pericias en
los tribunales de justicia.
En una célula humana, el ADN se localiza principalmente en el núcleo,
aunque también existe una pequeña cantidad de ADN en las mitocondrias, de
cuya aplicación forense se hablará en otro capítulo. El ADN nuclear se
encuentra dividido y muy compactado en los cromosomas, que son unas
estructuras muy densas formadas por ADN y proteínas. El genoma humano
nuclear está constituido por 22 pares de cromosomas autosómicos y un par de
cromosomas sexuales, X e Y, cuya combinación determina el sexo femenino
(XX) o masculino (XY).
La mayor parte de los análisis de identificación genética humana se
centra en marcadores polimórficos localizados en regiones no codificantes de
los cromosomas autosómicos. Casi la mitad del ADN no codificante está
constituido por ADN repetitivo, en el que destacan las secuencias repetidas en
tándem, constituidas por una secuencia determinada que se repite
consecutivamente una detrás de la otra un número variable de veces.
Atendiendo al tamaño de la unidad de repetición, estas secuencias se
denominan satélites (unidad de repetición: 1 000-10 000 nucleótidos),
minisatélites (unidad de repetición: 7-100 nucleótidos) y microsatélites o STRs
(“Short Tandem Repeats”) (cuya unidad de repetición contiene de 2 a 6
nucleótidos), siendo éstos últimos los más ampliamente utilizados en Genética
Forense.

Análisis de STRs mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

La introducción de la PCR en Genética Forense ha hecho posible el


análisis de una gran variedad de muestras cuyo estudio resultaba imposible
mediante las técnicas convencionales. La PCR permite la obtención in vitro de
millones de copias de un fragmento de ADN específico a partir de una cantidad
ínfima de ADN mediante una reacción enzimática cíclica.

Dados los espectaculares avances científicos y tecnológicos


experimentados en los últimos años (que incluyen el desarrollo de múltiples
fluorocromos para el marcaje diferencial de fragmentos de ADN y plataformas
complejas de detección capaces de discriminar selectivamente entre ellos), hoy
en día se pueden analizar de forma conjunta 15 STRs o más a partir de tan
sólo 0,1-1 ng de ADN, obteniéndose un perfil genético suficiente para la
individualización de un resto biológico.
La principal ventaja de la aplicación de la PCR al laboratorio forense
reside en el espectacular incremento en la sensibilidad de la técnica de
individualización por ADN. No obstante, ello conlleva el inconveniente de un
elevado riesgo de contaminación. Además, aunque la PCR ha supuesto una
revolución en biología forense, presenta una serie de limitaciones que a veces
son muy difíciles de salvar y que se refieren principalmente a las posibilidades
de degradación, inhibición de la reacción de PCR o la modificación del ADN.
Por otra parte hay que tener en cuenta que durante la amplificación por PCR de
marcadores STRs pueden originarse una serie de artefactos que pueden
interferir con una clara interpretación de los resultados y cuya consideración es
necesaria para garantizar un correcto genotipado.

Por otra parte, con cierta frecuencia llegan al laboratorio muestras en las
que se detectan perfiles genéticos que reflejan la presencia de una mezcla de
células procedentes de más de un individuo cuyo análisis es más complicado y
laborioso que en casos de perfiles únicos y requiere un alto grado de formación
y experiencia por parte del perito para distinguir entre los alelos verdaderos
presentes en la mezcla y los posibles artefactos, lo cual no siempre es posible.

STRs autosómicos de uso generalizado en genética forense


Con fines de identificación humana es importante disponer de
marcadores de ADN que exhiban una alta variación entre individuos y que en
conjunto permitan discriminar entre ellos. Actualmente existen miles de STRs
identificados y se calcula que en el genoma humano existe un STR cada 10 000
pares de bases. En los criterios a seguir para la selección de STRs con
aplicación en identificación humana deben primar los siguientes factores: alto
poder de discriminación, alta heterocigosidad, localización en distintos
cromosomas para evitar el ligamiento entre marcadores, robustez y
reproducibilidad de resultados en reacciones múltiplex, baja tasa de mutación y
longitud de alelos en el rango de 90-450 pares de bases.

Para un intercambio y comparación de resultados efectivo entre distintos


laboratorios es necesaria la utilización de una batería de marcadores genéticos
comunes. Actualmente, los marcadores más extendidos en el ámbito mundial
son los 13 STRs autosómicos integrados en el sistema CODIS (“Combined
DNA Index System”) establecido en 1997 por el FBI para la creación de un
banco de datos nacional. La probabilidad de coincidencia al azar entre
individuos no relacionados mediante el análisis de los 13 marcadores del
CODIS es inferior a uno en un billón.
APLICACIÓN FORENSE DE LOS CROMOSOMAS X e Y

MARÍA JOSÉ FARFÁN ESPUNY


Jefa del Servicio de Biología. Instituto Nacional de Toxicología y Ciencias
Forenses. Departamento de Sevilla

Aparte de los STRs autosómicos, estrellas de la individualización


mediante técnicas de ADN y a los que hemos dedicado el capítulo anterior,
existen marcadores genéticos de especial relevancia en los cromosomas
sexuales, cuyas peculiaridades los hacen idóneos para determinadas
aplicaciones concretas.

Un marcador de sexo: amelogenina

La amelogenina es un locus localizado en una región homóloga de los


cromosomas sexuales. Existe una diferencia de 6 pares de bases entre el
tamaño del alelo presente en el cromosoma X y el Y, que se debe a una
pequeña deleción en el cromosoma X. El resultado de la amplificación por PCR
de este locus en un ADN femenino (XX) será de una única banda, mientras que
si el ADN es masculino (XY), el resultado serán dos bandas de distinto tamaño.
La mayoría de los kits comerciales actuales incluyen este marcador, que
permite la designación del sexo del individuo donante de la muestra. No
obstante, hay que tener en cuenta que, aunque ocurre con muy baja
frecuencia, se ha detectado la existencia de deleciones en esta región del
cromosoma Y, de tal forma que una muestra masculina podría asignarse
erróneamente como femenina. En este caso, el análisis de marcadores
específicos del cromosoma Y permitirían una correcta asignación del sexo.

STRs del cromosoma Y

El cromosoma Y presenta una diferencia importante respecto al resto de


cromosomas, su herencia es exclusivamente paterna, es decir, se transmite de
padres a hijos varones sin que exista la posibilidad de recombinación. Por
tanto, la información genética contenida en el mismo se hereda como haplotipo,
o sea, los genotipos para cada uno de los marcadores del cromosoma Y se
transmiten en bloque y no de forma independiente. De esta forma, salvo
posibles mutaciones, todos los individuos varones emparentados por vía
paterna comparten el mismo haplotipo para el cromosoma Y.
En los últimos años, el análisis de marcadores del cromosoma Y se ha
extendido en los estudios de evolución humana para trazar linajes paternos. En
Genética Forense, estos marcadores han demostrado también su utilidad en
casos de mezclas complejas, en estudios de filiación cuando los individuos
implicados son varones y resultan de especial utilidad en los casos de agresión
sexual. En éstos es común encontrar indicios donde existe una mezcla de
células femeninas de la víctima y masculinas del agresor. Aunque existen
métodos de extracción basados en una lisis diferencial que permite la
separación del ADN de las células epiteliales (normalmente vaginales) del ADN
de los espermatozoides, esta separación no siempre es posible, especialmente
si los espermatozoides están muy deteriorados o el agresor es azoospérmico.
En estos casos, el uso de marcadores específicos del cromosoma Y aumenta
las posibilidades de detectar pequeñas cantidades de ADN masculino
presentes en un fondo de abundante ADN femenino, el cual en otro tipo de
análisis (STRs autosómicos, por ejemplo) enmascararía la obtención de
resultados a partir del ADN masculino.
La limitación de este tipo de análisis reside en que, dado que el
cromosoma Y no está sujeto a recombinación, es menos variable entre
individuos, por lo que es necesario el análisis de muchos marcadores para
obtener un alto poder de discriminación.

STRs del cromosoma X

En las células femeninas existe una pareja de cromosomas X de forma


que éstos pueden recombinar entre sí comportándose de la misma forma que
los cromosomas autosómicos, hablando en términos de su herencia. No
obstante, los individuos varones transmiten a su descendencia femenina todos
los marcadores localizados en su cromosoma X en bloque, es decir, uno de los
cromosomas X de cada mujer es idéntico al de su padre. Esta peculiaridad
proporciona una herramienta útil en casos de paternidad con descendencia
femenina así como en estudios de filiación o identificación en los que el
presunto padre no está disponible y hay que recurrir a familiares en primer o
segundo grado de parentesco.
APLICACIÓN FORENSE DEL ANALISIS DEL ADN MITOCONDRIAL

MANUEL CRESPILLO MÁRQUEZ


Facultativo del Servicio de Biología. Instituto Nacional de Toxicología y
Ciencias Forenses. Departamento de Barcelona.

Todo el patrimonio genético que poseemos los seres humanos se


encuentra confinado en dos orgánulos celulares: núcleo y mitocondria dando
nombre al ADN que en dichos estructuras se localiza: ADN nuclear (ADNn) y
ADN Mitocondrial (ADNmt). La mayor parte del ADN celular se encuentra
empaquetado en el núcleo, sin embargo, las mitocondrias, que se encuentran
ubicadas en el citoplasma y constituyen las autenticas plantas generadoras de
energía de la célula, poseen un ADN propio dispuesto circularmente y cerrado
que se encuentran en múltiples copias dentro de la célula (1000 a 10000
copias).
Por su composición bioquímica, las dos cadenas son diferentes, ya que
en la secuencia nucleotídica de una de ellas prevalecen las bases púricas
(adenina y guanina), por lo que es más pesada que su complementaria donde,
para respetar la complementariedad han de predominar las pirimidínicas (timina
y citosina). Así la primera de las hebras se denomina H (Heavy o pesada) y a la
segunda L (Light o ligera).
El ADNmt tiene 16569 pares de bases y en esa secuencia se distribuye
37 genes que codifican aproximadamente para el 10 % de las proteínas
constitutivas de la mitocondria. Únicamente un 10% del genoma mitocondrial
es no codificante.
El ADNmt fue secuenciado completamente en 1981 por Anderson et al.
La mayor parte de las variaciones entre individuos aparecen en una región no
codificante del ADNmt de aproximadamente 1112 pares de bases y
denominada bucle de desplazamiento (displacement loop, D-loop o región de
control) (1-3 nucleótidos diferentes cada 100 bases), y dentro de esta región
aparecen dos regiones descritas como región hipervariable I (HVR1) y región
hipervariable II (HVRII) que son las que más interés han suscitado para la
comunidad forense.
Pero, ¿Por qué interesa el ADNmt?. Tres son las características que hacen del
ADNmt una herramienta útil para el laboratorio forense.

1. El número de copias de ADNmt por célula puede oscilar entre 1000 y


10000 dependiendo del tipo de célula y su actividad metabólica. Esta
peculiaridad permite que ante muestras degradadas o con escasa o nula
cantidad de ADNnuclear (pelos caídos) por una cuestión de mera
probabilidad siempre puedan presentarse moléculas de ADNmt íntegras
dispuestas para ser analizadas.
Posiblemente, características estructurales como la disposición circular y su
escasa extensión (sólo 16569 pb) la hacen también ser más difícilmente
vulnerable a la acción de nucleasas, de manera que esta “resistencia” al
proceso de degradación, tan usual en las muestras procesadas en el
laboratorio forense, aumenta extraordinariamente el atractivo del ADNmt.

2. La ubicación de la molécula de ADNmt en zonas próximas a la membrana


interna de la mitocondria, lugar donde se lleva a cabo la fosforilación
oxidativa, expone de forma permanente al ADN a la acción de los radicales
libres generados con el consiguiente efecto mutagénico. A diferencia de lo
que ocurre con el ADN nuclear el ADNmt no posee histonas, de manera que
dicho ADN quedará mucho más expuesto a la acción mutagénica. Por
último la ADNmt polimerasa tiene una pobre actividad reparadora.
El resultado de todo ello es un ADN con unos índices de mutación
superiores al ADNn (5-10 veces superior). Esta gran variabilidad es
siempre una propiedad interesante en el ámbito forense a efectos de poder
discriminar entre individuos.

3. El ADNmt se hereda exclusivamente por vía materna, por tanto todos


aquellos individuos emparentados por vía materna poseerán, salvo
mutaciones de “novo” puntuales, idéntico ADNmt.
Esta propiedad es especialmente útil en casos de identificación de
cadáveres en los que no se dispone de muestras de familiares próximos y
se tiene que recurrir a familiares lejanos emparentados por vía materna.
Hay un caso que ilustra a la perfección lo expuesto, se trata de la
identificación de los restos del último zar de Rusia Nicolás II y parte de su
familia, los cuales fueron ejecutados y sepultados tras la Revolución
bolchevique en 1918 y el hecho de poder contar con muestras de referencia
de parientes maternos, algunos de ellos aún vivos, permitió su identificación
certera mediante el análisis del ADNmt.

Por tanto, el tipo de muestras en las que el análisis de ADNmt resulta


especialmente útil son en aquellas que presentan un avanzado estado de
degradación o en aquellas que la cantidad de ADN nuclear sea escasa o nula
(por ej. pelos caídos o carentes de raíz).
Actualmente el análisis del ADNmt se lleva a cabo mediante
secuenciación directa de las regiones HVR1 (~400pb) y HVR2 (~400pb) tras la
reacción de PCR.
En los últimos años y gracias a un importante avance tecnológico, los
métodos y procedimientos de secuenciación han experimentado un
espectacular avance que ha permitido rápidos y precisos procesos de análisis y
gran culpa de ello lo ha tenido especialmente la aparición de secuenciadores
automáticos y el empleo de fluorocromos.
Sin embargo, recientemente, la comunidad científica forense ha fijado
sus esfuerzos en el análisis de otro tipo de polimorfismo que se presenta en el
genoma (ADNn y ADNmt) con gran frecuencia, se trata de los SNPs (Single
Nucleotide Polymorphisms).
En este caso las variaciones entre individuos están basadas en
mutaciones puntuales en la base ubicada en una cierta posición del genoma.
Las estrategias así como las plataformas de análisis desarrolladas para el
análisis de SNPs son muy variadas. El análisis de este tipo de polimorfismo
dentro del ADNmt supone una herramienta muy útil cuando analizamos
muestras altamente degradadas y el análisis de secuenciación no es viable o
en aquellos casos en los que la secuencia obtenida es altamente frecuente y
requerimos una mayor discriminación.
El análisis del ADNmt presenta también una serie de limitaciones que
convienen describir aunque sea sucintamente:
1. En primer lugar nos encontrado con la temida contaminación, que supone
uno de los auténticos caballos de batalla de los laboratorios forenses. El
análisis de ADNmt es mucho más sensible a la acción de contaminaciones,
pensemos que la incorporación accidental de una sola célula aportando
ADN exógeno al propio de la evidencia supone la adición de miles de copias
de ADNmt. Esta circunstancia supondrá la aparición de resultados no
interpretables y en el peor de los casos resultados erróneos. Es por tanto
fundamental extremar al máximo las medidas encaminadas a evitar
contaminaciones.

2. El ADNmt se hereda exclusivamente por vía materna, de manera, que en un


individuo cabe esperar un único tipo de ADNmt, sin embargo esto no es
siempre así y en ocasiones podemos encontrar individuos en los que
coexisten más de un tipo de ADNmt. A este fenómeno lo denominamos
heteroplasmia. Estas pueden clasificarse en dos grandes tipos: de
secuencia, caracterizadas por ser moléculas que discrepan en una
determinada base en una posición concreta, y las llamadas heteroplasmias
de longitud, cuya característica es diferenciarse unas de otras en el número
de citosinas presentes en determinados tractos de las regiones HV1 y HV2.
La aparición de una heteroplasmia en una muestra de referencia y no en la
dubitada o viceversa puede, en ocasiones, complicar la interpretación y
posterior valoración de resultados sin embargo en otros casos cuando la
heteroplasmia se presenta tanto en la muestra dubitada como en la de
referencia puede dar más peso, si cabe, al hecho de la coincidencia.

3. El análisis de ADNmt se muestra como una prueba realmente eficiente en


casos de exclusiones, sin embargo cuando detectamos una coincidencia
entre las muestras dubitadas y las muestras de referencia se hace
imprescindible un tratamiento estadístico, y por tanto darle un peso a dicho
“match”. El hecho de que la herencia del ADNmt sea exclusivamente
materna, lo que implica una ausencia de recombinación, obliga a tratar la
secuencia de ADNmt como un único locus. La práctica corriente y por otra
parte recomendada por la Internacional Society of Forensic Genetic (ISFG)
consiste en determinar la “rareza”de una determinada secuencia mediante
comparación con bases de datos poblacionales, y determinar el número de
secuencias idénticas a la de la muestra problema que hayan sido
detectadas en dicha base de datos. Las bases de datos que actualmente se
disponen están nutridas con un número de secuencias relativamente
escaso (3500-4000), el resultado es un bajo poder de discriminación si lo
comparamos con el que el análisis del ADNn nos ofrece. Es por tanto muy
importante hacer crecer dichas bases de datos y en esa línea ha volcando
la comunidad forense sus esfuerzos con el fin de generar una gran base de
datos mundial que contenga secuencias perfectamente contrastadas
(EMPOP -EDNAP mtDNA population database-www.empop.org).

En resumen, hemos de señalar que la molécula de ADNmt reúne una


serie de características que hacen de ella una herramienta imprescindible en
los laboratorios forenses. La comunidad científica ha hecho y sigue haciendo
grandes esfuerzos para que en la actualidad su uso ante los Tribunales de
Justicia de todo el mundo esté ampliamente aceptado.
El análisis del ADNmt ha posibilitado emitir conclusiones y dictámenes en
casos, que sin este tipo de estudio, hubiera sido del todo imposible, es por
tanto justo darle la importancia que requiere este tipo de análisis con las
ventajas e inconvenientes que hemos descrito anteriormente.
NUEVAS TECNOLOGÍAS EN GENÉTICA FORENSE

LOURDES PRIETO SOLLA


Laboratorio de Biología-ADN de la Comisaría General de Policía Científica.

Introducción
La genética forense es una ciencia que no ha dejado de evolucionar y
que sigue en constante cambio. Desde sus comienzos en España a principios
de los años 90, hasta hoy, se han producido muchos avances en el campo
molecular que se han ido incorporando a la rutina de los laboratorios forenses.
Hace unos años se requería una mancha de sangre de considerable tamaño
para poder realizar una identificación y hoy se puede obtener un perfil genético
de un filtro de cigarrillo e incluso de los restos epiteliales presentes en las
prendas de vestir producidas por el contacto continuado con la piel.
Pero ¿qué podemos esperar en los próximos años?; si el análisis de
ADN con fines forenses es una técnica tan estandarizada y establecida ¿por
qué buscar nuevas tecnologías?
Aunque es verdad que la tecnología del ADN ha permitido mejorar las
investigaciones criminales, todavía existen limitaciones que actualmente están
tratando de superarse. En la mayoría de los casos, los resultados de “la prueba
del ADN” son claros y no están sujetos a debate. Sin embargo, no podemos
obviar que los resultados analíticos de algunos casos son ambiguos.
Desgraciadamente, las muestras biológicas relacionadas con el delito se
encuentran a veces, diluidas, degradadas o proceden de varios contribuyentes.
En estos casos, el análisis estándar de ADN y las búsquedas en las bases de
datos son menos productivas y los resultados que ofrecen no son de elevada
confianza. Por otro lado, el tiempo que transcurre desde que las evidencias
biológicas llegan al laboratorio hasta que se emite el informe pericial puede ser
considerablemente largo si el número de muestras involucradas en el caso es
elevado. Por ello, las nuevas tecnologías en el análisis forense de muestras
biológicas con fines identificativos se centran fundamentalmente en: posibilitar
el análisis de muestras degradadas, facilitar el análisis de mezclas y aumentar
la rapidez y eficacia de los análisis.

Estrategias en el estudio de muestras degradadas


La identificación genética puede complicarse cuando existen largos
períodos de tiempo entre la muerte y la aparición del cadáver, cuando la
muerte ocurrió en unas condiciones críticas (explosiones por ejemplo), o
cuando las muestras han estado sometidas a condiciones ambientales muy
desfavorables (temperatura, humedad, cambios en el pH, agentes oxidantes,
radiación, etc.), incluso aunque el tiempo transcurrido no sea muy largo. En
estos casos el escaso ADN que pueda permanecer en las muestras se
encuentra totalmente degradado (rotura de hebras, pérdida de nucleótidos,
etc.).
En estas muestras críticas, el análisis de STRs convencionales es
problemático, pues los de mayor tamaño (300-400 pares de bases) no se
logran amplificar en la reacción PCR. Actualmente, para evitar este problema,
muchos laboratorios están centrándose en el diseño de nuevas PCR
multiplexes con el fin de obtener amplicones más cortos (miniSTRs) que no den
problemas en muestras de ADN de escasa calidad. Los miniSTRs, por tanto,
son polimorfismos STR que se analizan mediante el diseño de los “primers” en
una zona cercana al propio polimorfismo, evitando grandes regiones
flanqueantes. Con ello se pueden analizar muestras degradadas que
típicamente producen perfiles genéticos parciales y ausencia de información
para loci grandes.
Otro tipo de polimorfismos que pueden utilizarse en muestras
degradadas son los SNPs (single nucleotide polymorphisms). Se trata de
cambios de una única base dentro de una secuencia concreta de ADN. Pueden
amplificarse mediante PCR produciendo amplicones muy cortos (50-100pb),
pero además presentan otras ventajas como: su abundancia en el genoma
humano, su baja tasa de mutación (característica muy importante en los casos
de paternidad e identificación cadavérica) y la posibilidad de automatizar su
análisis. Es ya una realidad en muchos laboratorios el estudio de SNPs
situados en el ADN mitocondrial y el cromosoma Y, pues al tratarse en estos
casos de genomas haploides, su análisis es menos dificultoso. Sin embargo, ya
se están comenzando a estudiar SNPs autosómicos, sobre todo con fines de
fenotipaje. Cuando no disponemos de una muestra de referencia para
comparar con una evidencia, no se puede deducir ninguna información útil a
partir del ADN que habitualmente estudiamos (excepto el sexo). Por ello,
actualmente se están buscando SNPs que ofrezcan información sobre el
individuo que dejó la evidencia en el lugar del delito. Así se podrá orientar la
investigación hacia uno u otro sospechoso en casos delictivos, pero también
será una herramienta útil a la hora de facilitar la investigación de la identidad de
una víctima en casos de cadáveres en mal estado de conservación. Aunque la
ciencia forense está encaminada hacia estas investigaciones, el tipaje de SNPs
autosómicos probablemente tardará años en ser aceptado en los tribunales.

Estrategias en el análisis de mezclas


El análisis de mezclas de ADN es una práctica habitual en la rutina
forense. Su interpretación es delicada dado que se hace imposible diferenciar
qué alelos pertenecen a cada contribuyente a la mezcla. Si además la mezcla
está desequilibrada (uno de los contribuyentes aportó más cantidad de fluido
biológico que el otro u otros) podemos cometer errores al asignar alelos que en
realidad son artefactos de la amplificación (sttuters) o al no detectar alelos que
realmente existen en la mezcla (drop out alélico).
Si la mezcla está formada por el mismo tipo de fluido procedente de dos
o más individuos la posibilidad de separar los perfiles genéticos se complica,
pero si los fluidos que formaron la mezcla presentan diferentes características
puede lograse la separación. Tal es el caso de las agresiones sexuales, en las
cuales nos encontramos mezclados el perfil genético de la víctima procedente
del fluido vaginal con el perfil genético del sospechoso procedente del semen.
Habitualmente estas muestras se procesan extrayendo su ADN mediante lisis
diferencial, basada en la resistencia que presentan los espermatozoides (y no
las células del epitelio vaginal) a la digestión mediante proteinasa K. Sin
embargo, cuando el número de espermatozoides es escaso (bien por que la
toma de muestra se realizó transcurrido un tiempo desde la agresión, porque la
víctima retirara la mayoría mediante lavado, o porque el agresor sea
oligospérmico) la lisis diferencial no es eficaz.
Para solucionar estos problemas se han creado programas informáticos
que nos ayudan a la interpretación de mezclas (Pendulum) cuando no existe la
posibilidad de la separación física de los perfiles genéticos. Por otro lado, en
casos de delitos contra la libertad sexual, donde la separación física es posible,
es cada vez más frecuente el uso de microscopios capturadores de
espermatozoides. Estos microscopios permiten aislar mediante láser cada
espermatozoide que visualizamos e introducirlos en un tubo para extraer su
ADN independientemente del de la víctima, evitándose así los perfiles mezcla.

Automatización y rapidez del análisis forense


Uno de los principales problemas hoy en los laboratorios forenses es el gran
número de datos electrónicos que se generan regularmente. Desde que una
muestra llega al laboratorio hasta que se escribe el informe pericial son muchos
los pasos que se dan y los resultados analíticos que se producen. Hemos de
tener en cuenta el carácter judicial de las muestras que analizamos, y como
tales han de estar controladas en todo momento, siguiendo una cadena de
custodia tanto de los efectos como de las sub-muestras que se generan de
ellos. Por tanto, en los últimos años ha sido necesario desarrollar sistemas
informáticos que permitieran el manejo fácil y seguro de toda esta información
generada, los LIMS (Laboratory Information Management Systems). Estos
sistemas nos permiten saber dónde están en cada momento las muestras que
se analizan y en qué fase del análisis se encuentran (trazabilidad), nos
proporcionan las herramientas necesarias para las revisiones administrativas
de cada caso y contienen módulos analíticos para estudios de ADN
(comparación y almacenamiento de perfiles genéticos, análisis estadísticos,
etc.).
Las técnicas de análisis en sí también están automatizándose. Existen
hoy en día robots para extraer ADN de un elevado número de muestras en un
par de horas, aunque aún no están preparados para muestras críticas.
También se está realizando un gran esfuerzo en acortar los tiempos de análisis
utilizando tecnologías que permitan realizar PCR multiplexes de un gran
número de loci (zip-code primers) así como técnicas de genotipaje alternativas
a la secuenciación. La mayor parte de los nuevos métodos de genotipaje se
basan en dos principios: hibridación con oligonucleótidos específicos de alelo y
uso de enzimas modificadores de ADN. Ejemplos del primer tipo serían el uso
de sondas ASO (allele specific oligonucleotides) o de primers específicos de
alelo durante la PCR. Entre los enzimas modificadores de ADN podemos
nombrar la ADN polimerasa (minisecuenciación), la ADN ligasa (ligamiento de
oligos) y las ya clásicas enzimas de restricción).
Estos diferentes métodos de análisis pueden combinarse con multitud de
nuevos métodos de detección. Los sofisticados biochips en todas sus
modalidades (conventional spoting microarrays, electronically activates
microarrays) y la espectrometría de masas (MALDI-TOF), son algunos de los
ejemplos que ya hoy son una realidad en los laboratorios forenses más
punteros.
TÉCNICAS MOLECULARES DE IDENTIFICACIÓN
DE SETAS CON INTERÉS FORENSE

Mª JESÚS ITURRALDE PARDO


Facultativo del Servicio de Biología. Instituto Nacional de Toxicología y
Ciencias Forenses. Departamento de Madrid.

Introducción
A lo largo de los últimos 50 años las intoxicaciones por setas presentan
un crecimiento significativo en todo el mundo. Las causas de este hecho se
deben tanto a la mayor afición de recolectar y consumir setas como al
incremento del consumo voluntario de setas alucinógenas. En cuanto a la
etiología médico legal, la mayor parte son accidentales; le siguen el uso
intencionado de hongos psicoactivos siendo excepcional la etiología homicida o
suicida.
La importancia de los micetismos se encuentra, no tanto en la frecuencia
con que se presentan sino porque los pacientes pueden haber ingerido setas
con toxinas potencialmente mortales. El análisis de laboratorio no sólo sirve
para confirmar el diagnóstico de un micetismo y aportar nuevos taxones al
catálogo de especies tóxicas, sino también para evitar tratamientos agresivos,
hospitalizaciones innecesarias y diagnosticar síndromes mixtos o micetismos
cuyos períodos de incubación queden solapados.
La identificación tradicional de las setas tóxicas se basa en criterios
morfológicos y en la detección de toxinas. Estos análisis en ejemplares muy
deteriorados e incluso triturados, cocinados y a veces en vómitos o heces
suelen ser muy difíciles. Por ello un método de identificación independiente
tanto de la calidad del material fúngico como de la cantidad sería
extremadamente útil. La determinación de especie mediante el estudio de
marcadores genéticos podría ser una buena herramienta.
Tabla 1. Clasificación de los micetismos en función del periodo de latencia y del órgano sobre el
que actúa la toxina.
Periodo de latencia Organo diana Tipo de reacción Toxinas Especies

Inferior a 6 horas Sistema nervioso - Colinérgico Muscarina Clitocybe/Inocybe

- Glutaminérgico Ac. iboténico Amanita muscaria

Muscimol Amanita pantherina

- Epileptogénico Hidracinas Giromitra

- Alucinogénico Psilocina Psilocybe

Psilocibina

Gastrointestinal - Reacción disulfiram Coprina Coprinus atramentarius

- Miscelánea gastrointestinal Boletus sp; Entoloma sp, etc

Alérgico - Inmunohemolítico Paxilus involutus

- Neumónico Lycoperdon sp.

Entre 6-24 horas Hígado - Hepototóxico Amatoxinas Amanita phalloides

Lepiota sp; Galerina sp.

Riñón - Nefrotóxico Amanita proxima

Amanita smithiana

Otros - Eritromelalgia Acidos acromélicos Clitocybe acromelalga

Clitocybe amoenolens

Superior a 1 día Riñón - Nefrotóxico Orellanina Cortinarius sp

Sistema nervioso - Neurotóxico Hapalopilus rutilans

Músculo - Rabdomiolisis Tricholoma equestre (*)

Russula subnigricans
(*) considerada gran comestible hasta el año 2001

Regiones polimórficas del ADN en hongos. De los diferentes genes del ADN
que han sido investigados en micología, gen de la Beta-tubulina, gen de la
Orotidina descarboxilasa, gen de la Chitina sintetasa, gen de la Actina, gen del
Factor de elongación, son las regiones ITS-1 e ITS-2 (internal transcribed
spacer) del nrDNA las que más se han utilizado para la identificación molecular
de hongos.

Metodología de análisis del ADN. Basada en la Técnica de Amplificación


génica por PCR (Reacción en cadena de la polimerasa). Para amplificar cada
una de las regiones diana de interés en taxonomía se diseñan cebadores
específicos para ellas. Los productos amplificados pueden ser caracterizados
de diferentes maneras. Las técnicas más utilizadas en micología son:

PCR/RAPD (Análisis del ADN amplificado al azar). Se trata de un método en el


que no se necesita tener conocimientos previos sobre el genoma de un
determinado organismo y se realiza a partir del genoma entero. Se utilizan
diferentes iniciadores de secuencia arbitraria. Los productos amplificados se
separan mediante electroforesis. Se obtiene un patrón de bandas PCR/RAPD
para cada especie.

PCR/RFLP (Análisis del polimorfismo de la longitud de los fragmentos de


restricción). Esta técnica permite obtener, para cada organismo, una serie de
fragmentos del ADN de diferentes tamaños que dan lugar a un patrón de
bandas PCR/RFLP. Ello se consigue fragmentando la región amplificada
mediante el uso de enzimas de restricción. Comentarios: técnicas rápidas y
económicas pero dan patrones difíciles de interpretar y poco reproducibles.

PCR/SSCA (Análisis conformacionales del ADN de una sola cadena). Es un


método rápido y económico para detectar polimorfismos de secuencia sin
necesidad de secuenciar. Se basa en la movilidad de las cadenas sencillas de
ADN. Los cambios en la migración tienen un alto grado de sensibilidad, de tal
manera que dos cadenas del ADN que difieran en una sola base migrarán de
forma diferente. La región amplificada se desnaturaliza y se realiza una
separación electroforética en condiciones desnaturalizantes. El patrón de
bandas PCR/SSCA es propio para cada organismo. Comentarios: Al igual que
ocurre con las técnicas anteriores, el perfil que se obtiene no es siempre
reproducible pero puede utilizarse como método de screening previo a la
secuenciación.

PCR/Secuenciación. El método más fiable y sensible para detectar la


diversidad genética es la secuenciación directa de los productos de
amplificación de la región diana. La técnica más utilizada es la secuenciación
cíclica con terminadores de cadena marcados con fluorocromos. Las
secuencias de nucleótidos que se obtienen para la región diana en cada
organismo y en diferentes laboratorios pueden ser publicadas en bases de
datos electrónicas (GENBANK, EMBL, etc). Comentarios: en ocasiones puede
que el material de herbario no esté identificado correctamente o que no se
utilice la misma nomenclatura sin olvidar las contaminaciones del laboratorio
debido a una mala praxis. Estas situaciones dan lugar a que existan
secuencias erróneas en las bases de datos públicas. Por ello sería conveniente
disponer de bases de datos propias, cuidadosamente generadas, de las
especies tóxicas.
Análisis de las secuencias de la región ITS para la identificación de
hongos

El análisis comparativo de una secuencia desconocida con las bases de


datos públicas, EMBL o Gen Bank, puede ser un método útil de identificación
de especie. Estas bases de datos disponen, via Internet, de programas de
comparación de secuencias: FASTA y BLAST (Based Local Alignment Search
Tool). Comentarios: aunque existen muchas secuencias publicadas de las
regiones ITS todavía son insuficientes para identificar algunos hongos. El
constante aumento de secuencias permitirá ir identificando las setas
responsables de producir intoxicaciones.

Diseño de test rápidos para la identificación de especie

El alineamiento y comparación de las secuencias nucleotídicas de una


determinada región diana entre ejemplares de la misma y de distinta especie,
permite conocer la variabilidad de la región y si es apta para el diseño de
nuevos test. Cada vez se investiga más el diseño de iniciadores específicos de
especie o sondas TaqMan mediante Real-Time PCR (RT-PCR). Comentarios:
son sistemas de identificación menos problemáticos y más rápidos que la
secuenciación.
GENETICA FORENSE NO HUMANA: IDENTIFICACIÓN DE ESPECIES

LOURDES PRIETO SOLLA


Laboratorio de Biología-ADN de la Comisaría General de Policía Científica

La necesidad de estudiar ADN no humano con fines forenses se hace


cada día más patente y actualmente es frecuente que se solicite a los
laboratorios el análisis de muestras de origen no humano. Existen multitud de
situaciones en las que cabe este tipo de análisis: restos de origen no humano
en la escena del crimen (pelos de animales domésticos, restos vegetales, etc),
tráfico ilegal de especies protegidas o en peligro de extinción, identificación de
fauna cadavérica con el fin de estimar la data la muerte (identificación de larvas
de insectos), fraude en la composición de alimentos procesados, investigación
de accidentes de tráfico causados presuntamente por animales, negligencia
médica en casos de infecciones (transmisión de VIH o hepatitis C),
bioterrorismo (ántrax), etc.
El análisis de restos biológicos no humanos con interés forense se ha
abordado tradicionalmente mediante estudios inmunológicos o análisis de
proteínas. Estos métodos encuentran su limitación cuando las muestras a
estudiar no se encuentran en condiciones idóneas de conservación. Con el
desarrollo de la biología molecular han surgido nuevos métodos basados en las
diferencias genéticas entre especies. El análisis de ADN mitocondrial (ADNmt)
es el más apropiado para estudiar restos no humanos fundamentalmente por
dos motivos: (i) la gran cantidad de copias por célula permite que muestras
críticas, que no dan resultados con el estudio de ADN nuclear, puedan ser
analizadas (pelos, alimentos tratados) y (ii) su tasa de mutación es más rápida
que la del ADN nuclear, hecho que permite encontrar diferencias en las
secuencias de especies muy cercanas.
Las regiones de ADNmt más utilizadas en genética forense con fines de
identificación de especie son el gen responsable del citocromo b (cytb) y los
ADNs ribosómicos 12S y 16S. Los análisis se realizan mediante PCR y
posterior secuenciación del producto amplificado. Para ello, dentro de estas
tres regiones se han buscado dos tipos de zonas nucleotídicas: (i) zonas muy
conservadas (con poca variabilidad entre especies) con el fin de poder diseñar
primers universales que permitan la amplificación de ADN de los principales
grupos taxonómicos y (ii) zonas menos conservadas que permitan la
discriminación entre las muestras estudiadas al menos a nivel de género. Así,
con un único par de primers se puede amplificar cada región en distintas
especies y la secuencia obtenida tras la amplificación puede comparase con
secuencias conocidas de diferentes especies.
El uso de esta técnica implica el conocimiento de la filogenia de las
especies involucradas, el manejo de las bases de datos de secuencias de ADN
disponibles en la red (GenBank, EMBL), así como el uso de los softwares de
comparación de secuencias (ej: BLAST, CLUSTAL). Es fundamental, por tanto,
que el biólogo forense se familiarice con las herramientas que la bioinformática
pone a nuestra disposición.
Una base de datos biológica es una lista de datos persistentes larga y
organizada, asociada generalmente a un software automatizado diseñado para
actualizar, buscar y recuperar los datos almacenados dentro del sistema.
Actualmente existen organismos que proporcionan bases de datos gratuitas
para que los usuarios las puedan utilizar a través de Internet. Uno de los
organismos que más ha desarrollado las bases de datos biológicas y las
herramientas bioinformáticas es el NCBI (National Center for Biotechnology
Information). Este organismo dispone de una página web
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov) muy útil que y que la mayoría de investigadores
del campo de la genómica y la proteómica manejan habitualmente. El NCBI
tiene múltiples bases de datos biológicas (de secuencias, de proteínas, de
genomas, taxonómica, de publicaciones, etc) ligadas entre sí, de tal forma que
se puede usar un único sistema de búsqueda y recuperación de datos llamado
ENTREZ. Este sistema de búsqueda permite que un usuario tenga acceso y
recupere información de muchas bases de datos a la vez. Por ejemplo, la base
de datos de secuencias de ADN Entrez está ligada a la base de datos de
taxonomía Entrez. Esto permite al investigador encontrar información
taxonómica de la especie a la que pertenece la secuencia.
Otro de los recursos que ofrece el NCBI y que más se utilizan en biología
forense es el software BLAST (Basical Logical Alignment Search Tool). Entre
otras aplicaciones este software ofrece la posibilidad de comparar la secuencia
que hemos obtenido en el laboratorio con las secuencias presentes en las
bases de datos de manera automática.
Aunque las bases de datos de ADN están en constante crecimiento,
para ciertos organismos no existen datos de las secuencias que nos interesan.
Como consecuencia de esto, el éxito en la identificación del origen de una
muestra forense no humana depende en gran medida de la disponibilidad de la
secuencia de interés en la base de datos. Sin embargo, este problema puede
superarse cuando en la base de datos existen secuencias de especies
relacionadas con nuestra muestra problema o tenemos idea de qué especie
puede tratarse mediante datos no genéticos del caso en cuestión (por ejemplo,
el análisis de pelos encontrados en un vehículo involucrado en el robo de
abrigos de visón). En estas situaciones podemos recurrir al análisis de una
muestra indubitada de la especie que sospechamos y a la comparación de
dicha muestra de referencia con nuestra muestra problema.
Por otro lado, no es extraño que tanto cytb, como 12S y 16S presenten cierto
nivel de polimorfismo, lo cual complica la interpretación de los resultados. Así,
secuencias similares en un 98% de sus nucleótidos pueden derivarse tanto de
distintos miembros de la misma especie como de dos especies estrechamente
relacionadas que se han separado recientemente.
En ocasiones el problema que se nos plantea es comprobar si los restos
biológicos encontrados en el lugar de los hechos coinciden en cuanto a especie
con los restos encontrados en, por ejemplo, las ropas de un sospechoso. En
los casos en los que no tenemos idea de a qué tipo de organismo pueden
pertenecer o el posible organismo está pobremente caracterizado a nivel
genético en las bases de datos, podemos recurrir al análisis de sus ADNs por
medio de RAPDs (random amplified polimorphic DNA). La técnica consiste en
el desarrollo de una reacción PCR en la que los primers se han diseñado al
azar. Estos primers de corta longitud (8-12 nucleótidos) anillan en diferentes
regiones del genoma del organismo problema generando productos
amplificados al azar de diferente longitud. Los fragmentos pueden separarse
mediante electroforesis dando un patrón de bandas característico de la
especie.
Muchos laboratorios forenses españoles tienen ya la tecnología
necesaria para el análisis de los fragmentos mitocondriales cytb, 12S o 16S.
Sin embargo queda mucho trabajo por hacer en identificaciones de restos
vegetales o de microorganismos. Sin duda, la genética forense no humana es
una nueva puerta que se abre para responder a las preguntas aquí expuestas,
pero el campo es tan amplio que se necesitarán grandes inversiones para
satisfacer tan amplia demanda.
VALORACIÓN ESTADÍSTICA DE LA PRUEBA DE ADN

MARÍA JOSÉ FARFÁN ESPUNY


Jefa del Servicio de Biología. Instituto Nacional de Toxicología y Ciencias
Forenses. Departamento de Sevilla.

Una vez obtenidos los perfiles genéticos resultantes de la


individualización de una muestra biológica mediante la aplicación de la
tecnología del ADN, éstos carecen de valor sin una valoración estadística
apropiada. En otro capítulo se tratará con más detalle la valoración estadística
en casos de filiación, por lo que aquí nos referiremos sólo a los casos de
investigación criminal.

En la mayoría de estos casos, la prueba del ADN sólo tiene sentido si es


posible una comparación de perfiles de un vestigio frente a una muestra
indubitada o entre diferentes vestigios. Cuando se trata de investigar si un resto
biológico puede pertenecer a un determinado individuo o al donante de otros
vestigios, es necesario realizar un cotejo de los perfiles genéticos obtenidos. Si
los perfiles son distintos, puede asegurarse que ese resto biológico no
pertenece al individuo en cuestión o que ambos vestigios proceden de
personas diferentes. Pero si existe una coincidencia entre los perfiles
comparados es necesario hacer una valoración estadística para estimar el
grado de incertidumbre de que esos perfiles coincidan entre sí sólo por
cuestiones de azar y no porque procedan del mismo individuo. Para ello se
requiere disponer de datos fiables sobre las frecuencias de los alelos presentes
en la población de referencia, las cuales se estimarán mediante la realización
de estudios poblacionales basados en el tipado de numerosos individuos no
relacionados.

Para estimar el valor de la prueba es necesario considerar (al menos)


dos hipótesis alternativas para su ocurrencia. La prueba debe evaluarse
calculando su probabilidad bajo cada una de las hipótesis. Por ejemplo, se
detecta una mancha de semen en la prenda de una víctima de agresión sexual
y el perfil genético del semen coincide con el del sospechoso. Es necesario
establecer dos hipótesis alternativas, que en este caso serían: H0: el semen
pertenece al sospechoso; H1: el semen pertenece a un individuo al azar de la
población. A continuación se procede a calcular la probabilidad de obtener ese
perfil genético para el semen bajo la hipótesis H0, y bajo la hipótesis H1. La
valoración más correcta consiste en calcular, mediante la aplicación del
teorema de Bayes, la razón de verosimilitud o LR (“Likelihood Ratio”) que es
el cociente entre ambas probabilidades. El resultado obtenido refleja cuántas
veces la coincidencia de perfiles es más probable si consideramos la hipótesis
H0, (o sea, que el semen pertenezca al sospechoso) que si consideramos la
hipótesis H1, (que el semen pertenezca a un individuo al azar de la población).

Un elemento importante en la comparación de perfiles genéticos con


fines de investigación criminal o en casos de identificación reside en la creación
de bases de datos de ADN, aspecto que se tratará más detalladamente en otro
capítulo.
ORÍGENES POBLACIONALES MEDIANTE MARCADORES DE HERENCIA
UNIPARENTAL: ADN MITOCONDRIAL y CROMOSOMA Y

MANUEL LÓPEZ SOTO


Facultativo del Servicio de Biología. Instituto Nacional de Toxicología y
Ciencias Forenses. Departamento de Sevilla.

La primera pregunta que tal vez pudiera plantearse un alumno de este


curso podría ser ¿qué sentido tiene hablar de los orígenes poblacionales en un
curso de Biología Forense?. La respuesta a esta pregunta hay que buscarla en
los propios fundamentos de la genética forense, que no son sino, la aplicación
de conceptos de la Genética de Poblaciones a la identificación de individuos.
En este sentido, siempre que obtenemos un perfil genético (STRs autosómicos,
ADN mitocondrial, STRs de cromosomas X e Y) es necesario realizar una
valoración estadística de dicho perfil mediante comparación con la población de
referencia. Esto requiere, por un lado, conocer qué frecuencias alélicas definen
a dicha población y por otro, qué distribución haplotípica o de haplogrupos
presenta respecto al ADN mitocondrial y al Cromosoma Y. Estos dos
marcadores, como ya se ha explicado a lo largo del curso, se caracterizan
entre otras cosas, por presentar un modo de herencia uniparental; el ADN
mitocondrial es transmitido por la madre a todos sus descendientes y el
cromosoma Y es transmitido por el padre a sus hijos varones. Este hecho
biológico nos permite trazar linajes a lo largo de la historia hasta remontarnos al
origen de nuestros antepasados.
Con respecto al origen de los humanos anatómicamente modernos (del
que derivan las poblaciones humanas actuales) se han expuesto dos hipótesis
alternativas. La primera de ellas, llamada multirregional o policéntrica, explica
que los humanos modernos surgieron al mismo tiempo en cuatro regiones
distintas, llevando una evolución paralela a través de largos períodos de
tiempo, teniendo a la migración y a la selección natural como principales
motores del proceso evolutivo. La otra hipótesis, conocida como OUT OF
AFRiCA, se basa en que los humanos modernos se originaron en África y
desde allí emigraron hacia Asia y Europa y después a América y Oceanía. Esta
segunda hipótesis, más aceptada por la comunidad científica internacional, ha
sido apoyada por estudios de ADN mitocondrial y de cromosoma Y. En otras
palabras, parece claro que los humanos anatómicamente modernos del que
derivan todas las poblaciones actuales surgieron como un único proceso de
especiación originado en África, aunque no está del todo claro si estos
humanos llevaron un reemplazamiento total o parcial de las otras especies de
homínidos existentes, como los neardentales en Europa.
Como hemos dicho anteriormente, estos humanos anatómicamente
modernos llegaron a Europa. Existen opiniones contrarias en relación con
cómo se produjo el poblamiento de este continente. Para muchos genetistas,
encabezados por la figura de Cavalli-Sforza, Europa se pobló durante el
Neolítico a través de la llegada de colonos agricultores procedentes de Oriente
Medio, a juzgar por lo que muestran los análisis genéticos de marcadores
clásicos. Sin embargo, para otros genetistas como M. Richards, V. Macaulay y
A. Torroni, basados en los análisis de ADN mitocondrial, y O. Semino en los de
Cromosoma Y, llegan a la conclusión de que Europa ya estaba poblada
durante el Paleolítico, que además se produjo una expansión desde los pocos
territorios libres de hielo en la última glaciación y que hubo una pequeña
colonización durante el Neolítico.
Una controversia parecida se da con respecto al poblamiento de
América. Para A. Torroni et al. y basados en estudio de ADN mitocondrial, el
poblamiento llegó procedente de Asia, entrando un haplotipo de cada uno de
los haplogrupos existentes en América en tres oleadas diferentes. Sin
embargo, para Merriwheter et al. en América entraron varios haplotipos de ADN
mitocondrial en una sola oleada.
Haremos una pequeña mención a dos poblaciones: la brasileña y los
inuits. Brasil se caracteriza por ser la población más diversa del mundo desde
el punto de vista genético-poblacional. De hecho, podemos encontrarnos dos
individuos fenotípicamente muy distintos (blanco y mulato) y presentar ambos
el mismo haplogrupo de ADN mitocondrial o de Cromosoma Y. A modo de
ejemplo, el 28% de la población blanca de Brasil tiene una ADN mitocondrial
africano, que puede explicarse por ser el resultado de la masiva llegada de
esclavos desde el Golfo de Guinea ocurrida en siglos anteriores. Algo similar,
pasa con la población de los Inuits, en la que al analizar el ADN mitocondrial y
el Cromosoma Y se observa que el marcador materno es amerindio y el
paterno, europeo. Se sabe que a estos territorios de hielo llegaron colonos
procedentes de Europa y que era costumbre en estas poblaciones esquimales
ofrecer alimento, alojamiento y la mujer a sus huéspedes, de ahí el haplogrupo
europeo observado en esta población.
Se presentarán los datos obtenidos de un estudio de ADN mitocondrial
realizado por el departamento de Sevilla del Instituto Nacional de Toxicología y
Ciencias Forenses en la población andaluza. Cuestiones tales como ¿qué
legado genético han dejado los ocho siglos de invasión árabe en Andalucía?
¿encaja el sustrato mitocondrial en la variabilidad europea? ¿qué origen tiene
la población andaluza? ¿hay homogeneidad genética entre las provincias?,
entre otras, serán resueltas en este curso.
Por último, y enlazando con el principio de este resumen, se presentarán
ejemplos de la aplicación forense que tiene conocer la distribución geográfica o
el origen de los patrones de ADN mitocondrial y de Cromosoma Y.
INVESTIGACIÓN BIOLÓGICA DEL PARENTESCO

JUAN ANTONIO LUQUE GUTÍERREZ


Jefe del Servicio de Biología. Instituto Nacional de Toxicología y Ciencias
Forenses. Departamento de Barcelona.

La investigación biológica de la paternidad en un sentido amplio


(investigación biológica del parentesco), abarca cualquier estudio de la relación
biológica entre dos individuos, ya que una relación genética entre dos
individuos, siempre puede resolverse como una sucesión de relaciones
paternofiliales ascendentes y descendentes dentro de un árbol genético, por
muy distantes que sean sus posiciones. Así podemos hablar del estudio más
simple como es el caso estándar (trío Presunto Padre-Madre-Hijo/a), de
paternidad/maternidad con un solo progenitor, de estudios con abuelos, estudio
de hermanos, paternidades a partir de familiares (cuando el padre está fallecido
o no disponible), etc...
Casos especiales de estos estudios son los casos de desastres en
masa, identificaciones de restos cadavéricos, o la búsqueda de familiares del
autor de un delito a través de una base de datos, que tienen como base los
estudios de paternidad pero que conllevan una problemática asociada adicional
que se verá en otro momento en este mismo curso.
También pueden considerarse paternidad/maternidad en su sentido
amplio el estudio de marcadores de cromosoma Y y de ADN mitocondrial,
estudiando en este caso no una relación p(m)aternofilial directa, sino una
relación genética de toda una línea genética padres/hijos o madres/hijos. En
ocasiones (algunos laboratorios de rutina) emplean estas técnicas como
complementarias en los estudios de paternidad.
El estudio de la paternidad en su sentido más estricto, como es el aclarar
la paternidad (maternidad) biológica de un hijo cuestionado, tiene unas
implicaciones legales (aunque se haga de forma privada y no judicial) que hay
que tener presentes. Por suerte, tanto la legislación como la ciencia han
llegado a un punto en el que es posible la investigación de la paternidad con
garantías suficientes, pero no siempre ha sido así.
Desde el principio de la historia de una u otra manera se ha permitido o
prohibido la investigación de la paternidad. En un principio la ciencia no
disponía de herramientas adecuadas para su resolución, pero se recurría a la
investigación de otros indicios. Así podemos considerar que el Rey Salomón
celebró el primer juicio de paternidad (en este caso maternidad) documentado
históricamente (en la Biblia), en el que se recurrió a métodos “psicológicos”.
Durante mucho tiempo, la ciencia no pudo aportar métodos adecuados para
dicha investigación, recurriéndose a métodos circunstanciales (como el tiempo
de gestación) o físicos (color de pelo, ojos, parecido...). No fue hasta la
descripción del grupo ABO por Landsteiner en 1900 y la descripción de su
transmisión hereditaria en 1910, que se dispuso de pruebas objetivas, naciendo
así la hemogenética forense. Desde entonces se han utilizado gran cantidad de
sistemas genético moleculares hasta nuestros días en que los estudios de ADN
han desplazado por su potencia y facilidad al resto de técnicas.
En España, no es hasta 1978 que la Constitución Española en su
articulo 39.2 establece que “...La ley posibilitará la investigación de paternidad”,
y posteriormente en 1981 se produce la reforma del Código Civil recogiendo en
su artículo 127 que “En los juicios sobre filiación será admisible la investigación
de la paternidad y de la maternidad mediante toda clase de pruebas, incluidas
las biológicas”. Desde entonces, el desarrollo ha sido vertiginoso, uniéndose, a
los escasos laboratorios que por entonces hacían pruebas, un sinfín de
laboratorios cada vez más dotados, y que hoy día pueden considerarse de
primer nivel a escala mundial.
En cuanto a las técnicas utilizadas, los primeros laboratorios utilizaban
una larga batería de grupos sanguíneos, enzimas y proteínas polimórficas y
HLA, mediante reacciones antígeno-anticuerpo o mediante técnicas
electroforéticas. Dichas técnicas suponían un gran trabajo, pero la potencia
obtenida era la justa. La aplicación en el campo forense por Jeffreys en 1985
del análisis de VNTR de ADN mediante las llamadas “sondas” supuso una
revolución, ya que permitía poder analizar directamente genotipos y no
fenotipos como hasta entonces. Al final de los 80 ya se hacían en España,
permaneciendo hoy día un par de laboratorios que todavía mantienen una
variante, dado que tienen gran capacidad de discriminación. Sin embargo, en el
mismo 1985, K. Mullis descubrió un proceso al que denominó reacción en
cadena de la polimerasa (PCR), por la que luego recibiría el premio Nobel, que
imita la replicación del ADN de las células en un tubo, consiguiendo hasta un
millón de copias de pequeños fragmentos de ADN. Desde el principio de los 90,
la mayoría de los laboratorios trabajan mediante análisis de marcadores de
PCR.
La prueba biológica la podemos dividir en varias fases:

● Toma de muestras
Este punto es fundamental para una buena pericia. No puede haber un
análisis de calidad si las muestras no son adecuadas. Ya antes de comenzar
hay que hacer una selección de las personas que realizarán la prueba. En
casos estándar (PP-M-H) los individuos vienen predefinidos, pero hay que
tener mucho cuidado en asegurarse de que se toman las muestras con todas
las garantías necesarias, y que se rotulan y se procesan de forma que se
minimice la posibilidad de un cambio de muestras o un fraude de identidad. En
casos complejos (cuando no se dispone del padre), la elección de familiares es
crucial para poder alcanzar un resultado fiable, siendo uno de los puntos que
más aumentan el resultado final el disponer de la madres del hijo dubitado y de
otros hijos “legítimos” si es que se necesita. En ocasiones los individuos vienen
condicionados por el propio caso, y por tanto no se pueden elegir teniendo que
realizar la prueba con las muestras disponibles.

● Obtención de perfiles de ADN y análisis genético


Como ya hemos comentado anteriormente, la mayoría de laboratorios
usan hoy día marcadores de PCR. Es necesario disponer de una amplia
batería de marcadores para conseguir lo que llamamos un “poder de exclusión
a priori” alto, o lo que es los mismo, la probabilidad de excluir de forma directa
a un presunto padre falsamente acusado. Para casos de tríos, con 13-15
marcadores suele ser suficiente. A partir de ahí, es como un puzzle, cuantas
más piezas tengamos, más fácil es saber que dibujo contiene. Por tanto si la
información genética que se aporta es baja (por falta de individuos o por
tratarse de relaciones genéticas lejanas), la cantidad de marcadores que se
usen debe incrementarse.
Los análisis genéticos en estos casos suelen ser fáciles, ya que las
muestras se suelen recoger en abundancia y en condiciones óptimas. En casos
forenses, a veces las muestras no son tan buenas, teniendo que recurrir a
estrategias especiales.
Hay que tener en cuenta que además de las leyes de la genética y de la
estadística, hay que tener en cuenta las leyes de Murphy, y saber que todo el
proceso se realiza partiendo de unos supuestos teóricos, que a veces se
alteran con anomalías varias como pueden se mutaciones, trisomías,
superfecundaciones, etc.
Una vez que tenemos unos perfiles genéticos, hay que contrastar los
resultados para comprobar la compatibilidad genética antes de pasar a la
siguiente fase, que es la valoración estadística. La valoración genética se basa
en los principios de la herencia mendeliana, sabiendo que cada individuo de los
dos alelos (variantes) que presenta para cada marcador (pseudogen) hereda
uno de su padre y otro de su madre. Si sabemos cual es el alelo que transmite
la madre, tendremos cual es el alelo “obligatorio” que ha transmitido el padre
biológico, y podremos contrastar con el presunto padre si posee dicho alelo o
no. En caso de que no lo posea hablamos de exclusión, y por tanto de
incompatibilidad genética. En caso de compatibilidad habrá que valorar
estadísticamente los resultados como veremos más adelante. No obstante,
debido a que en ocasiones hay anomalías como hemos comentado
anteriormente, en caso de exclusiones aisladas o incluso de únicamente dos
exclusiones, se suele valorar igualmente la prueba con las pertinentes
modificaciones.
En casos más complejos, la solución se complica, puesto que puede ser
que la madre no esté disponible, o lo que es peor, que no lo esté el presunto
padre. En estos casos, lo que se hace es reconstruir el posible perfil genético.
Si no se obtiene el perfil completo, habrá que valorar todas las combinaciones
genéticas compatibles con los individuos analizados, y a su vez comprobar si al
menos una de las combinaciones es compatible con el hijo. Si todas son
incompatibles, volveremos a hablar de exclusión. En caso contrario, habrá que
valorar estadísticamente todas las combinaciones de forma ponderada.
● Valoración estadística
Una vez demostrada la compatibilidad de las personas estudiadas,
habrá que valorar dicha compatibilidad.

De forma simplificada y genérica podemos decir que el cálculo de


paternidad se basa en calcular la probabilidad del genotipo del hijo (aunque
este cálculo se ve afectado por múltiples circunstancias). Habrá que diferenciar
cuando el hijo es homozigoto y heterozigoto.

Hijo homozigoto (AA):

Prob. genotipo hijo = prob. Padre trasmita A x prob. Madre trasmita A

Pr(AA) = P->A x M->A

Hijo heterozigoto (AB):

Prob. genotipo hijo = prob. Padre trasmita A x prob. Madre trasmita B +


+prob. Padre trasmita B x prob. Madre trasmita A

Pr(AB) = P->A x M->B + P->B x M->A

Estas fórmulas las vamos a usar continuamente para valorar las


paternidades, y en función de cada tipo de caso este padre (P) y esta madre
(M) variarán y por tanto las probabilidades de transmisión variarán.
De forma genérica podemos decir que si tenemos un progenitor de
genotipo conocido homozigoto la probabilidad de transmisión del alelo es 1, ya
que no tiene otra opción y en el 100% de los casos lo trasmite. Si el progenitor
es heterozigoto, la probabilidad de transmisión de cada alelo es la mitad, o sea
0,5. Si el progenitor no tiene el alelo, la probabilidad de transmisión será 0.
Probabilidad de transmisión del alelo
A
AA -> 1
AB -> 0,5
BB,BC -> 0

Si desconocemos el genotipo del progenitor la probabilidad de


transmisión será la frecuencia poblacional para dicho marcador, es decir la
probabilidad de transmisión del alelo A será a.

Para la valoración, se establecen siempre dos hipótesis excluyentes:

H1: el presunto padre (PP) es el padre biológico del hijo


H0: el presunto padre (PP) no es el padre biológico del hijo y por
tanto es otro hombre

Estas dos hipótesis tienen una probabilidad (condicionada) en función de


la información del caso (I) y del análisis genético (E de evidencia genética). A
través del teorema de Bayes podemos expresarlas en forma de cociente u
“odds”:

Pr(H 1 | E, I) Pr(E | H 1 , I) Pr(H 1 | I)


= x (Fórmula 1)
Pr(H 0 | E, I) Pr(E | H 0 , I) Pr(H 0 | I)

Como podemos ver hay tres términos:

Odds a posteriori = LR x Odds a priori

El odds a posteriori es lo que intenta determinar el juzgador, es decir,


saber en función de la información del caso que tiene, genética (E) y de otro
tipo (I), la relación a favor/en contra de la paternidad. Para ello hay que
combinar el LR (likelihood ratio o coeficiente de verosimilitud) con los odds a
priori. El LR es el valor que puede obtener el laboratorio, que en casos de
paternidad de denomina Índice de Paternidad (IP).
Los odds a priori es un valor que debe proporcionar el juzgador, y que no
viene a ser otra cosa que la relación a favor en contra de la paternidad que se
tiene antes de realizar la prueba genética (con las evidencias no genéticas).
Tradicionalmente se establece, a falta de otra indicación, un a priori neutro, es
decir, que hay las mismas probabilidades a favor que en contra. No obstante,
este valor puede no ser adecuado, y de hecho se discute que es incluso
erróneo. En varios países, los tribunales proporcionan un a priori concreto e
incluso se hace el cálculo con un panel de a prioris diferentes.

En el caso de las paternidades

Pr(H1|E,I)=1- Pr(H0|E,I)
Pr(H1|I)=1- Pr(H0|I) (Fórmula 2)

Por lo que sustituyendo nos queda

LR × Pr(H 1 | I)
Pr(H 1 | E, I) =
LR × Pr(H 1 | I) + [1 − Pr(H 1 | I)]

Donde Pr(H1|E,I) es la probabilidad de paternidad o W (Wahrscheinlickeit


según Essen-Möller) y Pr(H1|I) es la probabilidad de paternidad a priori. Si
consideramos que la probabilidad de paternidad a priori es igual que la
probabilidad de no paternidad, y por tanto igual a 0,5 (aplicar fórmula 2),
tendríamos la ecuación de Essen-Möller:
W=LR/(LR+1)=1/(1+1/LR) (por tanto LR=W/(1-
W))

En general, para simplificar tendremos que asumir una serie de


premisas:

1. Ambos progenitores biológicos (Padre y Madre) no están relacionados


genéticamente
2. Hay equilibrio de Hardy-Weinberg en la población de referencia (lo que
implica que no hay subestructuración poblacional, que los marcadores son
independientes y que no hay alelos silentes)
3. No ocurren mutaciones
4. La herencia es mendeliana con sistemas codominantes

Ninguna de las premisas son ciertas en mayor o menor grado, y hay que ser
conscientes de si conocemos dichas circunstancias y en que manera pueden
alterar nuestros resultados.
Asumiendo todas las premisas expuestas vamos a abordar el caso más
simple al que podemos enfrentarnos, el caso estándar (trío PP-M-H). Para
calcular el IP (LR) lo que tenemos a nuestra disposición es el tipaje genético
del presunto padre (padre alegado), madre e hijo para un número adecuado de
marcadores. Suponemos la maternidad cierta, y que a priori se excluye
cualquier pariente próximo del presunto padre. El IP total será el producto de
los IP de cada marcador.

Tradicionalmente se expresa el IP como el cociente X/Y siendo


X=Pr(E|H1,I) e Y=Pr(E|H0,I). La evidencia genética que tenemos (E) son los
genotipos del presunto padre, madre e hijo (GP, GM, GH). Por tanto:

X Pr(E | H 1 , I) Pr(G P , G M , G H | H 1 , I)
IP = LR = = =
Y Pr(E | H 0 , I) Pr(G P , G M , G H | H 0 , I)

Dónde aplicando la tercera ley de la probabilidad

X Pr(GH | G P , G M , H 1 , I) Pr(GP , G M | H 1 , I)
IP = = ×
Y Pr(GH | G P , G M , H 0 , I) Pr(GP , G M | H 0 , I)
(Fórmula 3)

En esta ecuación en el segundo término, los genotipos de los padres son


independientes de las hipótesis, por lo que serán iguales en el numerador y en
el denominador, y por tanto su valor será 1. En otros casos (complejos) no será
así y no se eliminarán de los cálculos. Aun así hay autores que prefieren no
eliminarlos de las fórmulas y por tanto la X y la Y serán algo diferentes a las
que veremos.

Para hacer más comprensible la explicación abandonaremos la notación


estadística a partir de aquí y volveremos a la notación más genética y genérica
que es más intuitiva. El desarrollo completo puede encontrarse en varios
textos.

Como vimos antes se trata de calcular la probabilidad del genotipo del


hijo condicionada al genotipo de los padres bajo ambas hipótesis diferenciando
cuando el hijo es homozigoto y heterozigoto.

Hijo homozigoto (AA):

X PP → A × M → A
IP = =
Y Pob → A × M → A

Hijo heterozigoto (AB):

X PP → A × M → B + PP → B × M → A
IP = =
Y Pob → A × M → B + Pob → B × M → A

En la X usaremos los genotipos de los padres (presunto padre: PP y


madre biológica: M) y aplicaremos las probabilidades de transmisión que vimos
anteriormente.
En el caso de la Y (denominador), consideramos que el padre no es el
presunto padre, sino otro individuo no relacionado (padre alternativo), lo que se
conoce como padre de la población (Pob). En este caso la probabilidad de
transmisión será la frecuencia poblacional para dicho marcador. Para la madre,
que conocemos su genotipo hacemos igual que en el numerador (X).
Habrá casos en los que el padre es incompatible con la combinación
Madre-Hijo, por lo que el valor de X será cero, y por tanto el IP será cero.
Para casos más complejos, las premisas modifican los cálculos, y en
casos defectivos hay que jugar con el calculo ponderado de todas las
combinaciones posibles. Con unos ejemplos prácticos podremos entender
mejor la forma de calcularlo.

● Emisión de informe y defensa ante los tribunales

Una vez valorada la prueba, tanto genéticamente como


estadísticamente, hay que emitir un informe. En dicho informe se deben reflejar
todos los datos que afecten a la valoración, como técnicas y marcadores, las
referencias poblacionales empleadas, y las hipótesis valoradas y los
resultados.
Deben evitarse aseveraciones como “es el padre”, ya que lo que hace el
laboratorio es evaluar únicamente la evidencia genética mediante el IP, y por
tanto siempre hablamos de probabilidades que no son absolutas.
Si es requerido, el perito deberá defender y explicar su informe ante los
tribunales, cuestión harto difícil, dado el desconocimiento de personas ajenas a
la genética de temas tan complejos.
IDENTIFICACIÓN DE RESTOS CADAVÉRICOS

MANUEL LÓPEZ SOTO


Facultativo del Servicio de Biología. Instituto Nacional de Toxicología y
Ciencias Forenses. Departamento de Sevilla.

La aparición de restos humanos en lugares tan diversos, la exhumación


de restos óseos cuando está en litigio alguna prueba de filiación, los
accidentes domésticos y de tráfico, los últimos atentados terroristas que están
conmocionando al mundo, están haciendo que la identificación de restos
cadavéricos forme parte de la rutina diaria de un laboratorio de biología legal o
forense.
Cuando se trata de identificar a individuos vivos podemos recurrir a
multitud que mecanismos que permiten resolver esta cuestión de forma rápida,
como por ejemplo, los datos fisonómicos, el peso, la talla, el registro de voz, el
D.N.I. Sin embargo, cuando queremos identificar un cadáver, es decir,
reconocer si una persona es la que se busca, todos esos mecanismos que en
principio parecen tan obvios para los sujetos vivos, en el caso de los
cadáveres, brillan por su ausencia en ocasiones.
Cuando nos encontramos ante unos restos cadavéricos que
necesitamos identificar unos restos cadavéricos, es preciso observar en primer
lugar el estado de conservación en el que se encuentra. Éste dependerá de si
se han puesto en marcha o no los procesos de destrucción natural tales como
los mecanismos de autólisis, originados por la fermentación anaeróbica de las
enzimas propias del organismo y los mecanismos de putrefacción originados
por la contaminación bacteriana. No obstante, en algunos casos, el cadáver se
puede encontrar, de forma natural o artificial, conservado en estados de:
momificación, embalsamación, saponificación, corificación o congelación.
De forma general, un cadáver se puede identificar siguiendo tres etapas
independientes entre sí o consecutivas: datación de los restos cadavéricos
mediante unos criterios morfológicos y químicos; un diagnóstico de especie
mediante análisis inmunológicos o de ADN y por último, un diagnóstico
individual mediante la determinación de la etnia, sexo, talla, y por supuesto,
ADN.
Cuando un laboratorio de biología forense se enfrenta a la identificación
genética de unos restos humanos, se va a encontrar con el problema de que
posiblemente en dichos restos se han puesto en marcha los mecanismos de
modificación del ADN postmortem, cuyos agentes causales son los agentes
oxidantes, las radiaciones ultravioletas, la humedad, la temperatura, los
microorganismos y el pH ambiental. Todos estos factores, además de producir
daños moleculares van generar un foco de contaminación y una fuente de
posibles inhibidores que requerirá una excelente praxis pericial por parte del
laboratorio.
Desde el punto de vista del análisis genético y con relación a qué tipo de
muestra se selecciona para su análisis, existe un gran consenso en el ámbito
internacional. El orden más lógico de selección sería, en primer lugar, sangre;
en segundo lugar, músculo o pelos con raíz y, en tercer lugar, dientes o
huesos, prefiriendo de estos últimos, los huesos largos a los cortos o planos.
Aunque cada laboratorio puede elegir el método de extracción que más
crea más conveniente, nosotros recomendamos para la sangre fenol-
cloroformo-isoamílico (FCI) seguido de un paso de microfiltración-purificación o
precipitación con etanol (si la sangre está en mal estado) o mediante columnas
de extracción del tipo GFx o NSB (si la sangre es líquida y está en buen
estado); para el músculo, los pelos, los huesos o los dientes también
recomendaríamos el mismo método de extracción expuesto para la sangre en
mal estado. No obstante, tanto los huesos como los dientes necesitarán de un
procesado previo consistente en: limpieza, para eliminar restos de suciedad
adheridos a los mismos, exposición a U.V., para eliminar contaminantes
superficiales, pulverización en nitrógeno líquido, descalcificación (opcional) y
extracción orgánica con FCI. Los huesos, además, se someterán a un lijado y
corte en secciones transversales de la superficie que se va a analizar entre el
paso de lavado y pulverización.
Una vez extraído el ADN de los restos cadavéricos se cuantificará y se
decidirá si analizar marcadores de STRs (autosómicos como de cromosoma Y)
o ADN mitocondrial.
Por último, se comentarán algunas de las identificaciones de interés
histórico como fueron las de Josef Mengele y Martin Bormann, las de Jesse
James, las de la familia Romanov y las del Tercer Presidente de los Estados
Unidos, Thomas Jefferson. También abordaremos, dado el interés social que
ha generado en la actualidad, la identificación de los restos óseos de Cristóbal
Colón y de Diego Colón, su hermano, así como las de Hernando Colón, hijo del
afamado almirante.
IDENTIFICACIÓN GENÉTICA EN GRANDES CATASTROFES

ANTONIO ALONSO ALONSO


Facultativo del Servicio de Biología. Instituto Nacional de Toxicología y
Ciencias Forenses. Departamento de Madrid.

La utilización de bases de datos de ADN cobra también una vital


importancia en los procesos de identificación humana en grandes catástrofes
en los que a menudo se requiere el uso de herramientas bioinformáticas
capaces de realizar búsquedas sistemáticas de un alto número de perfiles de
ADN de acuerdo a diferentes algoritmos y que al mismo tiempo permitan
evaluar con rapidez la significación estadística (LR) de los distintos grados de
coincidencia observados entre los perfiles genéticos de las muestras post-
mortem y los perfiles obtenidos de las posibles muestras antemortem de las
víctimas (utensilios de aseo personal, biopsias,...) o de muestras de referencia
(sangre o saliva) de sus familiares vivos.
Existe un conjunto interrelacionado de factores y circunstancias que
pueden comprometer o dificultar el objetivo final de la identificación genética de
las víctimas de una gran catástrofe, tales como: (1) el número de víctimas y
modelo poblacional (población abierta o cerrada), (2) los mecanismos de
destrucción de los cuerpos, (3) el grado de fragmentación, (3) el estado de
degradación del ADN, (4) la accesibilidad a las muestras post-mortem o (5) el
tipo de muestra de referencia disponible.
En esta lección examinaremos las diferentes fases del proceso de
identificación genética (toma de muestras, análisis de ADN y tecnología
aplicable, sistemas de búsqueda y comparación de perfiles de ADN en base de
datos, valoración estadística y criterios de significación de los distintos grados
de coincidencia) y revisaremos la problemática de este tipo especifico de
análisis de ADN en diversos casos de grandes catástrofes descritos en la
literatura científica. Pondremos especial énfasis en el progreso científico
obtenido de los esfuerzos de colaboración entre diversos laboratorios públicos
y privados de EEUU durante la identificación de victimas del atentado terrorista
contra el WTC de Nueva York el 11 de Septiembre de 2001. Incluyendo no
solamente el desarrollo de nuevas tecnologías (Min-STRs, SNPs, ) aplicables
al estudio de muestras post-mortem altamente degradadas, sino también
diversos aspectos de la toma de muestras y su registro y documentación
electrónicas, así como de la interpretación estadística de la prueba del ADN y
su significación en distintos escenarios.
Analizaremos los principales retos y los posibles obstáculos para la
identificación de las más de 200.000 víctimas producidas por el Tsunami (26
de Diciembre de 2004) que afectó a 12 países del sur del continente Asiático.
Presentaremos también nuestra propia experiencia y la problemática
surgida en algunos casos recientes tales como el ataque terrorista en Madrid
del 11 de marzo de 2004 que arrojo 191 víctimas, o el accidente aéreo del
Yakolev-42 en Trabzon (Turquía) el 23 de Mayo de 2003 en el que perdieron la
vida 62 militares españoles que volvían a España de una misión de paz en
Afganistán.
BASES DE DATOS DE ADN

ANTONIO ALONSO ALONSO


Facultativo del Servicio de Biología. Instituto Nacional de Toxicología y
Ciencias Forenses. Departamento de Madrid.

Las bases de datos de ADN con fines de investigación criminal son


actualmente las bases de datos genéticas de mayor interés para los
laboratorios forenses. Gracias a la experiencia acumulada por un gran número
de países en todo el mundo (que ya han desarrollado una legislación
específica) hoy sabemos que la comparación sistemática de los perfiles de
ADN provenientes de distintas causas penales estructurados en una misma
base de datos, puede ser una herramienta muy eficaz para reducir el índice de
criminalidad de determinados delitos sin autor conocido y, especialmente,
aquellos en los que existe una alta reincidencia. De esta forma la prueba del
ADN ha dejado de ser un mero testigo “a posteriori" de los hechos criminales
para convertirse potencialmente en una herramienta preventiva de la
criminalidad. Serán, por tanto, estas bases de datos las que centren gran parte
del contenido de esta presentación en la que realizaremos una revisión de la
situación en Europa para, con posterioridad, hablar de la situación especifica
de nuestro país en este tema.
No debemos de olvidar, sin embargo, que existen otro tipo de bases de
datos genéticas de gran interés para la comunidad científica forense y que
también serán abordadas en esta lección del curso. Me estoy refiriendo por
ejemplo a las bases de datos de ADN para la identificación de desaparecidos
entre las que destacan los proyectos de identificación de victimas de conflictos
bélicos o de victimas de catástrofes. (Los retos a los que se enfrenta la prueba
del ADN en la identificación genética de victimas de grandes catástrofes,
serán tratados por el autor en otra lección de la presente edición del curso de
Biología Forense).
Por otro lado, se abordarán las bases de datos poblacionales de
marcadores de ADN humanos utilizados en genética forense (muchas de ellas
públicas y accesibles por Internet) que se han convertido en una herramienta
esencial para poder realizar una evaluación bioestadística adecuada del valor
de la prueba del ADN, tanto de marcadores STR autosómicos como de datos
haplotípicos (Y-STR o mtDNA).
Haremos también una breve referencia a un grupo heterogéneo de
bases de datos de ADN que emergen en los diversos ámbitos de aplicación de
las ciencias forenses y que pueden ser de utilidad en muy diversos
diagnósticos que van desde la identificación genética de vestigios de distintas
especies animales en la escena del crimen a la identificación de especies
tóxicas o patógenas.
Por último, nos asomaremos al futuro de las bases de datos de ADN
forense en la era de la genómica.
MESA REDONDA

EL INFORME PARCIAL Y SU DEFENSA ANTE LOS TRIBUNALES

PONENTE: CARLOS PUIGCERVER ASOR


Profesor de Derecho Procesal de la Universidad de Valencia

LA VALORACIÓN DE LA PRUEBA PERICIAL

1.- INTRODUCCIÓN
Cuando un Juez o Tribunal dicta una sentencia realiza un acto de
pensamiento que es un juicio lógico jurídico que responde a la estructura del
silogismo en el que, la premisa mayor es la norma, la premisa menor es el
hecho y la consecuencia es el fallo o parte dispositiva de la resolución judicial.
La sentencia es, pues, aplicación del derecho mediante la subsunción de
un hecho en una norma jurídica de manera que se produzca una determinada
consecuencia jurídica.
En uno de los estadios de este proceso intelectual el juez debe fijar los
hechos ocurridos en la realidad y para ello deberá valorar la prueba practicada.

2. LA VALORACIÓN DE LOS MEDIOS DE PRUEBA


En definitiva, para que el juzgador conozca si se han producido o no los
hechos afirmados en el proceso debe valorar la prueba practicada lo que
implica dos operaciones, una primera denominada interpretación en la que
deberá extraer cuáles son las afirmaciones, las consecuencias que se
desprenden de las pruebas y una segunda que será la de darles valor para fijar
o no unos determinados hechos como producidos o existentes.

A) Valoración libre y valoración tasada o legal de los medios de


prueba
Esa segunda labor que consiste en la de fijar el valor de ese medio de
prueba, puede estar reglada por la ley, en el sentido de establecer unas
normas o criterios para valorar, son los llamados medios de prueba de
valoración legal o tasada, o, por el contrario, puede dejarse a la libre
apreciación del juzgador, son los llamados medios de prueba de valoración
libre.
B) La valoración de la prueba pericial
La prueba pericial es un medio de prueba de libre valoración, es decir,
desde el plano teórico, los informes periciales, cualquiera que sea la autoridad
científica de la que emanan no constituyen verdad intangible o incontrovertible,
sino que sólo son una opinión científica o técnica que será valorada por el Juez
o Tribunal, pues de otro modo, como afirma ALONSO PÉREZ, se le llegaría a
vincular de tal manera que el perito se convertiría en juez sustituyendo a éste
en su función.
Ahora bien, prueba de valoración libre no quiere decir prueba arbitraria
de modo que el Tribunal no puede rechazar de manera irrazonada o caprichosa
un dictamen pericial, sino que deberá expresar las razones que le llevan a no
darle valor y el proceso lógico llevado a cabo para llegar a esa conclusión, lo
que no resultará fácil cuando deban de manejarse conocimientos científicos o
técnicos de gran precisión o complejidad, por lo que en innumerables
ocasiones el juzgador concederá a la prueba pericial un valor absoluto.

3. TRATAMIENTO JURISPRUDENCIAL DE LAS PRUEBAS BIOLÓGICAS


DE PATERNIDAD
El valor que se concede por los Tribunales a las pruebas biológicas de
paternidad es absoluto, casi de certeza, aunque dicho valor no se atrevan a
confesarlo directamente en todos los casos, disimulando el valor determinante
de la misma mediante referencias a otros medios de prueba que valorados
conjuntamente les llevan a la misma conclusión.
Es significativo que en todos los casos en que se ha practicado una
prueba de paternidad y su resultado ha dado alta probabilidad de paternidad, la
sentencia ha terminado por declarar la filiación, eso sí declarando que no se le
está dando valor absoluto o de certeza.
Sirva de muestra la Sentencia del Tribunal Supremo (Sala de lo Civil), de
20 mayo 1991 en donde se afirma que la probanza biológica de la paternidad
constituye una prueba directa, pero no plena y absoluta, no obstante ha de
atribuírsele valor de casi total aproximación a la verdad, sobre todo, cuando
sucede, como en la presente controversia, que dicho informe pericial, ha sido
emitido por un órgano técnico oficial, dotado de medios y eficacia, para su
elaboración más exacta, cual es el Instituto Nacional de Toxicología,
dependiente del Ministerio de Justicia y que concurren el 99,9998 por cien de
probabilidad, y con un índice (IP) de paternidad de 840191:1, y según la
posición científica de K. Hammel, ello supone una «paternidad prácticamente
probada».
También la Sentencia del Tribunal Supremo núm. 1070/1992 (Sala de lo
Civil), de 24 noviembre que con un porcentaje del 99,9324% en las pruebas
biológicas afirma que debe entenderse que la paternidad está prácticamente
probada, encontrándonos con ante una prueba de casi absoluta fiabilidad.
Finalmente es de destacar la Sentencia del Tribunal Supremo de 2 de
enero de 1991 en donde se decía que «La probabilidad de paternidad (w)
obtenida es de 99,91% valor que se encuentra dentro del rango considerado
por K. Hummel y colaboradores como Paternidad prácticamente probada.
Asimismo el Índice de Paternidad (IP) obtenido es de 1293,48, valor que se
encuentra dentro de rango considerado por los mismos autores como
Paternidad prácticamente probada, y de aquí, que proyectando cuanto
antecede al meritado caso de que se trata, es de llegar a la conclusión de que
en él, se consiguió una certeza casi absoluta en el resultado de la valoración de
la prueba».

4. VALORACIÓN JUDICIAL DE LA NEGATIVA A SOMETERSE A LAS


PRUEBAS BIOLÓGICAS DE PATERNIDAD
Para concluir debemos hacer una referencia a las graves y negativas
consecuencias que tiene el no someterse a las pruebas biológicas, pues,
generalmente, dan lugar a una sentencia declarando la paternidad siempre y
cuando en el proceso se hayan acreditado otras circunstancias tales como la
existencia de relaciones, sostenimiento económico o relación personal,
habiéndose rechazado todos las excusas alegadas para negarse a su práctica
cuando están basadas en los derechos constitucionales a la intimidad personal
y familiar o a la integridad física y moral, admitiéndose tan solo en dos casos, a
saber, cuando exista un grave peligro para la salud, o cuando no exista un
mínimo de prueba que permita deducir la posibilidad de paternidad.
Recogen esta doctrina las siguientes sentencias: Sentencia Audiencia
Provincial núm. 14/2004 Asturias (Sección 5ª), de 22 enero de 2004, Sentencia
del Tribunal Supremo de 11 de septiembre de 2003 y Sentencia del Tribunal
Constitucional 95/1999, de 31 de mayo.

BIBLIOGRAFÍA DE INTERÉS:

1.- FONT SERRA, EDUARDO; El dictamen de peritos y el reconocimiento


judicial en el proceso civil. Ed.: La Ley, 1ª edición, mayo de 2000. Las Rozas
(Madrid)
2.- LÓPEZ-MUÑIZ GOÑI, MIGUEL; La prueba pericial. Guía práctica y
jurisprudencia. Ed.: Colex. 2ª edición. Madrid 2004.
3.- ALONSO PÉREZ, FRANCISCO; Medios de investigación en el proceso
penal. Ed.: Dykinson, 2ª edición. Madrid 2003.
3.- MONTERO AROCA, JUAN; BARONA VILAR, SILVIA; GÓMEZ COLOMER,
JUAN-LUIS Y MONTÓN REDONDO, ABERTO, “Derecho jurisdiccional I”, Ed.
Tirant lo Blanch. 13ª edición, Valencia 2004.
4.- MONTERO AROCA, JUAN; BARONA VILAR, SILVIA; GÓMEZ COLOMER,
JUAN-LUIS Y MONTÓN REDONDO, ABERTO, “Derecho jurisdiccional II”, Ed.
Tirant lo Blanch. 13ª edición, Valencia 2004.
5.- ALMAGRO NOSETE, JOSÉ; GIMENO SENDRA, VICENTE; CORTÉS
DOMÍNGUEZ, VALENTÍN Y MORENO CATENA, VÍCTOR, “Derecho procesal”
Tomo I (Vol. I), Ed. Tirant lo Blanch. 4ª edición, Valencia 1989.

PONENTE: FELIX SÁNCHEZ UGENA


Director del Instituto de Medicina Legal de Badajoz

El Juez solicitará un informe pericial cuando, para conocer o


apreciar algún hecho, fueran necesarios conocimientos científicos
especializados. Aunque tradicionalmente se dice que los Jueces sentencian
según se les informa, lo cierto es que nuestra Legislación establece que “Los
Jueces y Tribunales apreciaran la prueba pericial según las reglas de la sana
crítica, sin estar obligados a sujetarse al dictamen de los peritos”.
REQUISITOS Y CUALIDADES QUE DEBE REUNIR EL PERITO

1.- CUALIDADES PERSONALES

a) Objetividad.

b) Capacidad de reflexión y sentido común


c) Prudencia.
d) Imparcialidad..
e) Veracidad.

2.- FORMACIÓN CIENTÍFICA.

3.- CONOCIMIENTOS JURÍDICOS.

VALOR JERÁRQUICO DE LA PRUEBA PERICIAL

− CERTEZA MATEMÁTICA. Consiste en la comprobación de las leyes


mismas del pensamiento, por lo que partiendo de postulados ciertos se
ha de llegar a resultados exactos.

− CERTEZA MORAL. Se trata de una convicción sin pruebas sólidas


que la sustenten.

− CERTEZA FÍSICA. Se encuentra entre lo absoluto de la certeza


matemática y la relatividad de la certeza moral.

− CERTEZA LEGAL. A estos tres grado de certeza podemos añadir en


la práctica la denominada certeza legal. Es aquella que aunque no es
absoluta, si es suficiente para la administración de justicia, ya que
“permite razonablemente fijar una conclusión que responda a criterios
científicos y lógicos, aunque no alcance una evidencia integral”.
EL INFORME PERICIAL

Es un documento médico-legal emitido por orden de las autoridades o


a petición de particulares sobre el significado de ciertos hechos con
trascendencia judicial o administrativa. Puede ser evacuado por un solo
perito o por una corporación científica: Instituto Nacional de Toxicología,
Cuerpo de Médicos Forenses, Colegios de Médicos, Reales Academias, etc.
y suele ser solicitado en actuaciones judiciales ya adelantadas.

Sus características fundamentales serian:

a) Se trata de un documento oficial, parte integrante e importante en el


procedimiento, que contienen datos médico-biológicos y datos
susceptibles de ser discutidos.

b) La discusión tiene como objetivo reconstruir un hecho de interés judicial


sucedido en el pasado.

c) No se trata de aportar una opinión, sino una demostración.

d) El informe generalmente se continua en una declaración verbal ante el


tribunal.

Desde el punto de vista formal, un Informe Pericial debe constar de


consta de las siguientes partes

PREÁMBULO. Se inicia con los hombres del perito o peritos, sus títulos,
residencia, autoridad o persona que ha solicitado el informe y objeto del
mismo, reproduciéndolo literalmente de la orden recibida.

RELACIÓN Y DESCRIPCIÓN DE LOS OBJETOS ACERCA DE LOS


CUALES DEBE EMITIRSE EL INFORME. Pueden ser documentos médico-
legales, objetos (armas, manchas, huellas o cualquier otro tipo de pruebas
de convicción) o personas (inculpado lesionado, cadáver). Tanto la
trascripción de los documentos como la descripción de los objetos y
personas será minuciosa y fidedigna, y a ser posible acompañarse de
fotografías, croquis...

OPERACIONES PRACTICADAS. Conviene su descripción, puntualizando


las técnicas que se hayan usado en cada caso.

VALORACIÓN. Es lo fundamental del informe. Se trata de la discusión de


estos resultados, de su estudio científico, doctrinal y técnico. Precisa un
razonamiento lógico y claro que sirva de nexo de unión entre los hechos que
se recogen y las conclusiones que se sientan.

CONCLUSIONES. Deben ser entresacadas de las consideraciones


efectuadas en el razonamiento anterior. Se formulan numerándolas en
párrafos separados, haciendo tantos apartados como afirmaciones o
negaciones se hagan.

FÓRMULA FINAL. Generalmente es la siguiente: “Lo cual es cuanto puede


manifestar en cumplimiento de la misión que le había sido encomendada”.
Fecha y firma.

EXPOSICIÓN DE CASOS PRÁCTICOS