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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ INSTITUTO DE TECNOLOGIA FACULDADE DE ENGENHARIA DE ALIMENTOS

GYORGY RONALDO SAMPAIO FERREIRA 10091001901

RELATÓRIO SOBRE ATIVIDADE DA PEROXIDASE NA POLPA DE AÇAÍ (Euterpe oleracea)

Relatório apresentado como pré-requisito para obtenção de nota para a disciplina Bioquímica de Alimentos II, referente às aulas práticas dos dias 15 de setembro, 13 e 27 de outubro de 2009, sobre a atividade enzimática da peroxidase presente no açaí.

BELÉM OUTUBRO- 2009

(LEHNINGER et al. cor. fibras e outras substâncias nutracêuticas. naturalmente presentes em vegetais in natura (MENEZES et al. remoção dos frutos desses cachos. Podem causar mudanças indesejáveis no aroma.1... A degradação do açaí pode decorrer da ação da enzima polifenoloxidase.1. Enzimas têm um pH ótimo(ou intervalo de pH) no qual sua atividade é máxima. esse produto é altamente perecível. gosto. a manipulação favorece a proliferação de microrganismos e reações enzimáticas. (EMBRAPA. 2006) As peroxidases (POD) e polifenoloxidases (PFO). transporte e condições ambientais desfavoráveis. 2005). 2008) Essas reações enzimáticas são responsáveis por mudanças nas suas propriedades organolépticas e nutricionais.11. por possuir significativo teor lipídico. com destaque para a peroxidase que. participar da destruição de vitamina C. é matériaprima para produção de polpa ou suco. à elevada carga microbiana presente no fruto. catalisar o branqueamento dos carotenóides na ausência de ácidos graxos insaturados e a descoloração de antocianinas. produzindo voláteis que alteram o sabor (BRITO et al. a sua inativação é utilizada como indicadora da eficiência nos tratamentos térmicos. Essa perecibilidade pode estar associada. 2008). são as principais responsáveis por alterações indesejáveis das características originais. como altas temperaturas e alta umidade relativa. Em extremos de pH (muito ácido ou muito alcalino) essa atividade diminui. Catalisa a reação de degradação de ácidos graxos insaturados. principalmente. doador H2O2 oxidorredutase) é uma enzima associada a reações de deterioração oxidativa em frutas e vegetais e produtos processados. e agravada às práticas pós-colheita a que o fruto é submetido. no processo de obtenção da polpa. Essas enzimas catalisam a oxidação de substâncias polifenólicas. e com grande conteúdo funcional em razão do conteúdo de antocianinas. alimento altamente energético. Além disso. 2006) .. relacionada com a colheita dos cachos. presentes na maioria dos vegetais. A peroxidase (E. textura e também a perda de nutrientes. INTRODUÇÃO O açaí (Euterpe oleracea) é um fruto típico da Amazônia.1.. por ser a enzima mais termorresistente. Porém.7.C.. (MENEZES et al. principais responsáveis pela deterioração desse produto.

A peroxidase é termorresistente. Por está razão. em que enzimas naturais termorresistentes estão presentes. se a peroxidase é inativada. está enzima é muitas vezes utilizada como indicador das outras enzimas presentes no mesmo alimento. (ROGEZ. É geralmente admitido que. Este máximo ocorre devido o processo térmico fornecer suficiente letalidade para os microrganismos. 1992) O objetivo destas três práticas foi avaliar o comportamento da atividade enzimática da peroxidase presente no açaí variando o pH. mas insuficientes para a inativação da enzima. todas as outras enzimas também serão. . há limitação na temperatura máxima que pode ser atingida no processo. 2000) No açaí. tempo e temperatura. (MAGALHÃES. pois sua inativação só se inicia a partir de 70°C. Isto é uma conseqüência da diferença de degradação microbiana e enzimática à temperatura (D e Z).

Para o pH 3 foi utilizado ácido cítrico (C6H8O7) e hidróxido de sódio (NaOH). Balão volumétrico. Termômetro. 2 e 3 respectivamente. As equações utilizadas estão nas Figuras 1. 2. 4. 4. MÉTODOS 2.                  Polpa de açaí.2.2. Cubetas.1. Espectrofotômetro (BioPharma Ultrospec 200) Balança semi-analítica. MATERIAL Os materiais utilizados nas aulas práticas dos dias 15 de setembro.H2O) e fosfato de sódio difásico (Na2HPO4). 6 e 7. Tubos de ensaio. Cronômetro. Soluções tampão pH 3. 13 e 27 de outubro estão listados abaixo. Tubos de inox. Para os pH’s 4 foi utilizado sódio de acetato anidro (CH3COONa) e ácido acético glacial (CH4O2). 6 e 7. Para isso foram feitos os cálculos de suas concentrações e através delas calculou-se a massa/volume utilizada de cada reagente. . Prática I: Soluções tampão Nesta aula prática foram feitas soluções tampão de pH’s 3. Funil. Micropipetas. Ultrassom (UltraSonic Clear). 5. 5. MATERIAL E MÉTODOS 2. Banho-maria (Quimis Q-215 M2).2. Solução de p-pda (phenylenediamine). e para os pH’s 6 e 7 fosfato de sódio monohidratado (NaH2PO4. Solução de peróxido de hidrogênio (H2O2). Papel filtro.1.

Para o preparo das amostras foram pesadas. A essas cubetas foi adicionado 2700 μL de tampão. 100 μL de H2O2. açaí e p-pda. em cubetas de 3000 μL.5 μL de H2O2 com uma micropipeta e estes foram armazenados no isopor ao abrigo da luz e sob refrigeração. Após a homogeneização as soluções foram transferidas para os tubos eppendorf. H 2O2. 76. Para o preparo da solução de peróxido de hidrogênio (H2O2) a 30% foi colocado em balões volumétricos de 50 mL. 7 amostras cada uma contendo cerca de 1 g de açaí. Foram então diluídas novamente a um fator de 3.33 e foram então transferidas para cubetas. 4. utilizada para encontrar o volume de solução em razão da densidade. Após a adição de cada.2.2 g de p-pda em uma balança semi-analítica e essa massa foi colocada em um balão volumétrico de 10 mL protegido de papel alumínio e foi então solubilizada com as soluções tampão descritas acima. De posse da determinação do melhor pH foi feito então a determinação de K M e VMÁX. que continham soluções tampão de pH’s 3. Prática II: Determinação de pH ótimo e determinação de KM e VMÁX Para se determinar o pH ótimo de ativação enzimática foi preparada uma solução de p-pda. e foram então armazenadas dentro de um isopor para que pudessem ficar sob refrigeração e não fossem expostas a luz. as . 2. em seguida foram adicionadas a elas suas soluções tampão de pH respectivo a um fator de diluição de 1:9. esses balões volumétricos foram levados a um banho de ultrassom para que o p-pda fosse homogeneizado totalmente na solução tampão. Nessa solução foram pesados 0. Equação utilizada para encontrar a concentração.2.[ [ Figura 1: ] ] Figura 2: Equação Figura 3: Equação utilizada para encontrar a massa de reagente sólido.. 6 e 7. As amostras foram então filtradas em papeis filtro e que estavam dentro de tubos de ensaio. 5. Essas cubetas foram então homogeneizadas e levadas ao espectrofotômetro para que fosse feito a leitura de absorbância para se determinar o pH ótimo através da maior absorbância. 100 μL de açaí diluído em seu respectivo tampão e 100 μL de p-pda a 2%. Para isso foram utilizadas certas quantidades de solução tampão. Essas quantidades estão na Tabela 1.

33. 100µl da diluição . Prática III: Determinação de D e Z. Primeiramente foram pesadas 5 amostras de açaí cada uma contendo cerca de 20 g dentro de tubos de inox.2. 2. Tabela 1: Quantidades de soluções adicionadas às cubetas Cubeta 1 2 3 4* 5 6 7 Solução tampão (μL) 2790 2790 2780 2750 2700 2600 2400 H2O2 (μL) 100 100 100 100 100 100 100 Açaí (μL) 0 100 100 100 100 100 100 p-pda 2% (μL) 10 10 20 50 100 200 400 *A amostra foi feita em triplicata. sendo que uma amostra foi feita em triplicata.3. em função desta massa foram então diluídas a um fator igual a 1:9 com o tampão ideal. Após esta diluição foram filtradas e transferidas para um tubo de ensaio e foram novamente diluídas a um fator igual a 3. 100µl de peróxido. Quando as amostras atingiram a temperatura e o tempo desejado foram resfriados a uma temperatura de 21°C. Esses tubos foram colocados em um banho-maria para que as amostras atingissem determinadas temperaturas em tempos diferentes (Tabela 2). Tabela 2: Tempo de incubação pela temperatura a qual cada amostra sofreu Tubos 1 2a 2 b c Tempo de incubação 1s 30 s 30 s 30 s 10 min.cubetas foram levadas ao espectrofotômetro para que se pudesse saber o valor KM e VMÁX. Em cubetas foi adicionado 2700µl de tampão. 1s 1s Temperatura(°C) 85 85 85 85 85 75 65 2 3 4 5 Após este tratamento térmico foi pesado em um tubo de ensaio um grama de cada amostra e também uma nova amostra que não havia sofrido tratamento térmico.

2. Determinação do pH ótimo Para a determinação de pH ótimo foi feito um gráfico (Figura 4) em que é mostrado os resultados desta aula prática. 6 e 7) teve-se uma atividade enzimática máxima no pH próximo a 6.2 0.0 2 3 4 5 pH 6 7 8 Figura 4: Gráfico de atividade enzimática em função da peroxidase.1.3 UA/min 0. E então foi com os cálculos da absorbância foi feito o cálculo da concentração de produto formado através da equação da reta da curva de calibração (Figura 5). 5. RESULTADOS 3. Determinação de KM e VMÁX Para a determinação de KM e VMÁX foi primeiramente necessário ser feito da absorbância em cada cubeta em função da concentração de p-pda (Tabela 3).1. e que em no pH 3 e quando está se passando do pH 7 e indo para um pH mais alcalino a atividade enzimática começa a decrescer. RESULTADOS E DISCUSSÃO 3. 3.do açaí e 100µl da solução de p-pda (2%). 0. De acordo com o gráfico (Figura 4) foi possível notar que atividade enzimática da peroxidase em função do pH (3. A tabela 4 mostra esta concentração de substrato em cada cubeta e o gráfico (Figura 6) mostra o comportamento da reação à medida que é aumentada a concentração de substrato. 4.1 0. .1.1.4 0. estas foram então homogeneizadas e levadas ao espectrofotômetro. 3.

0623 0.14 0.02 0.0839 0.04 0.1154 [S] 0.1013 0.1073 0. Figura 5: Equação da curva de calibração Tabela 2: Concentração de produto formado e a concentração de substrato.0623. um desvio padrão de 0. Cubetas Produto formado 1 2 3 4 5 6 7 0.0920 0.069 0.0021 e um coeficiente de variação de 3.6667 mM eq produto formado 0.3333 24.0833 6.00 0 5 10 15 [S] 20 25 30 Figura 6: Quantidade de produto formado pela concentração de substrato adicionado . Cubetas 1 (branco) 2 3 4** 5 6 7 Média da Absorbância 0.08 0. sendo que ele apresentou uma média de 0.Tabela 1: Média da absorbância em cada cubeta em função da concentração de p-pda.052 0.2333 3.1010 0.043 0.001 0.078 p-pda 2% µL 10 10 20 50 100 200 400 ** O ponto 4 foi feito em triplicata.6167 0.6167 1.0460 0.1667 12.12 0.06 0.10 0.062 0.4633.

8108 0.0 Figura 7: Gráfico de linearização de Lineweaver-Burk á [ ] á Figura 8: Equação utilizada para o cálculo de KM e VMÁX.Foi possível notar que à medida que concentração de substrato foi aumentada maior foi a quantidade de produto formado.9247 10.0 1/[S] 1.0 0.7926x + 9.0187 e 0. através da equação mostrada na Figura 8. A partir da equação da linearização mostrada na Figura 7 obtiveram-se os de KM e VMÁX.9018 9. respectivamente. foram iguais. fazendo a inversão do produto formado pela concentração de substrato o resultado está na Tabela 5 e esse comportamento é mostrado no gráfico da linearização de Lineweaver-Burk (Figura 7).6216 1.7451 11.5 2.6216 0.8724 9. A partir destes valores encontrados foi feita a determinação de KM e VMÁX.184 R² = 0.9061 1.3193 8.1622 0.0811 0. Os valores de KM e VMÁX.1089 .0405 1/mM eq produto formado 14 12 10 8 6 4 2 0 0.3243 0.5 y = 1.6641 1/[S] 1.8725 9. Tabela 3: Valores encontrados Cubetas 1/Produto formado 1 2 3 4 5 6 7 21. a 0.

.02 0. a tempo constante.0094 0. respectivamente.0 5.1 Temperatura (°C) Figura 10: Determinação de Z (absorbância em função da temperatura.84x + 91. E o comportamento da enzima em função do tempo e em função da temperatura está na Figura 9 e 10.0803 0.025 0.04 0.3.0731 0.005 0 0.) 100 80 UA/mim 60 40 20 0 0 0.3.) y = -276.0178 R² = 0.0204 0.08 0.8291 10. Tabela 4: Média da absorbância. pode-se então calcular os valores de D e Z.06 0.0 y = -0.0739 0.0 Tempo (mim) Figura 9: Determinação de D (absorbância em função do tempo.0009x + 0. Determinação de D e Z Após o submetimento das amostras ao tratamento térmico foi feita a leitura no espectrofotômetro os resultados obtidos estão na Tabela 6.1.015 0.02 UA/mim 0. Tubo 1 2 3 4 5 6 Média de absorbância 0.112 R² = 0. à temperatura constante.7688 A partir das equações da reta.0147 0.01 0.

04ºC e a 0. . E que também quanto maior a temperatura maior o inativação enzimática.No cálculo de D foi obtido o seguinte resultado: E no cálculo de D foi obtido o seguinte resultado: ( ) A partir dos resultados obtidos foi possível concluir que o tratamento térmico a 62.17 minutos houve uma redução de 90% na atividade enzimática.

ed.A.4.) Merrill) da cultivar IAC Gomo-de-mel e do clone IAC-1.S. Campinas. 2006 LEHNINGER. A. v. Efeito da alta pressão hidrostática na atividade de enzimas da polpa de açaí. Belém. 2. 2005 COHEN. A.J.O. Princípios de bioquímica. M. 28.M..: 189-222 MAGALHÃES. 166 f. 2000. 1992. 25. Açaí: preparo. Campinas.. v. composição e melhoramento da conservação.. com ou sem adição de sacarose na polpa de mamão “formosa” (Carica papaua L.M. 2008 ROGEZ. São Paulo: Sarvier. ed. SIQUEIRA. 4. Ciência e Tecnologia de Alimentos. E. SATO. SPIRONELLO.H.. Tese (Doutorado em Ciência e Tecnologia e Alimentos) – Universidade Estadual de Campinas MENEZES. Belém: UFPA. A.) acidificada e o estabelecimentodo processamento térmico requerido. ROSENTHAL. Ciência e Tecnologia de Alimentos. K.S. 4. H.M. Estudo cinético da inativação térmica de enzimas termorresistentes. A. 313p.. Sistema de produção do açaí: Processamento embalagens e concervação. p.K. ALVES. n. CALADO. Enzimas. Características da atividade da peroxidase de abacaxis (Ananas comosus (L. W. REFERÊNCIAS BRITO. 2006. A.. S. et al..... H. .L. A.. SRUR. V. SANTOS. CAMARGO. PA: EMBRAPA. L.