Abstrato

Uma lipase extracelular alcalina de um termo tolerante Bacillus coagulans BTS-3 foi imobilizada em glutaraldedo ativado Nylon-6 por ligao covalente. Sob condies ideais, a imobilizao resultou em uma carga de protena de 228 mg / g de Nylon-6. A enzima imobilizada apresentou atividade mxima a uma temperatura de 55 C e pH 7.5. A enzima ficou estvel entre pH 7,5-9,5. Reteve 88% de sua atividade original, a 55 C por 2 horas e tambm reteve 85% de sua atividade original aps oito ciclos de hidrlise de p-NPP. Parmetros cinticos Km e Vmax foram encontrados com 4 mM e 10 mmol / min / ml, respectivamente. A influncia de solventes orgnicos sobre a atividade cataltica da enzima imobilizada tambm foi avaliada. A lipase ligada mostrou atividade reforada quando exposta a nheptano. A especificidade de substrato da enzima imobilizada revelou hidrlise mais eficiente de steres com maior nmero de carbono (C-16) do que os outros.

1. Introduo Lipases (CE 3.1.1.3) ocupam um lugar de destaque entre os biocatalisadores devido s suas mltiplas aplicaes em oleo-qumica, sntese orgnica, formulao de detergentes e nutrio (Pandey et al., 1999). Nos ltimos anos, tem havido um interesse crescente no uso de enzimas para a biossntese de molculas em meios orgnicos (Gargouri et al, 2002;. Castillo et al, 2003;. Noel e Combes, 2003). Lipases tm sido com sucesso imobilizadas em uma variedade de matrizes para a realizao de reaes de esterificao e trans-esterificao em solventes orgnicos (Hiol et al., 2000). Lipases imobilizadas oferecem incentivos econmicos de estabilidade trmica e qumica melhorada, facilidade de manuseamento e fcil recuperao e reutilizao em relao as no-imobilizadas (Malcata et al, 1990;. Kanwar et al, 2004). A matriz particularmente conveniente, barata e relativamente inerte para imobilizao da enzima Nylon6. Ao contrrio mais outros nylons, Nylon-6 no um polmero de condensao, mas formado por um anel de abertura de polimerizao. Durante a polimerizao, a ligao peptdica dentro de cada molcula quebrada, fazendo com que com os grupos ativos de cada parte formem dois novos ligantes, tornando o monmero parte da espinha dorsal do polmero. Nylon 6-assemelha-se a polipeptdeos naturais, mas, na verdade, se tornaria um aminocido se fosse hidrolisado. Tambm no-txico e prontamente disponvel. Podendo ser obtido em um nmero de formulaes. A ativao de nylon envolve hidrlise cida parcial da superfcie do Nylon-6 para gerar grupos amino (e grupos carboxila), que poderia se unir s protenas com glutaraldedo (Sundaram e Hornby, 1970). Recentemente, Mucor javanicus lipase foi eficientemente imobilizada em nanopartculas de slica ativada por Glycidyl-metacrilato (Kim et al., 2006). Nylon-6 sendo em grande parte no-poroso ligado superfcie com a enzima e difcil comparar a cintica enzimtica e os rendimentos de enzima imobilizada, devido s diferentes formas de Nylon-6 utilizadas. O objetivo do trabalho foi caractersticas bioqumicas e imobilizao da lipase de Bacillus coagulans BTS-3 imobilizada em Nylon-6. estudar as

2. Mtodos 2.1. Microorganismo e lpase As bactrias termoflicas e alkaliflicas produtoras de lipase foram originalmente isoladas a partir do lixo de cozinha de uma loja de doces, atravs do mtodo de enriquecimento direto utilizando soluo normal salina (0,89%, v / v) sob condies de agitao. A enzima foi purificada 40 vezes homogeneidade por precipitao com sulfato de amnio e DEAE-Sepharose numa coluna de cromatografia. Seu peso molecular foi de 31 kDa em SDS-PAGE (Kumar et al., 2005).

2.2. Imobilizao de lipase em Nylon-6

A lipase purificada de B. coagulans foi imobilizada em Nylon-6. Um aumento da quantidade de protena (2,28-22,8 g) foi adicionado a uma quantia fixa de matriz (50 mg). As partculas de Nylon-6 foram parcialmente hidrolisadas com cido clordrico 6N durante 30 min, lavados com gua destilada e unidos com uma soluo de glutaraldedo a 2,5% preparado em tampo de fosfato de potssio pH 7,0 por 1 h. Finalmente, o Nylon-6 tratado com gluteraldedo foi lavado com excesso de tampo e unido com uma enzima purificada a 4 C por 12 h.

2.3. Ensaio enzimtico

O ensaio da lipase foi realizada por um mtodo colorimtrico (Winkler e Stuckmann, 1979). A soluo

estoque de p-NPP (20 mM) foi preparada do iso-propanol. A mistura de reao composta de 75 mL de p-NPP soluo padro, 5 l de leo / enzima purificada ou 50 mg de enzima imobilizada. O volume final desta mistura de reao foi feita a 3 ml com 0,05 M tris, pH 8,5 para lpase livre e 7,5 para lipase presa com Triton X-100 (0,4%, v / v) e goma de accia (0,1%, w / v ). Os tubos de ensaio foram incubados por 10 min a 55 C, sob agitao contnua (120 rpm) em banhomaria. O controle adequado com uma enzima inativada pelo calor (5min em banho-maria), foi includa a cada ensaio. A absorbncia de p-nitrofenol liberado foi lido em A410nm (Shimadzu UV / visvel em spectrofotmetro, Japo). Cada um dos ensaios foi realizado em duplicata e valores mdios foram apresentados. A atividade enzimtica foi definida como mmol (s) de p-nitrofenol liberado por minuto por 1 ml de enzima livre ou por grama de enzima imobilizada (peso da matriz includo) em condies de ensaio padro. A protena foi analisada por um mtodo padro (Lowry et al., 1951).

2.4. Efeito da concentrao de protena na imobilizao

Quantidades crescentes de protena (2,28-22,8 mg) foram incubadas com valor fixo de Nylon-6 na matrix (50 mg). A atividade enzimtica e a concentrao de protenas (no ligada) no sobrenadante de matriz foi analisada pelos mtodos convencionais, a relao entre a concentrao de protena ligada a matriz e sua atividade correspondente foi calculada.

2.5. Cintica de imobilizao

Foi realizado um estudo para descobrir a taxa de imobilizaozao da lipase em Nylon-6. A atividade de e protena lipase (no ligada) livre foi marcada no super-sobrenadante (que j havia sido retirado periodicamente) pelos mtodos convencionais.

2.6. Caracterizao bioqumica de Nylon-6 imobilizada lpase

2.6.1. Efeito da temperatura e pH sobre a atividade A enzima imobilizada (50 mg matriz) foi imersa em tampo fosfato de potssio, pH 8,5 e ensaiadas para atividade residual da lipase em diferentes temperaturas 35, 45, 55, 65 e 75 C e pH para a mesma quantidade de enzima. Foi testada em tris tampo (0,1 M) em diferentes valores de pH (6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0 e 9.5).

2.6.2. Perfil de estabilidade da enzima imobilizada

A termoestabilidade da enzima imobilizada foi estudada incubando o biocatalisador em 55, 60, 65 e 70 C por 2 h em shaker de banho-maria (120 rpm). Da mesma forma que se determina a estabilidade em diferentes pH, a enzima imobilizada foi pr-incubada separadamente em 0,1 M tampo tris em pH 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0 e 9,5 por 2 horas a 55 C e a atividade residual da lipase foi determinada sob condies de ensaio padro.

2.6.3. Reutilizao da enzima imobilizada para a atividade hidroltica para 4-NPP

A enzima imobilizada foi lavada trs vezes com tampo tris 0,1 M (pH 8,5) e atividade enzimtica foi analisada a 55 C a cada 10 min repetidamente, at que a atividade hidroltica para p-NPP foi de 25% da atividade original. 2.6.4. Determinao de Km e Vmax O ensaio de enzima ligada foi realizado com diferentes concentraes de p-NPP (5, 10, 15, 20 e 25 mM). A curva de Lineweaver-Burke foi usada para calcular Km e Vmax da enzima.

2.6.5. Efeito de solventes orgnicos na atividade da lipase imobilizada

O efeito de vrios lcoois (etanol, metanol, iso-propanol, iso-butanol, acetona e clorofrmio), bem como alcanos (n-pentano, n-hexano e n-heptano) foi estudado sobre a atividade da lipase imobilizada. A lipase ligada (50 mg) foi incubada separadamente com cada um dos solventes selecionadas a 55 C por 30 min.Posteriormente, o solvente foi removido por decantao e o biocatalisador imobilizado foi testado para a atividade residual da lipase.

2.6.6. Especificidade de substrato da lipase imobilizada

Cada um dos selecionados substratos, 4-nitrofenil palmitato, 4-nitrofenil laurato, 4-nitrofenil caprilato e 4-nitrofenil formiato (20 mM), elaborados em iso-propanol foi usado para ensaio da atividade hidroltica da lipase ligada a 55 C aps 10 min de incubao.

3. Resultados e discusso

3.1. Imobilizao e cintica de imobilizao da lipase em Nylon-6

A lipase de B. coagulans BTS-3 (total de protena 11,4 g), quando incubadas com o suporte (50 mg), mostrou eficincia com carter vinculativo mximo (70%) para a protena (lipase) com 1,2 U / g de atividade da enzima (Fig. 1) . Anteriormente, uma carga de protena de aproximadamente 15 mg / g foi relatada de lipase imobilizada em Nylon-6 (Zaidi et al., 2002). Recentemente, descobriu-se que 77% de protena em sobrenadante de Candida rugosa foi imobilizada em caulim (Rahman et al., 2005). A cintica de imobilizao revelou que a lipase imobilizada foi otimizada em Nylon-6 em 1 h de incubaco (Fig. 2) e apenas pouca lipase livre (no ligada) pode ser detectada no sobrenadante. As molculas de lipase podem ser imobilizadas na superfcie exposta e dentro da camada superior do apoio por parte da quimissoro (adsoro), bem como ativao qumica (glutaraldedo) de Nylon-6 enquanto as molculas de protena de lipase substituem as de gua Anteriormente quando a lipase a partir de um Bacillus GK8 foi imobilizada em slica, levou apenas 30 min para se ligar ao mximo (Dosanjh e Kaur, 2002). Em outro estudo, a lipase de B. coagulans BTS-1 mostrou imobilizao mxima em slica aps 20 min de incubao (Kanwar et al., 2004).

3.2. Caractersticas da enzima imobilizada

Um aumento de quatro vezes na atividade da lipase imobilizada foi observado, quando a temperatura foi elevada de 45 para 55 C. Temperatura ideal da enzima ligada (55 C) tambm foi a temperatura tima da enzima livre (Kumar et al., 2005). Um aumento na temperatura resultou em uma acentuada diminuio na atividade da lipase ligada. Em outro estudo, a temperatura tima para a lipase imobilizada por uma cepa mutante de Corynebacterium (Roy et al., 2004) e lipase imobilizada em slica do B. coagulans MTCC-6375 (Kanwar et al., 2005) foi encontrada como 50 C. A imobilizao da lipase de C. rugosa em quitosana mostrou temperatura de reao ideal de 30 C (Hung et al., 2003), enquanto a imobilizao da lipase de mesmo organismo em caulim mostraram maior atividade a 40 C (Rah-man et al., 2005 ). A enzima ligada mostrou 88% de atividade residual, quando incubada a 55 C por 2h, enquanto a atividade residual diminuiu em altas temperaturas, que pode ser devido perturbao da estrutura globular da protena pelo calor. Antes, a preparao enzimtica livre mostrou 50% de atividade residual a 55 C (Kumar et al., 2005). Em nosso estudo recente, a enzima quando imobilizada em polietileno ativado, mostrou 60% de atividade residual a 70 C (Kumar et al., 2006). Assim, as enzimas imobilizadas foram muito mais estveis que as enzimas solveis em maior temperaturas. A lipase de Bacillus thermocatenulatus, quando immobilizada em suportes hidrofbicos, manteve 100% da atividade a 65 C (Palamo et al., 2004). A lipase de Bacillus GK8 quando imobilizada em HP-20 manteve atividade completa a 60 C (Dosanjh e Kaur, 2002).

A enzima imobilizada foi bastante estvel dentro de uma faixa de pH de 7,5-9,5, com pH timo 7,5. A enzima livre manteve-se estvel dentro de uma faixa de pH de 8,0-10,5 com pH timo 8.5 (Kumar et al., 2005). Bacillus sp. lipase foi estvel na faixa de pH de 7,0-10,0 com pH timo 8.0 (Dosanjh e Kaur, 2002). A lipase de uma cepa mutante da bactria Coryne sp. foi imobilizada e o pH para o ensaio de lipase imobilizada foi encontrado para ser o mesmo (8.0) como a de uma enzima solvel (Roy et al., 2004). Em contraste, a lipase imobilizada de C. rugosa ficou estvel na faixa de pH de 5,0-8,0 com timo pH 9.0 (Hung et al., 2003).

3.3. Reutilizao da enzima imobilizada para a atividade hidroltica para 4-NPP

A enzima imobilizada manteve 85% de sua atividade hidroltica original aps ciclo de 8 (Tabela 1). Em um estudo anterior, a lipase imobilizada do Bacillus em CNBR-activated-Sepharose 4B manteve mesmo aps 13 ciclos. Recentemente, a lipase de C. rugosa foi imobilizada no polmero de lcool polivinlico (PVA), alginato e cido brico e mostrou reteno quase completa de atividade no reutilizar at 10 ciclos (Dave e Madamwar, 2006).

3.4. Km e Vmax da lipase imobilizada. A Km para imobilizada lipase foi 4mm e Vmax 10 mmol / min / ml. O Vmax de lipase imobilizada foi encontrado como maior que a lipase livre (0,72 mmol / min / ml). O Km comparvel para valores em Nylon-6 de lipase imobilizada e lipase livre (3,8 mM) indicou afinidade quase o mesmo em direo ao substrato. Para uma lipase de Pseudomonas cepacia, Km e Vmax tiveram valores de 12 mm e 30 mmol / min, respectivamente e foram relatados com p-NPP (Pancreac'h e Baratti, 1996). Km e Vmax tiveram valores de 18,0 e 96,1 mM de protena U / mg, respectivamente para lipase imobilizada em quitosana de C. rugosa (Hung et al., 2003).

3.5. Efeito de diferentes solventes orgnicos na atividade cataltica

A atividade da lipase imobilizada foi maior em presena de n-heptano e diminuiu em acetona, em comparao ao controle (Tabela 2). Os suportes podem prender e impedir a interrupo da ligao entre gua e enzima, essencial para manter a estrutura tridimensional da enzima para a catlise. Como solventes polares tendem a tirar gua da molcula de enzima, portanto, a enzima pode ser mais estvel em solventes orgnicos do que na gua, e essa foi a razo pela qual eles foram usados como meios de reao nas atividades enzimticas. Em nosso estudo anterior, a mesma enzima quando imobilizada em glutaraldedo ativado e polietileno mostrou aumento da atividade na presena de n-hexano (Kumar et al., 2006)

3.6. Especificidade de substrato

Quanto maior o comprimento de C (C, 16) ster (4-NPP) melhor a eficincia de hidrolisado pela enzima ligada a outros steres(60-70%). 4-NPP tambm foi mais eficiente hidrolisada pela enzima livre (Kumar et al., 2005). Isso indica uma especificidade preferencial da lpase de B. coagulans para substratos com maior comprimento de cadeia, conforme relatado anteriormente para uma lipase termo-alkaliflica de Bacillus sp. (Sunna et al., 2002). Em outro estudo, a lipase de psicrotrficos pseudo-domonas sp. apresentaram atividade mais elevada para C: 10 grupos de acila de 4-nitrofenil steres (Rashid et al, 2001)..Alm disso, a lipase imobilizada de B. coagulans BTS-1 foi mais hidroltica para um ster de comprimento mdio, de menor ou de maior comprimento (Kanwar et al., 2004).

4. Concluso No presente estudo, a lipase de B. coagulans BTS-3 imobilizada em glutaraldedo ativado Nylon-6 teve atividade tima em pH 7,5 e temperatura de 55 C.Tambm mostrou a hidrlise mais eficiente de substrato p-NPP durante a catlise repetitiva em fase aquosa. Alm disto, mostrou aumento da atividade quando exposta ao n-heptano e iso-propanol.