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Universidad Andrés Bello Facultad de Ciencias Biológicas Departamento de Ciencias Biológicas

Universidad Andrés Bello Facultad de Ciencias Biológicas Departamento de Ciencias Biológicas GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS MICROBIOLOGIA

GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS MICROBIOLOGIA GENERAL

BIO055

Carrera:

Nutrición y Dietética

SEGUNDO SEMESTRE 2011

ÍNDICE

CONTENIDO

PÁGINAS

INTRODUCCIÓN AL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA

9 – 17

Nº1 TÉCNICAS BÁSICAS DE MICROBIOLOGÍA Y MORFOLOGÍA BACTERIANA

18

31

Nº2 MORFOLOGÍA BACTERIANA: EXAMEN MACROSCÓPICO Y MICROSCÓPICO. TINCIONES.

34

44

Nº3 FLORA NORMAL Y FISIOTAXONOMÍA DE BACTERIAS GRAM POSITIVO. ANTIMICROBIANOS

47

66

Nº4 FISIOTAXONOMÍA DE BACTERIAS GRAM NEGATIVO. ANTIMICROBIANOS

69

88

Nº5 AISLAMIENTO BACTERIANO DESDE ALIMENTOS.

89

95

Nº6 HONGOS UNICELULARES Y FILAMENTOSOS

98 105

Objetivos del Práctico de Microbiología

Al término del curso práctico, el alumno deberá ser capaz de:

  • 1. Identificar el material habitual utilizado en la práctica de la microbiología.

  • 2. Manipular correctamente el material de laboratorio y los cultivos de microorganismos.

  • 3. Aislar y propagar microorganismos tanto de muestras heterogéneas (por ejemplo alimentos) como a partir de cultivos puros.

  • 4. Identificar correctamente formas y agrupaciones bacterianas mediante observación microscópica.

  • 5. Emplear distintas formas de tinción para identificar microorganismos o estructuras importantes de estos.

  • 6. Utilizar la información derivada de la actividad metabólica de microorganismos sobre distintos sustratos, con fines taxonómicos (identificación).

  • 7. Realizar estudios de sensibilidad a agentes antimicrobianos para diferenciar bacterias según su grado de sensibilidad a ciertos antibióticos.

  • 8. Aislar y propagar levaduras y hongos filamentosos tanto de muestras heterogéneas como a partir de cultivos puros.

  • 9. Reconocer y diferenciar la morfología macroscópica y microscópica de levaduras y hongos filamentosos.

Programa de trabajos prácticos

1.Procedimientos básicos de microbiología

Identificación del material de uso microbiológico. Clasificación y utilidad de medios de cultivo. Técnicas de siembra en medios de cultivo sólidos y líquidos. Obtención de colonias aisladas, análisis macroscópico de éstas.

2.Morfología bacteriana: Examen macroscópico y microscópico. Tinciones.

Crecimiento y cultivo en distintos medios de cultivo. Descripción macroscópica de colonias. Tinciones y análisis microscópico de las bacterias en estudio: Morfología y agrupación; tinción de Gram, tinción de cápsula, tinción de esporas. Análisis de muestras al fresco.

3.

Fisiotaxonomía de bacterias Gram positivo:

Pruebas bioquímicas para cocáceas Gram positivos. Estudio de sensibilidad a antibióticos. Estudio de las alteraciones producidas por la acción bacteriana en medios de cultivo: Hemólisis. Análisis microscópico de bacterias Gram positivo.

4.

Fisiotaxonomía de bacterias Gram negativo:

Pruebas bioquímicas para Gram negativo: Batería bioquímica y API. Estudio de sensibilidad a antibióticos. Estudio de las alteraciones producidas por la acción bacteriana en medios de cultivo: Utilización de lactosa. Análisis microscópico de bacterias Gram negativo.

5.

Aislamiento bacteriano desde alimentos:

Metodologías de enriquecimiento y aislamiento de microorganismos presentes en alimentos ya sea como contaminantes o constituyentes de los mismos. Aislamiento de enterobacterias, Staphylococcus sp., Pseudomonas sp., Vibrio sp. y Lactobacillus sp. Uso de medios de cultivo selectivos y diferenciales.

6.

Hongos: Levaduras y Mohos

Descripción macroscópica y microscópica de levaduras y hongos. Análisis de estructuras reproductivas. Cultivo de hongos provenientes de muestras de alimentos ya sea como contaminantes o constituyentes de los mismos.

Profesores y secciones:

Horario : Miércoles, módulos 1 y 2 (8:30 - 10:10 hrs.) Jueves, módulos 1 y 2 (8:30 - 10:10 hrs.)

Sesiones cada 15 días

Secciones 1 y 2: Profesores Leslie Daille y Milka Darlic

Secciones 3 y 4: Profesores Francisca Álvarez y Jorge Irarrázaval

Secciones 5 y 6: Profesores Anilei Hoare y Alejandro González

Sección 7: Profesores Nicolás Villagra y Matías Jofré

Salas de Laboratorio:

  • - Laboratorio de Microbiología I (LAB 206): Secciones 1 y 2

  • - Laboratorio de Microbiología II (LAB 207): Secciones 3 y 4

  • - Laboratorio de Biología IV (BIO 204) Secciones 5 y 6

  • - Laboratorio de Biología V (BIO 117): Sección 7

Evaluación:

El curso se aprueba con nota final igual o superior a 3.95, según planilla de cálculo del sistema en Intranet. No existirá ningún tipo de interrogación y/o trabajo para subir nota.

 

La

nota

de

presentación se calculará de acuerdo a los siguientes

parámetros:

 

1)

Pruebas de entrada

60 %

2)

Informes

 

40 %

El promedio de las actividades señaladas con la ponderación establecida corresponde a la nota de presentación.

Promedio Final:

1) Nota de presentación

70%

2) Examen Teórico-Práctico 30 %

La nota final se expresa con un solo decimal. En este caso, cuando la centésima sea igual o mayor a 0,05 se aproximará a la décima superior. Por su parte, si la centésima es igual o menor a 0,04 se mantiene el decimal. Esto de acuerdo al siguiente ejemplo:

Nota final

:

3,95

se aproxima a 4,0 (aprobado)

 

3,94

se mantiene en 3,9 (reprobado)

Pruebas Recuperativas

Sólo tendrán derecho a Prueba Recuperativa aquellas inasistencias debidamente justificadas en la Escuela.

Ante la inasistencia a una sesión de laboratorio, se realizará un control recuperativo sólo cuando esté debidamente justificado y hayan entregado una fotocopia de la aceptación del certificado médico al profesor que corresponda.

Independiente del trabajo práctico al cual el alumno haya faltado, se realizará un control al final del semestre y contemplará TODOS los contenidos de los trabajos realizados.

Los alumnos que obtengan nota 1,0 como consecuencia de llegar atrasados al trabajo práctico NO TIENEN DERECHO a recuperar esa nota.

No

se

contemplan

actividades

recuperativas

para

los informes de

laboratorio.

 

Condiciones de eximición

Se eximirán del examen final SÓLO aquellos alumnos que alcancen una nota 5,5 ó superior. (Condiciones establecidas que se rigen según el Reglamento del Alumno de Pregrado, Artículo 40).

Cronograma de actividades

AGOSTO

Miércoles 24:

Organización del curso SECCIONES IMPARES

Jueves 25:

Organización del curso SECCIONES PARES

Miércoles 31:

Práctico 1: Procedimientos Básicos I SECCIONES IMPARES

SEPTIEMBRE

Jueves 1:

Práctico 1: Procedimientos Básicos II SECCIONES IMPARES

Miércoles 7:

Práctico 1: Procedimientos Básicos I SECCIONES PARES

Jueves 8:

Práctico 1: Procedimientos Básicos II SECCIONES PARES

Miércoles 14:

Práctico 2: Morfología Bacteriana I SECCIONES IMPARES

Jueves 15:

Práctico 2: Morfología Bacteriana II SECCIONES IMPARES

Miércoles 21:

Práctico 2: Morfología Bacteriana I SECCIONES PARES

Jueves 22:

Práctico 2: Morfología Bacteriana II SECCIONES PARES

Miércoles 28:

Práctico 3: Gram positivos y Flora Normal I SECCIONES IMPARES

Jueves 29:

Práctico 3: Gram positivos y Flora Normal II SECCIONES IMPARES

OCTUBRE

Miércoles 5:

Práctico 3: Gram positivos y Flora Normal I SECCIONES PARES

Jueves 6:

Práctico 3: Gram positivos y Flora Normal II SECCIONES PARES

Miércoles 12:

Práctico 4: Fisiotaxonomía de Gram negativos I SECCIONES IMPARES

Jueves 13:

Práctico 4: Fisiotaxonomía de Gram negativos II SECCIONES IMPARES

Miércoles 19:

Práctico 4: Fisiotaxonomía de Gram negativos I SECCIONES PARES

Jueves 20:

Práctico 4: Fisiotaxonomía de Gram negativos II SECCIONES PARES

Miércoles 26:

Práctico 5: Aislamiento bacteriano desde alimentos I SECCIONES IMPARES

Jueves 27:

Práctico 5: Aislamiento bacteriano desde alimentos I SECCIONES PARES

NOVIEMBRE

Miércoles 2:

Práctico 5: Aislamiento bacteriano desde alimentos II SECCIONES IMPARES

Jueves 3:

Práctico 5: Aislamiento bacteriano desde alimentos II SECCIONES PARES

Miércoles 9:

Práctico 6: Levaduras y Hongos filamentosos I SECCIONES IMPARES

Jueves 10:

Práctico 6: Levaduras y Hongos filamentosos II SECCIONES IMPARES

Miércoles 16:

Práctico 6: Levaduras y Hongos filamentosos I SECCIONES PARES

Jueves 17:

Práctico 6: Levaduras y Hongos filamentosos II SECCIONES PARES

Miércoles 23:

Sin actividades

Jueves 24:

Sin actividades

Miércoles 30:

Controles Recuperativos y revisión de notas para todas las secciones

DICIEMBRE

Normas Generales del trabajo en el Laboratorio

1.El alumno llevará obligatoriamente un delantal blanco, fundamentalmente para proteger su ropa de material infeccioso y reactivos corrosivos o de tinción.

El NO uso del delantal significará que el alumno NO podrá ingresar al trabajo práctico.

2.Está absolutamente prohibido ingresar o consumir cualquier tipo de alimentos, beber o fumar en el laboratorio.

3.Para evitar contaminación y el peligro de quemaduras es indispensable la utilización del cabello recogido durante el desarrollo del trabajo práctico.

4.Para evitar contaminación y el peligro de quemaduras no se debe portar elementos como gorros, bufandas o pañuelos ni ningún tipo de ropa que incomode durante el desarrollo del trabajo práctico.

5.En caso de ruptura de material contaminado con bacterias u hongos, debe comunicarse inmediatamente con el profesor encargado para proceder a la desinfección de la zona.

6.No se podrá ingresar al Laboratorio de Práctico con mochilas, bolsos o ropa de abrigo por lo que deben ser guardados en las gavetas dispuestas para ello. Deben traer su propio candado.

7.Cada grupo de trabajo será responsable por los microscopios disponibles y del material entregado. El material debe ser devuelto íntegramente y los microscopios deben quedar limpios y ordenados.

Introducción al Laboratorio de Microbiología

1. Introducción

  • 1.1 BIOSEGURIDAD

Un laboratorio de microbiología debe contar con la infraestructura necesaria para manipular un microorganismo (mo) de acuerdo a su riesgo biológico cumpliendo con los procedimientos del nivel de bioseguridad correspondiente (niveles del 1 al 4).

Nuestro trabajo docente involucra microorganismos no patógenos, siendo nuestro nivel de Bioseguridad de tipo 2. Es decir, se requiere de un espacio diseñado especialmente para la manipulación del microorganismo (mo) y otros espacios para la preparación del material estéril y la eliminación o esterilización del material contaminado. Además se deben seguir normas que permitan una manipulación libre de contaminación para el mo, el experimentador y para el medio ambiente.

  • 1.2 MATERIALES PRESENTES EN UN LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA

Es esencial que posea: estereomicroscopios (lupas), microscopios, refrigeradores, cámaras de cultivo, balanzas, centrífugas y destiladores de agua. En muchas ocasiones las cámaras de cultivo y refrigeradores se ubican en una sala especial, o bien algunos de estos equipos son de uso común para varios laboratorios.

MICROSCOPIO OPTICO COMPUESTO:

Sistema óptico OCULAR: Lente situada cerca del ojo del observador. Amplía la imagen del objetivo. OBJETIVO: Lente situada cerca de la preparación. Amplía la imagen de ésta. CONDENSADOR: Lente que concentra los rayos luminosos sobre la preparación. DIAFRAGMA: Regula la cantidad de luz que entra en el condensador.

o

o

o

o

o FOCO: Dirige los rayos luminosos hacia el condensador. Sistema mecánico SOPORTE: Mantiene la parte óptica. Tiene dos partes: el pie o base y el brazo. PLATINA: Lugar donde se deposita la preparación. CABEZAL: Contiene los sistemas de lentes oculares. Puede ser monocular o binocular. REVÓLVER: Contiene los sistemas de lentes objetivos. Permite, al girar, cambiar los objetivos. o TORNILLOS DE ENFOQUE: Macrométrico que aproxima el enfoque y micrométrico que consigue el enfoque correcto.

o

o

o

o

o FOCO: Dirige los rayos luminosos hacia el condensador.  Sistema mecánico SOPORTE: Mantiene la parte

1.3 Otros materiales utilizados son:

a) De vidrio: placas de Petri, matraces Erlenmeyer, tubos de ensayo, pipetas Pasteur, embudos, matraces aforados, pipetas graduadas, buretas, probetas, cristalizadores, portaobjetos, cubreobjetos, desecadores, frascos (diferentes capacidades, transparentes o color ámbar), vasos de precipitado, frascos cuenta gotas, etc.

b) Otros: algodón, papel filtro, papel indicador de pH, papel de envolver, pinzas, bisturíes, asas con hilos de platino, colorantes, reactivos diversos, etc.

Para realizar siembras y/o repiques, se utilizan asas con hilos de platino o de tungsteno. La utilización de estos metales se debe a que son resistentes a la oxidación y porque una vez esterilizados a la llama, se enfrían rápidamente sin riesgo de provocar la muerte de los microorganismos con que se está trabajando. Además, estos

hilos son muy maleables pudiendo ser transformados en un asa o en espátula, permitiendo repicar o resembrar desde un medio líquido o sólido.

hilos son muy maleables pudiendo ser transformados en un asa o en espátula, permitiendo repicar o
hilos son muy maleables pudiendo ser transformados en un asa o en espátula, permitiendo repicar o
hilos son muy maleables pudiendo ser transformados en un asa o en espátula, permitiendo repicar o

Asa níquelcromo

Placa de Petri.

hilos son muy maleables pudiendo ser transformados en un asa o en espátula, permitiendo repicar o

Placa petri con medio sólido.

hilos son muy maleables pudiendo ser transformados en un asa o en espátula, permitiendo repicar o

Matraz Erlenmeyer.

hilos son muy maleables pudiendo ser transformados en un asa o en espátula, permitiendo repicar o

Pipeta Pasteur

hilos son muy maleables pudiendo ser transformados en un asa o en espátula, permitiendo repicar o

INCUBADORA : (Rango temperatura 5100°C)

AUTOCLAVE

AUTOCLAVE 12

En términos de Física experimental se define el punto de ebullición de un líquido como la temperatura a la cual se iguala el valor de la presión de vapor del fluido con el que corresponde a la presión atmosférica. El autoclave está formado por una vasija cilíndrica de hierro forjado, de paredes gruesas y con una tapadera resistente que se cierra herméticamente mediante la acción o giro de un potente tornillo conectado a una abrazadera. En un comienzo antes de que se alcance la temperatura de 100°C, se elimina la presión del vapor de agua (Flowing steam), de modo que suba la temperatura junto con la presión, sin alcanzar el punto de ebullición del agua. Este procedimiento aplicado sobre material resistente a la temperatura elimina mo, virus y esporas, es decir, queda totalmente estéril.

1.4 PRECAUCIONES EN EL LABORATORIO Y DURANTE EL TRABAJO PRÁCTICO

Para evitar posibles contaminaciones, es esencial la limpieza y el orden dentro del laboratorio.

Antes de comenzar a trabajar se debe limpiar el mesón con un algodón embebido en alcohol etílico 7096°, o con una solución de hipoclorito de sodio (15%).

Se recomienda trabajar en forma cómoda en un mesón de material sintético duro y no inflamable. Este mesón debe estar ubicado en un sitio con menor corriente de aire (las ventanas deben estar cerradas), alejado de las zonas de circulación de otras personas y debe contar con un mechero.

Los tubos de ensayo o matraces que contengan medios de cultivos o cultivos de mo, nunca deben abrirse en posición vertical, sino lo más horizontalmente posible (inclinados) y para quitar el tapón de algodón se mantendrán inclinados con una mano y se abrirán con la otra, la que sostendrá a su vez el asa (con el dedo meñique, se retira el tapón de algodón que obtura el tubo). Una vez abierto de la forma señalada, se flamea por algunos segundos el orificio, repitiendo dicha operación una vez realizada la siembra (el tapón nunca debe dejarse sobre el mesón).

Antes de utilizar las asas con hilos de platino, que sirven para las siembras y/o repiques, éstas deben flamearse al rojo en posición vertical bajo la acción de la llama. Antes de efectuar la siembra y/o repique debe esperarse algunos segundos a que se enfríen, pudiendo enfriarse también en el borde de la placa de Petri que contiene el medio de cultivo. Inmediatamente después de haberlas utilizado, deben flamearse nuevamente, evitando diseminar el microorganismo en el medio ambiente.

Partes de la llama

1.Cono frío: no llega oxígeno

2.Cono de reducción: poco oxígeno

3.Cono de oxidación: abundancia de oxígeno

4.Zona de fusión: alcanza los 1500 ºC (Zona

que esteriliza por calor)

El asa se flamea en la zona 4, hasta lograr la

 Antes de utilizar las asas con hilos de platino, que sirven para las siembras y/o
 Antes de utilizar las asas con hilos de platino, que sirven para las siembras y/o
 

Incandescencia.

Las placas de Petri deben abrirse manteniéndolas en lo posible en posición vertical.

El material de vidrio destinado a esterilización debe prepararse previamente (placas de Petri envueltas en papel, etc.), estar bien lavado y seco. El lavado se realiza con detergentes y/o soluciones especiales, luego debe enjuagarse con H 2 O corriente y posteriormente con H 2 O destilada.

Las observaciones microscópicas, tinciones y las diferentes pruebas bioquímicas deben realizarse en el momento oportuno.

1.5 NORMAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO

  • a) Dejar la ropa innecesaria en los casilleros fuera del laboratorio y usar un delantal (blanco).

  • b) Nunca deben llevarse a la boca lápices, etiquetas o cualquier otro material.

  • c) Los mesones del laboratorio deben limpiarse antes y al final de cada laboratorio con un desinfectante apropiado.

  • d) Las asas con los hilos de platino deben esterilizarse a la llama del mechero en toda su extensión antes y después de su uso. El salpicado se evita sosteniendo el hilo alrededor de la llama antes de flamearlo.

  • e) No se distraiga conversando mientras trabaja, así evitará quemarse con el mechero o sufrir otros accidentes.

  • f) Si se derrama un cultivo en el mesón o piso, cubrir el área con un desinfectante y notificar al Instructor.

  • g) Nunca deben sustraerse cultivos de microorganismos del laboratorio.

  • h) Los medios inoculados deben colocarse en las cámaras de cultivo con su identificación respectiva, ej.: nombre, naturaleza del espécimen, sustrato del cual se aísla, fecha, identificación del manipulador.

  • i) Cuando no se utilizan los mecheros, éstos deben guardarse y se debe estar seguro que se les ha apagado al final de cada laboratorio.

  • j) Oculares, objetivos, como también otras partes del microscopio, deberán limpiarse antes y después de su uso. Los lentes deben limpiarse con papel especial para lentes o un paño de batista.

  • k) Todos los reactivos y equipos deben dejarse en su lugar de origen al término de cada laboratorio.

  • l) Todos los tubos, placas de Petri, pipetas, portaobjetos, etc., deben dejarse en los recipientes adecuados una vez terminado el laboratorio.

  • m) Todos los materiales de desecho como trozos de papel, algodón, etc., deben colocarse en los basureros adecuados y no en los mesones o suelo.

  • n) Accidentes personales, tales como derrame de reactivos, cortes y quemaduras, deben comunicarse inmediatamente al Instructor.

  • o) Todos los estudiantes deberán lavarse las manos con jabón o con un desinfectante si es necesario, antes de dejar el laboratorio.

EVITE ACCIDENTES TRABAJANDO ORDENADAMENTE Y CON PRECAUCION. Si en forma accidental entra en contacto con este material, avise inmediatamente a su Instructor indicándole el origen de la contaminación.

MEDIOS DE CULTIVO.

Estado de los medios de cultivo:

Los microorganismos pueden crecer en un medio sólido, líquido o semisólido. La mayoría de los medios de sólidos llevan un agente solidificante llamado Agar en una concentración de 1,5% y semisólido 0,7%. El agar es un polisacárido ácido producido por ciertas algas rojas y cuyas propiedades principalmente son; solidificar por debajo de los 45ºC, ser inocuo para la mayoría de los microorganismos y no ser utilizado como fuente de carbono, nitrógeno o energía.

Composición de los medios de cultivo:

  • a) Medios sintéticos o químicamente de finidos: llevan fuente de carbono, fuente de nitrógeno, sales que suplan iones (P, K, Mg, Fe, Ca…), otros elementos como son estimuladores del crecimiento a concentraciones conocidas.

  • b) Medios complejos o de composición indefinida: estos medios llevan ingredientes como extracto de levadura, peptona, infusión de cerebro, extracto de carne, etc. Contienen nutrientes en abundancia pero sin saber con exactitud la composición cualitativa ni cuantitativa de estos nutrientes.

  • c) Medios selectivos: son aquellos que favorecen por su diseño el crecimiento específico de un microorganismo en particular. Es de gran utilidad para el aislamiento de microorganismos a partir de una población mixta.

  • d) Medios diferenciales: son aquellos destinados a facilitar la discriminación de microorganismos de una mezcla por sus propiedades diferenciales de crecimiento en dichos medios. Ejemplo agar MacConkey diferencia bacterias lactosa positivo de lactosa negativo.

  • e) Medios de mantenimiento: suelen ser distintos a los de crecimiento óptimo ya que el crecimiento rápido y prolífico suele ocasionar la muerte rápida de las células.

  • f) Medios de criópreservación: deben proteger a las células del efecto lítico del agua en el proceso de descongelamiento rápido, ya que los cristales de agua actúan como cuchillas que cortan a la célula. El medio más utilizado es el glicerol al 100% estéril diluido en razón 1:1.

TRABAJO PRÁCTICO Nº1 TÉCNICAS BÁSICAS DE MICROBIOLOGÍA

OBJETIVOS GENERALES

  • 1. Identificar material básico empleado durante la práctica bacteriológica.

  • 2. Adquirir la destreza para manipular materiales y cultivos bacterianos.

  • 3. Adquirir la destreza y el cuidado para trabajar en esterilidad.

  • 4. Conocer los diferentes medios de cultivo.

  • 5. Conocer la utilidad de los medios de cultivo más usados.

  • 6. Conocer el concepto de siembra y aislamiento de bacterias.

  • 7. Practicar diferentes tipos de siembra.

  • 8. Practicar aislamiento bacteriano.

  • 9. Conocer distintos tipos de tinciones y la utilidad de éstas.

El objetivo principal del práctico es la adquisición de conocimientos básicos en lo que respecta a la manipulación de cultivos bacterianos. Esto incluye manejo del concepto de esterilidad, siembra en medios líquidos, en medios sólidos (diferenciales, selectivos, etc.) y siembra en condiciones anaeróbicas. El cumplimiento de las tareas en microbiología de alimentos exige la realización de tres actividades: la primera de ellas, aislamiento e identificación de microorganismos, se inicia con el cultivo, de las muestras procedentes de alimentos, en medios específicos y en condiciones definidas, y va seguido de examen microscópico y pruebas bioquímicas al microorganismo aislado; la segunda actividad, involucra el conocimiento de la resistencia o sensibilidad a antibióticos, biotipificación y serotipificación; y por último, la tercera actividad involucra la identificación epidemiológica o comparación de los aislamientos de la misma especie con el fin de hacer el control de la infección o análisis de población. Para poder realizar la primera de estas actividades, es imprescindible contar con un cultivo puro que debe ser mantenido en condiciones de laboratorio, para esto es necesario e indispensable emplear material completamente estéril (Tabla Nº 1). Para poder mantener las bacterias en condiciones de laboratorio se utiliza otro procedimiento importante en el área de la microbiología que es la siembra o cultivo.

Esta consiste en colocar a los microorganismos en un ambiente adecuado para que se desarrollen y multipliquen. En el laboratorio este medio ambiente lo constituyen los medios de cultivo corrientes o básicos y especiales, operación que debe realizarse en forma aséptica. Generalmente las muestras contienen una flora mixta, que se manifiesta por el desarrollo de distintas especies bacterianas: algunas son saprófitas (flora normal) o contaminantes del proceso de muestreo y otras son las que tienen un rol patógeno. Obtener una cepa bacteriana aislada significa, por lo tanto, obtener un cultivo en estado de pureza, condición indispensable para poder estudiar sus características morfológicas y bioquímicas y lograr así su identificación correcta. Si en la placa de agar ha crecido más de un tipo de bacterias, se debe realizar el aislamiento de UNA colonia a otro medio de cultivo semejante o a medios selectivos. En el caso de los medios líquidos, una vez obtenido el crecimiento bacteriano, se debe realizar un aislamiento de UNA gota o UNA asada del cultivo a un medio sólido para obtener colonias aisladas y puras (Tabla Nº 2). Nota: La “asada” es el volumen que se encuentra retenido en el extremo curvo del filamento del asa de platino. Si fuese necesario, las colonias se someterán a uno o más reaislamientos, hasta obtener cultivos puros, es decir que todas las colonias sean similares, presenten la misma morfología y microscópicamente correspondan a un solo tipo de bacteria. Sólo en este momento se puede proceder a la identificación de la especie bacteriana mediante el traspaso de UNA sola colonia a una batería de medios de identificación.

Colonia A Colonias A y B se encuentran mezcladas Colonia B Figura Nº 2: Aislamiento por
Colonia A
Colonia A

Colonias A y B se encuentran mezcladas

Colonia B
Colonia B

Figura Nº 2: Aislamiento por estrías o en cuadrantes en placa de agar MacConkey.

19

Material por grupo (2 personas x grupo).

Medios de Cultivo

Cultivos Bacterianos por grupo

  • 2 Tubos con Agar Nutritivo tendido.

2 Cultivo en Placa Petri.

  • 2 Tubos con Agar Nutritivo.

2 Cultivo Bacteriano en Medio Líquido.

  • 6 Placas Petri con Agar Nutritivo.

  • 2 Tubos con Medio Líquido

Material

  • 4 Tórulas estériles

Solución de Alcohol 70 %

  • Solución de Yodo

1 Tubo con 3 mL de Suero Fisiológico

  • Solución de Cloro

Tabla Nº 1 : Material de uso común en el Laboratorio de Microbiología

Material

 

Esterilización

 

Tipo esterilización

Antes de ser utilizada

Después de ser utilizada

Tipo de material

Asa de platino

Directo a la llama del mechero

Re-utilizable

Pipetas aforadas de vidrio *

Directo a la llama del mechero

Re-utilizable

Pipetas aforadas de plástico

Química

No

No

Desechable

Pipetas Pasteur de vidrio *

Autoclave

No

Si

Desechable

Tubos estériles **

Autoclave Boca del tubo en la llama del Mechero

Si

Si

Re-utilizable

Placas Petri de vidrio

Autoclave

Si

Si

Re-utilizable

Puntas de Papel Absorbente

Autoclave

No

No

Desechable

Placas Petri de plástico

Química

No

Si

Desechable

* Este material se pueden encontrar en cilindros metálicos o envueltas en papel, ya estériles. En el primer caso, se debe poner el cilindro en forma horizontal, destaparlo y sacar una pipeta sin tocar con los dedos las otras, en el segundo caso se debe desenvolver la pipeta, de manera de no tocar su extremo inferior.

** Cada vez que se destape un tubo estéril, se debe flamear su boca y repetir la operación inmediatamente antes de volver a cerrarlo. Este procedimiento pretende evitar la entrada de microorganismos del aire al interior del tubo.

ACTIVIDADES PRÁCTICAS

  • 1. De medios Sólidos a medios Sólidos. 1.1. Desde placa Petri a tubo con Agar tendido:

    • a. Rotular el tubo de agar con los datos correspondientes (Nombre del microorganismo, Grupo y Fecha).

    • b. Flamear el asa para su esterilización.

Nota: Flamear el asa implica mantenerla en contacto con la llama del mechero hasta que el filamento se vea completamente rojo. Después se deja enfriar al lado del mechero.

  • c. En la placa Petri con la muestra, enfriar el asa en las zonas del agar donde no existan colonias.

  • d. Tomar una muestra con el asa desde el medio sólido con la bacteria en estudio (Con solo tocar la colonia estará tomando la cantidad de bacteria suficiente para poder sembrar).

  • e. Destapar el tubo con agar tendido y flamear la boca del tubo.

  • f. Introducir el asa hasta el fondo. Posteriormente, en un sólo movimiento, deslizar el asa con movimientos en zigzag ascendentes por la superficie del medio de cultivo.

  • g. Flamear y tapar la boca del tubo.

  • h. Flamear el asa para su esterilización.

i. Incubar el tubo recién sembrado a la temperatura adecuada. A B C D
i.
Incubar el tubo recién sembrado a la temperatura adecuada.
A
B
C
D

Figura Nº 1: Siembra desde agar en placa Petri a Tubo con agar tendido.

De medios Sólidos a medios Líquidos. 1.2. Desde placa Petri a tubo con medio de cultivo líquido:

  • a. Rotular el tubo de caldo con los datos correspondientes (Nombre microorganismo, Grupo, Fecha).

  • b. Flamear el asa para su esterilización.

  • c. Enfriar el asa en las zonas del agar donde no existan colonias.

  • d. Tomar una muestra con el asa desde el medio sólido con la bacteria en estudio (Con solo tocar la colonia estará tomando la cantidad de bacteria suficiente para poder sembrar).

  • e. Flamear la boca del tubo con medio líquido.

  • f. Introducir el asa dentro del tubo con caldo y agitar vigorosamente.

  • g. Flamear la boca del tubo y el asa para su esterilización.

  • h. Tapar el tubo e incubar a la temperatura adecuada.

A B C D 18 – 24 Hrs.
A
B
C
D
18 – 24 Hrs.

Figura Nº 2: Siembra desde agar en placa Petri a Tubo con caldo de cultivo.

2.

De medios Líquidos a medios Sólidos 2.1. Desde tubo con cultivo bacteriano líquido a placas de Petri:

  • a. Rotular la placa en el reverso (por donde se encuentra el agar) con los datos correspondientes.

  • b. Flamear el asa para su esterilización.

  • c. En la placa Petri con la muestra, enfriar el asa en las zonas del agar donde no existan colonias.

  • d. Destapar el tubo que contiene el cultivo bacteriano, flamear la boca del tubo e introducir el asa hasta el fondo. Posteriormente, agitar suavemente el asa y retirarla.

  • e. Flamear y tapar la boca del tubo.

  • f. Colocar la tapa de la placa sobre el mesón cerca del mechero.

  • g. Tomar la placa por su base y realizar la siembra mediante estrías, para ello:

i. Deslizar el asa con la muestra en forma de zig – zag en un pequeño sector de la placa. Flamear el asa. ii. A partir del sector ya sembrado en la placa, deslizar el asa hacia el sector contrario de la placa nuevamente en forma de zig – zag. Flamear el asa. iii. A partir de las últimas líneas realizadas, deslizar el asa hacia el sector contrario de la placa en forma de zigzag. Flamear el asa. iv. Repetir el procedimiento descrito en iii.) hasta completar la placa. Tener cuidado de que cuando se hacen las estrías en ii.) y iii.) no tocar las que ya se encuentran en la placa.

  • h. Tapar la placa y flamear el asa para su esterilización.

i. Incubar la placa a la temperatura adecuada. A B C D 18 – 24 Hrs.
i.
Incubar la placa a la temperatura adecuada.
A
B
C
D
18 – 24 Hrs.

Figura Nº 3: Siembra desde cultivo bacteriano líquido a agar en placa Petri.

2.2. Desde tubo con cultivo bacteriano líquido a tubo con agar (Por picadura).

  • a. Rotular el tubo con los datos correspondientes.

  • b. Flamear el asa para su esterilización.

  • c. Enfriar el asa en las paredes internas.

  • d. Tomar un inóculo del tubo problema.

  • e. Efectuar la siembra del tubo problema al tubo estéril; para ello: i.Destapar el tubo estéril e introducir el asa cargada sin tocar las paredes, picando el medio de cultivo al centro sin llegar al fondo del mismo. ii.Retirar el asa con precaución para producir el menor desgarro posible.

  • f. Flamear la boca del tubo y tápelo.

  • g. Flamear el asa para su esterilización.

  • h. Incubar el tubo sembrado a la temperatura adecuada.

A B C D
A
B
C
D

Figura Nº 4: Siembra desde cultivo bacteriano líquido a Tubo con agar

3. Desde tubo con cultivo bacteriano líquido a tubo con agar (Zig – Zag superficie).

  • a. Rotular el tubo con los datos correspondientes.

  • b. Flamear el asa para su esterilización.

  • c. Enfriar el asa en las paredes internas o en el líquido de condensación.

  • d. Tome un inóculo del tubo problema.

  • e. Destapar el tubo con agar tendido y flamear la boca del tubo.

  • f. Introduzca el asa hasta el fondo. Posteriormente, en un sólo movimiento, deslizar el asa con movimientos en zigzag ascendentes por la superficie del medio de cultivo.

  • g. Flamear y tapar la boca del tubo.

  • h. Flamear el asa para su esterilización.

  • i. Incubar el tubo recién sembrado a la temperatura adecuada.

A B C D Figura Nº 5: Siembra desde cultivo bacteriano líquido a tubo con agar
A
B
C
D
Figura Nº 5: Siembra desde cultivo bacteriano líquido a tubo con agar
tendido.

4.

Desde medios Líquidos a medios Líquidos.

  • 4.1. Desde tubo con cultivo bacteriano líquido a tubo con medio de cultivo líquido.

    • a. Rotular el tubo con los datos correspondientes.

    • b. Homogenizar el tubo problema por agitación.

    • c. Flamear el asa para su esterilización.

    • d. Enfriar el asa en las paredes internas del tubo.

    • e. Tomar un inóculo del tubo problema procurando que quede una película en el asa.

    • f. Destapar el tubo estéril e introducir el asa cargada sin tocar las paredes, agitar en el medio de cultivo y retirar con cuidado.

    • g. Flamear la boca del tubo y tápelo.

    • h. Flamear el asa para su esterilización.

    • i. Incubar el tubo sembrado a la temperatura adecuada.

A B C 18 - 24 hrs.
A
B
C
18 - 24 hrs.

Figura Nº 6: Siembra desde cultivo bacteriano líquido a tubo con medio de cultivo.

Tabla Nº2: Cuadro Resumen Actividad Técnicas de Siembra.

Desde Medio Tipo

A Medio Tipo

Toma de muestra desde

Siembra en

Tipo Siembra

     

Tubo con Agar Tendido

ZigZag superficie

Sólido

Sólido

Placa Petri

Tubo con Agar

Pinchadura

Líquido

Placa Petri

Tubo con Medio de cultivo

Agitación con asa

     

Placa Petri

En cuadrantes

Sólido

Tubo con cultivo líquido

Tubo con Agar

Pinchadura

Líquido

Tubo con Agar Tendido

ZigZag superficie

Líquido

Tubo con cultivo líquido

Tubo con Medio de cultivo

Agitación con asa

5.

Técnicas de Esterilización 5.1. Flameado

  • a. Dividir una placa por la mitad.

  • b. Tomar un asa y abrir una placa de agar nutritivo y deslizarla suavemente por una mitad del agar. Cerrar la placa.

  • c. Flamear el asa para su esterilización, enfríela en la tapa y deslícela suavemente por la otra mitad del agar.

  • d. Cerrar la placa.

  • e. Incubar la placa a 37ºC.

  • 6. Desinfección y Asepsia

    • a. Tomar una tórula y deslizarla rápidamente por un sector dentro o fuera del laboratorio de amplia exposición

    • b. Pasarla suavemente sobre una mitad del agar nutritivo de una placa.

    • c. Humedecer la misma tórula con la solución de cloro y deslizarla por la otra mitad de la placa.

    • d. Incubar la placa a 37ºC.

  • 7. Yodo

    • a. Dividir una placa en dos, por una mitad deslizar suavemente uno de sus dedos por el agar.

    • b. Tome un trozo de algodón con yodo y aplíquelo en el dedo que utilizó, espere unos segundos.

    • c. Pasar el dedo suavemente por la otra mitad de la placa.

    • d. Incubar la placa a 37ºC.

  • 8. Alcohol

    • a. Repita los pasos realizados para la actividad del cloro.

    • b. Escoja otro lugar del laboratorio de amplia exposición.

    • c. Incubar la placa a 37ºC.

  • Análisis Macroscópico

    Una etapa importante y básica en el estudio de las características de una bacteria, es la observación de su morfología. Como consecuencia del pequeño tamaño que presentan no es posible distinguirlas a simple vista y, debido a esto es que tenemos que estudiar poblaciones bacterianas, llamadas colonias. Para obtener estas colonias es necesario proporcionarles a las bacterias los requerimientos necesarios de materia orgánica, iones inorgánicos y factores de crecimientos entre otros a través de un medio de cultivo. Cada colonia corresponde en su origen a una sola bacteria que se ha multiplicado y desarrollado en un medio de cultivo sólido, hasta formar una

    población que se represente como una colonia visible. Por lo tanto una colonia está formada por millones de bacterias. El crecimiento de las bacterias en medios líquidos, no da origen a la formación de colonias. El desarrollo se evidencia mediante la turbidez del caldo, sedimento y otras características. Cabe destacar que la morfología macroscópica de las colonias (análisis macroscópico) permite un acercamiento en la identificación de los géneros bacterianos que poseen características propias de desarrollo de sus colonias, según su forma, elevación, margen, superficie, brillo, color y hemólisis (en agar sangre). Muchas especies bacterianas presentan colonias que son muy parecidas lo que hace imposible diferenciarlas solo con la observación macroscópica de estas por lo que se hace necesario además una observación microscópica de las células que conforman estas colonias. Esto datos proporcionan una orientación sobre las pruebas bioquímicas para la identificación definitiva de las colonias. En la figura Nº 1 se observan algunas características macroscópicas de colonias bacterianas, frecuentemente utilizadas para la descripción de una bacteria o microorganismo. Para observar la elevación, coloque la placa de forma horizontal frente a sus ojos y observe la colonia. La forma que adquiere por sobre el horizonte del agar es lo que se considera como “elevación”. El “margen” en cambio, corresponde al perímetro de la colonia. Por ejemplo, una colonia bacteriana puede ser circular pero su borde o margen puede ser lobulado.

    Figura Nº 1: Criterios macroscópicos para la descripción de una colonia bacteriana. 31

    Figura Nº 1: Criterios macroscópicos para la descripción de una colonia bacteriana.

    APUNTES

    APUNTES

    TRABAJO PRÁCTICO Nº 2:

    MORFOLOGÍA BACTERIANA EXAMEN MACROSCÓPICO Y MICROSCÓPICO TINCIONES

    Una etapa importante y básica en el estudio de las características de una bacteria, es la observación de su morfología. Como consecuencia del pequeño tamaño que presentan no es posible distinguirlas a simple vista y, debido a esto es que tenemos que estudiar poblaciones bacterianas, llamadas colonias. Para obtener estas colonias es necesario proporcionar a las bacterias los requerimientos necesarios de materia orgánica, iones inorgánicos y factores de crecimiento, entre otros, mediante un medio de cultivo. Cada colonia corresponde en su origen a una sola célula bacteriana que se ha multiplicado y desarrollado en un medio de cultivo sólido, hasta formar una población que se representa como una colonia visible. Por lo tanto una colonia esta formada por millones de bacterias. El crecimiento de las bacterias en medios líquidos no da origen a la formación de colonias. El crecimiento en este medio se evidencia mediante la turbidez del caldo, sedimento y otras características. Cabe destacar que la morfología macroscópica de las colonias (análisis macroscópico) permite un acercamiento en la identificación de los géneros bacterianos que poseen características propias de desarrollo de sus colonias, según su forma, elevación, margen, superficie, brillo, color y hemólisis (en agar sangre). En la figura Nº 1 se observan algunas características macroscópicas de colonias bacterianas, frecuentemente utilizadas para la descripción de una bacteria o microorganismo. Muchas especies bacterianas presentan colonias que son muy parecidas, lo que hace imposible diferenciarlas solo con la observación macroscópica de estas por lo que se hace necesario además una observación microscópica de las células que conforman estas colonias. Estos datos proporcionan una orientación sobre las pruebas bioquímicas para la identificación definitiva de las colonias.

    La observación al microscopio de las bacterias nos permite conocer una serie de características complementarias a la morfología de colonia entre las que encontramos:

    forma, disposición o agrupación, presencia o ausencia de estructuras (cápsulas, esporas, flagelos), movilidad, etc. Existen numerosas técnicas para la observación microscópica de los microorganismos, de las cuales en el laboratorio son fáciles de realizar las siguientes:

    • 1. Observación de bacterias vivas: Para observar las bacterias vivas, sin teñir, se utiliza el microscopio de fase contrastada. Este tipo de microscopio se desarrolló para hacer posible observar células pequeñas sin teñir. Se basa en utilizar y aumentar la pequeña diferencia de índice de refracción que existe entre las células y el medio que las circunda. Esta diferencia puede ser usada para crear una imagen con mucho mayor contraste que la que se obtiene en el microscopio de campo claro. Este microscopio usa un lente objetivo especial y en el condensador se inserta un diafragma especial; además para aumentar el contraste se insertan filtros verdes o azules.

      • a. En fresco: Este método de examen permite observar el microorganismo al estado vivo y evita las deformaciones artificiales de su morfología que producen las técnicas de coloración. Su aplicación más importante se refiere al estudio de la movilidad de los microorganismos.

      • b. Con fondo oscuro: Se basa en el fenómeno de Tyndall, de reflexión luminosa. Para la observación se sustituye el condensador de Abbé por el condensador de fondo oscuro, o de ultra. Se ilumina la preparación en forma oblicua, incidiendo los rayos luminosos directamente sobre los microorganismos sin penetrar en el objetivo del microscopio. Se emplea para la observación de bacterias muy pequeñas o de aquellas que difícilmente se observan al microscopio de campo claro por su falta de contraste con el medio.

      • c. Gota colgante: Consiste en suspender el microorganismo a observar en un líquido y depositar una gota de la suspensión sobre un cubreobjeto el cual se coloca sobre un portaobjeto, luego se procede a la observación microscópica.

    2.

    Observación de bacterias muertas:

    • a. Tinciones simples. Se utiliza un sólo colorante para revelar la presencia de microorganismos y su forma en general. Son de poco uso en bacteriología.

    • b. Tinción negativa. Se tiñe el fondo mientras que las células permanecen sin teñir (transparentes), observándose como entidades claras sobre un fondo oscuro. Ejemplo de este tipo de tinción es la tinción de cápsula en la que se usa tinta china.

    • c. Tinciones especiales. Se utilizan para observar alguna estructura en particular como nucleoide, flagelo, esporas, etc.

    • d. Tinciones diferenciales. Las bacterias son diferentes entre sí, tanto en su estructura física como en su composición química, de modo que reaccionan en forma diferente frente a los colorantes. Estas tinciones se utilizan para diferenciar los distintos grupos de bacterias. La tinción de

    Gram es la tinción diferencial más importante usada en bacteriología. Otra muy utilizada es la tinción ácido resistente o tinción de ZiehlNeelsen. Otras estructuras bacterianas que también pueden ser diferenciadas por métodos de tinción son las esporas y la cápsula

    • a. Observación de esporas: Esta tinción es un ejemplo de una tinción especial. Algunos géneros bacterianos como Bacillus y Clostridium, producen endosporas como una forma de resistencia a condiciones ambientales adversas, por ejemplo sequedad o falta de nutrientes. Las endosporas o esporas se caracterizan por ser altamente resistentes al calor, a las radiaciones y a la desecación. La resistencia de la espora se debe a la estructura proteica (rica en aminoácidos azufrados) de sus capas externas, lo que también las hace resistentes a tinción. Por este motivo las esporas se tiñen en caliente.

    • b. Observación cápsula: se trata de una tinción negativa usando tinta china que

    permite determinar la presencia de cápsulas polisacarídicas. Entonces, el estudio macro y microscópico de una muestra bacteriana permite obtener una orientación preliminar de su identidad y dirige a el desarrollo de pruebas bioquímicas especificas que permitan una identificación más certera y precisa.

    OBJETIVOS

    • 1. Practicar tinciones diferenciales de frotis bacterianos: tinción de Gram, tinción de cápsula y esporas.

    • 2. Observar endosporas y su disposición en formas vegetativas de Bacillus spp.

    • 3. Observar la presencia de cápsula en Klebsiella spp.

    • 4. Comparar colonias bacterianas desarrolladas en distintos medios de cultivo sólido (Placas de Agar).

    • 5. Describir colonias de acuerdo a criterios macroscópicos.

    ACTIVIDADES PRÁCTICAS

    OBSERVACIONES MACROSCÓPICAS

    • 1. Describa las colonias desarrolladas en los medios de cultivo entregados por el profesor de Laboratorio. Considere los siguientes aspectos: forma, borde, elevación, superficie, características físicas (textura, color y brillo).

    • 2. Siembre la siguiente batería de placas como lo indica la tabla y deje incubando.

     

    Gram Positivo

    Gram Negativo

    Agar Corriente

    +

    +

    Agar Sangre

    +

    +

    Agar MacConkey

    +

    +

    • 3. En la siguiente sesión de trabajo práctico observe y describa las colonias desarrolladas en los distintos medios, considerando los aspectos anteriormente mencionados.

    OBSERVACIONES MICROSCÓPICAS

    • 1. Tinción de Esporas (Demostrativa).

    Procedimiento :

    • a. Limpie una lámina portaobjeto con alcohol y seque cuidadosamente con papel absorbente.

    • b. Coloque una gota de cultivo de Bacillus spp. con el asa hasta que sea del tamaño de una arveja y fije en el mechero hasta que se seque completamente (sin hervir).

    • c. No olvide esterilizar el asa después de usarla. No la deje contaminada sobre el mesón.

    • d. Corte papel absorbente en forma rectangular, de manera que cubra el frotis con bacteria.

    • e. Ponga 4 capas de papel sobre el frotis y, a continuación agregue solución colorante verde de malaquita. Debe fijarse que el colorante tiene que atravesar las 4 capas de papel y ponerse en contacto con el frotis bacteriano.

    • f. Esta tinción se realiza en caliente: para ello con unas pinzas de madera debe colocar la muestra encima de la llama del mechero hasta observar emisión de vapor durante 5 min. No sobrecaliente para evitar que se queme su muestra o se rompa el portaobjeto.

    • g. Una vez que se detenga la emisión de vapor desde la muestra, hay que reponer el colorante nuevamente. Debe repetir 4 veces este proceso.

    • h. Lave con agua de tal manera que escurra suavemente todo el colorante verde de malaquita.

    • i. Posteriormente durante 2 min., cubra el frotis con el colorante de contraste, safranina.

    • j. Lave con agua.

    • k. Seque cuidadosamente con papel absorbente y observe con inmersión.

    NOTA:

    Las bacterias se observan rosadas mientras que las esporas (de menor tamaño que las bacterias) son pequeñas esferas verdes.

    Es posible observar esporas libres y esporas intracelulares. En estas últimas es posible determinar si se encuentran al centro o hacia un extremo de la célula y, si la espora deforma o no al bacilo.

    A C
    A
    C
     Es posible observar esporas libres y esporas intracelulares. En estas últimas es posible determinar si
     Es posible observar esporas libres y esporas intracelulares. En estas últimas es posible determinar si

    B

     Es posible observar esporas libres y esporas intracelulares. En estas últimas es posible determinar si
    D Papel absorbente
    D
    Papel
    absorbente
    Verde malaquita E
    Verde malaquita
    E
    F
    F
    G Safranin
    G
    Safranin

    Una vez observada la muestra deseche la lámina en los frascos con DESINFECTANTE ubicados en cada mesón.

     Es posible observar esporas libres y esporas intracelulares. En estas últimas es posible determinar si

    2.

    Tinción de Cápsula (Demostrativa).

    Procedimiento:

    • a. Limpie una lámina portaobjeto con alcohol y seque cuidadosamente con papel absorbente.

    • b. En una esquina de la lámina portaobjeto coloque una gota de tinta china del tamaño de una arveja.

    • c. Esterilice el asa y tome parte del cultivo de la bacteria Klebsiella spp.

    • d. Mezcle la tinta china con la bacteria, esterilice el asa y repita 3 o 4 veces (sólo agregar la bacteria). La tinta china impide ver si la solución tiene o no suficiente bacteria, por lo mismo es necesario mezclar con suficiente cultivo.

    • e. No ensucie su cultivo bacteriano con tinta china, asegúrese de esterilizar el asa previamente y de enfriar ésta en las paredes del tubo.

    • f. Realice un frotis extendiendo la suspensión de manera que quede una capa delgada. Esto se realiza tomando un cubreobjeto y, esparciendo la mezcla a lo largo del portaobjeto que contiene la mezcla tinta chinabacteria. Ver Figura.

    • g. Fije suavemente en el mechero.

    • h. Durante 2 min cubra completamente con colorante de contraste, fucsina.

    • i. Lave con agua, seque con papel absorbente y observe con inmersión.

    A
    A

    B

    A B C E Fucsina D F Bacterias Cápsula 41

    C

    A B C E Fucsina D F Bacterias Cápsula 41
    E Fucsina
    E
    Fucsina

    D

    A B C E Fucsina D F Bacterias Cápsula 41

    F

    Bacterias Cápsula
    Bacterias
    Cápsula

    3.

    Tinción de Gram.

    Fundamento

    Las bacterias Grampositivo y Gramnegativo se tiñen de forma distinta debido a diferencias en su pared celular. La pared de las Grampositivo es gruesa y consiste en varias capas interconectandas de peptidoglicano así como algo de ácido teicoico. Generalmente, el 80%90% de la pared de las células Grampositivo es peptidoglicano. Por otro lado, la pared celular de bacterias Gramnegativo, contiene una capa mucho más delgada de peptidoglicano y está rodeada por una membrana exterior compuesta de fosfolípidos, lipopolisacáridos, y lipoproteínas. Sólo 10% 20% de la pared de la célula Gramnegativo es peptidoglicano. Debido a su importancia en taxonomía bacteriana y a que indica diferencias fundamentales de la pared celular de las distintas bacterias, describiremos aquí con algún detalle la tinción de Gram y las interpretaciones que actualmente se hacen sobre el por qué de su funcionamiento. Las células fijadas al calor sobre un portaobjetos se tiñen, primero con una solución de cristal violeta (otros colorantes básicos no son tan efectivos) y son lavadas para quitar el exceso de colorante. En este estado, todas las células, tanto las Grampositivo como las Gramnegativo, están teñidas de azul. El portaobjetos se cubre entonces con una solución de yodoyoduro potásico. El ingrediente activo es aquí el I2; el KI simplemente hace soluble el I2 en agua. El I2 entra en las células y forma un complejo insoluble en agua con el cristal violeta. De nuevo tanto las células Grampositivo como las Gramnegativo se encuentran en la misma situación. La decoloración se lleva a cabo usando una mezcla de alcoholacetona, sustancias en las que se solubiliza el complejo I2cristal violeta. En esta etapa los organismos Grampositivos no se decoloran, mientras que los Gramnegativos si se decoloran. La diferencia se debe probablemente a que en bacterias Gramnegativo, la mezcla alcohol/acetona disuelve la membrana externa de la pared celular (y también puede

    dañar la membrana citoplásmica a la que se une peptidoglicano), siendo incapaz de retener el de complejo cristal violetayodo, causando la decoloración. Las células Grampositivo, a diferencia de las anteriores, poseen una pared celular con mayor contenido de peptidoglicano y menor contenido lipídico, siendo menos permeables a

    la mezcla alcohol/acetona. Esto causa la deshidratación de la célula y el cierre de los poros disminuyendo el espacio entre las moléculas, atrapando el complejo I2cristal violeta dentro de la pared celular. Después de la decoloración