Universidad Andrés Bello  Facultad de Ciencias Biológicas  Departamento de Ciencias Biológicas 

 
         

             
 
               

GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS  MICROBIOLOGIA GENERAL  BIO‐055
Carrera:  Nutrición y Dietética 
     

SEGUNDO SEMESTRE 2011

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ÍNDICE  
 

CONTENIDO  INTRODUCCIÓN AL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA  Nº1 TÉCNICAS BÁSICAS DE MICROBIOLOGÍA Y MORFOLOGÍA  BACTERIANA  Nº2 MORFOLOGÍA BACTERIANA: EXAMEN MACROSCÓPICO Y  MICROSCÓPICO. TINCIONES.  Nº3 FLORA NORMAL Y FISIOTAXONOMÍA  DE BACTERIAS GRAM  POSITIVO. ANTIMICROBIANOS  Nº4 FISIOTAXONOMÍA  DE BACTERIAS GRAM NEGATIVO.  ANTIMICROBIANOS  Nº5 AISLAMIENTO BACTERIANO DESDE ALIMENTOS.  Nº6 HONGOS UNICELULARES Y  FILAMENTOSOS 
 

PÁGINAS  9 – 17  18 – 31   34 – 44   47 – 66  69 – 88   89 – 95  98 – 105  

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Objetivos del Práctico de Microbiología   
Al término del curso práctico, el alumno deberá ser capaz de:      1. Identificar el material habitual utilizado en la práctica de la microbiología.    2. Manipular  correctamente  el  material  de  laboratorio  y  los  cultivos  de  microorganismos.    3. Aislar  y  propagar  microorganismos  tanto  de  muestras  heterogéneas  (por  ejemplo alimentos) como a partir de cultivos puros.    4. Identificar  correctamente  formas  y  agrupaciones  bacterianas  mediante  observación microscópica.    5. Emplear  distintas  formas  de  tinción  para  identificar  microorganismos  o  estructuras importantes de estos.    6. Utilizar la información derivada de la actividad metabólica de microorganismos  sobre distintos sustratos, con fines taxonómicos (identificación).    7. Realizar  estudios  de  sensibilidad  a  agentes  antimicrobianos  para  diferenciar  bacterias según su grado de sensibilidad a ciertos antibióticos.    8. Aislar  y  propagar  levaduras  y  hongos  filamentosos  tanto  de  muestras  heterogéneas como a partir de cultivos puros.    9. Reconocer  y  diferenciar  la  morfología  macroscópica  y  microscópica  de  levaduras y hongos filamentosos. 

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 y  Lactobacillus sp.‐  Fisiotaxonomía de bacterias Gram positivo:       Pruebas  bioquímicas  para  cocáceas  Gram  positivos.‐  Procedimientos básicos de microbiología                Identificación  del  material  de  uso  microbiológico.  Aislamiento de enterobacterias.. Staphylococcus sp.      Crecimiento y cultivo en distintos medios de cultivo. Tinciones. Vibrio sp.  Obtención de colonias aisladas. Análisis de  muestras al fresco.  Cultivo  de  hongos  provenientes  de  muestras  de  alimentos ya sea como contaminantes o constituyentes de los mismos. Descripción macroscópica de  colonias.    6. análisis macroscópico de éstas.  Estudio  de  las  alteraciones  producidas  por  la  acción  bacteriana en medios de cultivo: Utilización de lactosa.‐  Hongos: Levaduras y Mohos      Descripción  macroscópica  y  microscópica  de  levaduras  y  hongos. Uso de medios de cultivo selectivos y diferenciales.  Estudio  de  sensibilidad  a  antibióticos. Análisis microscópico de  bacterias Gram negativo.Programa de trabajos prácticos    1.. Pseudomonas sp.‐    Morfología bacteriana: Examen macroscópico y microscópico.‐  Fisiotaxonomía de bacterias Gram negativo:       Pruebas  bioquímicas  para  Gram  negativo:  Batería  bioquímica  y  API. Tinciones y análisis microscópico de las bacterias en estudio: Morfología  y agrupación.  Estudio  de  las  alteraciones  producidas  por  la  acción  bacteriana  en  medios de cultivo: Hemólisis. tinción de esporas. Técnicas de siembra en medios de cultivo sólidos y líquidos. tinción de Gram.‐  Aislamiento bacteriano desde alimentos:      Metodologías  de  enriquecimiento  y  aislamiento  de  microorganismos  presentes  en  alimentos  ya  sea  como  contaminantes  o  constituyentes  de  los  mismos.    3.  Clasificación  y  utilidad  de  medios de cultivo.  Análisis  de  estructuras  reproductivas.    2.    4.    5. tinción de cápsula. Análisis microscópico de bacterias Gram positivo.  Estudio  de  sensibilidad  a  antibióticos.            4 .

Promedio Final: 1) Nota de presentación 70% 2) Examen Teórico-Práctico 30 % 5 . módulos 1 y 2 (8:30 .10:10 hrs. módulos 1 y 2 (8:30 .Profesores y secciones:  Horario : Miércoles.10:10 hrs.) Jueves.) Sesiones cada 15 días Secciones 1 y 2: Profesores Leslie Daille y Milka Darlic Secciones 3 y 4: Profesores Francisca Álvarez y Jorge Irarrázaval Secciones 5 y 6: Profesores Anilei Hoare y Alejandro González Sección 7: Profesores Nicolás Villagra y Matías Jofré Salas de Laboratorio:     Laboratorio de Microbiología I (LAB 206): Secciones 1 y 2 Laboratorio de Microbiología II (LAB 207): Secciones 3 y 4 Laboratorio de Biología IV (BIO 204) Secciones 5 y 6 Laboratorio de Biología V (BIO 117): Sección 7 Evaluación:      El curso se aprueba con nota final igual o superior a 3.95. según planilla de cálculo del sistema en Intranet. La nota de presentación se calculará de acuerdo a los siguientes parámetros: 1) Pruebas de entrada 60 % 2) Informes 40 % El promedio de las actividades señaladas con la ponderación establecida corresponde a la nota de presentación. No existirá ningún tipo de interrogación y/o trabajo para subir nota.

9 (reprobado) Pruebas Recuperativas Sólo tendrán derecho a Prueba Recuperativa aquellas inasistencias debidamente justificadas en la Escuela. 6 . Esto de acuerdo al siguiente ejemplo: Nota final : 3.94 se aproxima a 4. Independiente del trabajo práctico al cual el alumno haya faltado.05 se aproximará a la décima superior. se realizará un control al final del semestre y contemplará TODOS los contenidos de los trabajos realizados. Condiciones de eximición Se eximirán del examen final SÓLO aquellos alumnos que alcancen una nota 5. En este caso. (Condiciones establecidas que se rigen según el Reglamento del Alumno de Pregrado. si la centésima es igual o menor a 0. Ante la inasistencia a una sesión de laboratorio. Por su parte.0 (aprobado) se mantiene en 3.La nota final se expresa con un solo decimal.04 se mantiene el decimal. se realizará un control recuperativo sólo cuando esté debidamente justificado y hayan entregado una fotocopia de la aceptación del certificado médico al profesor que corresponda. No se contemplan actividades recuperativas para los informes de laboratorio. Artículo 40).0 como consecuencia de llegar atrasados al trabajo práctico NO TIENEN DERECHO a recuperar esa nota.5 ó superior.95 3. Los alumnos que obtengan nota 1. cuando la centésima sea igual o mayor a 0.

Cronograma de actividades AGOSTO Miércoles 24: Jueves 25: Miércoles 31: Organización del curso SECCIONES IMPARES Organización del curso SECCIONES PARES Práctico 1: Procedimientos Básicos I SECCIONES IMPARES SEPTIEMBRE Jueves 1: Miércoles 7: Jueves 8: Miércoles 14: Jueves 15: Miércoles 21: Jueves 22: Miércoles 28: Jueves 29: Práctico 1: Procedimientos Básicos II SECCIONES IMPARES Práctico 1: Procedimientos Básicos I SECCIONES PARES Práctico 1: Procedimientos Básicos II SECCIONES PARES Práctico 2: Morfología Bacteriana I SECCIONES IMPARES Práctico 2: Morfología Bacteriana II SECCIONES IMPARES Práctico 2: Morfología Bacteriana I SECCIONES PARES Práctico 2: Morfología Bacteriana II SECCIONES PARES Práctico 3: Gram positivos y Flora Normal I SECCIONES IMPARES Práctico 3: Gram positivos y Flora Normal II SECCIONES IMPARES OCTUBRE Miércoles 5: Jueves 6: Miércoles 12: Jueves 13: Miércoles 19: Jueves 20: Miércoles 26: Jueves 27: Práctico 3: Gram positivos y Flora Normal I SECCIONES PARES Práctico 3: Gram positivos y Flora Normal II SECCIONES PARES Práctico 4: Fisiotaxonomía de Gram negativos I SECCIONES IMPARES Práctico 4: Fisiotaxonomía de Gram negativos II SECCIONES IMPARES Práctico 4: Fisiotaxonomía de Gram negativos I SECCIONES PARES Práctico 4: Fisiotaxonomía de Gram negativos II SECCIONES PARES Práctico 5: Aislamiento bacteriano desde alimentos I SECCIONES IMPARES Práctico 5: Aislamiento bacteriano desde alimentos I SECCIONES PARES NOVIEMBRE Miércoles 2: Jueves 3: Miércoles 9: Jueves 10: Miércoles 16: Jueves 17: Miércoles 23: Jueves 24: Miércoles 30: Práctico 5: Aislamiento bacteriano desde alimentos II SECCIONES IMPARES Práctico 5: Aislamiento bacteriano desde alimentos II SECCIONES PARES Práctico 6: Levaduras y Hongos filamentosos I SECCIONES IMPARES Práctico 6: Levaduras y Hongos filamentosos II SECCIONES IMPARES Práctico 6: Levaduras y Hongos filamentosos I SECCIONES PARES Práctico 6: Levaduras y Hongos filamentosos II SECCIONES PARES Sin actividades Sin actividades Controles Recuperativos y revisión de notas para todas las secciones DICIEMBRE Miércoles 14: EXAMEN PRÁCTICO TODAS LAS SECCIONES 7 .

Normas Generales del trabajo en el Laboratorio    1. Deben  traer su propio candado.    El  NO  uso  del  delantal  significará  que  el  alumno  NO  podrá  ingresar  al  trabajo  práctico.‐  Para evitar contaminación y el peligro de quemaduras no se debe portar elementos  como gorros.    7.    5.‐  Para  evitar  contaminación  y  el  peligro  de  quemaduras  es  indispensable  la  utilización del cabello recogido durante el desarrollo del trabajo práctico. bufandas o pañuelos ni ningún tipo de ropa que incomode durante el  desarrollo del trabajo práctico.‐  En  caso  de  ruptura  de  material  contaminado  con  bacterias  u  hongos.    4.‐  El  alumno  llevará  obligatoriamente  un  delantal  blanco.       8 .    3.    6.  fundamentalmente  para  proteger su ropa de material infeccioso y reactivos corrosivos o de tinción.‐  No  se  podrá  ingresar  al  Laboratorio  de  Práctico  con  mochilas.  debe  comunicarse  inmediatamente  con  el  profesor  encargado  para  proceder  a  la  desinfección de la zona.‐  Cada  grupo  de  trabajo  será  responsable  por  los  microscopios  disponibles  y  del  material entregado.  beber o fumar en el laboratorio. El material debe ser devuelto íntegramente y los microscopios  deben quedar limpios y ordenados.  bolsos  o  ropa  de  abrigo por lo que deben ser guardados en las gavetas dispuestas para ello.    2.‐  Está  absolutamente  prohibido  ingresar  o  consumir  cualquier  tipo  de  alimentos.

  microscopios.  MICROSCOPIO OPTICO COMPUESTO:    Sistema óptico   o OCULAR: Lente situada cerca del ojo del observador.  cámaras de cultivo. o bien algunos  de estos equipos son de uso común para varios laboratorios.  Amplía  la  imagen  de  ésta.  se  requiere  de  un  espacio  diseñado  especialmente para la manipulación del microorganismo (mo) y otros espacios para la  preparación  del  material  estéril  y  la  eliminación  o  esterilización  del  material  contaminado. En muchas ocasiones  las cámaras de cultivo y refrigeradores se ubican en una sala especial.  Es  decir.   o CONDENSADOR:  Lente  que  concentra  los  rayos  luminosos  sobre  la  preparación.1 BIOSEGURIDAD    Un  laboratorio  de  microbiología  debe  contar  con  la  infraestructura  necesaria  para  manipular un microorganismo (mo) de acuerdo a su riesgo biológico cumpliendo con  los procedimientos del nivel de bioseguridad correspondiente (niveles del 1 al 4). Amplía la imagen  del objetivo.  refrigeradores.      Nuestro  trabajo  docente  involucra  microorganismos  no  patógenos.   o DIAFRAGMA: Regula la cantidad de luz que entra en el condensador.    1.  siendo  nuestro  nivel  de  Bioseguridad  de  tipo  2.   9 . Introducción  1. balanzas.2 MATERIALES PRESENTES EN UN LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA   Es  esencial  que  posea:  estereomicroscopios  (lupas).   o OBJETIVO:  Lente situada  cerca  de  la  preparación.Introducción al Laboratorio de Microbiología    1.  Además se deben seguir normas que permitan una manipulación libre  de contaminación para el mo. centrífugas y destiladores de agua. el experimentador y para el medio ambiente.

  cambiar los objetivos. Tiene dos partes: el pie o base y el  brazo. vasos de precipitado.  pipetas  graduadas. Además.  cristalizadores. reactivos diversos.  desecadores. La utilización de estos metales se debe a que son resistentes a la oxidación  y  porque  una  vez  esterilizados  a  la  llama. frascos cuenta gotas. pipetas Pasteur.  probetas. colorantes.  papel  indicador  de  pH.  papel  de  envolver.  portaobjetos.  bisturíes. etc.  buretas. matraces Erlenmeyer.  Puede  ser  monocular o  binocular.  pinzas.  frascos  (diferentes  capacidades.  se  utilizan  asas  con  hilos  de  platino  o  de  tungsteno.  transparentes o color ámbar).o  FOCO: Dirige los rayos luminosos hacia el condensador.   o TORNILLOS  DE  ENFOQUE:  Macrométrico  que  aproxima  el  enfoque  y  micrométrico que consigue el enfoque correcto.  b)  Otros:  algodón.   CABEZAL:  Contiene  los  sistemas  de  lentes  oculares.  se  enfrían  rápidamente  sin  riesgo  de  provocar la muerte de los microorganismos con que se está trabajando. al girar. estos  10 .  embudos. etc. asas con hilos de platino.  cubreobjetos.   o o PLATINA: Lugar donde se deposita la preparación.              1.   Sistema mecánico   o SOPORTE: Mantiene la parte óptica.  matraces  aforados. Permite.  Para  realizar  siembras  y/o  repiques.  o REVÓLVER: Contiene los sistemas de lentes objetivos.  papel  filtro.3 Otros materiales utilizados son:  a) De vidrio: placas de Petri. tubos de ensayo.

  permitiendo repicar o resembrar desde un medio líquido o sólido.              Placa petri con medio sólido.                          INCUBADORA : (Rango temperatura 5‐100°C)          11      Pipeta Pasteur  .                Matraz Erlenmeyer.          Asa níquel‐cromo               Placa de Petri.hilos  son  muy  maleables  pudiendo  ser  transformados  en  un  asa  o  en  espátula.

AUTOCLAVE                                                  12 .

  repitiendo  dicha  operación  una  vez  realizada  la  siembra  (el  tapón  nunca  debe  dejarse  sobre  el  mesón).  se  flamea  por  algunos  segundos  el  orificio. es esencial la limpieza y el orden dentro del  laboratorio. es decir.  El  autoclave  está  formado  por  una  vasija  cilíndrica de hierro forjado. Una vez abierto de la  forma  señalada.En términos de Física experimental se define el punto de ebullición de un líquido como  la temperatura a la cual se iguala el valor de la presión de vapor del fluido con el que  corresponde  a  la  presión  atmosférica. se  elimina  la  presión  del  vapor  de  agua  (Flowing  steam). nunca deben abrirse en posición vertical.  de  modo  que  suba  la  temperatura  junto  con  la  presión.   Antes de comenzar a trabajar se debe limpiar el mesón con un algodón embebido  en alcohol etílico 70‐96°.    1. virus y  esporas. sino lo más horizontalmente posible  (inclinados) y para quitar el tapón de algodón se mantendrán inclinados con una  mano  y  se  abrirán  con  la  otra.   Se recomienda trabajar en forma cómoda en un mesón de material sintético duro  y no inflamable. En un comienzo antes de que se alcance la temperatura de 100°C. queda totalmente estéril.4 PRECAUCIONES EN EL LABORATORIO Y DURANTE EL TRABAJO PRÁCTICO    Para evitar posibles contaminaciones.    13 .  la  que  sostendrá  a  su  vez  el  asa  (con  el  dedo  meñique.  Este  procedimiento aplicado sobre material resistente a la temperatura elimina mo. se retira el tapón de algodón que obtura el tubo).  sin  alcanzar  el  punto  de  ebullición  del  agua.   Los tubos de ensayo  o  matraces que contengan medios de cultivos o cultivos de  mo. de paredes gruesas y con una tapadera resistente que se  cierra  herméticamente  mediante  la  acción  o  giro  de  un  potente  tornillo  conectado  a  una abrazadera. Este mesón debe estar ubicado en un sitio con menor corriente  de aire (las ventanas deben estar cerradas). alejado de las zonas de circulación de  otras personas y debe contar con un mechero. o con una solución de hipoclorito de sodio (1‐5%).

 luego debe enjuagarse con H2O  corriente y posteriormente con H2O destilada.  Inmediatamente  después  de  haberlas  utilizado.  El  lavado  se  realiza con detergentes y/o soluciones especiales. evitando diseminar el microorganismo en el medio  ambiente. Antes  de  utilizar  las  asas  con  hilos  de  platino.  estar  bien  lavado  y  seco.  tinciones  y  las  diferentes  pruebas  bioquímicas  deben realizarse en el momento oportuno.  ‐ El  material  de  vidrio  destinado  a  esterilización  debe  prepararse  previamente  (placas  de  Petri  envueltas  en  papel.  que  sirven  para  las  siembras  y/o  repiques.  deben flamearse nuevamente.  éstas  deben  flamearse  al  rojo  en  posición  vertical  bajo  la  acción  de  la  llama.‐ Zona de fusión: alcanza los 1500 ºC (Zona       que esteriliza por calor)    El asa se flamea en la zona 4. Antes de efectuar la siembra y/o repique debe esperarse algunos segundos  a que se enfríen.‐ Cono de reducción: poco oxígeno  3. hasta lograr la   Incandescencia.‐ Cono de oxidación: abundancia de oxígeno  4.).‐ Cono frío: no llega oxígeno  2.    14 .    Partes de la llama  1.   ‐ Las  observaciones  microscópicas.  etc. pudiendo enfriarse también en el borde de la placa de Petri que  contiene  el  medio  de  cultivo.  ‐ Las  placas  de  Petri  deben  abrirse  manteniéndolas  en  lo  posible  en  posición  vertical.

 deben dejarse en los  recipientes adecuados una vez terminado el laboratorio. placas de Petri.  m) Todos  los  materiales  de  desecho  como  trozos  de  papel.  h) Los  medios  inoculados  deben  colocarse  en  las  cámaras  de  cultivo  con  su  identificación respectiva.  g) Nunca deben sustraerse cultivos de microorganismos del laboratorio. identificación del manipulador.  15 .  f) Si se derrama un cultivo en el mesón o piso.  deberán  limpiarse antes y después de su uso. El salpicado se evita sosteniendo el hilo  alrededor de la llama antes de flamearlo. 1.  etc. naturaleza del espécimen. Los lentes deben limpiarse con papel especial  para lentes o un paño de batista.  c) Los  mesones  del  laboratorio  deben  limpiarse  antes  y  al  final  de cada  laboratorio  con un desinfectante apropiado.5 NORMAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO  a) Dejar la ropa innecesaria en los casilleros fuera del laboratorio y usar un delantal  (blanco).  deben  colocarse en los basureros adecuados y no en los mesones o suelo.  l) Todos los tubos. ej. etc. éstos deben guardarse y se debe estar seguro  que se les ha apagado al final de cada laboratorio.  i) Cuando no se utilizan los mecheros.  e) No  se  distraiga  conversando  mientras  trabaja.  k) Todos los reactivos y equipos deben dejarse en su lugar de origen al término de  cada laboratorio. sustrato del cual  se aísla. pipetas.: nombre.  b) Nunca deben llevarse a la boca lápices.  d) Las asas con los hilos de platino deben esterilizarse a la llama del mechero en toda  su extensión antes y después de su uso. portaobjetos.  algodón.  objetivos.. fecha.  como  también  otras  partes  del  microscopio. cubrir el área con un desinfectante y  notificar al Instructor. etiquetas o cualquier otro material..  así  evitará  quemarse  con  el  mechero o sufrir otros accidentes.  j) Oculares.

  Fe.  Estado de los medios de cultivo:  Los microorganismos pueden crecer en un medio sólido.  16 .  infusión  de  cerebro.  Composición de los medios de cultivo:  a) Medios sintéticos o químicamente de finidos: llevan fuente de carbono. nitrógeno o energía.  tales  como  derrame  de  reactivos. ser inocuo para la mayoría de los microorganismos y no ser utilizado como  fuente de carbono.  otros  elementos  como son estimuladores del crecimiento a concentraciones conocidas.    MEDIOS DE CULTIVO.  Ca…).  Mg. avise inmediatamente a su Instructor  indicándole el origen de la contaminación. El agar es un polisacárido ácido producido  por ciertas algas rojas y cuyas propiedades principalmente son.  peptona.7%.  Es  de  gran  utilidad  para  el  aislamiento de microorganismos a partir de una población mixta.  cortes  y  quemaduras. fuente  de  nitrógeno. antes de dejar el laboratorio.  sales  que  suplan  iones  (P. líquido o semi‐sólido.    EVITE ACCIDENTES TRABAJANDO ORDENADAMENTE Y CON PRECAUCION.  c) Medios  selectivos:  son  aquellos  que  favorecen  por  su  diseño  el  crecimiento  específico  de  un  microorganismo  en  particular. La  mayoría de los medios de sólidos llevan un agente solidificante llamado Agar en una  concentración de 1.  deben comunicarse inmediatamente al Instructor. solidificar por debajo  de los 45ºC. etc. Contienen nutrientes en abundancia  pero sin saber con  exactitud la composición cualitativa ni cuantitativa de estos nutrientes. Si en forma  accidental entra en contacto con este material.  o) Todos los estudiantes deberán lavarse las manos con jabón o con un desinfectante  si es necesario.5% y semi‐sólido 0.n) Accidentes  personales.  b) Medios  complejos  o  de  composición  indefinida:  estos  medios  llevan  ingredientes  como  extracto  de  levadura.  K.  extracto de carne.

  Ejemplo  agar  MacConkey  diferencia  bacterias  lactosa positivo de lactosa negativo.  El  medio  más  utilizado  es  el  glicerol al 100% estéril diluido en razón 1:1. ya que los cristales de agua  actúan  como  cuchillas  que  cortan  a  la  célula.   e) Medios de mantenimiento: suelen ser distintos a los de crecimiento óptimo ya  que  el  crecimiento  rápido  y  prolífico  suele  ocasionar  la  muerte  rápida  de  las  células.  17 .d) Medios  diferenciales:  son  aquellos  destinados  a  facilitar  la  discriminación  de  microorganismos  de  una  mezcla  por  sus  propiedades  diferenciales  de  crecimiento  en  dichos  medios.  f) Medios de criópreservación: deben proteger a las células del efecto lítico del  agua en el proceso de descongelamiento rápido.

 y va seguido de examen microscópico y pruebas bioquímicas  al  microorganismo  aislado.  Conocer distintos tipos de tinciones y la utilidad de éstas.  Conocer la utilidad de los medios de cultivo más usados.  Practicar diferentes tipos de siembra. 6.  la  segunda  actividad.  selectivos.  Adquirir la destreza para manipular materiales y cultivos bacterianos. en medios específicos y  en condiciones definidas. 2.  involucra  el  conocimiento  de  la  resistencia o sensibilidad a antibióticos. etc. biotipificación y serotipificación.TRABAJO PRÁCTICO Nº1  TÉCNICAS BÁSICAS DE MICROBIOLOGÍA    OBJETIVOS GENERALES    1.  Conocer el concepto de siembra y aislamiento de bacterias. 9. es imprescindible contar con un  cultivo  puro  que  debe  ser  mantenido  en  condiciones  de  laboratorio. y por último.  18 . en medios sólidos (diferenciales. 7.  para  esto  es  necesario e indispensable emplear material completamente estéril (Tabla Nº 1). 3. 5. se  inicia con el cultivo. Identificar material básico empleado durante la práctica bacteriológica. 8. la  tercera  actividad  involucra  la  identificación  epidemiológica  o  comparación  de  los  aislamientos de la misma especie con el fin de hacer el control de la infección o análisis  de población.  Practicar aislamiento bacteriano.      El  objetivo  principal  del  práctico  es  la  adquisición  de  conocimientos  básicos  en  lo  que  respecta  a  la  manipulación  de  cultivos  bacterianos. siembra en medios líquidos. aislamiento e identificación de microorganismos. de las muestras procedentes de alimentos.  Adquirir la destreza y el cuidado para trabajar en esterilidad.  Conocer los diferentes medios de cultivo.) y siembra en condiciones anaeróbicas. 4.  Esto  incluye  manejo  del  concepto de esterilidad.    Para  poder  mantener  las  bacterias  en  condiciones  de  laboratorio  se  utiliza  otro  procedimiento  importante  en  el  área  de  la  microbiología  que  es  la  siembra  o  cultivo.     Para poder realizar la primera de estas actividades.     El cumplimiento de las tareas en microbiología de alimentos exige la realización de  tres actividades: la primera de ellas.

  Obtener  una  cepa  bacteriana  aislada  significa.  condición  indispensable  para  poder  estudiar  sus  características  morfológicas y bioquímicas y lograr así su identificación correcta. una vez obtenido  el crecimiento bacteriano.  Generalmente  las  muestras  contienen  una  flora  mixta.  es  decir  que  todas  las  colonias  sean  similares.    Sólo  en  este  momento  se  puede  proceder  a  la  identificación  de  la  especie  bacteriana  mediante  el  traspaso  de  UNA  sola  colonia  a  una  batería  de  medios  de  identificación. 19 .  hasta  obtener  cultivos  puros.  se  debe  realizar  el  aislamiento de UNA colonia a otro medio de cultivo semejante o a medios selectivos.Esta consiste en colocar a los microorganismos en un ambiente adecuado para que se  desarrollen  y  multipliquen.  operación  que  debe  realizarse  en  forma aséptica.  presenten  la  misma morfología y microscópicamente correspondan a un solo tipo de bacteria.  obtener  un  cultivo  en  estado  de  pureza.    Si  en  la  placa  de  agar  ha  crecido  más  de  un  tipo  de  bacterias.  las  colonias  se  someterán  a  uno  o  más  re‐aislamientos.     En  el caso de los medios líquidos.  que  se  manifiesta  por  el  desarrollo  de  distintas  especies  bacterianas:  algunas  son  saprófitas  (flora  normal)  o  contaminantes del proceso de muestreo y otras son las que tienen un rol patógeno.  En  el  laboratorio  este  medio  ambiente  lo  constituyen  los  medios  de  cultivo  corrientes  o  básicos  y  especiales.    Colonia A Colonias A y B se encuentran mezcladas Colonia B Figura Nº 2: Aislamiento por estrías o en cuadrantes en placa de agar MacConkey.  por  lo  tanto.  Nota:  La  “asada”  es  el  volumen  que  se  encuentra  retenido  en  el  extremo  curvo  del  filamento del asa de platino. se  debe realizar un aislamiento de UNA gota o UNA asada del cultivo a un medio sólido  para obtener colonias aisladas y puras (Tabla Nº 2).    Si  fuese  necesario.

  Medios de Cultivo   2 Tubos con Agar Nutritivo tendido.   2 Tubos con Medio Líquido  Material   4 Tórulas estériles   Solución de Yodo   Solución de Cloro     Solución de Alcohol 70 %   1 Tubo con 3 mL de Suero Fisiológico      Cultivos Bacterianos por grupo   2 Cultivo en Placa Petri.    20 .   2 Cultivo Bacteriano en Medio Líquido.   6 Placas Petri con Agar Nutritivo.   2 Tubos con Agar Nutritivo.Material por grupo (2 personas  x grupo).

  Tabla Nº 1 : Material de uso común en el Laboratorio de Microbiología Esterilización Material Tipo esterilización Antes de ser utilizada Asa de platino Pipetas aforadas de vidrio* Pipetas aforadas de plástico Pipetas Pasteur de vidrio* Tubos estériles ** Tipo de material Después de ser utilizada Sí Sí No Si Si Si No Si Re-utilizable Re-utilizable Desechable Desechable Re-utilizable Re-utilizable Desechable Desechable Directo a la llama del mechero Directo a la llama del mechero Química Autoclave Autoclave Boca del tubo en la llama del Mechero Autoclave Autoclave Química Sí Sí No No Si Si No No Placas Petri de vidrio Puntas de Papel Absorbente Placas Petri de plástico * Este material se pueden encontrar en cilindros metálicos o envueltas en papel. 21 . ya estériles. se debe poner el cilindro en forma horizontal. en el segundo caso se debe desenvolver la pipeta. En el primer caso. destaparlo y sacar una pipeta sin tocar con los dedos las otras. ** Cada vez que se destape un tubo estéril. Este procedimiento pretende evitar la entrada de microorganismos del aire al interior del tubo. de manera de no tocar su extremo inferior. se debe flamear su boca y repetir la operación inmediatamente antes de volver a cerrarlo.

  1.1. Rotular  el  tubo  de  agar  con  los  datos  correspondientes  (Nombre  del  microorganismo.  e.  deslizar el asa con movimientos en zig‐zag ascendentes por la superficie del  medio de cultivo.  d. Desde placa Petri a tubo con Agar tendido:  a. enfriar el asa en las zonas del agar donde  no existan colonias. Grupo y Fecha). Después se deja enfriar al  lado del mechero.  Posteriormente.   Nota: Flamear el asa implica mantenerla en contacto con la llama del mechero  hasta que el filamento se vea completamente rojo. Destapar el tubo con agar tendido y flamear la boca del tubo.ACTIVIDADES PRÁCTICAS  1. Introducir  el  asa  hasta  el  fondo.  b. Flamear y tapar la boca del tubo. En la placa Petri con la muestra. Flamear el asa para su esterilización.  h.  g.  i.  f.  c.    22 .                      A B             C D     Figura Nº 1: Siembra desde agar en placa Petri a Tubo con agar tendido. De medios Sólidos a medios Sólidos.  en  un  sólo  movimiento. Flamear el asa para su esterilización. Incubar el tubo recién sembrado a la temperatura adecuada. Tomar  una  muestra  con  el  asa  desde  el  medio  sólido  con  la  bacteria  en  estudio (Con solo tocar la colonia estará tomando la cantidad de bacteria  suficiente para poder sembrar).

Enfriar el asa en las zonas del agar donde no existan colonias.De medios Sólidos a medios Líquidos. Tapar el tubo e incubar a la temperatura adecuada.  e. Desde placa Petri a tubo con medio de cultivo líquido:  a.  1. Grupo.                                                    A B C D 18 – 24 Hrs.  g.  d.  h. Rotular  el  tubo  de  caldo  con  los  datos  correspondientes  (Nombre  microorganismo.  c.  b. Introducir el asa dentro del tubo con caldo y agitar vigorosamente. Flamear el asa para su esterilización. Tomar  una  muestra  con  el  asa  desde  el  medio  sólido  con  la  bacteria  en  estudio (Con solo tocar la colonia estará tomando la cantidad de bacteria  suficiente para poder sembrar). Fecha).  f.2. Figura Nº 2: Siembra desde agar en placa Petri a Tubo con caldo de cultivo. 23 . Flamear la boca del tubo y el asa para su esterilización. Flamear la boca del tubo con medio líquido.

Destapar  el  tubo  que  contiene  el  cultivo  bacteriano.  g. enfriar el asa en las zonas del agar donde  no existan colonias. A  partir  del  sector  ya  sembrado  en  la  placa.) y iii.  i.1. Tomar la placa por su base y realizar la siembra mediante estrías.  d. para ello:  i. Posteriormente. Flamear el asa. Colocar la tapa de la placa sobre el mesón cerca del mechero.  h. Flamear el asa para su esterilización. Flamear el asa.) no tocar  las que ya se encuentran en la placa.  Flamear el asa. A partir de las últimas líneas realizadas.  deslizar  el  asa  hacia  el  sector  contrario  de  la  placa  nuevamente  en  forma  de  zig  –  zag.  iv.  f. 24 .  ii.  c.  flamear  la  boca  del  tubo e introducir el asa hasta el fondo. De medios Líquidos a medios Sólidos   2. Flamear y tapar la boca del tubo. Figura Nº 3: Siembra desde cultivo bacteriano líquido a agar en placa Petri. Repetir  el  procedimiento  descrito  en  iii.  e.)  hasta  completar  la  placa. deslizar el asa hacia el sector  contrario de la placa en forma de zig‐zag.      A D B C 18 – 24 Hrs. Rotular  la  placa  en  el  reverso  (por  donde  se  encuentra  el  agar)  con  los  datos correspondientes. En la placa Petri con la muestra.2.  Tener cuidado de que cuando se hacen las estrías en ii. Desde tubo con cultivo bacteriano líquido a placas de Petri:  a. Deslizar  el  asa  con  la  muestra  en  forma  de  zig  –  zag  en  un  pequeño  sector de la placa. agitar suavemente  el asa y retirarla.  iii. Incubar la placa a la temperatura adecuada.  b. Tapar la placa y flamear el asa para su esterilización.

  f.  g. e.  h. Rotular el tubo con los datos correspondientes.  Enfriar el asa en las paredes internas.  Tomar un inóculo del tubo problema. b.  picando el medio de cultivo al centro sin llegar al fondo del mismo. para ello:  i.  Flamear el asa para su esterilización.2. Flamear la boca del tubo y tápelo. d.  a.2.  ii. c. Flamear el asa para su esterilización.‐  Retirar el asa con precaución para producir el menor desgarro posible. Desde  tubo  con  cultivo  bacteriano  líquido  a  tubo  con  agar  (Por  picadura). Incubar el tubo sembrado a la temperatura adecuada.‐  Destapar el tubo estéril e introducir el asa cargada sin tocar las paredes.  Efectuar la siembra del tubo problema al tubo estéril.          B   A                       D   C                            Figura Nº 4: Siembra desde cultivo bacteriano líquido a Tubo con agar       25 .

Introduzca  el  asa  hasta  el  fondo.  b.  Posteriormente.  c.  Rotular el tubo con los datos correspondientes.  e.  g.  deslizar el asa con movimientos en zig‐zag ascendentes por la superficie del  medio de cultivo.  i. Tome un inóculo del tubo problema.  h.  d. Flamear el asa para su esterilización. Incubar el tubo recién sembrado a la temperatura adecuada. Enfriar el asa en las paredes internas o en el líquido de condensación. Flamear y tapar la boca del tubo.    A B C D Figura Nº 5: Siembra desde cultivo bacteriano líquido a tubo con agar tendido.3.  a. Desde  tubo  con  cultivo  bacteriano  líquido  a  tubo  con  agar  (Zig  –  Zag  superficie).  f. Flamear el asa para su esterilización. 26 .  en  un  sólo  movimiento. Destapar el tubo con agar tendido y flamear la boca del tubo.

4. Desde medios Líquidos a medios Líquidos.  4.1. Desde  tubo  con  cultivo  bacteriano  líquido  a  tubo  con  medio  de  cultivo líquido.  
 

a. b. c. d. e.

Rotular el tubo con los datos correspondientes.  Homogenizar el tubo problema por agitación.  Flamear el asa para su esterilización.  Enfriar el asa en las paredes internas del tubo.  Tomar un inóculo del tubo problema procurando que quede una película en  el asa.  f. Destapar  el  tubo  estéril  e  introducir  el  asa  cargada  sin  tocar  las  paredes,  agitar en el medio de cultivo y retirar con cuidado.  g. Flamear la boca del tubo y tápelo.  h. Flamear el asa para su esterilización.  i. Incubar el tubo sembrado a la temperatura adecuada. 

     
                                           

A

B

C

18 - 24 hrs.

Figura Nº 6: Siembra desde cultivo bacteriano líquido a tubo con medio de cultivo.

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  Tabla Nº2: Cuadro Resumen Actividad Técnicas de Siembra.  Desde Medio Tipo  A Medio Tipo  Toma de muestra desde  Siembra en  Tubo con Agar Tendido  Sólido  Sólido  Líquido  Placa Petri  Placa Petri  Tubo con Agar  Tubo con Medio de cultivo  Placa Petri  Sólido  Líquido  Tubo con Agar Tendido  Líquido  Tubo con cultivo líquido  Tubo con Medio de cultivo  Zig‐Zag superficie  Agitación con asa  Tubo con cultivo líquido  Tubo con Agar  Pinchadura  Agitación con asa  En cuadrantes  Pinchadura  Tipo Siembra  Zig‐Zag superficie 

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5. Técnicas de Esterilización  5.1. Flameado 
a. b. c. d. e.   Dividir una placa por la mitad.  Tomar un asa y abrir una placa de agar nutritivo y deslizarla suavemente  por una mitad del agar. Cerrar la placa.   Flamear  el  asa  para  su  esterilización,  enfríela  en  la  tapa  y  deslícela  suavemente por la otra mitad del agar.   Cerrar la placa.  Incubar la placa a 37ºC. 

6. Desinfección y Asepsia   
a. b. c. d.   Tomar una tórula y deslizarla rápidamente por un sector dentro o fuera  del laboratorio de amplia exposición   Pasarla suavemente sobre una mitad del agar nutritivo de una placa.  Humedecer  la  misma  tórula  con  la  solución  de  cloro  y  deslizarla  por  la  otra mitad de la placa.  Incubar la placa a 37ºC. 

7. Yodo 
a. Dividir  una  placa  en  dos,  por  una  mitad  deslizar  suavemente  uno  de  sus  dedos por el agar.  b. Tome  un  trozo  de  algodón  con  yodo  y  aplíquelo  en  el  dedo  que  utilizó,  espere unos segundos.  c. Pasar el dedo suavemente por la otra mitad de la placa.  d. Incubar la placa a 37ºC.   

8. Alcohol 
a. Repita los pasos realizados para la actividad del cloro.  b. Escoja otro lugar del laboratorio de amplia exposición.  c. Incubar la placa a 37ºC.   

Análisis Macroscópico 
    Una etapa importante y básica en el estudio de las características de una bacteria,  es  la  observación  de  su  morfología.  Como  consecuencia  del  pequeño  tamaño  que  presentan  no  es  posible  distinguirlas  a  simple  vista  y,  debido  a  esto  es  que  tenemos  que  estudiar  poblaciones  bacterianas,  llamadas  colonias.  Para  obtener  estas  colonias  es necesario proporcionarles a las bacterias los requerimientos necesarios de materia  orgánica,  iones  inorgánicos  y  factores  de  crecimientos  entre  otros  a  través  de  un  medio de cultivo. Cada colonia corresponde en su origen a una sola bacteria que se  ha  multiplicado  y  desarrollado  en  un  medio  de  cultivo  sólido,  hasta  formar  una  29

 según su  forma.  frecuentemente  utilizadas  para  la  descripción  de  una  bacteria  o  microorganismo.    Cabe  destacar  que  la  morfología  macroscópica  de  las  colonias  (análisis  macroscópico)  permite  un  acercamiento  en  la  identificación  de  los  géneros  bacterianos que poseen características propias de desarrollo de sus colonias.  Esto  datos  proporcionan  una  orientación  sobre  las  pruebas  bioquímicas  para  la  identificación definitiva de las colonias. una  colonia bacteriana puede ser circular pero su borde o margen puede ser lobulado. sedimento y otras  características. no da origen a la formación de  colonias. Por ejemplo.  El “margen” en cambio.    El crecimiento de las bacterias en medios líquidos. elevación.  En  la  figura  Nº  1  se  observan  algunas  características  macroscópicas  de  colonias  bacterianas. color y hemólisis (en agar sangre). margen. coloque la placa de forma horizontal frente a sus ojos y  observe la colonia. La forma que adquiere por sobre el horizonte del agar es lo que se  considera como “elevación”. superficie. brillo.  Muchas  especies  bacterianas  presentan  colonias  que  son  muy  parecidas  lo  que  hace imposible diferenciarlas solo con la observación macroscópica de estas por lo que  se hace necesario además una observación microscópica de las células que conforman  estas colonias.  Por  lo  tanto  una  colonia  está  formada por millones de bacterias.                30 . corresponde al perímetro de la colonia. El desarrollo se evidencia mediante la turbidez del caldo.  Para observar la elevación.población  que  se  represente  como  una  colonia  visible.

                    Figura Nº 1: Criterios macroscópicos para la descripción de una colonia bacteriana. 31 .

APUNTES    32 .

APUNTES  33 .

  Como  consecuencia  del  pequeño  tamaño  que  presentan  no  es  posible  distinguirlas  a  simple  vista  y.  lo  que  hace imposible diferenciarlas solo con la observación macroscópica de estas por lo que  se hace necesario además una observación microscópica de las células que conforman  estas colonias. color y hemólisis (en agar sangre). según su  forma.  Para  obtener  estas  colonias  es  necesario  proporcionar  a  las  bacterias  los  requerimientos  necesarios  de  materia  orgánica.    El crecimiento de las bacterias en medios líquidos no da origen a la formación de  colonias.  Estos  datos  proporcionan  una  orientación  sobre  las  pruebas  bioquímicas  para  la  identificación definitiva de las colonias. elevación.  Muchas  especies  bacterianas  presentan  colonias  que  son  muy  parecidas.TRABAJO PRÁCTICO Nº 2:  MORFOLOGÍA BACTERIANA  EXAMEN MACROSCÓPICO Y MICROSCÓPICO  TINCIONES    Una etapa importante y básica en el estudio de las características de una bacteria.  34 .  sedimento y otras características.  debido  a  esto  es  que  tenemos  que  estudiar  poblaciones  bacterianas.  En  la  figura  Nº  1  se  observan  algunas  características  macroscópicas  de  colonias  bacterianas. entre otros.  llamadas  colonias.  El  crecimiento  en  este  medio  se  evidencia  mediante  la  turbidez  del  caldo. iones inorgánicos y factores de crecimiento.  frecuentemente  utilizadas  para  la  descripción  de  una  bacteria  o  microorganismo.  hasta  formar  una  población  que  se  representa  como  una  colonia  visible. mediante un medio  de cultivo.  es  la  observación  de  su  morfología. margen.  Por  lo  tanto  una  colonia  esta  formada por millones de bacterias.    Cabe  destacar  que  la  morfología  macroscópica  de  las  colonias  (análisis  macroscópico)  permite  un  acercamiento  en  la  identificación  de  los  géneros  bacterianos que poseen características propias de desarrollo de sus colonias. Cada colonia corresponde en su origen a una sola célula bacteriana que se  ha  multiplicado  y  desarrollado  en  un  medio  de  cultivo  sólido. brillo. superficie.

  c. Esta diferencia puede ser usada  para crear una imagen con mucho mayor contraste que la que se obtiene en el  microscopio de campo claro.  b.  o  de  ultra.  presencia  o  ausencia  de  estructuras  (cápsulas.    35 . de las cuales en el laboratorio son fáciles de realizar las siguientes:  1.  a. Observación  de  bacterias  vivas:  Para  observar las  bacterias  vivas. movilidad. flagelos).  Se  basa  en  utilizar  y  aumentar  la  pequeña  diferencia  de  índice  de  refracción  que  existe  entre las células y el medio que las circunda. además para aumentar el  contraste se insertan filtros verdes o azules. En fresco: Este método de examen permite observar el microorganismo al  estado  vivo  y  evita  las  deformaciones  artificiales  de  su  morfología  que  producen  las  técnicas  de  coloración.  luego  se  procede  a  la  observación  microscópica. Este microscopio usa un lente objetivo especial y  en el condensador se inserta un diafragma especial.  Se emplea  para  la  observación  de  bacterias  muy  pequeñas  o  de  aquellas  que  difícilmente  se  observan  al  microscopio  de  campo  claro  por  su  falta  de  contraste con el medio.  Su  aplicación  más  importante  se  refiere al estudio de la movilidad de los microorganismos. etc.  sin  teñir.  La  observación  al  microscopio  de  las  bacterias  nos  permite  conocer  una  serie  de  características complementarias a la morfología de colonia entre las que encontramos:  forma.  incidiendo  los  rayos  luminosos  directamente  sobre  los  microorganismos sin penetrar en  el objetivo del microscopio.  esporas.  Se  ilumina  la  preparación  en  forma  oblicua. Para la observación se sustituye el condensador de Abbé por el  condensador  de  fondo  oscuro.  disposición  o  agrupación.  Este  tipo  de  microscopio  se  desarrolló  para  hacer  posible  observar  células  pequeñas  sin  teñir. Gota colgante: Consiste en suspender el microorganismo a observar en un  líquido y depositar una gota de la suspensión sobre un cubreobjeto el cual  se  coloca  sobre  un  portaobjeto.    Existen  numerosas  técnicas  para  la  observación  microscópica  de  los  microorganismos.  de  reflexión  luminosa. se  utiliza  el  microscopio  de  fase  contrastada. Con  fondo  oscuro:  Se  basa  en  el  fenómeno  de  Tyndall.

 flagelo.  el  estudio  macro  y  microscópico  de  una  muestra  bacteriana  permite  obtener una orientación preliminar de su identidad y dirige a el desarrollo de pruebas  bioquímicas especificas que permitan una identificación más certera y precisa. Por este motivo las esporas se tiñen en caliente. producen endosporas  como  una  forma  de  resistencia  a  condiciones  ambientales  adversas. Tinción negativa.  observándose  como  entidades  claras  sobre  un  fondo oscuro. Se tiñe el fondo mientras que las células permanecen sin  teñir  (transparentes).  Las  endosporas    o  esporas  se  caracterizan  por  ser  altamente  resistentes  al  calor.  por  ejemplo  sequedad  o  falta  de  nutrientes. esporas. tanto en su  estructura  física  como  en  su  composición  química. Las bacterias son diferentes entre sí. Tinciones  especiales. Ejemplo de este tipo de tinción es la tinción de cápsula en  la que se usa tinta china.  de  modo  que  reaccionan en forma diferente frente a los colorantes. Tinciones simples.  Entonces. etc.  a  las  radiaciones  y  a  la  desecación. Observación de bacterias muertas:  a.  Son  de  poco  uso  en  bacteriología.    Otras estructuras bacterianas que también pueden ser diferenciadas por métodos  de tinción son las esporas y la cápsula  a. Estas tinciones se  utilizan  para  diferenciar  los  distintos  grupos  de  bacterias. Tinciones diferenciales.  lo  que  también  las  hace  resistentes a tinción.  Algunos géneros bacterianos como Bacillus y Clostridium. Se utiliza un sólo colorante para revelar la presencia de  microorganismos  y  su  forma  en  general.  b.  d.2. La resistencia de la espora se debe a la estructura proteica (rica en  aminoácidos  azufrados)  de  sus  capas  externas.  36 .  Otra  muy  utilizada  es  la  tinción  ácido  resistente  o  tinción  de  Ziehl‐ Neelsen. Observación  de  esporas:  Esta  tinción  es  un  ejemplo  de  una  tinción  especial.  Se  utilizan  para  observar  alguna  estructura  en  particular como nucleoide.  La  tinción  de  Gram  es  la  tinción  diferencial  más  importante  usada  en  bacteriología.   c.  b. Observación  cápsula:  se  trata  de  una  tinción  negativa  usando  tinta  china  que  permite determinar la presencia de cápsulas polisacarídicas.

   4.OBJETIVOS  1.  2. En  la  siguiente  sesión  de  trabajo  práctico  observe  y  describa  las  colonias  desarrolladas  en  los  distintos  medios. color y brillo). Comparar colonias bacterianas desarrolladas en distintos medios de cultivo sólido  (Placas de Agar). tinción de  cápsula y esporas. Siembre la siguiente batería de placas como lo indica la tabla y deje incubando. Practicar tinciones diferenciales de frotis bacterianos: tinción de Gram.  considerando  los  aspectos  anteriormente  mencionados. características físicas (textura.  5.    ACTIVIDADES PRÁCTICAS    OBSERVACIONES MACROSCÓPICAS    1.  Considere  los  siguientes  aspectos:  forma. Observar la presencia de cápsula en Klebsiella spp.  Gram Positivo  +  +  +  Gram Negativo  +  +  +  37 .  Describa  las  colonias  desarrolladas  en  los  medios  de  cultivo  entregados  por  el  profesor  de  Laboratorio.  borde. superficie.  elevación.  3.  2. Describir colonias de acuerdo a criterios macroscópicos. Observar endosporas y su disposición en formas vegetativas de Bacillus spp.    Agar Corriente  Agar Sangre  Agar MacConkey    3.

Esta  tinción  se  realiza  en  caliente:  para  ello  con  unas  pinzas  de  madera  debe  colocar la muestra encima de la llama del mechero hasta observar emisión de  vapor durante 5 min.  safranina. Posteriormente  durante  2  min.  de  manera  que  cubra  el  frotis  con bacteria. Corte  papel  absorbente  en  forma  rectangular. Lave con agua de tal manera que escurra suavemente todo el colorante verde  de malaquita. Debe fijarse que el colorante tiene que atravesar  las 4 capas de papel y ponerse en contacto con el frotis bacteriano. Debe repetir 4 veces este proceso.OBSERVACIONES MICROSCÓPICAS  1.  d.    NOTA:    Las bacterias se observan rosadas mientras que las esporas (de menor tamaño  que las bacterias) son pequeñas esferas verdes.   g. Tinción de Esporas (Demostrativa). Ponga  4  capas  de  papel  sobre  el  frotis  y. No sobrecaliente para evitar que se queme su muestra o  se rompa el portaobjeto. Seque cuidadosamente con papel absorbente y observe con inmersión.  cubra  el  frotis  con  el  colorante  de  contraste. No la deje contaminada sobre el  mesón.  h..  con  el  asa  hasta  que  sea  del  tamaño de una arveja y fije en el mechero hasta que se seque completamente  (sin hervir).  j. Una vez que se detenga la emisión de vapor desde la muestra.  e.  k. Lave con agua.  a  continuación  agregue  solución  colorante verde de malaquita.  b.  38 . Coloque  una  gota  de  cultivo  de  Bacillus  spp.  i.  Procedimiento :  a. No olvide esterilizar el asa después de usarla.  c. hay que reponer  el colorante nuevamente.  f. Limpie una lámina portaobjeto con alcohol y seque cuidadosamente con papel  absorbente.

  si la espora deforma o no al bacilo.  A B C D Papel absorbente Verde malaquita F G E Safranin  Una  vez  observada  la  muestra  deseche  la  lámina  en  los  frascos  con  DESINFECTANTE ubicados en cada mesón.          39 . En estas últimas es  posible determinar si se encuentran al centro o hacia un extremo de la célula y. Es posible observar esporas libres y esporas intracelulares.

Esterilice el asa y tome parte del cultivo de la bacteria Klebsiella spp.  e. En  una  esquina  de  la  lámina  portaobjeto  coloque  una  gota  de  tinta  china  del  tamaño de una arveja. por lo mismo es necesario mezclar con suficiente cultivo.  h. esterilice el asa y repita 3 o 4 veces (sólo  agregar la bacteria). Lave con agua.  Procedimiento:  a. Fije suavemente en el mechero. La tinta china impide ver si la solución tiene o no suficiente  bacteria. seque con papel absorbente y observe con inmersión. No ensucie su cultivo bacteriano con tinta china.  d. Realice  un  frotis  extendiendo  la  suspensión  de  manera  que  quede  una  capa  delgada.  b.  c. Ver Figura.  f. Limpie una lámina portaobjeto con alcohol y seque cuidadosamente con papel  absorbente.   i. Mezcle la tinta china con la bacteria. Tinción de Cápsula (Demostrativa).  g. esparciendo la mezcla a lo  largo del portaobjeto que contiene la mezcla tinta china‐bacteria. Esto se realiza tomando un cubreobjeto y.  40 . asegúrese de esterilizar el asa  previamente y de enfriar ésta en las paredes del tubo.2. fucsina. Durante 2 min cubra completamente con colorante de contraste.

A B D C     E Fucsina F Bacterias Cápsula   41 .

   Generalmente.  Sólo  10%  ‐  20%  de  la  pared  de  la  célula Gram‐negativo es peptidoglicano.  causando  la  decoloración. Tinción de Gram. el 80%‐90% de la pared de las células Gram‐positivo es peptidoglicano.  poseen  una  pared  celular  con  mayor  contenido de peptidoglicano y menor contenido lipídico.  siendo  incapaz  de  retener  el  de  complejo  cristal  violeta‐yodo.  Por otro lado.  mientras  que  los  Gram‐negativos  si  se  decoloran.  La decoloración se lleva a cabo usando una mezcla de alcohol‐acetona. siendo menos permeables a  42 .  y  lipoproteínas.  La  diferencia  se  debe  probablemente  a  que  en  bacterias  Gram‐negativo. La pared de las Gram‐positivo es gruesa y consiste en  varias capas interconectandas de peptidoglicano así como algo de ácido teicoico.  la  mezcla  alcohol/acetona  disuelve  la  membrana  externa  de  la  pared  celular  (y  también  puede  dañar  la  membrana  citoplásmica  a  la  que  se  une  peptidoglicano). primero con una solución de  cristal violeta (otros colorantes básicos no son tan efectivos) y son lavadas para quitar  el exceso de colorante. contiene una capa mucho  más delgada de peptidoglicano y está rodeada por una membrana exterior compuesta  de  fosfolípidos.3.  Las  células  Gram‐positivo.  lipopolisacáridos. En esta etapa los organismos Gram‐ positivos  no  se  decoloran.  Fundamento  Las  bacterias  Gram‐positivo  y  Gram‐negativo  se  tiñen  de  forma  distinta  debido  a  diferencias en su pared celular.  Debido  a  su  importancia  en  taxonomía  bacteriana  y  a  que  indica  diferencias  fundamentales  de  la  pared  celular  de  las  distintas  bacterias.  El  portaobjetos  se  cubre  entonces  con  una  solución  de  yodo‐yoduro  potásico.  describiremos  aquí  con  algún detalle la tinción de Gram y las interpretaciones que actualmente se hacen sobre  el por qué de su funcionamiento.  a  diferencia  de  las  anteriores. la pared celular de bacterias Gram‐negativo. sustancias en  las que se solubiliza el complejo I2‐cristal violeta. El I2  entra  en las células  y forma  un complejo insoluble en  agua  con el cristal violeta. están teñidas de azul. De nuevo  tanto  las  células  Gram‐positivo  como  las  Gram‐negativo  se  encuentran  en  la  misma  situación. el KI simplemente hace soluble el I2  en agua.  Las células fijadas al calor sobre un portaobjetos se tiñen. tanto las Gram‐positivo como  las Gram‐negativo. En este estado. todas las células.  El  ingrediente activo es aquí el I2.

  como  la  safranina  o  la  fucsina  básica. pero las Gram‐negativo son incoloras.  Habitualmente  es  un  colorante  de  color  rojo.  atrapando  el  complejo  I2‐cristal  violeta dentro de la pared celular. Fijar el frotis exponiéndolo a la llama del mechero hasta que se seque.5 cm de  diámetro).  e. Dejar con lugol por  2 min.  d. Tome un inóculo del tubo problema procurando que quede una película en el  asa. Enfriar el asa en un sector del agar donde no existan colonias. Verificar.la mezcla alcohol/acetona.  mientras  que las Gram‐positivo permanecen azules.  Después  de  la  coloración  de  contraste  las  células  Gram‐negativo  son  rojas.    Preparación frotis bacteriano a partir de colonia.  f. Dejar escurrir el cristal violeta y agregar sobre la muestra una solución de lugol. Esto causa la deshidratación de la célula y el cierre de los  poros  disminuyendo  el  espacio  entre  las  moléculas. Enfríe el asa en las paredes internas del tubo.    Preparación frotis bacteriano a partir de caldo de cultivo.  d. Después de la decoloración las células Gram‐positivo  son todavía azules.  c.  b. Colocar con el asa una gota de agua en el centro de la lámina (aprox. Fijar el frotis exponiéndolo a la llama del mechero hasta que se seque. Obtener una pequeña muestra desde la placa. Mezclar la muestra con la gota de agua y esparcirla por la superficie del  portaobjeto. Cubrir el frotis completamente con cristal violeta y dejar en reposo por 3 min.    Tinción frotis   a. con el dorso de la mano.  d.  43 . 0.  c.  b.  b.  c.  Para poder visualizar a las células Gram‐negativo se utiliza una coloración de contraste.  a. que el vidrio no esté demasiado caliente. Flamear el asa para su esterilización. Esparcir la gota por la superficie del portaobjeto. Flamear el asa para su esterilización.  e.  a.

  g. Lavar con agua dejando escurrir suavemente. Observar en el microscopio óptico con inmersión.  44 . (es importante no sobrepasar  este tiempo ya que la decoloración excesiva puede alterar los resultados de la  tinción). Safranina al 1%. por 1 min. hasta eliminar el exceso  de cristal violeta. Cubrir con colorante de contraste. dejar escurrir y secar suavemente con papel absorbente. anotar y dibujar lo que observe. Lavar el lugol con alcohol‐acetona por 15‐20 seg.  h.  f.        Gram  Positivo  Negativo  Cocos  Morfología  Bacilos  Bacilos curvos  Cocobacilos  Individual  Agrupación  Cadena  Racimo  Tétrada    Utilizar el microscopio. Lavar con agua.e.

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APUNTES  46 .

  Innumerables bacterias son filtradas a medida que el aire que los transporta pasa a  través  de  la  nasofaringe.  la  médula  ósea  y  las  vías  aéreas  inferiores  (bronquios y alvéolos).  S.  La  flora  transitoria  de  la  piel  se  encuentra  representada  principalmente  por  bacterias Gram positivo.   La  sangre.  intestinos.  S.  faecalis.  aun  en  las  personas más sanas.  pneumoniae.  Pseudomonas  aeruginosa.  Proteus  mirabilis.  S.  lactobacilos.  oídos.  Streptococcus  mitis.  el  líquido  cefalorraquídeo. carecen de microorganismos debido a los  mecanismos  de  defensa  que  presentan. los senos  nasales.  la  tráquea  y  los  bronquios.  en  el  organismo  humano  hay  lugares  que  normalmente se mantienen estériles y otros donde cohabitan.  faringe.  Haemophilus  influenzae. entre muchos otros.  piel. Así. bronquios y pulmones. Staphylococcus aureus y del  género Neisseria.  bacteroides.  nariz  o  conjuntivas  residen  diversos  microorganismos  que  conforman  la  flora  normal  del  ser  humano.  coli.  Pero  en  la  boca.  bacterias  coliformes  como  E.  la  mayoría  de  estos  microorganismos son atrapados en la secreciones mucosas y deglutidos.  S.  La  nasofaringe es el hábitat natural de bacterias y virus patógenos comunes que causan  infecciones en la nariz.  son:  Staphylococcus  epidermidis.  Algunos  de  los  microorganismos  más  frecuentemente  encontrados en los cultivos de las diferentes regiones del cuerpo y que se consideran  integrantes  de  la  flora  normal.  la  tráquea. además de flora fúngica como Candida albicans. la cual se considera  patógena siempre que se aísla en la piel (Tabla Nº1).  S.TRABAJO PRÁCTICO Nº 3:  FLORA NORMAL Y FISIOTAXONOMÍA DE BACTERIAS   GRAM POSITIVO Como  en  la  mayoría  de  los  animales.  vagina.  pyogenes.  espiroquetas. garganta.  salivarius.  los  bronquios  y  los  pulmones  son  habitualmente  estériles.  mutans.  aureus.  47 .  una  gran  diversidad  y  una  cantidad  sorprendente  de  microorganismos. también normalmente.  clostridios  como  Clostridium tetani. como Streptococcus del grupo A.  S.  Algunas  personas  se  convierten  en  portadores  nasales  de  estreptococos  y  estafilococos y descargan estos microorganismos en grandes cantidades desde la nariz  hacia el aire.

     Es  en  estos  casos  que  el  diagnóstico  de  los  organismos  responsables  es  de  suma  importancia  para  poder  elaborar  tratamientos  adecuados.  . Formación de productos finales o intermediarios del metabolismo microbiano:  Indol. Observación directa al microscopio  b. Acido sulfhídrico (H2S). Utilización de fuentes de carbono:   Glucosa.  48 Lactosa.  Sacarosa. Acetilmetilcarbinol. Los cultivos permiten observar la morfología de las colonias  bacterianas en un medio determinado. etc. Estudios de sensibilidad a agentes antimicrobianos      La observación directa de la muestra teñida con  Gram entrega información sobre  su contenido bacteriano.  Estas  manifestaciones  han  permitido  establecer  diferencias  entre  ellas. Citrato. Identificación fisiotaxonómica (batería bioquímica)  d.  las  que  han  sido  utilizadas  en  su  clasificación en diferentes géneros y especies. Cultivo  c.  Las  bacterias  con  las  que  convivimos  diariamente  pueden  representar  un  riesgo  para nuestra salud cuando el ecosistema en el cual conviven simbióticamente cuerpo  humano‐bacteria se ve afectado.  b.    La fisiología bacteriana estudia el comportamiento de las bacterias vivas a través de  las  alteraciones  que  producen  en  el  medio  de  cultivo.    Las  técnicas  de  identificación  bioquímica  de  las  bacterias  diferencian  géneros  y  especies bacterianas en base a la detección de:  a.  Por  este  motivo.  Sorbitol. por lo general sigue la siguiente secuencia:    a. ya sea por alteración del ecosistema bacteriano o por  factores del huésped que favorecen la disminución de la inmunidad (defensas) y que  permiten que las bacterias normales invadan y ataquen a su huésped humano.      El análisis microbiológico de una muestra.  Manitol.  el  Laboratorio  de  Microbiología  cumple  un  rol  fundamental  en  la  identificación  de  bacterias en una muestra determinada. Ambos estudios orientativos se complementan  con  análisis  de  identificación  como  baterías  bioquímicas  y  de  sensibilidad  a  agentes  antimicrobianos. CO2.

       En  este  trabajo  se  analizaran  dos  de  las  Familias  de  Bacterias  Gram  positivo  más  importantes.    49 .c. etc.  d. Ureasa. como son las Micrococcaceae y Streptococcaceae.  para  cocáceas  Gram  positivo  se  utilizan  fundamentalmente  los  dos  últimos métodos.  Optoquína. Novobiocina. Sensibilidad  a  algunas  compuestos  químicos  o  antibióticos:  Bacitracina. etc. Presencia de enzimas: Catalasa.  Estos test se pueden realizar mediante  baterías en tubos convencionales o mediante  sistemas comerciales más fáciles de manipular (API). Oxidasa. en cambio para bacilos Gram negativo se emplean los tres primeros.    En  general. Coagulasa.

Coagulasa negativo No saprophyticus R Staphylococcus saprophyticus Streptococcus grupo viridans Streptococcus pneumoniae Optoquina resistente Hemólisis Alfa Observar Hemólisis Hemólisis Beta Test de Latex Optoquina sensible Hemólisis Gamma Bilis Esculina NaCl 6. C. D. G Enterococcus 50 .5 % Enterococcus Listeria Bacilo en empalizada Corynebacterium sp Bilis positivo NaCl positivo Bacilos Grandes Esporulados Bordes netos Bacillus sp Bacilos finos Negativo Streptococcus Bacilos Catalasa positivo Aspecto Tinción Gram (+) Staphylococcus aureus Streptococcus Grupo A. F.  TABLA DE IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS GRAM POSITIVO Cocaceas Catalasa Positivo Test de Bacitracina R Test de Coagulasa S Micrococcus (-) Staphylococcus Coagulasa negativo Test de Novobiocina S S. B.

   Staphylococcus aureus es patógeno para el hombre. esféricas (cocos) agrupadas en racimo.  Las  principales  especies  del  género  Staphylococcus  son:  Staphylococcus  aureus  y  Staphylococcus epidermidis.   Otra  característica  que  diferencia  ambos  géneros. Son  catalasa positivos. reacción que se usa para diferenciar la Familia Micrococcaceae de  otros cocos Gram positivos como por ejemplo Streptococcus.  en  el  suelo  y  el  agua. Staphylococcus y  Planococcus.  es  la  propiedad  de  Staphylococcus  de  fermentar  glucosa  en  anaerobiosis. se encuentran habitualmente  en  la  piel  de  mamíferos.La Familia Micrococcaceae comprende los géneros Micrococcus.      51 .  a  diferencia  de  las  especies  del  género  Staphylococcus  que  son  aerobios  anaerobios facultativos.  no  así  los  Micrococcus  que  no  tienen esta propiedad.  Tienen  metabolismo  estrictamente  aerobio. algunos de estos se describen en las Tablas  Nº 1 y 2. Produce una variedad de  factores responsables de su patogenicidad. Son bacterias Gram positivo.                              Figura Nº 1: Agrupación de algunas cocáceas Gram Positivo Las especies del género Micrococcus son saprófitas.

 se utilizan:  a.  * También es conocida como toxina de Panton ‐ Valentine. AGAR SANGRE.  Coagulan el plasma y. aureus   : produce halos de hemólisis completa alrededor de las colonias. la que causa el síndrome de piel  quemada.  producida por la alfa toxina.  Las toxinas producidas por Staphylococcus aureus son causantes de los síntomas de las  enfermedades estafilocócicas. aureus en muestras CLÍNICAS como pus. heridas.  Algunas cepas producen esta toxina. epidermidis  : no produce hemólisis o lo hace débilmente.  Toxinas  Alfa toxina  Leucocidina*  Exfoliatina  Enterotoxinas  Acción en la célula blanco  Es una hemolisina que produce lisis total de los glóbulos rojos.  S.  Causa degranulación de los leucocitos y macrófagos.Tabla Nº 1: Algunas enzimas producidos por Staphylococcus aureus.  Acción en la célula blanco  Rompe el cemento celular facilitando la invasión de los  tejidos por las bacterias. se pueden encontrar secretadas al  medio extracelular y otras que están unidas a membranas.  Hidrolizan DNA.    Aislamiento y Caracterización:    El  medio  de  cultivo  utilizado  para  el  aislamiento  de  S.  S.  Permite  el  desarrollo  abundante  de  las  especies  de  Staphylococcus y además permite visualizar la producción de hemolisinas por lisis  de los glóbulos rojos alrededor de las colonias.  52 .  aureus  dependerá  si  la  muestra es un alimento o si es una muestra clínica. Es una  proteína antigénica de peso molecular 30.  etc.  Enzimas  Hialuronidasa  Fibrinolisina  Coagulasa  Nucleasas    Tabla Nº 2: Algunas toxinas producidos por Staphylococcus aureus.  Éste es un medio enriquecido que contiene sangre defibrinada de  cordero  o  de  conejo. secreciones.   Para el aislamiento de S.  Disgrega coágulos de fibrina.  Algunas cepas producen estas toxinas que causan intoxicaciones  alimentarías.000 D.

   S. Esta técnica detecta la coagulasa libre.  se  hace  una  suspensión  abundante  sobre  una  gota  de  agua. ya que otras  especies  pueden  dar  colonias  semejantes.  es  decir.  Una vez aisladas las colonias y habiendo observado su aspecto y características en  medios  selectivos  se  realizan  las  pruebas  bioquímicas.      En  los  dos  medios  (Agar  Sangre  y  Agar  Manitol  Salado)  se  debe  confirmar  mediante tinción de Gram la presencia de cocos Gram positivo en racimo.  Esta  53 . la que se observa por el viraje del indicador a amarillo.Micrococcus                : no produce hemólisis.  Es  un  medio  selectivo  que  contiene  manitol.  En  este  medio  además  se  evidencia  la  fermentación  de  manitol. Esta es  una prueba de PATOGENICIDAD.5%  y  el  indicador  de  pH  rojo  de  fenol.  b) Técnica  en  portaobjeto:  a  partir  de  un  cultivo  de  Staphylococcus  en  medio  sólido.  Una  vez  confirmada  la  presencia  de  cocos  Gram  positivo  en  racimo  se  realizan  pruebas  bioquímicas  para  confirmar  el  diagnóstico.  Figura Nº 2: Tipos de hemólisis b) AGAR  MANITOL  SALADO  O  MEDIO  DE  CHAPMAN.  son  capaces  de  crecer  en  esta  concentración  de  NaCl. epidermidis  :  generalmente no fermenta el manitol  Micrococcus   :  no fermenta el manitol.  NaCl  al  7. la cual se puede realizar de dos formas:  a) Técnica  en  tubo:  consiste  en  incubar  plasma  de  conejo  con  gotas  de  cultivo  líquido de Staphylococcus. aureus  :  da  colonias  amarillas  cremosas  rodeadas  de  una  zona  amarilla  (producto de la fermentación)  S. se realiza la prueba de la COAGULASA.  Si  se  sospecha  que  la  colonia  corresponde a Staphylococcus aureus.  Micrococcus  y  Staphylococcus  son  halotolerantes. La reacción positiva se observa como la aparición de  un coágulo a las 4 horas.

 Sobre ésta se coloca una o dos  gotas  de  plasma  de  conejo  y  se  homogeniza. 54 .  Bacterias  Aglutinación de las partículas  Figura  N°  3:  Fundamento  del  test  de  látex  para  identificación  de  Gram  positivos.  Partículas de  latex con  anticuerpos    Anticuerpo (Antígeno específico)  =       reconocen el antígeno bacteriano.  La  reacción  positiva  se  observa  como  aglutinación  de  las  bacterias  a  los  20  segundos.  Esta  técnica  detecta  la  coagulasa unida a membrana.suspensión debe ser lo más homogénea posible.

  leches fermentadas y yoghurt (Streptococcus lactis).  tracto  intestinal.  otitis. Se encuentran en diferentes superficies y mucosas del  hombre  y  de  algunos  animales  como  cavidad  oral.  Es  un  diplococo  no  perfectamente  esférico.  tiene  forma  de  cabeza  de  lanza  (lanceolado).  Es habitante normal de la faringe del  hombre. que es el más patógeno  del género.  faringe.  así  tenemos  por  ejemplo  estreptococos  beta hemolíticos del grupo A como Streptococcus pyogenes.  Algunas especies son utilizadas en la industria lechera para la elaboración de quesos.  b) Alfa hemolíticos: producen halos de hemólisis incompleta de color verdoso  (viridans) alrededor de las colonias.  Los miembros del género Streptococcus se clasifican de acuerdo a:  1.  Bajo ciertas condiciones de cultivo las  células son ovoides o alargadas.  Streptococcus  pyogenes    produce  varias  toxinas  y  enzimas  responsables  de  su  poder  patógeno.  faringitis.  Streptococcus  pneumoniae  o  pneumococo  es  otra  especie  importante  de  este  género.  etc.  Es  el  agente  causal  de  infecciones  locales  purulentas  como  amigdalitis. Para su aislamiento las placas deben incubarse en un ambiente con 10% de  55 .  a) Beta  hemolíticos:  producen  halos  limpios  de  hemólisis  alrededor  de  las  colonias.  piel.  Su  forma  virulenta se encuentra rodeada por una cápsula.  Se  basa  en  la  composición  química  y  antigénica  de  un  hidrato  de  carbono  presente  en  la  pared  celular  y  permite  clasificar  a  los  estreptococos  en  grupos serológicos que van desde la A hasta la U.  anaerobios  facultativos que se disponen en pares o en cadenas y son catalasa negativos reacción  que los diferencia de la Familia Micrococcaceae.  Ambas  clasificaciones se  asocian  entre  sí.  agente  causante  de  neumonia  lobar  en  el  hombre.  c) Gama hemolíticos: no producen hemólisis  2.‐  ACTIVIDAD  HEMOLÍTICA:  según  el  tipo  de  hemólisis  que  presenten  al  ser  cultivadas en placas de agar sangre de conejo o de cordero.  Además  provoca  enfermedades  sistémicas  como  fiebre puerperal y escarlatina.‐  SEGÚN CONSTITUCIÓN ANTIGÉNICA DE LA PARED CELULAR: es la clasificación de  Lancefield.Familia Streptococcaceae  El  Género  Streptococcus  corresponde  a  cocos  Gram  positivos.

    Aislamiento y Caracterización:  El aislamiento de Streptococcus pyogenes se efectúa sembrando la muestra sobre  una  placa  de  agar  sangre. característico al desdoblar la bilis esculina.  toleran  las  sales  biliares  y  pueden  hidrolizar  la  esculina.  Los  Streptococcus  pyogenes  presentan  las  siguientes  características:  1. Hemólisis en placa de agar sangre. El diagnóstico de Streptococcus pyogenes se debe confirmar  mediante  reacciones  serológicas  con  antisueros  específicos  para  el  antígeno  superficial.5%).   Se debe confirmar mediante tinción de Gram la presencia de cocos Gram positivo  en  cadena  ya  que  otras  especies  pueden  dar  colonias  semejantes.6) y presencia sales biliares en que otros estreptococos no  pueden hacerlo. Se caracterizan porque  generalmente  son  no  hemolíticos  y  pueden  crecer  en  condiciones  de  alta  salinidad  (NaCl 6.  Estas  propiedades  se  pueden  usar  para  distinguir  los  Enterococos  de  otros  cocos  Gram  Positivo  catalasa‐negativos.  b) Pruebas serológicas.  a) Prueba  de  sensibilidad  a  Bacitracina. Se observa hemólisis limpia alrededor de las  colonias.  En  agar  sangre  S.  por  ejemplo  Staphylococcus.  sin  embargo  no  son  beta hemolíticos. En la prueba positiva.CO2. Existen  otras especies de Streptococcus que habitan el intestino del hombre y animales y se les  conoce con el nombre de estreptococos fecales o enterococos. las cuales son muy pequeñas. Su presencia en alimentos o agua indica contaminación fecal.    56 .  NaCl  6.  c) Bilis/Esculina. pH básico (pH 9.  Los  Enterococos  crecen  en  presencia  de  NaCl  6.  Los  estreptococos  beta  hemolíticos  del  grupo A (Streptococcus pyogenes) son sensibles a Bacitracina (se estudia como un  antibiograma). el tubo donde está el medio se torna de  color chocolate oscuro.  Estreptococos  fecales  o enterococos (por ejemplo Enterococcus faecalis).  pneumoniae  presenta  alfa  hemólisis  y  las  colonias  son  planas  con formas de fichas de damas.  Otros  estreptococos  también  son  sensibles. Una vez confirmada su presencia se realizan pruebas adicionales para  confirmar el diagnóstico.5%.5%.

    El  antibiótico  en  los  discos  difunde  radialmente durante el tiempo de incubación de tal manera que a medida que se aleja  del disco. la concentración disminuye.      Test de susceptibilidad a los agentes antimicrobianos  Método de difusión en agar o Kirby‐Bauer      Una metodología común para el estudio de la sensibilidad a antimicrobianos es la  difusión en agar. El  diámetro del área de inhibición puede ser convertido a las categorías de “susceptible”.  “intermedio”  o  “resistente”  de  acuerdo  a  las  tablas  publicadas  por  el  “National  Committee for Clinical Laboratories Standars (NCCLS)”.  En un punto determinado.  produciéndose  entonces una zona circular de inhibición (o halo de inhibición) alrededor del disco. Este método cualitativo se basa en la inoculación del microorganismo  sobre una placa de agar donde se colocan discos de papel filtro estériles impregnados  con  una  concentración  conocida  de  antibiótico. la concentración del  antibiótico  no  podrá  inhibir  el  crecimiento  del  microorganismo.                  Antibiograma mediante la técnica de difusión con discos 57 .

Clavulánico Ampicilina / Sulbactam   10 U 30 g 30 g 1 g 10 g 30 g 5 g 15 g 2 g 30 g 30 g 5 g 20 / 10 g 10 / 10 g  29  23  18  13  15  19  21  23  21  15  18 ≥ 16 ≥ 20 ≥ 15 15 – 22 15 – 17 11 – 12 13 – 14 15 – 18 16 – 20 14 – 22 15 – 20 13 – 17 12 – 14 ≤ 28 ≤ 14 ≤ 14  10 ≤ 12 ≤ 14 ≤ 15  13  14 ≤ 12 ≤ 16 ≤ 19 ≤ 11 Interpretación de los halos de Inhibición para Streptococcus -hemolíticos (Mueller-Hinton con sangre de cordero) DROGA CONTENIDO DEL DISCO SENSIBLE (Halo en mm) INTERMEDIA (Halo en mm) RESISTENTE (Halo en mm) Penicilina Ampicilina Cefotaxima Eritromicina Tetraciclina Cloranfenicol Claritromicina Clindamicina Vancomicina 10 unidades 10 g 30 g 15 g 30 g 15 g 15 g 2 g 30 g  24 ≥ 24 ≥ 24 ≥ 21 ≥ 23 ≥ 21 ≥ 21  19  17 - - 16 – 20 19 – 22 18 – 20 17 – 20 16 – 18 -  15  18  17  16  15 - 58 .Interpretación de los halos de Inhibición para Staphylococcus spp (Agar Mueller – Hinton) DROGA CONTENIDO DEL DISCO SENSIBLE (Halo en mm) INTERMEDIA (Halo en mm) RESISTENTE (Halo en mm) Penicilina Cefotaxima Ceftazidima Oxacilina Gentamicina Tetraciclina Ciprofloxaxino Eritromicina Clindamicina Vancomicina Cloranfenicol Novobiocina Amoxicilina / A.

 se incuba 16‐24 horas y después se mide el tamaño del halo.  Se  utiliza  un  disco  de  optoquina  que  se  deposita  en  una  placa  de  agar  sangre cordero luego de haber diseminado la colonia sospechosa.75 g Vancomicina 30 g  20  23  21  19  21  21  17 19 – 22 16 – 18 16 – 20 16 – 20 -  18  20  15  15  15 - Interpretación de los halos de Inhibición para Streptococcus spp.  Micrococcus son sensibles a bacitracina.  Staphylococcus.   Se considera sensible cuando existe un halo de inhibición ≥ 10 mm de diámetro.    Optoquina:  es  un  compuesto  químico  que  pone  a  prueba  la  fragilidad  de  la  membrana  celular  de  la  bacteria  y  que  a  bajas  concentraciones  (5g/ml)  permite  diferenciar  Streptococcus  pneumoniae  que  es  sensible  de  otros  Streptococcus    hemolíticos. Luego se coloca un disco de  bacitracina. Se incuba la placa a  59 . del grupo Viridans α-hemolítico (Mueller-Hinton con sangre de cordero) DROGA CONTENIDO DEL DISCO SENSIBLE (Halo en mm) INTERMEDIA (Halo en mm) RESISTENTE (Halo en mm) Tetraciclina Cefotaxima Cloranfenicol Clindamicina Eritromicina Vancomicina   30 g 30 g 30 g 2 g 15 g 30 g  23  28  21  19  21  17 19 – 22 26 – 27 18 – 20 16 – 18 16 – 20 -  18  25  17  15  15 - Bacitracina: Es un antibiótico que interfiere con la síntesis de las subunidades del  peptidoglicano. son resistentes a bacitracina.25 / 25.  Se considera resistente cuando el halo de resistencia es de < 10 mm de diámetro.  Se  debe  diseminar  en  una  placa  de  agar  sangre  una  colonia  con  la  precaución de una siembra homogénea y total de la placa.Interpretación de los halos de Inhibición para Streptococcus pneumoniae (MuellerHinton con sangre de cordero) DROGA CONTENIDO DEL DISCO SENSIBLE (Halo en mm) INTERMEDIA (Halo en mm) RESISTENTE (Halo en mm) Penicilina 1 g de oxacilina Tetraciclina 30 g Cloranfenicol 30 g Clindamicina 2 g Eritromicina 15 g Trimet/sulfame 1.

    Infecciones del tracto respiratorio inferior. Si el halo es  de 14 mm.  bronconeumonía.  amigdalitis  recurrente:  Estas  infecciones  son  a  menudo  producidas por Streptococcus pneumoniae. sepsis pélvica o puerperal y sepsis intraabdominal.  En  otras  situaciones. Se utiliza para el tratamiento  de infecciones por S. en particular exacerbaciones agudas  de  bronquitis  crónicas  (especialmente  si  se  consideran  graves). y Enterococcus spp.  en  particular  cistitis  (especialmente  cuando  sea  recurrente  o  complicada  excluyendo  prostatitis).  en  particular  celulitis. Haemophilus influenzae.      Amoxicilina  /  Ácido  Clavulánico:  La  asociación  amoxicilina/ácido  clavulánico  está  indicado  para  el  tratamiento  a  corto  plazo  de  las  infecciones  bacterianas  en  las  siguientes localizaciones cuando se sospecha que estén causadas por cepas resistentes  a  amoxicilina  productoras  de  beta‐lactamasas.    Infecciones  del  tracto  respiratorio  superior  (incluyendo  ORL).  Estas  infecciones  son  a  menudo  producidas  por  Streptococcus pneumoniae.  corresponde a Streptococcus pneumoniae      Novobiocina: es un antibiótico activo por vía oral. Algunas cepas de estos gérmenes producen beta‐lactamasas.  debería  considerarse la amoxicilina sola.  en  particular  sinusitis.  mordeduras  de  animales  y  abscesos  dentales  con  celulitis  diseminada  que  son  a  menudo  producidas  por  Staphylococcus  aureus.37°C por 24 horas y después se mide el halo de inhibición.  las  cuales  son  a  menudo  producidas  por  Enterobacterias  (principalmente  Escherichia coli.  Streptococcus  pyogenes  y  Bacteroides  spp.  otitis  media. aborto séptico. Staphylococcus saprophyticus spp. Haemophilus influenzae y Moraxella catarrhalis.     Infecciones  del  tracto  genitourinario  e  infecciones  abdominales.)    Infecciones  de  la  piel  y  tejidos  blandos.   60 . Moraxella  catarrhalis y Streptococcus pyogenes. aureus y para el tratamiento de infecciones urinarias resistentes a  otros  fármacos.  Este  fármaco  se  utiliza  muy  poco  debido  que  su  uso  está  asociado  a  una  alta  incidencia  de  reacciones  adversas  y  a  que  frecuentemente  emergen  cepas  resistentes. lo cual hace  que no sean sensibles a amoxicilina sola.

  61 . RECUERDE QUE ESTÁ TRABAJANDO CON MUESTRAS BIOLÓGICAS Y MICROORGANISMOS PATÓGENOS.NOTA: Lea el procedimiento por completo antes de comenzar a trabajar. POR LO QUE DEBE APLICAR LAS MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD APRENDIDAS CON ANTERIORIDAD. Realizar pruebas bioquímicas para la identificación de cocáceas Gram positivo  Reconocer alteraciones producidas en los medios de cultivo. por la presencia de  productos intermediarios. RECUERDE EN TODO MOMENTO TRABAJAR CON TÉCNICA ASÉPTICA PARA EVITAR LA CONTAMINACIÓN QUE CONDUCIRÁ A RESULTADOS ERRÓNEOS. debido a la acción bacteriana.     Objetivos    1. 2.

 Tome la tórula mojada y deslícela  sobre toda la superficie del agar Müller‐Hinton (Staphylococcus) o agar Sangre  (Streptococcus). Observe si se  trata de cultivos  puros.  cuidando  de  que  no  queden  demasiado  cerca  del  borde  de  la  placa  ni  demasiado  cerca  entre  sí.  c) Tome  la  tórula  estéril  y  (sin  flamearla!!!!)  sumérjala  en  el  caldo  recién  inoculado. Observe las placas sembradas. Observe al microscopio. 3.  tome  una  colonia  desde  la  placa  y  siémbrela  en  el  tubo  de  agua  estéril hasta que quede turbio.  Realice el Test de difusión por disco (Sensidisco)  a) Ud.   b) Con  el  asa.  Tome  con  cuidado  cada  uno  de  los  sensidiscos  (discos  de  papel  impregnados  con  el  antibiótico)  y  distribúyalos  homogéneamente  en  la  placa.                                         62 . Una vez que termine. Describa las colonias bacterianas.  cuenta  con  una  placa  de  agar  Sangre  donde  se  encuentra  la  bacteria  en  estudio.ACTIVIDADES PRÁCTICAS    1.  Realice una tinción de Gram a su muestra. 2. elimine la tórula.  d) Tome  la  pinza  y  flaméela  brevemente.  ya  que  estas  situaciones  dificultarán la medición de los halos de inhibición. Flamee la boca del tubo y cierre.

   Tipos de zonas que pueden desarrollarse alrededor de los discos:  a. se estudiará la presencia de enzimas como catalasa y coagulasa.  El  test  permite  diferenciar  Staphylococcus.  Se  debe  colocar  una  gota  de  peróxido  de  hidrógeno  en  un  portaobjetos.  se  utilizan  básicamente  la  detección de enzimas y la sensibilidad a compuestos químicos o antibióticos.  63 .  “intermedio”  o  “resistente”  con  respecto  a  los  antibióticos dispuestos en el agar. Resistentes: No hay zona de inhibición o si existe es muy estrecha. La excepción es Streptococcus que no puede descomponer el H2O2.  sólo  déjelos  caer  desde  cerca  y  presiónelos suavemente contra el agar con la pinza (sin hundirlos!!!)    Observación de un Test de Sensidiscos   Observe los halos de inhibición y mida el diámetro de estos para determinar si  la  bacteria  es  “susceptible”. que descompone el H2O2 en  H2O + O2  La  enzima  se  encuentra  en  la  mayoría  de  las  bacterias  que  contienen  citocromo.  b.  Micrococcus  y  Listeria  (catalasa  +)  de Streptococcus (catalasa ‐). Realice las pruebas bioquímicas correspondientes según la tabla   Para  el  estudio  de  bacterias  Gram  positivo. Intermedio:  Hay  una  estrecha  zona  libre  de  crecimiento  bacteriano  alrededor del disco. La aparición rápida y sostenida de  burbujas (antes de 20 segundos) indica test (+).  c. Compare con la Tabla adjunta.    Catalasa: Busca la presencia de la enzima catalasa. La  sensibilidad a antibióticos se tocó en el punto anterior. Sensible: Hay una amplia zona libre de crecimiento bacteriano alrededor del  disco.Nota :   Asegúrese de flamear las pinzas cada vez que va a tomar un sensidisco y enfríe  en la tapa de la placa antes de sacar uno.  Trate  de  no  tocar  el  agar  al  poner  los  discos.    4.  Ante esto.  sobre la cual se agrega la colonia en estudio.

  c) Ponga  sobre  el  portaobjeto  con  la  bacteria  una  gota  de  H2O2  y  observe.    la  pared  de  Staphylococcus aureus posee receptor de fibrinógeno lo que permite la formación  de puentes entre bacteria y bacteria.  Coagulasa:  Busca  la  presencia  de  la  enzima  coagulasa  producida  por  Staphylococcus aureus.  64 .  Anote lo observado y compare con su resultado del Gram.  b) Pase la Pasteur con la bacteria sobre un portaobjeto y elimine la Pasteur. la colonia sospechosa.Precauciones:  no  tocar  el  agar  sangre  al  tomar  la  colonia  ni  usar  asas  de  platino ya que estas sustancias dan falsos positivos.  además. El  fundamento de la técnica de aglutinación con partículas de látex se muestra en la  figura N° 3. Siempre se debe realizar un control negativo que está incluido en el kit. a continuación  se emulsiona sobre la gota.    Diferencia Staphylococcus aureus de otros Staphylococcus coagulasa negativo. Se debe colocar una gota del reactivo latex sobre un círculo  de la tarjeta. formándose un coágulo.  La  enzima  es  un  activador  del  fibrinógeno  a  fibrina.  Se realiza en tubo con plasma de conejo o en lámina como test de aglutinación  con partículas de latex. se  agita  durante  unos  segundos  y  si  hay  formación  de  grumos  visibles  se  considera  positiva.              Procedimiento Prueba de la catalasa  a) Flamee  brevemente  una  pipeta  Pasteur  y  tome  una  colonia  desde  el  agar  (sin sacar agar).

Espere unos minutos agitando constantemente. Con un palillo de plástico tome varias colonias desde el agar. Si  existe  la  presencia  de  coágulos  (como  “leche  cortada”).‐ Incubar a la temperatura adecuada.   b.  c.  Anote  lo  observado y compare con su resultado del Gram.  Munch  y  Petersen. Este procedimiento se utiliza para confirmar la presencia de Streptococcus  tipo  B  por  la  producción  de  una  zona  de  hemólisis  característica  cuando  crece  en  la  proximidad de Staphylococcus aureus. realice con el asa una o más estrías con el cultivo  de Streptococcus.‐  Sobre  una  placa  de  agar  Sangre  realice  con  el  asa  una  única  estría  en  el centro  a  partir de un cultivo de Staphylococcus aureus. lo que se denomina “punta de lanza” (Ver figura  adjunta)                Procedimiento:  1.  d.  los  descubridores  del  fenómeno.  3.    Si  se  ve  siempre  homogéneo. Tome  una  tira  reactiva  y  agregue  una  gota  de  cada  reactivo  en  las  zonas  marcadas. Mezcle con la solución de anticuerpos del Test de aglutinación (plasma de  conejo).‐ Perpendicular a la estría original.‐    La  sigla  CAMP  proviene  de  Christie.    65 Test de CAMP para Streptococcus  .    5.  Atkins.  la  reacción  es  negativo.  2.  e.Procedimiento Prueba de la Coagulasa:  a.  la  reacción  es  positiva.

 Realizar análisis macro y microscópico de la colonia más representativa.  a.6.)  b.‐          Siembra de flora normal en placas de agar sangre. 66 . etc.  de una zona anatómica de interés (boca. Sembrar en placas de agar sangre e incubar a 37ºC por 24 horas. manos. naríz.  c. Tomar una muestra de flora normal con una tórula humedecida en suero fisiológico.

                                                                 APUNTES  67 .

APUNTES  68 .

Realizar  Test  de  Detección  Comerciales  para  la  identificación  de  bacterias  Gram  negativo (API 10E – API 20E – API 32A ‐ API 10S). Realizar  pruebas  bioquímicas  convencionales  para  la  identificación  de  bacterias    Gram negativo.  De  este  modo  esta  técnica  taxonómica  se  basa  principalmente en la detección de:    a) Utilización de fuentes de carbono. la fisiotaxonomía  bacteriana  estudia  el  comportamiento  de  las  bacterias  vivas  a  través  de  las  alteraciones  que  producen  en  medios  de  cultivo  indicadores.  ya  que  no  todos  los  microorganismos  poseen  los  mismos  requerimientos  nutricionales  o  poseen  las  mismas  rutas  metabólicas.  por  la  presencia  de  productos intermediarios.    En el laboratorio de Microbiología el análisis de una muestra sigue. Realizar prueba de susceptibilidad antimicrobiana por difusión en agar.  4.  3.  d) Identificación fisiotaxonómica (reacciones metabólicas específicas)  e) Estudios de sensibilidad a agentes microbianos. Reconocer  alteraciones  producidas  en  los  medios  de  cultivo.  b) Formación de productos finales.  2.  Estas  alteraciones  son  producidas  por  enzimas  específicas  de  las  diferentes  bacterias.  69 . debido a la acción bacteriana.    Como se vio en el trabajo práctico sobre bacterias Gram positivo.TRABAJO PRÁCTICO Nº4:  FISIOTAXONOMÍA DE BACTERIAS GRAM NEGATIVO  Objetivos    1.  la siguiente secuencia:    a) Siembra y obtención del microorganismo aislado (cultivo puro)  b) Observación de morfología macroscópica  c) Tinciones y observación de morfología y agrupación microscópica. por lo general.

 No significan de ninguna manera un estudio profundo  del metabolismo bacteriano.  etc.  indicador.    70 .  grupo  de  enzimas  o  determinada vía metabólica.  Los  sistemas  comerciales  utilizan  modificaciones  de  las  pruebas  bioquímicas  convencionales.)  que  pueden  ser  diferentes  aún  para  el  mismo  ensayo  si  se  trata  de  diferentes  microorganismos.  revelador.  tiras  de  papel  de  filtro  impregnadas  en  reactivos  o  pequeños  compartimentos  con  medios  listos  para  sembrar.   A  la  determinación  de  la  especie  se  puede  llegar  según  diversos  sistemas  (manuales  de  identificación.  porque  proveen  los  reactivos  listos  para  su  uso  o  porque  son  totalmente  automatizables.  porque  proponen el mejor conjunto de pruebas bioquímicas para la identificación de un grupo  bacteriano.  En  todos  los  casos  se  emplean  códigos numéricos para la interpretación de resultados.  porque  simplifican  la  interpretación  de  un  resultado  utilizando  un  valor  numérico.  Por  ejemplo  se  debe  suplir  con  factores de crecimiento el medio de cultivo para estudiar la fermentación de distintos  azúcares cuando se sabe que el microorganismo en estudio es exigente.  etc. crecimiento a una determinada temperatura.   Existen  diferentes  sistemas  que  facilitan  la  realización  de  tales  ensayos.  comerciales.    La  identificación  de  un  bacteriana  aislada  puede  realizarse  utilizando  diferentes  ensayos bioquímicos que generalmente determinan la actividad de una vía metabólica  (conjunto  de  reacciones  químicas)  a  partir  de  un  sustrato  que  se  incorpora  en  un  medio de cultivo y que la bacteria al crecer transforma o no.   Para llevarlas a cabo.   Las pruebas o ensayos bioquímicos. son pruebas simples que se han desarrollado  para  demostrar  en  forma  clara  una  determinada  característica  bioquímica  como  presencia  o  ausencia  de  una  determinada  actividad  enzimática. crecimiento  en presencia de inhibidores.).c) Presencia de enzimas  d) Sensibilidad a productos químicos o antibióticos.  ya  sea  sustratos  deshidratados. se pueden utilizar diferentes sistemas de trabajo (medio de  cultivo. etc.

‐ Agar tendido corriente:  Es  un  medio  sólido  nutritivo.  azul a pH alcalino)   Este medio contiene como única fuente de carbono el citrato y solamente pueden  desarrollarse  aquellas  bacterias  que  posean  la  enzima  citrato  permeasa  la  que  les  permite transportar el citrato a través de la membrana citoplasmática.La batería con la cual trabajaremos en el laboratorio consta de 6 tubos con medio  estéril:    1. como única fuente de carbono   ‐ Indicador de pH azul de bromo timol (verde a pH  neutro.  El  cambio de pH se observa por viraje de un indicador de pH como la fenolftaleína.‐ Agar Urea:   Es un medio sólido en él que se puede observar la producción de  ureasa  ya  que  contiene  además  de  nutrientes  básicos:                                ‐ Triptona  ‐ Urea  ‐ Indicador de pH fenolftaleína  Esta  prueba  se  basa  en  la  capacidad  de  algunas  bacterias  que  poseen  la  enzima  ureasa  y  pueden  degradar  urea  a  amoníaco  y  CO2.  Esta  reacción  es  fácilmente  evidenciable  por  que  el  pH  varía  hacia  alcalino  debido  al  efecto  del  amoníaco.       3.‐ Agar Citrato:    Este medio de cultivo contiene además de sales minerales:                                 ‐ Fosfato de amonio  ‐ Citrato de sodio.  2. Una vez en el  71 .  que  permite  observar  posible pigmentación en las colonias.

 láctico.0%  ‐ Citrato de amonio y Hierro  ‐ Indicador de pH rojo de fenol (amarillo pH ácido.                              Coloración azul del medio indica prueba positiva. peptona.1%  1.  Si  la  bacteria  fermenta  solamente  la  glucosa. rojo pH  alcalino)    La  bacteria  primero  usará  glucosa.) y gases (CO2.  se  agota  rápidamente.  como  la  concentración  es  baja.  extracto  de  levadura. Existen  muchos medios de cultivo que se han diseñado con el objeto de detectar la producción  de ácidos y de gas a partir de distintos azúcares.‐ Agar TSI:  Las bacterias pueden utilizar azúcares (hidratos de carbono) a través  de varias rutas metabólicas. H2). Los productos finales de estas reacciones dependerán de  la  bacteria  de  que  se  trate.  en  el  fondo  del  tubo  se  producirán  ácidos  y  el  indicador  de  pH  virará  a  amarillo.   El  Agar  TSI  (Triple  Sugar  Iron)  es  un  medio  rico  que  contiene  los  nutrientes  necesarios para el crecimiento de las bacterias y que permite visualizar utilización de  azúcares.  en  la  superficie  72 .  En  general  estos productos serán ácidos (fórmico.  En  cambio.0%  1. etc.  Contiene  además  de  nutrientes  como  extracto  de  carne. etc:                                          ‐ Glucosa   ‐ Lactosa  ‐ Sacarosa              0.interior  de  la  célula  el  ión  citrato  es  metabolizado  a  través  del  ciclo  de  los  ácidos  tricarboxílicos.  del  azúcar  utilizado  y  de  la  ruta  metabólica. pirúvico.    4.

  este  reacciona  con  la  sal  de  hierro  dando  sulfato  ferroso. un compuesto insoluble de color negro.  3:  Desaminación  de  aminoácidos  positiva.  fermentación  de  glucosa  positiva.     Si  la  bacteria  produce  H2S.  fermentación de lactosa y sacarosa negativo. se producirán aminas.  4:  Desaminación  de  aminoácidos  positiva.  fermentación de lactosa y sacarosa positiva.  fermentación de lactosa y sacarosa positiva. producción de H2S positivo.  fermentación de lactosa y sacarosa negativo.inclinada  por  efecto  del  metabolismo  oxidativo  de  los  aminoácidos  presentes  en  el  medio de cultivo. pues no se  alcanza a consumir toda la lactosa presente.  la  lactosa  (que  está  en  mayor  concentración) todo el tubo virará a amarillo por la producción de ácidos.  fermentación de lactosa y sacarosa negativo. por lo que el indicador en la superficie virará a  rojo.    Si  se  produce  gas  se  observará  como  quiebres  en  el  agar  o  separación  de  la  columna de agar del fondo del tubo. producción de H2S negativo.  73 . Siempre hay que asegurarse que exista desarrollo bacteriano.  2:  Desaminación  de  aminoácidos  positiva. producción de H2S negativo.  fermentación  de  glucosa  positiva.  fermentación  de  glucosa  negativo.  Si  la  bacteria  fermenta  además  de  la  glucosa.   Este medio permite diferenciar a los microorganismos que fermentan azúcares de  los que no. producción de H2S positiva. producción de H2S negativo.    C: Control negativo  1:  Desaminación  de  aminoácidos  positiva.  fermentación  de  glucosa  positiva.  5:  Desaminación  de  aminoácidos  positiva.  fermentación  de  glucosa  positiva.

  la  cual  remueve  el  grupo  COOH  de  la  lisina  dando  como producto CO2 y una diamina  (alcalina). morado a pH alcalino). Si  la bacteria PRODUCE  la  enzima  lisina  descarboxilasa.  Si  la  bacteria  NO  PRODUCE  lisina  descarboxilasa  se  mantendrá esta coloración amarilla (Reacción K/A.  desaminándolos  o  descarboxilándolos.  La bacteria primero utiliza la glucosa produciendo ácido por lo que el pH baja y el  indicador  vira  a  amarillo. negativo).  Si  la  bacteria  es  capaz  de  desaminar  a  la  lisina.:                                          ‐ Aminoácido lisina   ‐ Aminoácidos azufrados  ‐ Glucosa  ‐ Citrato de hierro y amonio  ‐ Indicador de pH púrpura de bromocresol (amarillo a pH  ácido.  la  superficie  se  verá  roja y el fondo amarillo (Reacción R/A)      74 . produciendo H2S (reacción que se observa también en el medio TSI).  Otro  efecto  de  las  bacterias  sobre  aminoácidos  azufrados  es  la  remoción  del  grupo ‐SH2.‐ Agar LIA:  Las distintas bacterias poseen enzimas inducibles que pueden actuar  sobre  algunos  aminoácidos.  positiva)    Si la bacteria produce H2S éste reacciona con la sal de hierro formando sulfuro  ferroso  (negro).5. etc.    Este  medio  contiene    además  de  nutrientes  como  peptona  y  extracto  de  levadura.  Ejemplo  de  estas  reacciones  enzimáticas  son:  la  descarboxilación  de  la  lisina  y  la  desaminación  de  la  lisina. entonces el indicador vira nuevamente  hacia  el  lado  alcalino  y  se  revierte  el  viraje  de  amarillo  a  morado  (Reacción  K/K.

 la reacción es positiva.  respectivamente. indol negativo (con reactivo de  Kovacs se observa anillo amarillo)  3: Motilidad positiva. Además. En este caso. se puede observar la presencia de indol.6.  Los  antibióticos  son  agentes  terapéuticos producidos por organismos vivos.  Los  ensayos  de  susceptibilidad  están  indicados  para  apoyar  la  quimioterapia antimicrobiana de tratamiento en procesos infecciosos por bacterias en  las  que  la  identidad  del  microorganismo  no  es  suficiente  para  predecir  en  forma  confiable su susceptibilidad.  La  reacción  positiva  se  observa  por  el  color  morado  del  tubo.  los  pares  están  organizados  sin  y  con  reactivos  de  Kovacs. ornitina descarboxilasa negativo. indol positivo (con reactivo de  Kovacs se observa anillo fucsia)  2: Motilidad positiva.  Si  el  crecimiento  bacteriano  se  observa como el enturbamiento completo del medio.    En  la  figura. Estos ensayos son a menudo indicados cuando se piensa  75 .  en  cambio en la reacción negativa el medio se torna amarillo (puede ponerse morado el  fondo). Si sólo se  limita al pinchazo. que inhiben o destruyen a los agentes  infecciosos. ornitina descarboxilasa positiva. indol positivo.  que  participa  en  el  metabolismo  de  varios  aminoácidos  en  algunas  bacterias. También es posible observar la presencia de la enzima  ornitina  descarboxilasa. la reacción positiva será la aparición de  un aro rojo sobre la superficie del medio. ornitina descarboxilasa positiva.      Otra  prueba  que  complementa  la  determinación  de  una  especie  bacteriana  desconocida  es  la  susceptibilidad  a  antibióticos. es negativo. para lo cual hay que agregar  una gota de reactivo de Kovacs.‐  Medio  MIO:    Permite  observar  motilidad.  1: Motilidad negativa.

 como  por ejemplo:  "el medio MIO sirve  para ver si la bacteria es móvil o no". se aprenda de  memoria cada una de las reacciones bioquímicas que se describieron. Sólo debe ser  capaz  de manejar los conceptos generales.  76 .    NOTA PARA LA PRUEBA DE LABORATORIO: NO es necesario que Ud.que el organismo causante pertenece a una especie capaz de mostrar resistencia a los  agentes antimicrobianos más comúnmente usados.     Los  métodos  de  susceptibilidad  antimicrobiana  o  antibiogramas  son  métodos  que  determinan  in  vitro  la  sensibilidad  de  los  microorganismos  a  una  variedad  de  agentes antimicrobianos bajo condiciones específicas y estandarizadas.

  e. es decir. Esterilice  el  asa. Los  medios  tendidos  (Agar  Citrato  y  Corriente)  se  siembran  sólo  en  la  superficie. y luego en zig‐zag por la superficie.   g.  atravesándolos hasta el fondo con el asa  en punta.   77 .  El  caldo  recién  sembrado  será  utilizado  como inóculo para sembrar toda la batería.  anote  los  colores  de  los  distintos  medios.  3.  c. se realiza un zig‐zag con un asa convencional (en argolla). sumerja el asa con cuidado y agite.  Cada  grupo  contara  con  una  batería  convencional  compuesta  por  6  pruebas  bioquímicas  dispuestas  en  6  tubos.  4. Antes  de  empezar. Los  medios  semitendidos  (Agar  TSI.  d. es decir.  se  incuba  a  37ºC  para  que  los  microorganismos  crezcan  y  produzcan  los  cambios  en  los  distintos  medios.    Una  vez  que  la  batería  es  sembrada.  h. Los  caldos  se  siembran  agitando  el  asa  con  el  inóculo  dentro  del  tubo  con  el  medio. Para cada tubo de la batería el asa debe ser esterilizada previamente y enfriada  en las paredes del tubo antes de sumergirla en el caldo inoculado.  Posteriormente  los  resultados  se  “leen”  y  se  comparan  con  la  Tabla  de  Resultados  adjunta.  Para  sembrar  la  batería  se  deben  seguir  las  siguientes indicaciones:  a.   f. Flamee la boca del tubo con caldo estéril. Siembra de Batería Bioquímica.  b.  enfríe  en  las  paredes  internas  del  tubo  recién  sembrado  y  sumérjala en el caldo. Use este inóculo para sembrar todos los tubos de la batería. Los medios semisólidos (agar MIO) se siembran sólo en profundidad con un asa  en punta. Tome  una  colonia  aislada  de  la  placa  de  agar  Nutritivo  sembrada  y  tape  la  placa.  Esto  le  servirá  para hacer una comparación con el resultado final.  Urea  y  LIA)  se  deben  sembrar  en  profundidad y en superficie.    Lectura e interpretación de la Batería. Flamee  el  asa  para  su  esterilización.ACTIVIDADES PRÁCTICAS    1.    Posteriormente siembre en los medio teniendo en cuenta que:  1. Flamee el asa para su esterilización. pinchando el agar hasta la mitad del tubo aproximadamente.  2.

    Para la producción de Nitritos: Coloque una gota del reactivo de NIT1 y NIT2 en  la prueba GLU.  d. Esperar unos minutos.  Para  la  producción  de  Indol:  Coloque  una  gota  del  reactivo  de  James  en  la  prueba IND (esperar un par de minutos). una gota de  aceite mineral.  Incubar a 37ºC  g. Que NO quedé un exceso.‐  Siembra  de  Tira  reactiva  comercial  para  la  identificación  de  bacterias Gram (‐) (API 10S)  a.  Tome con el asa una colonia desde el agar y siembre en el tubo de suero estéril  hasta una medida de densidad igual 0. para crea un ambiente microaerofílico.        f. en la parte lateral.  Preparar  una  cámara  de  incubación  y  rellenar  con  agua  corriente  lo  pocillos  para mantener un ambiente húmedo.  c.  Coloque la galería de reacciones sobre la cámara de incubación.  Con una pipeta Pasteur estéril.  78 . Coloración roja indica positivo.  h.  Anotar en el exceso de la tapa. URE y H2S coloque. inocule cada una de las celdas de la galería hasta  el menisco.5 McFarland (Estándar de turbidez).  e.  Lea  la  tira  de  acuerdo  a  la  Tabla  anexa  y  luego  agregue  los  reactivos  abajo  mencionados:  h. tal y como se muestra en la figura adjunta (línea azul). el nombre de la bacteria y el  de un integrante del grupo. ODC.  En las pruebas LDC. Coloración rosa indica positivo.  Llenar las pruebas CIT hasta la cúpula (ver figura)  g.  b. después de inocular.2.

  j. azul/verdoso  Azul. azul/verdoso  Amarillo  Amarillo  verde  pálido/amarillo  Depósito/línea  negra  Incoloro/gris  Rojo/naranja  Amarillo  79 . azul  NEGATIVO  Incoloro  Azul.  Para la detección de triptofano desaminasa: Coloque una gota de FeCl3 (TDA)  en la prueba TDA (Marrón es positivo)  i. Anote el  resultado en la cartilla y guárdelo para pegarlo en su informe.amarillo/ gris Amarillo  Naranja  Rojo/naranja  Azul/verde.  Lea y compare sus resultados con la Tabla adjunta.  k.      TEST  ONPG  GLU  ARA  LDC  ODC  CIT  H2S  URE    REACCIONES  Beta galactosidasa  Fermentación /oxidación  glucosa  Fermentación/oxidación   arabinosa  Enzima lisina descarboxilasa  Enzima ornitina descarboxilasa  Utilización del citrato  Producción de H2S  Enzima ureasa  POSITIVO  Amarillo  Amarillo.  Compare su código numérico con los catálogos que tiene la profesora.  Rellene la cartilla de resultados según como detalle la profesora.

  Tome  con  cuidado  cada  uno  de  los  sensidiscos y  distribúyalos  homogéneamente en  la  placa. Incube a 37ºC durante 16 hrs.  Una  vez que termine.  . Deslice  la  tórula  mojada  sobre  toda  la  superficie  del  agar  Müller‐Hinton. Deje secar la placa con la tapa ligeramente entreabierta.  f.  cuidando  de  que  no  queden demasiado cerca del borde de la placa ni demasiado cerca entre si. determine sensibilidad o resistencia al antibiótico.                                   NOTA:  Los diversos tamaños de los halos de inhibición producidos por antibióticos diferentes  para una misma especie bacteriana NO PUEDEN SER COMPARADOS ENTRE SI.  c. elimine la tórula. Tome  la  pinza  y  flaméela  brevemente.   b. Tome una tórula estéril y (sin flamearla!!) sumérjala en el caldo con el inoculo. Test de susceptibilidad a agentes antimicrobianos  Método de difusión en agar o Kirby‐Bauer    a.   e.3.  d.  Flamee la boca del tubo y cierre.   80 Según la tabla adjunta. Observe y mida el diámetro del halo formado alrededor de los sensidiscos.  Compare resultados usando diferentes especies bacterianas.

aeruginosa Clindamicina Ciprofloxacino 10 µg 10 µg 20 µg 5 µg 30 µg 30 µg 30 µg 20 / 10 µg 100 µg 100 µg 30 µg 2 µg 5 µg  17  15  18  21  26  15  21  18 ≤ 17 ≤ 13 ≤ 14 ≤ 14 ≤ 15 14 – 16 13 – 14 13 – 17 16 – 20 23 – 25 12 – 14 18 – 20 14 – 17 18 – 22 14 – 16 15 – 17 15 – 20 16 – 20  13  12  12  15  22  11  17  13 ≥ 23 ≥ 17 ≥ 18 ≥ 21 ≥ 21   4. coli Carbenicillin para P.  A  partir  de  una  colonia  aislada.  Compare  los  resultados  obtenidos  en  la  batería  bioquímica  tradicional  con  los  resultados obtenidos en el test comercial.    Interpretación de los halos de Inhibición para Enterobacterias (Mueller-Hinton) DROGA CONTENIDO DEL DISCO SENSIBLE (Halo en mm) INTERMEDIA (Halo en mm) RESISTENTE (Halo en mm) Ampicilina Gentamicina Cloranfenicol Ciprofloxacino Cefotaxima Tetraciclina Ceftazidima Amoxicilina / Ác.  81 .   Analice macroscópicamente una colonia aislada de su muestra problema.Por  ejemplo:  un  halo  de  inhibición  de  30  mm  para  Penicilina  no  indica  mayor  sensibilidad que un halo de 20 mm para Tetraciclina. Clavulanico Carbenicillin para Especies de Proteus E. para su incubación a 37°C. aeruginosa Ceftazidima para P.‐ Análisis de la muestra problema.  siembre  en  cuadrantes  en  una  placa  de  agar  MacConkey.

 Se anota como K        fondo amarillo (ácido). Se anota A  Desaminación de lisina negativo  : no hay cambio.     82 .Lectura de Batería Bioquímica    Agar Urea   Reacción positiva  : El agar se torna fucsia.    Agar TSI   Utilización de glucosa   : Superficie roja (pH alcalino).  Reacción negativa  : El agar no cambia de color. Se anota R      fondo amarillo. Se anota K/K. Se anota A/A  Producción de H2S      : ennegrecimiento del agar    Medio MIO   Reacción positiva  : El medio se observa de color morado.    Agar Citrato  Reacción positiva  : Viraje del indicador de pH a color azul (alcalino).   Reacción negativa    : El tubo no varía de color. Se anota K/K  Descarboxilación de lisina negativo  : superficie morada (alcalina). Se anota A  Utilización de lactosa   : Fondo y superficie amarilla (pH ácido). Se anota A/A  Producción de gas    : Ruptura de la columna de agar  Producción de H2S    : Ennegrecimiento del agar.   Reacción negativa  : El agar permanece de color verde (neutro).     Agar LIA   Descarboxilación de lisina positivo  : todo el tubo morado (alcalino). Se anota K        Fondo amarillo (pH ácido).     Presencia de indol     Reacción  positiva  será  la  aparición  de  un  aro  rojo  sobre  la  superficie  del  medio  al  agregar una gota de reactivo de Kovacs. Se anota como A  Desaminación de lisina positivo    : superficie roja.  Reacción negativa  : El medio se torna amarillo (puede ponerse morado el fondo).

APUNTES  83 .

APUNTES    84 .

RESULTADOS MAS FRECUENTES DE ALGUNAS PRUEBAS BIOQUIMICAS PARA LA FAMILIA ENTEROBACTERIACEAE      Escherichia coli  Shigella flexneri  Shigella dispar  Salmonella typhi  Salmonella paratyphi A  Salmonella paratyphi B  Salmonella gallinarum  Citrobacter freundii  Klebsiella pneumoniae  Enterobacter aerogenes  Enterobacter hafniae  Serratia marcescens  Serratia rubidae  Proteus vulgaris  Proteus mirabilis  Pseudomonas  i * Alcaligenes  faecalis*  Glucosa  Lactosa  Sacarosa  Manitol  Sorbitol  Gelatina  Citrato  H2S  AG  A  ‐  A  AG  AG  A  AG  AG  AG  AG  V  AV  AV  AG  ‐  ‐  +  ‐  V  ‐  ‐  ‐  ‐  +  +  +  V  ‐  +  ‐  ‐  ‐  ‐  V  V  ‐  ‐  ‐  ‐  ‐  +/‐  +  +  V  +  +  +  V  ‐  ‐  +  V  ‐  +  +  +  +  +  +  +  +  +  +  ‐  ‐  ‐  ‐  +  ‐  ‐  +  +  +  +  +  +  +  ‐  +  ‐  ‐  ‐  ‐  ‐  ‐  ‐  ‐  ‐  ‐  ‐  ‐  ‐  ‐  ‐/+  ‐  +  +  +  +  +  ‐  ‐  ‐  ‐  V  ‐  +  +  +  +  +  V  +  +  V  (+)  +  V  ‐  ‐  ‐  +  ‐  +  +/‐  +/‐  ‐  ‐  ‐  ‐  ‐  +  +  ‐  ‐  Motilidad  Indol  +/‐  ‐  ‐  +  +  +  ‐  +  ‐  +  +  +  +/‐  +  +  +  +  +  +  +  ‐  ‐  ‐  ‐  ‐  ‐  ‐  ‐  ‐  ‐  +  ‐  ‐  ‐  V‐P  ‐  ‐  ‐  ‐  ‐  ‐  ‐  ‐  +  +  +/‐  +  +  ‐  ‐/+  ‐  ‐  R‐M  +  +  +  +  +  +  +  +  ‐  ‐  ‐/+  ‐/+  ‐/+  +  +  ‐  ‐  Pigmento Urea  ‐  ‐  ‐  ‐  ‐  ‐  ‐  ‐  ‐  ‐  ‐  +  +  ‐  ‐  +  ‐  ‐  ‐  ‐  ‐  ‐  ‐  ‐  ‐  ‐  ‐  ‐  V  V  +  +  ‐  ‐  * No pertenecen a la familia Enterobacteriaceae  AG    = Acido‐Gas (utilización del substrato y producción de gas)  V    = Variable  (+)    = Positivo después de 3 ó 4 días  +/‐    = Generalmente positivo  ‐/+      = Generalmente negativo  85 .

Todos son Citrato positivo. coli son Lisina Descarboxilasa negativo. Klebsiella spp. que puede dar positivo al 2do o 3er día a : ciertas especies de S. 86 . Excepto E. Excepto Klebsiella. Nota : Todos producen gas de glucosa.TABLA I Fermentación de Glucosa Positivo Fermentación de Lactosa Positivo Lisina Desaminasa Negativo Producción de H2S Positivo Indol Negativo Lisina Descarboxilasa Positivo Salmonella Arizonaa Negativo Citrobacter freundii Positivo Escherichia coli Negativo Lisina Descarboxilasa Positivob Indol Negativo Enterobacter spp. coli Todos son Ureasa negativo. Arizona Fermentan la Lactosa lentamente b : ciertas especies de E.

mirabilis pueden o no utilizar Citrato Todos producen un poco de gas de Glucosa Todos son Ureasa positivo. vulgaris y P.TABLA II Fermentación de Glucosa Positivo Fermentación de Lactosa Negativo Lisina Desaminasa Negativo Producción de H2S   Positiva Lisina Descarboxilasa Indol Negativo Lisina Descarboxilasa Indol Citrato Positivo Proteus vulgaris Negativo Proteus mirabilis Negativo Proteus morganii Positivo Proteus rettgeri Nota : P. Excepto Providencia 87 .

TABLA III Fermentación de Glucosa Positivo Fermentación de Lactosa Negativo Producción de H2S Positiva Lisina Positivo Indo Positivo Citrato Negativo Negativo Edwarsiella Salmonella Typhi Salmonella Arizona Negativo Negativa Lisina Negativo Positivo Indol Negativo Citrato Positivo Serratia Negativo Citrato Negativo Citrato Positivo Citrobactera Citrato Positivo Salmonella Paratyphi Indol Negativo Salmonella Paratyphi A Shigella spp. Positivo Shigella spp. No producen gas de Glucosa Shigella. Salmonella Typhi y Yersinia enterocolitica. Yersinia enterocolitica Nota : Todos son Ureasa Negativo. El resto produce gas de   a: Ciertas especies de Citrobacter son Lactosa Negativo y pueden ser Indol Positivo o Negativo 88 . Serratia. Excepto algunas cepas de Yersinia enterocolitica.

  Pseudomonas sp.    89 .    INTRODUCCIÓN  Para  aislar  un  microorganismo  de  la  naturaleza.  Lactobacillus sp.  se  deben  conocer  previamente  los  requerimientos  nutricionales  y  las  condiciones  ambientales  óptimas  para  su  crecimiento. están  compuestas mayoritariamente por los géneros Bifidobacterium y Lactobacillus.    Organismos a aislar e identificar:         Enterobacterias  Staphylococcus sp.    Bacterias Probióticas  Las bacterias probióticas corresponden a bacterias vivas que producen algún tipo de  beneficio al organismo hospedero.  Los  alumnos  deberán  buscar  en  la  bibliografía. Presentes en numerosos productos lácteos.TRABAJO PRÁCTICO Nº5:  AISLAMIENTO BACTERIANO DESDE ALIMENTOS    OBJETIVO:  Aislamiento y posterior identificación de distintas especies bacterianas a partir de  diferentes muestras de alimentos.  Vibrio sp.  las  características  metabólicas  y  el  hábitat de los microorganismos que se van a utilizar.

   Existen  diferentes  sistemas  que  son  satisfactorios  para  el  cultivo  de  bacterias  anaerobias.           2 H2+ O2  2 H 2O Además en otras reacciones se forma H2 y CO2.    Cultivo en anaerobiosis.  que  consta  de  un  soporte para placas incluido en una cubeta transparente con tapa hermética (figura 1).   Las placas y los tubos sembrados en el interior de la jarra.  competencia con patógenos.  Para confirmar el ambiente anaerobio.  se coloca dentro de la jarra un papel indicador (azul de metileno) que vira de color (de  azul a blanco) en presencia de CO2. al reaccionar el catalizador con 10 ml de  agua destilada estéril que se  adiciona  al  sistema.  uno  de  los  más  utilizados  es  el  “Sistema  GASPAK”. mejora en el sistema inmunológico. efecto anticancerígeno.  Algunas  especies  bacterianas  presentes  en  alimentos  requieren  de  condiciones  especiales  de  cultivo  como    por  ejemplo  una  baja  o  nula  concentración  de  oxígeno  para su crecimiento.  de  esta  manera  se  produce  la  reducción  del  oxígeno  según  la  siguiente reacción.   Para crear la atmósfera anaeróbica se utiliza un sobre comercial con catalizador que  contiene  una  tableta  de  borohidrato  sódico  y  otra  de  bicarbonato  sódico  y  ácido  cítrico. obtendrán un ambiente de  anaerobiosis.                    Figura 1: Sistema GASPAK para crecimiento de bacterias anaeróbicas  90 .Los  beneficios  de  estas  bacterias  en  el  organismo  son  variados:  Alivio  en  la  intolerancia a la lactosa. entre otros.

 mientras que aquellas que no  son capaces de hacerlo producirán colonias de color  blanco o incoloras (por ejemplo  Salmonella). En muestras clínicas.  Se  trata  de  un  medio  altamente  selectivo  debido  a  su  alta  concentración  salina. En este  91 .  las  peptonas.    Agar Manitol salado:  Medio de cultivo selectivo y diferencial.  Por  fermentación  de  la  lactosa.  alimentos.  y  la  mezcla  de  sales  biliares y el cristal violeta son los agentes selectivos que inhiben el desarrollo de gran  parte  de  la  flora  Gram  positiva.  Al  igual  que  el  agar  MacConkey.  disminuye  el  pH  alrededor  de  la  colonia. Todas las  especies de  la familia Enterobacteriaceae pueden crecer en el mismo.  Los  microorganismos no fermentadores de lactosa producen colonias blancas. de agua y alimentos.  la  lactosa  es  el  hidrato  de  carbono  fermentable.  alimentos  y  muestras  clínicas.  productos  cosméticos  y  otros  materiales de importancia sanitaria.  aerobios  y anaerobios facultativos.  Los  Staphylococcus  coagulasa  positivo  hidrolizan  el  manitol  acidificando  el  medio  por  lo  que las colonias aparecen rodeadas de una zona amarilla brillante. Los Staphylococcus  coagulasa negativos. utilizado para el aislamiento y diferenciación  de  Staphylococcus.  aportan  los  nutrientes  necesarios  para  el  desarrollo  bacteriano. En  este medio  de  cultivo. Permite diferenciar bacterias  que utilizan  o  no.  Un medio complementario al agar MacConkey es el agar ENDO LES para el aislamiento  y  cultivo  de  bacterias  coliformes  desde  distintas  fuentes  como  agua.  Esto  produce  un    viraje  del  color  del  indicador  de  pH  (rojo  neutro).  la  absorción  en  las  colonias  y  la  precipitación  de  las  sales  biliares.MEDIOS DE CULTIVO ÚTILES PARA AISLAMIENTO DE BACTERIAS DESDE ALIMENTOS    Agar MacConkey:  Este medio se utiliza para el aislamiento de bacilos Gram negativos de fácil desarrollo.  Es  recomendado  para  el  aislamiento  de  Staphylococcus  patogénicos  a  partir  de  muestras  clínicas.  Aquellas  bacterias  coliformes  capaces  de  fermentar  la  lactosa  (por  ejemplo  Escherichia  coli)  formarán colonias de color rojo en el medio de cultivo.  este  agar  permite  el  crecimiento  selectivo  de  Gram  negativos  e  inhibe  el  crecimiento  de  Gram  positivos. presentan colonias rodeadas de una zona roja o púrpura.  la  lactosa como fuente de carbono.

  rodeadas  de  una  zona  del  mismo color o púrpura.  y  el  rojo  fenol  es  el  indicador de pH.  En este  medio. producen ácidos.  Pueden  aislarse  distintas  especies  desde  fuentes  como  alimentos  hasta  muestras  clínicas. el cloruro de sodio (que se encuentra en alta concentración) es el agente  selectivo  que  inhibe  el  desarrollo  de  la  flora  acompañante. y pueden o no fermentar el manitol.  el  extracto  de  carne  y  la  pluripeptona  constituyen  la  fuente  de  carbono.  el  manitol  es  el  hidrato  de  carbono  fermentable. Staphylococcus aureus es  capaz  de  fermentar  el  manitol  y  sus  colonias  se  visualizan  como  colonias  amarillas  rodeadas  de  una  zona  del  mismo  color.medio  de  cultivo. con lo que se modifica el pH del medio y vira el  indicador  de  pH  del  color  rojo  al  amarillo.  nitrógeno. Luego de la incubación  puede  observarse  la  producción  de  piocianina  como  una  zona  de  color  azul‐verdoso  que rodea la colonia o que se extiende en todo el medio de cultivo debido a la difusión  del  pigmento. la peptona de gelatina aporta  los  nutrientes  necesarios  para  el  desarrollo  bacteriano.  Los  Staphylococcus  crecen  en  altas  concentraciones de sal. aeruginosa y estimular la formación de pigmentos.    Agar TCBS:  Es  un  medio  selectivo  para  el  aislamiento  y  cultivo  de  distintas  especies  del  género  Vibrio.  Por  otra  parte.  debido  a  sus  componentes nutricionales y a la alta concentración de sales.  los  Staphylococcus  que  no  fermentan  el  manitol. La fórmula de este medio está desarrollada  para favorecer la selección de P. la detección y la diferenciación de Pseudomonas  aeruginosa y de otras especies del género.  La  producción  de  piorrubina  se  observa  como  una  zona  de  color  rojo  alrededor  de  la  colonia  o  que  se  extiende  en  todo  el  medio  de  cultivo  debido  a  la  difusión del pigmento.  vitaminas  y  minerales.  Este  medio  es  altamente  selectivo  para  Vibrio  sp.    Agar Pseudomonas:  Medio de cultivo para el aislamiento. Es  también conocido  como Medio King A.  la  glicerina  favorece  la  producción de pigmentos. Las bacterias que crecen en un medio con alta concentración de sal y  fermentan el manitol. las sales de magnesio y potasio estimulan la producción de  piocianina y piorrubina e inhiben la producción de fluoresceína. Este medio junto con el  92 .  se  visualizan  como  colonias  rojas.

Tomar  una  muestra  de  alimento  según  la  especie  bacteriana  que  se  desee  aislar. 93 .  3.  el  tiosulfato  de  sodio  y  la  bilis  actúan  como  agentes  inhibidores  de  bacterias  Gram  positivas  y  coliformes  dando  alcalinidad  al  medio.  desde  la  cavidad  oral  y  microflora intestinal.  La  sacarosa  es  el  hidrato  de  carbono  fermentable. El crecimiento de Lactobacillus  en  anaerobiosis  se  evidencia  por  la  formación  de  colonias  redondas  y  blancas  en  el  medio.  El  citrato  de  sodio.  vulnificus no fermenta la sacarosa por lo que presenta una coloración verde. Aislar directamente en medio de cultivo selectivo indicado para cada caso.  vitaminas  y  aminoácidos. también se pueden encontrar en la leche y sus derivados.  opacas  y  de  color  amarillo.agua peptonada alcalina es utilizado para el aislamiento de V.    METODOLOGÍA GENERAL:  Para el aislamiento directo desde alimento de las distintas especies bacterianas se va a  seguir el siguiente esquema:     1.  Agar Rogosa:  Medio  para  el  aislamiento  y  recuento  de  Lactobacillus. el crecimiento de Vibrios capaces de fermentar la  sacarosa  da  lugar  a  la  formación  de  colonias  lisas.  el  cloruro  de  sodio  promueve  el  crecimiento.  4. cholerae y otras especies  a  partir  de  muestras  fecales.  2. Dentro  de  sus  componentes  se  caracteriza  por  un  bajo  pH  y  alta  concentración  de  acetato  para inhibir el crecimiento de otros microorganismos. Realizar análisis macroscópico y microscópico de colonias. Observar crecimiento de colonias aisladas.  5.  Luego de 18 – 24 hrs. El azul de bromotimol actúa como indicador de pH. de incubación.  el  tiosulfato de sodio es la fuente de sulfuro  y el citrato de hierro es un  indicador  para  detectar la producción de H2S.  V. Incubar a temperatura y tiempo adecuados.  Componentes  como  el  extracto  de  levadura  y  las  peptonas  proporcionan  al  medio  la  fuente  de  nitrógeno.

 Aislamiento de Enterobacterias desde sandwich.  94 .  5‐ Realizar  análisis  macroscópico  observando  colonias  con  distinta  morfología  y  color.  2‐ Depositar muestras de alimento en una placa de agar Pseudomonas. Rotular las placas.  Rotular las placas. a 37 °C.    2.  5‐ Realizar  análisis  macroscópico  observando  colonias  con  distinta  morfología  y  color.  4‐ Incubar durante 24 hrs.  3‐ Aislar la muestra empleando técnica de agotamiento por estrías con asa estéril  para cada caso.  empleando  una  tórula estéril.  2‐ Depositar muestra de alimento en una placa de agar MacConkey y en placa de  agar ENDO LES.  1‐ Tomar una muestra de leche y de huevo empleando una tórula estéril.  empleando  una tórula estéril.  4‐ Incubar durante 48 hrs.    3.  1‐ Tomar  una  muestra  de  pastel  desde  superficie  de  interés.  3‐ Aislar la muestra empleando técnica de agotamiento por estrías con asa estéril.  6‐ Realizar análisis microscópico empleando tinción de Gram. Aislamiento de Pseudomonas sp.  6‐ Realizar análisis microscópico empleando tinción de Gram. desde pastel. desde leche y huevo.  1‐ Tomar  una  muestra  de  sandwich  desde  una  superficie  de  interés. Rotular las placas. a 37 °C.  2‐ Depositar  muestra  de  alimento  en  una  placa  de  agar  manitol  salado  y  agar  sangre.  3‐ Aislar la muestra empleando técnica de agotamiento por estrías con asa estéril  para cada caso. Aislamiento de Staphylococcus sp.Actividades Prácticas    1.

4‐ Incubar durante 48 hrs.  3‐ Aislar la muestra empleando técnica de agotamiento por estrías con asa estéril.  2‐ Depositar muestras de alimento en una placa de agar rogosa.  4‐ Incubar durante 48 hrs. desde yogur. desde choritos.  2‐ Depositar muestras de alimento en una placa de agar TCBS.  Rotular las placas. empleando una tórula estéril.  6‐ Realizar análisis microscópico empleando tinción de Gram.  4‐ Incubar  durante  a  37  °C  en  condiciones  de  anaerobiosis  empleando  una  jarra  Gaspak. a 42 °C.  Rotular las placas.  5‐ Realizar análisis macroscópico de colonias.  5‐ Realizar  análisis  macroscópico  de  colonias  observando  morfología  y  pigmentación.   1‐ Tomar una muestra desde yogur. empleando una tórula estéril.  6‐ Realizar análisis microscópico empleando tinción de Gram. Aislamiento de Vibrio sp. Aislamiento de Lactobacillus sp.  5‐ Realizar análisis macroscópico observando colonias con pigmentación de color  verde‐azulado.          95 . a 37 °C.  3‐ Aislar la muestra empleando técnica de agotamiento por estrías con asa estéril.    5.  1‐ Tomar una muestra desde choritos.  6‐ Realizar análisis microscópico empleando tinción de Gram.    4.

APUNTES  96 .

APUNTES  97 .

  pelos. fruta. incluyendo la penicilina.  Los  hongos. Por otro lado. Algunos producen  toxinas altamente venenosas.  plumas.  pintura.  98 .  muchos  hongos  son  valiosos  desde  el  punto  de  vista  comercial. están los hongos patógenos.  Los  alimentos  se  disuelven mediante enzimas que secretan los hongos.  Cerca  de  5.000 especies de hongos atacan cultivos comerciales.  junto  con  las  bacterias  heterótrofas  y  un  reducido  grupo  de  otros  organismos constituyen los descomponedores de la biosfera. las asociaciones existentes entre los hongos y las  raíces  de  las  plantas  (micorrizas)  juegan  un  rol  fundamental  en  la  nutrición  y  distribución de muchas especies vegetales.  Por  otra  parte. vegetales. además de a la mayoría de las  especies silvestres.  que  son  útiles  debido  a  su  utilidad  para  producir  sustancias  como  el  etanol  y  el  dióxido  de  carbono. además de sus potenciales usos como fuente de  proteínas.  Atacan  madera.  equipados  con  un  poderoso  arsenal  de  enzimas  que  degradan  los  compuestos orgánicos.  Los  hongos.  en  donde  pueden ser nuevamente  utilizados por las plantas y eventualmente  por los animales. Por ejemplo.  Pueden crecer sobre pan. Su actividad es esencial  para el continuo funcionamiento de la naturaleza. después se absorben a través de  la fina pared de la célula y se distribuyen por difusión simple en el protoplasma.  Otros  son  de  interés  como  fuentes  de  antibióticos.  Adicionalmente es importante señalar su importancia en la asociación que presentan  con otros organismos.  y  de  hecho  casi  cualquier  sustancia.TRABAJO PRÁCTICO Nº6:  HONGOS UNICELULARES Y FILAMENTOSOS  INTRODUCCIÓN  Los Hongos constituyen un grupo diverso de organismos unicelulares o pluricelulares  que  se  alimentan  mediante  la  absorción  directa  de  nutrientes. carne y otros productos.  Por  ejemplo  las  levaduras.  quienes  constituyen  la  principal  causa  de  las  enfermedades  de  las  plantas. La descomposición libera dióxido de  carbono  y  aporta  compuestos  nitrogenados  y  otros  minerales  al  suelo. muchas veces constituyen organismos dañinos para el hombre.  ropa.

  La  clasificación  se  basa  en  las  diferencias  en  sus  estructuras reproductivas.  cuyo contenido en glucosa es mayor que el de otros medios de cultivo y el pH es ácido  (pH  5. mientras que el  primero  agrupa  a  los  hongos  inferiores. hongos dermatofitos. 15‐30 días).  dentro  de  una  estructura  especial  denominada  ascos.  Ascomycota  y  Basidiomycota.6)  para  impedir  la  contaminación  bacteriana. 48 h aprox.  mientras  que  los  Basidiomycota  producen  basidioesporas  en  un  basidio. Estos dos últimos son considerados hongos superiores. aterciopeladas Colonias semejantes a las bacterianas Sifonado Septado Levaduras Micelio Unicelular Pluricelular   99 .  Generalmente  se  incuban  a  25‐ 30°C  por  un  tiempo  que  depende  de  la  especie  fúngica  (levaduras  y  hongos  ambientales.  generalmente  se  le  clasifica  en  tres  órdenes:  Zygomycota.  Colonias algodonosas.  Los Zygomycota  poseen  zygoesporas  como  esporas  de  reproducción  sexual  (cigotos  con  una  gruesa  pared  celular  y  sin  asociación  a  un  oogonio).  los  Ascomycota  producen  ascoesporas.    TALO  (cuerpo macroscópico)                          Tanto las levaduras como los hongos filamentosos se siembran en agar Sabouraud. lanosas.Aunque  existe  una  importante  discrepancia  en  la  clasificación  de  este  reino.

  Las  levaduras  más  importantes  desde  el  punto  de  vista  comercial  son  las  cepas  cerveceras  y  panaderas  del género Saccharomyces.  Penicillium). la aspergilosis se  adquiere  de  fuentes  exógenas.:  Los  microorganismos  que  pertenecen  a  éste  género  son  extremedamente frecuentes en el medio ambiente y de crecimiento rápido (48 h).  Dermatophytos).  Aspergillus. café y negras). la  cerveza.  Los hongos sifonados son  generalmente multinucleares (ej.  especialmente  insectos. etc. el vino.     Hongos Filamentosos:    Estos pueden  ser sifonados (aseptados) o septados.  como  patógenos  oportunistas  (ej. Microscópicamente presentan  hifas septadas de la que nace una prolongación no septada (conidóforo). Algunas  de  ellas  viven  en  simbiosis  con  animales. ya que juegan un papel crucial en la preparación del pan.  Normalmente  prosperan  en  hábitats  con  abundante azúcar. flores e incluso la corteza de los árboles.    1) Hongos septados  Estos  hongos  pueden  presentarse  como  contaminantes  ambientales  (ej.  Estos  microorganismo  se  identifican  por  sus  características  morfológicas  presentando  colonias  aterciopeladas. verde. Mucoral) y los hongos septados presentan hifas con  tabiques  que  son  prolongaciones  de  la  membrana  citoplasmática  (ej.Hongos unicelulares (Levaduras)    Las  levaduras  son  organismos  fúngicos  unicelulares  que  generalmente  se  reproducen  asexualmente  por  gemación.  algodonosas  o  pulvurentas. Gran  parte de este tipo de hongos se consideran contaminantes de  alimentos. coloreadas (crema.  sin  embargo  Penicillium  camemberti  y  Penicillium  roqueforti  son  ejemplos  de  aquellos  que  son  utilizados  en  la  empresa  alimenticia. el  cual  se  dilata  en  su  extremo  distal  (vesículas)  rodeándose  allí  de  células  conidiogénicas  100 .  específicamente  en  la  generación de quesos especiales: el queso Camembert y el queso Roquefort. En  contraste con la mayoría de las infecciones producidas por Candida.  Aspergillus)  y  como  patógenos  (ej. tales como frutas.  Dermatophytos).      Aspergillus  spp.

  aunque  pueden  producirse  colonizaciones  transitorias.  De  las  aproximadamente  900  especies  de  Aspergillus  descritas. fiálide y conidios se conoce como “cabeza aspergilar”.  A. Ver Figura 2.    101 . Las fiálides producen conidios los que se disponen en forma de cadenas.  El  conjunto vesícula.  La  aspergilosis  está  asociada  con problemas respiratorios como la dilatación crónica de la vía aérea hasta un colapso  de un segmento pulmonar.    Figura 2: Estructura microscópica de especies de Aspergillus.  Flavus  son  las  que  con  mayor  frecuencia  se  asocian  a  enfermedad  invasiva.(fiálides).  Fumigatus  y  A.    Son  ubicuitarios  en  el  ambiente  y  no  forman  parte  de  la  flora  normal  del  ser  humano.

 3).  102 . Esta observación casual llevó al descubrimiento de la penicilina.  Penicillium  : Estos microorganismo son ubicuitarios en el medio ambiente y  suelen  aislarse  en  muestras  de  aire  y  como  contaminantes  en  los  cultivos  de  laboratorio. bazo y hueso.  destruyendo  las  bacterias  que  se  encontraban  inmediatamente  en  contacto  con  el  hongo. En 1929.  como  una  placa  de  agar. Sir Alexander Fleming observó que  una  especie  de  Penicillium  había  contaminado  su  cultivo  de  Staphylococcus  aureus.  marnefeii  es  la  única  especie  patógena  de  Penicillium  y  es  causa  de  infecciones  espontáneas  del  sistema  retículoendotelial. hígado.  afectando  vasos  linfáticos. de color verde azulado (Fig.  pulmón.  germinan  y  crecen  rápidamente  produciendo  colonias con aspecto polvoriento.  Cuando  se  alojan  en  superficies.                                       Figura 3: Aspecto microscópico de Penicillium. desarrollándose en 3‐4 días.    P.    Los hongos que pertenecen a este género se caracterizan por la producción de  conodióforos  en  el  extremo  de  hifas  septadas  ramificantes.

2) Hongos sifonados.      Zigomicetos  : Especies de Rhyzopus, Mucor y Absidia han sido implicados en 

cuadros  de  zigomicosis.  Macroscópicamente  presentan  un  micelio  algodonoso.  Microscópicamente,  forman  hifas  aceptadas  y  se  reproducen  asexualmente  produciendo  esporangios  en  los  que  se  desarrollan  esporas  (Ver  figura  4).  Las  enfermedades  asociadas  a  estos  microorganismos  son  usualmente  la  mucormicosis  rinocerebral.  Esta  infección  se  origina  en  los  senos  paranasales  y  puede  afectar  la  órbita  y  el  paladar,  extendiéndose  hacia  el  cerebro.  En  pacientes  inmunodeprimidos  puede afectar el pulmón, el tracto gastrointestinal y los tejidos subcutáneos.   

 

    Figura  4:  Aspecto  microscópico  de  hongos  sifonados.    103

OBJETIVOS 
  1. Conocer  y  caracterizar  la  morfología  macroscópica  de  las  colonias  de  hongos  unicelulares o levaduras.  2. Conocer la morfología microscópica de las levaduras. 

  ACTIVIDADES PRÁCTICAS 
  1. Observación y descripción de cultivos de levadura.  a) Examen  macroscópico:  Describa,  tal  como  lo  hacía  para  colonias  bacterianas,  forma, color, aspecto de la superficie, borde, elevación y brillo de las colonias.  Anote lo que observe.  b) Examen microscópico: Realice una tinción Gram tradicional. Es decir, realice un  frotis  con  la  colonia  de  levaduras  en  una  gota  de  agua  y  continúe  con  el  protocolo por Ud. conocido. Observe con inmersión y dibuje lo que observa.    Nota: La tinción Gram es sólo una técnica de tinción. Las levaduras no son Gram  positivo ni Gram negativo.  Recuerde que la característica de ser Gram positivo  o  Gram negativo está relacionada con propiedades que pertenecen a las membranas  bacterianas.    2. Observación, descripción y siembra de hongos filamentosos.    a) Examen  macroscópicos:  Color  y  aspecto  (aterciopelada,  algodonosa,  polvorienta, lanosa) en anverso y reverso. Anote lo que observe.  b) Examen microscópico: Para esto se estudiaran microcultivos preparados por los  docentes usando el objetivo 40X.          104

3. Siembra y observación de hongos provenientes de muestras de alimento.    a) Reconozca a partir de diferentes muestras de quesos (Camembert, Roquefort),  hongos  que  se  encuentran  formando  parte  del  proceso  de  maduración  de  éstos. Siembre en agar Sabouraud en césped. Realice un examen macroscópico  y microscópico. Anote lo que observe.    b) Observación de levadura del pan Saccharomyces cerevisiae. Tome una muestra,  resuspenda en  medio  de  cultivo  y  siembre  en  cuadrantes  en  agar  Saburoaud.  Una vez crecida, realice Tinción Gram y observación de este hongo unicelular.    c) Observación de Nódulos de Kefir (yogur de pajarito). Realice una tinción Gram a  una  muestra  de  nódulo  y  observe  la  diversidad  microbiana  que  presenta  este  nódulo, incluyendo levaduras y bacterias.   

Nota :  
 Recuerde el principal criterio para la  identificación de estos microorganismos es el  morfológico, por lo tanto, es importante que trabaje con cuidado.   Recuerde  que  está  trabajando  con  patógenos  oportunistas:  Trabaje  siempre  cerca  del mechero y no se acerque demasiado a los medios que contienen los hongos. Así  mismo, ante cualquier posibilidad de contaminación, lávese de inmediato. 

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APUNTES  106 .

APUNTES  107 .

comienza con el recorrido de nuestros esfuerzos” 108 .  “El camino al éxito.

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