You are on page 1of 21

Prehrambeno-biotehnološki fakultet Zavod za biokemijsko inženjerstvo Laboratorij za tehnolgiju i primjenu stanica i biotransformacije

TEHNOLOGIJA ŽIVOTINJSKIH I BILJNIH STANICA
(4 ECTS)

Predavanja Seminari Vježbe
Nositelj modula: Nastavnici i suradnici:

20 h 15 h 15 h
Dr. sc. Višnja Gaurina Srček, doc. Dr. sc. Jasna Vorkapić-Furač, red. prof. Dr. sc. Ivana Radojčić Redovniković, doc. Dr. sc. Igor Slivac, doc. Kristina Radošević, dipl. ing. Marina Cvjetko, dipl. ing.

Raspored metodskih jedinica po datumima održavanja i predavačima

Datum
12. 10. 2010. 15.10. 2010. 19. 10. 2010. 22. 10. 2010. 26.10. 2010. 29 .10. 2010. 02. 11. 2010. 05. 11. 2010. 09. 11. 2010. 12. 11. 2010. 16. 11. 2010. 20.11. 2010. 23. 11. 2010. 26. 11. 2010.

Vrsta nastave
Predavanje Predavanje Predavanje Predavanje Predavanje Predavanje Predavanje Predavanje Predavanje Predavanje Seminar Seminar Seminar Seminar

Naziv nastavne jedinice
Svojstva kulture životinjskih stanica. Primarne kulture i stanične linije. Priprava i uzgoj biomase životinjskih stanica. Kinetika rasta i metabolizam stanica. Razvoj stanične linije Bioreaktori za kulture životinjskih stanica Kultura biljnih stanica i dobivanje biomase stanica, začetak staničnih kultura, održavanje kalusa i priprava suspenzijskih stanica. Infekcija biljnog materijala, sekundarni metaboliti i biotransformacije. Proizvodi tehnologije životinjskih stanica-virusna cjepiva; monoklonska protutijela Tkivno inženjerstvo. Dostignuća u primjeni matičnih stanica. Genetika transformacije biljaka i genetičko inženjerstvo. Bioreaktori za biljne stanice Praćenje i kontrola procesa s kulturama životinjskih stanica Postupci pročišćavanja proizvoda dobivenih tehnologijom životinjskih stanica Genetički modificirane biljke – za i protiv. Coleus blumei-izvor ružmarinske kiseline

Nastavnik
V. Gaurina Srček V. Gaurina Srček V. Gaurina Srček V. Gaurina Srček J. Vorkapić-Furač J. Vorkapić-Furač V. Gaurina Srček V. Gaurina Srček J. Vorkapić-Furač I. Radojčić Redovniković V. Gaurina Srček K. Radošević I. Radojčić Redovniković M. Cvjetko

1

Prehrambeno-biotehnološki fakultet Zavod za biokemijsko inženjerstvo Laboratorij za tehnolgiju i primjenu stanica i biotransformacije

Svojstva kulture životinjskih stanica Primarne kulture i stanične linije
Predavanje 1 Dr. sc. Višnja Gaurina Srček, doc.
Utorak, 6. listopada 2009.

ZBOG ČEGA RAST ŽIVOTINJSKIH STANICA U KULTURI? Primjena kulture životinjskih stanica
• Istraživanja fiziologije i biokemije stanica • Ispitivanje učinaka različitih spojeva na specifične tipove stanica (metaboliti, hormoni, faktori rasta) • Proizvodnja umjetnih tkiva (koža) • Sinteza viskovrijednih bioloških spojeva (proteini za terapijsku primjenu, virusna cjepiva, monoklonska protutijela)

2

Nedostaci primjene kulture životinjskih stanica Kriterij Ekspertiza Kontrola uvjeta Primjer Rukovanje. Prednosti primjene kulture životinjskih stanica Kriterij Fizikalno-kemijski okoliš Fiziološki uvjeti Mikrookoliš Homogenost stanične linije Karakterizacija Pohranjivanja Validacija&akreditacija Štednja reagensa Smanjenje broja životinja Prednost Kontrola pH. otopljenih plinova. Tablica 2. promjenjljivost Dediferencijacija. unakrsna kontaminacija Radno mjesto. temperature Kontrola hranjivih tvari i hormona Regulacija interakcija stanica-stanica Dostupnost medija za uzgoj. kontrola pH odlaganje biološkog otpada Količina i troškovi Genetička nestabilnost Fenotipska nestabilnost Identifikacija Kapitalna oprema. kozmetičkih pripravaka i sl. medij. mikrobna kontaminacija. praćenje toksičnosti farmaceutika. kemijska kontaminacija. selekcija Ekspresija markera. smanjenje troškova Citotoksičnost.Tablica 1. serum. histologija. citologija 3 . adaptacija. kloniranje Rutinski se provodi Čuvanje u tekućem dušiku Porijeklo i čistoća se mogu pratiti Smanjenje volumena. suñe Heterogenost. inkubacija.

Povijesni razvoj tehnologije životinjskih stanica 1880 Roux održavao pileće embrije u otopini soli 1890 1900 Harrison uzgajao žablje živčane stanice “hanging drop” tehnikom 1910 Carrel koristio aseptičnu tehniku za dugotrajan uzgoj Rous&Jones koristili tripsin za subkultiviranje 1920 Oblikovana “Carrel-ova” boca za kulturu stanica 1930 1940 Dodani antibiotici u podlogu za uzgoj Earle izolirao mišje L fibroblaste Enders uzgojio virus dj. paralize na kultiviranim ljudskim stanicama 1950 Gey uzgojio HeLa stanice Earle razvio kemijski definiranu podlogu za uzgoj 1960 Hayflick&Moorhead dokazali da ljudske stanice imaju ograničen životni vijek Ham uzgojio stanice u podlozi bez dodatka seruma Harris&Watkins fuzionirali ljudske i mišje stanice 1970 Kohler&Milstein proizveli hibridomske stanice koje izlučuju protutijela 4 .

stanice tvore monosloj na čvrstoj podlozi Različite stanice u ko-kulturi s i bez matriksa. uspostavljena organotipna struktura Slika 1. stanice migriraju i prerastaju Razgrañeno tkivo. Vrste kultura stanica 5 . zadržana histološka struktura Tkivo na čvrstoj podlozi.Sato razvio podlogu bez seruma iz hormona i faktora rasta 1980 Proizveden humani inzulin pomoću bakterija Monoklonsko protutijelo (OKT3) korišteno za terapiju u ljudi Licencirana proizvodnja rekombinantnog tPA za terapiju u ljudi 1990 Humanizirana himerna protutijela korištena za terapiju u ljudi Izolacija matičnih stanica 2000+ Human Genome Project (HUGO) Tkivno inženjerstvo Primjena matičnih stanica Vrste kultura životinjskih stanica KULTURA ORGANA KULTURA EKSPLANTATA KULTURA STANICA ORGANOTIPSKA KULTURA Tkivo.

homogene (genetički identične) i heterogene kulture stanica.stanje od izolacije stanica do prvog supkultiviranja/precjepljivanja Najsličnija je prirodnom tkivu Heterogenost Ograničeni potencijal rasta Kriza besmrtna transformirana stanična linija Faza 3 Normalne stanice Ograničeni životni vijek Može prerasti u staničnu vrstu ili se imortalizirati Slika 2.stanice izdvojene iz tkiva ili cijelih životinja. Faze rasta normalnih i transformiranih stanica Relativan broj stanica Faza 1 Faza 2 50 Broj generacija 6 . nastavljaju rasti in vitro ukoliko su opskrbljene hranjivim tvarima i faktorima rasta.Kultura stanica .problemi dugotrajnog održavanja zbog različitih potencijala rasta pojedinačnih stanica unutar tkiva 1. PRIMARNA KULTURA • • • • • • Kultura dobivena izravno iz tkiva .najčešće korištena tehnika zbog kontole uvjeta uzgoja te konzistencije i reproducibilnosti u staničnom rastu Kultura organa i tkiva . .održavanje cijelih organa ili dijelova tkiva. . .

skalpeli) • kod male količine tkiva i kad prinos stanica nije od velike važnosti . Razgradnja tkiva . elastaza. osobito ako se radi s tkivom koje potječe od ljudi rad s embrionalnim tkivom-posebna regulativa 2. Započinjanje kultureinkubacija.mehaničko usitnjavanje (škare. Koraci u uspostavi primarne kulture 1.Koraci u uspostavi primarne kulture 1. 3. 2. DNA-ze.enzimska disocijacija • • • cilj je razbiti veze izmeñu stanica i ekstracelularnog matriksa enzimi koji se koriste za razgradnju: tripsin. Slika 3. ONE TO VEĆ JESU! 7 . hijaluronidaza. kolagenaza II.uvijek u skladu s pravilima • • siguran rad. prihvaćanje i rast stanica 3. Izolacija tkiva 2. Usitnjavanje tkiva (mehaničko) i razgradnja stanica proteolitičkim enzimima 1. pronaze najčešće se koristi kombinacija spomenutih enzima IZUZETAK: HEMATOPOETSKE STANICE NE TREBA DISOCIRATI. Izolacija tkiva .

Inkubacija. faktora rasta te kontroliranu atmosferu i temperaturu. u laboratorijskim uvjetima ta podloga su različite posude (Petrijeve zdjelice. Fizikalne veze izmeñu stanica i ECM 8 . interakcija izmeñu stanične membrane i površine za rast je kritičan korak i uključuje kombinaciju elektrostatskih privlačenja i van der Waalsovih sila.3. nacjepljivanje prihvaćanje (1-2 h) stanica supstrat/čvrsta podloga širenje (24 h) Slika 5. stanice se nalaze u kontaktu s ostalim stanicama te u kontaktu s ekstracelularnim matriksom (ECM) veze izmeñu stanica i stanica i ECM uključuju brojne ligande i receptore za prihvaćanje stanica Slika 4. T-boce. soli.). prihvaćanje i rast stanica • • • • • stanice zahtijevaju čvrstu podlogu za prihvaćanje prije nego doñe do rasta stanica. prihvaćanje stanica se odvija u prisustvu Ca2+ kationa i bazičnih proteina pri čemu nastaje sloj izmeñu čvrste podloge i površine stanice stanice zahtijevaju medij za uzgoj s dodatkom glukoze. Prihvaćanje adherentnih stanica na čvrstu podlogu Fizikalne veze izmeñu stanica • • kod višestaničnih organizama... hormona. vitamina. aminokiselina.

Epitelne stanice • • prekrivaju organe i šupljine (koža. relativno se jednostavno uzgajaju i imaju duplikacijsko vrijeme 18-24 h. probavni sustav). rastu kao pojedinačne stanice tvoreći monosloj i karakterističnu strukturu (kao kaldrma). Fibroblasti • • • potječu od vezivnog tkiva i najčešći su tip korištenih stanica.Tipovi stanica • životinjske stanice se definiraju tkivom iz kojeg potječu te imaju karakterističan oblik/morfologiju koja se može vidjeti svjetlosnim mikroskopom. stanice su okruglog oblika kad se disociraju tripsinom. 9 . a kako rastu poprimaju karakterističan vretenasti oblik.

stanice) zbog 10 .Mišićne stanice • mišićno tkivo sadrži niz tubula nastalih iz stanica prekursora koje se fuzioniraju i stvaraju višejezgrine komplekse koji sadrže i strukturne proteine aktin i miozin Krvne stanice • najčešće se koriste limfoblasti (bijele krvne sposobnosti izlučivanja imunoregulacijskih spojeva.

neurita. neuroblastomi posjeduju neke karakteristike neurona. a dobivena je nakon in vitro oplodnje 11 .Živčane stanice • • • • živčano tkivo se sastoji od neurona neophodnih za prijenos električkih impulsa. a potječu od tumorskih stanica koje rastu u kulturi. Matične stanice Embrionalne matične stanice • • • • stanice koje imaju sposobnost “neograničenog” rasta i diferencijacije u bilo koji tip stanica prvi put su izolirane 1998. na Sveučilištu Wisconsin (Thomson i suradnici) dobili su nekoliko staničnih linija koje su rasle s najmanje 300 udvostručenja populacije stanica izolirane su iz unutrašnje stanične mase ljudske blastocite (otprilike 30 stanica) koja je bila stara nekoliko dana. visokodiferencirane stanice koje se u kulturi ne dijele dodatkom NGF može doći do nastajanja tzv. g.

Karakteristike embrionalnih matičnih stanica 1. Visoka aktivnost telomeraza Matične stanice iz odraslog organizma • • nediferencirane stanice tkiva ili organa služe za zamjenu ili popravak oštećenog tkiva Stanice koštane srži • -diferenciraju hematopoetskim putem 12 . Pluripotentnost-prekursori za sve stanične tipove u organizmu 2. Diploidni kariotip 5. Izravna diferencijacija 4. Neograničeno umnažanje u nediferenciranom stanju 3.

tumorskih stanica. supkultiviranje 2. Obično imaju izmijenjeni broj kromosoma (aneuploidi). Proliferacija i zadržavanje diferencijacijskih svojstava obično nisu povezani. Mogu se dobiti iz: • • • • • • • staničnih sojeva. U kulturi mogu rasti neograničeno. Faze razvoja stanične linije 13 .2. supkultiviranje Kontinuirana stanična linija (20-80 dioba) Kumulativni broj stanica Starenje i stanična smrt Interval izmeñu supkultiviranja Tjedni u kulturi Slika 6. transformiranih stanica. Razvoj stanične linije Transformacija Transformacija Primarna kultura Konačna stanična linija 1. Mogu rasti neovisno o podlozi za rast. STANIČNE LINIJE • • Stanice dobivene iz jedne parentalne transformirane stanice.

matične stanice i transformirane stanice).spontano .Razvoj stanične linije . • Neke stanice mogu postati kontinuirane stanične linije i praktički se mogu “neograničeno” uzgajati. • Uzrok tome je progresivno skraćivanje telomera nakon čega se stanice ne mogu više dijeliti (iznimke su spolne stanice.tumori 14 . • Normalna stanična linija se dijeli samo odreñeni broj puta tako da će stanične linije iz normalnog tkiva odumrijeti nakon odreñenog broja supkultiviranja.virusi .mutageni .onkogeni .nastavak • Nakon prvog supkultiviranja ili pasažiranja primarna kultura postaje stanična linija i može se uzgajati i pasažirati nekoliko puta. Transformacija stanica Cilj: omogućavanje neograničenog rasta životinjskih stanica Karakteristike • • • • • neograničeni životni vijek visok potencijal rasta niska ovisnost o faktorima rasta rast u suspenziji aneuploidi Metode dobivanja .

inženjerstvo brzorastuće tumorske stanice izolirane 50-ih god.org National Institute of Health (NIH) European Collection of Cell Culture www. odgovor na NGF izlučuju imunoglobuline Humani karcinom cerviksa Epitelne Mišje vezivno tkivo Pseći bubrezi Humana embr.ecacc. Najčešće korištene stanične linije Stanična linija BHK CHO HeLa L MDCK MRC-5 Namalwa WI-38 3T3 Vero NB41A3 MPC-11 Porijeklo Bubreg hrčka Ovarij kineskog hrčka Tip stanice Fibroblasti Epitelne Komentar adherentne i suspenzijske za proizvodnju cjepiva adherentne i suspenzijske pogodne za genet.Tablica 3.atcc. pluća Mišje vezivno tkivo Bubreg afričkog zelenog majmuna Mišji neuroblastom Mišji mijelom Fibroblasti Epitelne Fibroblasti Limfoblasti Fibroblasti Fibroblasti Fibroblasti Dostupnost staničnih linija Banke stanica: imaju veliki izbor karakteriziranih staničnih linija • • • • • American Type Cell Culture ATCC www.org. pluća Humani limfom Humani embr.uk Ostale privatne ili javne banke stanica Sam autor neke stanične linije 15 . prošlog stoljeća za proizvodnju cjepiva u veterini za proizvodnju humanih cjepiva za proizvodnju alfa-interferona za proizvodnju humanih cjepiva za razvoj tehnika zbog brzog rasta slična diploidnim staničnim linijama za proizvodnju humanih cjepiva Neuronske Limfoblasti posjeduju karakteristike neuronskih stanica.

tijekom proizvodnje te na kraju proizvodnog ciklusa. • stanice se počinju razlikovati od ishodnih stanica i stoga se genetičke karakteristike rastućih stanica moraju periodički pratiti. • promjene nastaju putem unutrašnjih izmjena u genomu nastalih djelovanjem mutacija ili selektivnim pritiscima. • cilj ovih ispitivanja je da se potvrdi identitet.Karakterizacija staničnih linija • stanične linije koje rastu kontinuirano u kulturi su osjetljive na genetičke promjene. radne banke stanica. Kariotip • • koristi se za utvrñivanje raspodjele kromosoma i može ukazivati na vrstu od koje potječu stanice kariotipom se može utvrditi da li su stanice transformirane ili da li je došlo do oštećenja kromosoma Princip • • • bojanje npr Giemsa bojom (visoko kondenzirani kromosomski materijal) rezultira karakterističnim oblikom transformirane stanice mogu biti heteroploidi brojanje kromosoma iz cca 100-200 stanica kako bi se izračunao modalni broj kromosoma 16 . čistoća i genetička stabilnost stanične linije. Testovi utvrñivanja identiteta staničnih linija 1. • ispitivanja se provode na razini master banke stanica.

Obilježavanje protutijelima • karakterizacija stanične linije uporabom fluorescentno obilježenih protutijela specifičnih za membranske antigene 4. laktat-dehidrogenaza i nukleozid fosforilaza 3.2. DNA fingerprinting • • rezultat fragmentacije nastao razgradnjom stanične DNA pod djelovanjem restrikcijskih endonukleaza nastali restrikcijski fragment se razdvaja elektroforezom. hibridizira i nastaje specifični “bar-code” oblik 17 . ali imaju različitu proteinsku strukturu gel elektroforeza staničnih homogenata pod nereducirajućim uvjetima bojanje proteinskih vrpci karakterističnih za pojedinu staničnu liniju najbolje su karakterizirani enzimi poput glukoza-6-fosfat dehidrogenaza. Izoenzimi • • • • • koristi se za utvrñivanje vrste od koje potječu stanične linije s visokim stupnjem pouzdanosti izoenzimi su različiti oblici istog enzima koji kataliziraju istu reakciju.

Testovi sterilnosti • banke stanica i hranjiva podloga nakon proizvodnje se testira na prisustvo bakterija i plijesni primjenom metode izravne inokulacije s dvije različite hranjive podloge. ovaj test se jednom provodi prije ispitivanja i odreñivanja mogućih inhibitornih učinaka ispitivanog materijala na rast bakterija/plijesni. • • • bakterije kvasci plijesni Slika 7. Primjeri kontaminacije stanične kulture 18 . standardi predviñaju da se testiraju najmanje 1% ili minimalno 2 ampule iz banke stanica.Testovi odreñivanja čistoće stanične linije 1. vrijeme inkubacije je 14 dana.

Ciklus (14 dana) 2. tripsin. osoblje koje radi sa stanicama 3. Test na mikoplazme • mikoplazme su paraziti koji mogu inficirati stanice te dovesti do narušavanja staničnog rasta. Testiranje na slučajne viruse • • • utvrñivanje širokog spektra virusa koji mogu kontaminirati staničnu liniju. serum. zaražene stanice iz banke stanica 2. odreñuju se virusi ovisno o porijeklu i vrsti stanične linije uključuje ljudske/non-human stanične linije primata koje su osjetljive na humane viruse... Ciklus (14 dana) T 75 -boca Hemadsorpcija Hematglutinacija Detekcijski limit >100 CFU T 75 -boca Multiwell ploča Hemadsorpcija Hematglutinacija Detekcijski limit >100 CFU Hemaglutinacija CPE Hemadsorpcija 19 . 1.2. ELISA 3. Izvori konaminacije mogu biti: 1. Testovi odreñivanja mikoplazmi • • • test na hranjivom agaru ili hranjivoj podlozi fluorescentno bojanje (Hoechst 33258) PCR.

indikator prisustva retrovirusa Metode odreñivanja retrovirusa PCR transmisijska elektronska mikroskopija Terminologija Kultura organa • trodimenzionalna kultura nerazgrañenog tkiva koja zadržava neka ili sva svojstva tkiva in vivo Kultura stanica • pojedinačne stanice dobivene dispergiranjem stanica nekog tkiva Primarna kultura stanica • dobivena iz tkiva uzetog izravno iz eksperimentalne životinje • obično preživljava konačan vremenski period • uključuje enzimsku i /ili mehaničku razgradnju tkiva te odreñene selektivne korake kako bi se iz heterogene populacije izolirale stanice od interesa 20 . Testiranje na retroviruse • stanice štakora posjeduju endogene retroviruse i stoga se mora utvrditi da li su ti virusi infektivni i da li mogu inficirati ljudske stanice -reverzna transkriptaza .4.

Terminologija .nastavak Klon • populacija stanica dobivena iz jedne jedine stanice Supkultiviranje • prijenos stanica iz jedne posude za uzgoj u drugu (precjeplivanje) Uspostavljena stanična linija • primarna kultura koja je postala besmrtna zbog postupaka transformacije • često se dobivaju iz tumorskog tkiva ili se transformiraju virusima poput Epstein-Barr virusa Broj pasaža • broj sukcesivnih supkultiviranja iz primarne kulture 21 .