You are on page 1of 7

PRÁCTICA DE LABORATORIO MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS 2011 – I DETERMINACIÓN DE ESPORAS DE Clostridium SULFITOS REDUCTORAS Guerra Laura, Mejía Leonardo, Paniquita

Carolina, Peñaloza Yanireth, Romero Nelsy INTRODUCCIÓN El género Clostridium está formado por más de cien especies con limitada relación genética y propiedades bioquímicas diversas. Comprende a bacilos grampositivos, anaerobios, esporulados. Son ubicuos pudiendo ser encontrados en el suelo y aguas residuales así como también en la flora intestinal de hombres y animales. En su mayoría son saprofitos, pero los patógenos pueden causar graves enfermedades como gangrena gaseosa, botulismo, tétanos, infecciones de piel y partes blandas, colitis asociada a antibióticos e intoxicaciones alimentarias. La capacidad para provocar enfermedad está vinculada a la posibilidad de sobrevivir en condiciones ambientales adversas mediante la formación de esporas, crecer rápidamente y producir toxinas histolíticas, enterotoxinas y neurotóxicas. (Aycachi R. 2008) Clostridium perfringens es la especie del género Clostridium más frecuentemente aislada en materiales clínicos. Es un bacilo gram positivo grande de bordes rectos y extremos romos. Desarrolla rápidamente en anaerobiosis, produciendo colonias grandes que muestran doble halo de hemólisis en las placas de agar sangre. Sus características morfológicas, la demostración de presencia de esporas, el rápido desarrollo en anaerobiosis y algunas propiedades bioquímicas (lecitinasa) conforman un perfil que facilita su rápida detección en el laboratorio. (Aycachi R. 2008) El método de recuento en tubo, es otro método que permite la determinación del número de microorganismos viables presentes en muestras de alimentos. Este método, es particularmente útil para el recuento de microorganismos anaerobios, tales como los Clostridium sulfito reductores, siempre y cuando se utilice el medio adecuado y las correctas condiciones de incubación. Los medios de cultivo empleados para el recuento de anaerobios (por ejemplo Clostridium sulfito reductores), son el medio Triptona Sulfito Neomicina Agae (TSN Agar), o el medio Sulfito Polimixina Sulfadiacina Agar (SPS Agar). (Alayo G, 2008).

OBJETIVO GENERAL  Determinar la presencia de esporas de Clostridium sulfito reductor a partir de productos enlatados (Atún Vam Camp´s).

OBJETIVOS ESPECÍFICOS:  Identificar la presencia de Clostridium sulfito reductor en la muestra de alimento (Atún Vam Camp´s), mediante el color y el número de las colonias.

la enterotoxina se une a un receptor de membrana del ribete en cepillo e induce una alteración de la permeabilidad calcio dependiente resultando en una pérdida de iones y metabólitos. Clostridium perfringens es agente etiológico de muchas enfermedades y es la tercera causa de toxiinfección alimentaria bacteriana después Salmonella spp y Staphylococcus aureus. suelos. anaeróbicos. Son deteriorantes. vegetación en descomposición. agua. ennegrecimiento del producto cuando éste tiene hierro. Estos microorganismos tienen la capacidad de reducir los sulfitos a sulfuros a partir de aminoácidos y compuestos azufrados y para su detección se utiliza la evidente coloración negra dada por la formación del precipitado. C. que están normalmente en las heces. MARCO TEORICO Clostridium spp son organismos Gram positivos. Es un bacilo gram positivo largo. con mucha frecuencia. D. Tomar conciencia de los peligros que ocasionan la presencia de estos microorganismos en los alimentos.   Determinar el número de microorganismos viables (anaerobios sulfito reductores) presentes en la muestra de alimento. Las esporas son altamente resistentes pudiendo sobrevivir en alimentos incorrectamente procesados. La enterotoxina es susceptible a pronasa pero no a tripsina ni quimiotripsina. Los pertenecientes al grupo I producen toxinas A. ya que pueden proceder de otras fuentes ambientales como suelo. formadores de esporas. (Atún Vam Camp´s). vísceras de cangrejos y bivalvos y en el tracto intestinal de mamíferos. sedimentos marinos. D y E. C. Clostridium botulinum.( Gesche E y col 2003). aguas superficiales. Existen dentro de la especie cinco tipos llamados A. B. Es posible dividir a los organismos en cuatro tipos (I a IV) según la toxina que producen y su actividad proteolítica. . su representante más característico es Clostridium perfringens.000 daltons de peso molecular) que se comporta como un superantígeno promoviendo la liberación de mediadores de inflamación en forma masiva. especialmente cuando las condiciones de higiene en la elaboración son deficientes. Los del grupo II producen toxinas B. como también en los alimentos. pollo. ya que producen malos olores y. Los alimentos que pueden estar contaminados son carnes vacuna. C. En el intestino delgado. F y G. La enfermedad se produce cuando el individuo ingiere alimento contaminado con un elevado número de organismos productores de enterotoxinas. E. que forma esporas subterminales. Analizar la calidad microbiológica del alimento Atún Vam Camp´s. Esta pérdida electrolítica altera la función metabólica intracelular provocando daño morfológico y eventual lisis. B. salsas cocinadas y no refrigeradas. Esta ampliamente distribuidos en la naturaleza. alfa. formando un precipitado oscuro de sulfuro de hierro. (Aycachi R. B o F y son proteolíticas en los cultivos. Produce una potente neurotoxina de la que existen siete tipos: A. heridas infectadas de hombre y animales. perfringens A es el responsable de la mayoría de los procesos infecciosos. Produce una enterotoxina (polipéptido de 35. anaerobio. 2008). El origen de los anaerobios sulfito-reductores no es exclusivamente fecal. Cuando los alimentos llegan al intestino delgado se produce la esporulación y la liberación de enterotoxinas.

E o F y no son proteolíticos. De las tres diluciones anteriores se tomaron 1 ml y fueron adicionados en tubos de ensayos tapa rosca y se calentaron a 80 oC durante 10 minutos en baño de maría. Espátulas estériles. Alcohol Algodón Gradilla Mortero PROCEDIMIENTO Se Mezclo muy bien la muestra para asegurar su homogenización. Se abrió asépticamente (con el mechero en medio) y adecuadamente la muestra y se tomaron porciones de diferentes sitos de la muestra. Balanza analítica. Luego se Desinfectó con alcohol al 75% el sitio por donde se tomó la muestra. Fueron pesados 11 gramos de la muestra en balanza analítica. La enfermedad humana está vinculada a los tipos I y II y a la toxina A principalmente. 11 g de Atún Van Camp´s 1 Erlenmeyer con 99ml de agua peptonada. Puntas azules. y se observo cada 24 horas . 2 tubos de ensayo con 9ml de agua peptonada. y se macero en un mortero. 3 tubos de ensayo estéril. Los 11 g de muestra macerados se añadieron a un recipiente que contenía 99 ml de agua peptonada para obtener la dilución de 10-1. Se agito vigorosamente el recipiente para homogenizar. Se preparó la dilución 10-3 trasfiriendo 1 ml de la dilución 10-2 un tubo de ensayo que contenía 9 ml de agua peptonada. Micropipeta de 1ml. sobre un papel graff estéril. MATERIALES               Papel graff estéril. Agar SPS. Se dejo solidificar y se agrego otra capa de SPS Se Incubo a 37°C durante 72 horas. pasado el tiempo se dejo enfriar y se adicionaron 4 ml de agar SPS ( Sulfato polimixina Sulfadiacina). Se preparó la dilución 10-2 trasfiriendo 1 ml de la dilución 10-1 a un tubo de ensayo que contenía 9 ml de agua peptonada.

.

tiene una mayor resistencia a las condiciones ambientales por esta razón su identificación en alimentos enlatados es muy común. es decir no pudimos aislar microorganismos reductores de sulfito a sulfato. INFORME: < 10 UFC/g de esporas de Clostridium sulfitos reductoras en el atún de marca Van Camps. CONCLUSIONES  Con la realización del anterior trabajo se logró determinar que la muestra del producto enlatado analizado (Atún Vam Camp´s) no se observó la presencia de esporas de Clostridium sulfito reductor. ANALISIS DE RESULTADO El género Clostridium por ser productor de esporas. no logramos observar ninguna colonia de color negro en el medio de cultivo. de igual manera no hubo aumento en el número de colonias. Según los datos obtenidos fue posible reportar la ausencia de esporas de Clostridium sulfito reductoras debido a que no se presentaron colonias de color negro al no llevarse a cabo la reducción del sulfito de sodio que contenía el medio ni la producción de sulfuro de hierro. .RESULTADOS Luego de incubar los tubos obtuvimos: 24 horas 48 horas 72 horas Al pasar las 72 horas de incubación.

Recuento en tubo de anaerobios Sulfito Reductores . Se considera que el alimento presentó una adecuada calidad microbiológica. Lambayeque.pdf Disponible en:    Alayo G.uy/pdf/clostridium.bvsops.com/doc/8536988/microbiologia-de-alimentos-LaboratoriosPascual M.com/doc/6674027/Microbiologia-de-Alimentos-Practica-n 14Aislamiento-e-identificacionde-Clostridium-perfringens Gesche E. 2003. Universidad Nacional de Trujillo. 2008. Editorial Díaz de Santos.2000. Saez M.uach. ya que de acuerdo a los estudios realizados no se observó la presencia Clostridium sulfito reductor tanto de esporas como de colonias. Vallejos A. 2008.scribd. P 75  . Madrid-España.Microbiologia Alimentaria. http://www.pdf Clostridium botulinum.Peru.org. Método de Número Más Probable (NMP).Eficiencia de Anaerobios sulfito-reductores como indicadores de calidad sanitaria de agua. Disponible en: http://es. BIBLIOGRAFIA  Aycachi R.scribd.cl/pdf/amv/v35n1/art11.105. Aislamiento e Identificación de Clostridium perfringens. Universidad Austral de Chile. P 99. Disponible en: http://es. Calderón V. Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo. Disponible en: http://mingaonline. Chile.

reductores. se produce a sulfuro. El sulfuro.5g 0.1g 0.012g 0. da lugar a sulfuro de hierro. (Pascual et all.05g 0. que se manifiesta formando un precipitado negro alrededor de las colonias. La Sulfadiazina sódica es selectiva e inhibe el crecimiento de gérmenes gram negativos. al reaccionar con el citrato de hierro. 2000) COMPOSICIÓN: Fórmula ( Gramo/ litro) Triptona Extracto de levadura Citrato férrico Sulfito de Sódio Tioglicolato de Sodio Monooleato Sorbitán Sulfadiazina Sulfato de Polimixina B Agar pH final: 7. por la acción sulfito reductora de la mayor parte de los Clostridium. 15g 10g 0.0 ± 0.ANEXOS AGAR SPS: Es un medio es selectivo para gérmenes sulfito.2 a 25 °C. El sulfato sódico.5g 0.01g 15g .

f°f 9 ³fff°  ¯ - ¾  -@D.

.

-  –x°  .

¾ ¯ ¾h €¯f  ½ ¯h¾  n ° ¾½ n ¾ n° ¯f f  fn° – °xnf  ½½ f ¾ ¯nf¾  ¾f¾  .

¯½ °  f fn¾ –f¯½¾¾  f°f  ¾  ¾½f ¾  °  n¾ ½  °  ¾  °n°f ¾ °  ¾   f–f¾  ¾ f ¾ f¾ n¯ f¯ x° ° f €f ° ¾°f  ¯  ¾  f°¯f ¾  ° ¾ ¯ff¾°¾f½€¾ ½ ¾½f– °¾½ °nf¾f–f ¾ °€ ¯ f ¾n¯ –f°– °f –f¾ ¾f  ¾¯  xf°¾  °€ nn° ¾  ½   ½f ¾ f° f¾  n¾ f¾nf f f f° n¾  °nfn° ¾ f¯ °ff¾  f nf½fn f  ½ff ½nf °€ ¯ f  ¾h °nf f f f ½¾  f  ¾   ° n° n° ¾ f¯  °f ¾ f  ¾f¾ ¯ f°  f €¯fn°  ¾½f¾  n n  h½ f¯ °   ½ n °f¾ ¾nf¾  ° °f¾° nf¾ %nfn % .

¾ ¯ ½ €°– °¾ ¾ f ¾½ n   –x°  .

¾ ¯ ¯h¾ € n ° ¯ °  f¾f f ° ¯f f ¾ n°n¾  ¾ ° fn –f¯ ½¾ –f°     ¾  n¾   ¯¾ ¯¾   ¾ff h½ f¯ °  ° f°f  ¾¾  ½ n °  n°f¾ –f° ¾   ¯ ¾f°    f   ¯¾¾ ° f¾ ½fnf¾  f–f ¾f°–  ¾ nffn ¾nf¾ ¯€–nf¾  f ¯¾fn°  ½ ¾ °nf  ¾½f¾   h½  ¾f ° f°f  ¾¾  f–°f¾ ½½ f ¾ ¯nf¾ % n°f¾f% n°€¯f° °½ € €fnf¾h½ f  nn° ° f f %nfn %   ¯x    n ° °    ¾  ¯x    ½ ¯  f  ¯°fn°  °¯   ¯n–f°¾¯¾ f  ¾ ½ ¾ ° ¾ ° ¯ ¾f¾  f¯ °¾  ¾  ¯x   ¾ ½fnf¯ °   ½ff   n °  ¯n–f°¾¯¾ f°f  ¾  f ¾ n¯ ¾ .

¾ ¯ ¾€  n ¾  ¾ ¯½   nf°  ¾  n   ¯  f nf f¾n nf¾n° n° ¾ °n fn° ¾¯ ¾ n ¯½ f ¾ ½ff   n °  f°f  ¾ %½ © ¯½ .

¾ ¯ ¾€  n ¾%  ¾°  ¯  @½°f € - ¯n°f –f  %@- –f%    ¯  € 9¯°f €f fn°f–f%9–f% %f %    @I- O   ¯°ff½ ¾ °nf  ¾½f¾ .

¾ ¯¾€ nf½f  ½ n¾ °ff ¾%°If¯.

f¯½¾%   @I9.

.

  O  °€nf f ½ ¾ °nf  .

¾ ¯ ¾€  n ° f ¯ ¾f  f¯ °%°If¯.

f¯½¾% ¯ f°  n °¯  f¾n°f¾  .

O   ¯°f  °¯   ¯n–f°¾¯¾ f  ¾ %f°f  ¾ ¾€  n ¾%½ ¾ ° ¾ °f¯ ¾f f¯ ° %°If¯.

f¯½¾%  O @¯f n°n °nf  ¾ ½ –¾   nf¾°f° f ½ ¾ °nf  ¾¾ ¯n–f°¾¯¾ °¾f¯ °¾  O °fffnf f ¯n –nf f¯ °°If¯.

.f¯½¾   .

@.

  .

¾ ¯¾½½¾°–f°¾¯¾f¯½¾¾ f°f  n¾ €¯f  ¾  ¾½f¾    ¾h° °¯f¯ °  ° f¾  n ¾  ¾  ½ ¾ °f°  ¯h¾ nffn ¾n ¾ .

¾ ¯ ½ €°– °¾  °  f° ¾  f   ½ n ° ¯f¾  ¾   n° ¯nf€ n °nf  °° – n¯ ° ½ nnf° x¾  °   €¯f°  °½ n½f ¾n ¾€   ¾¾¯n–f°¾¯¾ ° °fnf½fn f    n ¾ ¾€¾ f ¾€¾ f ½f  f¯°hn ¾  n¯½ ¾¾ f€f ¾  ½ff ¾  nn° ¾  f f  °  nfn° ° –f f f ½ f €¯fn°  ½ n½f  – ° ¾f°f  ¾¾€  n ¾° ¾ n¾f¯ ° € nf  f   ½ ° ½n   f¾ € ° ¾ f¯  °f ¾ n¯ ¾   ¾ ¯ °¾ ¯f°¾   – fn° ° ¾n¯½¾n°    f¾ °€ nf f¾  ¯    f°¯f ¾  f–f¾ ¾½ €nf ¾  n¯ f¯ x° ° ¾ f¯ °¾  ¾½ nf¯ °  nf°  f¾ n° n° ¾ – °  °f f fn°¾° €n ° ¾ % ¾n n%   .

¾ ¯½ €°– °¾ ¾f– °  –n ¯nf¾ °€ ¯ f ¾ ¾f n f nf¾f   °€ nn° f¯ °ff fn f°f ¾½x¾ f¯° f ¾½½  f½nnn¾f ¾ ¾ ° ° f ¾½ n n°n½¾f¯f ¾  .

  .

½ €°– °¾ ¾  ¾½°¾f   f¯ff ¾½n ¾¾°€ nn¾¾ 9 n  °f ° °f%½½x½    f°¾ ½ ¾¯ nf% ¾ n¯½f n¯ ° ¾½ f°– ° ½¯ °  f  fn°  ¯ f  ¾  °€f¯fn° ° €¯f ¯f¾f  f ° °f ¾ ¾¾n ½   f ½°f¾f ½  ° f ½¾°f ° ¯½¾°f  °  ° ¾° –f   f ° °f ¾  °  f °  n ½  ¯ ¯ f°f     ° n ½  ° n  °f f fn°  f ½ ¯ f  f  nfn ½ °  °   ¾f°  ° °f ½x  f  ° ¾  ¯ f ¾  ¾f ½x  f  nnf f f f €°n° ¯ f nf °fn f ½nf°  f³ ¯€–n   °f ¾¾   f °€ ¯ f  ¾  ½ n  nf°   °   °–   f¯ ° n°f¯°f  n° °   f  °¯   –f°¾¯¾ ½ n ¾  ° °f¾  ¾ f¯ °¾   ½ ° ¾f n°f¯°f ¾ ¾° nf° ¾ fn°f  ½  ¾f¾f¾ nn°f f¾  °  €– f f¾  .

f°  ¾ f¯ °¾  –f° f ° ¾° –f  ¾  ½ n f ¾½fn°f fn°  ° °f¾ %nfn %   .

¾ ¯ °¯ ¾° fn–f¯½¾f– f°f    €¯f ¾½f¾ ¾  ¯°f ¾  f¾ ¾½f¾ ¾° ff¯ °   ¾¾ ° ¾ ½  °  ¾   ° f¯ °¾ °n nf¯ °  ½n ¾f ¾  ¾f f¯½f¯ °  ¾  ¾ ° f °ff f  ¾ ¾  f–f  ¾n f¾  nf°– ©¾  f¾  °  fn ° ¾°f  ¯f¯€ ¾  9 n  °f ½ °  ° °f  f   ¾ ° ¾   ½¾     .

 f€f          ¾ ½¾     f ¾ –f°¾¯¾ ° nf ½¾ % f I% ¾ –° f °f ½ n °¾fn f ½ nf ¾½  ° n ° ¾f–½½ n ° °f¾  ¾°½ nf¾ °¾n¾ ¾ –½½ n °°f¾  .

@ O O O O O O O O O O O O O O 9f½ –f€€ ¾x  – °If°.°¾°½ n¾ f °€ ¯ f ¯f°f ¾h°nf ff¾½¾f f°f½°n½f¯ °   .

f¯½¾  °¯  n°¯ f–f½ ½°f f   ¾  °¾fn°¯ f–f½ ½°f f   ¾  °¾f ¾x  ff°ff°fnf  –f9  9°f¾f ¾  .n½½ f ¯  ¾½hf¾ ¾x ¾  n – ° f f .  9.

. n¯  °f¯ ¾f½fff¾ –f¾¯– °fn°  –¾  ¾°€ n n° fn f    ¾ ½ °  ¾  ¯ f ¯ ¾f   f f¾x½nf¯ ° %n° ¯ n  °¯ %f nf f¯ ° f¯ ¾f¾  ¯f°½n° ¾  €  ° ¾¾¾ f¯ ¾f   ° ½ ¾f ¾  –f¯¾  f ¯ ¾f ° ff°f f°fnf  ¾   ° ½f½  –f€€ ¾x ¾ ¯fn  °°¯   ¾– ¯ ¾f¯fn f ¾¾ f³f  °f° n½ °  n° °f¯  f–f½ ½°f f½ff  ° f n°    f––¾f¯ °   n½ °  ½ff¯– °f    ½ ½f f n°   f¾€ °   ¯  f n°   f °    °¾f n° °f¯ f–f½ ½°f f    ½ ½f f n°   f¾€ °   ¯  f n°   °    °¾f n° °f¯ f–f½ ½°f f    f¾  ¾ n° ¾ f°  ¾  ¾  ¯f°  ¯  € ° f n°f ¾ °  ¾  °¾f¾ f½f ¾nf  ¾  nf °f° f  .-@  .

 f°   ¯°¾ ° f³  ¯ff  ½f¾f   ¯½¾  © °€f¾ f n°f°¯ f–f9%€f½¯°f €f fn°f%   ©¾ €nf¾ f– –fnf½f 9  °n f.

 f° f¾ ¾  ¾ nf ff¾ .

          .

D@  – °n f¾ ¾ ¯¾  f¾   f¾  f¾       ½f¾f f¾  f¾  °n fn°  ° –f¯¾  ¾ f °°–°f n°f  n ° – ° ¯  n  ¾ n°½ ¯¾f¾f¯n–f°¾¯¾ n ¾ ¾€f¾€f    -.  D.

$–  ¾½f¾ .

¾ ¯¾€¾ nf¾ ° f°  ¯fnfIf°.

f¯½¾   -D@ –x° .

¾ ¯½¾ ½ n  ¾½f¾  ° °f¯f ¾¾ °nfff¾ n° n° ¾ f¯  °f ¾ ½ ¾f f° ¾  °€nfn° ° f¯ °¾ °ff ¾ ¾ ¯n¯°   –°¾ f¾  ° ¾€ ½¾   ½fff¾ °nf  ¾½f¾ .

¾ ¯ ¾€  nf¾   f   ° ¾  ½ ¾ °f° n°f¾  n ° – f °  f¾ fnf f nn° ¾€ ¾  n° °f ¯ °f½ nn° ¾€     .

-.

D- O .

°f ffn° f°  f f©¾ –  ¯°f f ¯ ¾f  ½ n °ff f°ff %°If¯.

f¯½¾%°¾  ¾ f½ ¾ °nf  ¾½f¾ .

¾ ¯¾€ n  –f¯f° f° f¯ ° ° °¯  n°f¾  .

O  n°¾ f  f¯ °½ ¾ °°ff nf fnf f ¯n –nf f   fn  f¾ ¾ ¾ ff ¾°¾  ¾ f½ ¾ °nf.

¾ ¯ ¾€ nf°  ¾½f¾n¯ n°f¾           O nfn     ¾f¯ °   °€nfn°  .

¾ ¯ ½ €°– °¾  f¯ f   D° ¾ f  -fn°f 9   f  ¾½°   °  ½ $$ ¾ ¾n n¯$ n$$.n –f ¯ °¾ 9fnnf ° ¾f¯ °  °€nfn° .

 €n °nf °f  ¾¾€  n ¾ n¯ ° nf  ¾  nf f  ¾f°ff  f–f  .¾ ¯ ½ €°– °¾  O  ¾n  If ©¾ f .h¾ 9 f  %-.x   -¯  .9% .

 D° ¾ f ¾f .

 9  ¾½°   °  ½ $$¯°–f°° fn n$½ €$f¯$°$f ½ €  O .

 .¾ ¯ °¯  ½ $$ ¾½¾ – $½ €$n¾ ¯ ½ €  O f       n ° °    f°f  ¾ €  n ¾ 9   D° ¾ f  -fn°f  @©  ¾½°   °  ½ $$ ¾ ¾n n¯$ n$$¯n –f f¯ °¾ f f¾  O 9f¾nf .

n –f ¯ °ff  .f ° I  .f  ¾½f³f   ff f°¾ 9            ¾½°   °  .

         -O  9  ¾°¯  ¾¾  n½ff–x¯ ° ¾¾€  n ¾ ¾€f¾ n  ½ffnn°¾€ nf f¯f½f  ¾.

¾ ¯ ¾ ½ n  f¾€ ¾€ f fnn°fn° nf    f–ff¾€       ¾  ¯f°€ ¾f €¯f°  ° ½ n½f  ° – f   f¾ n°f¾  f €f f°f ¾ nf ¾ ¾  nf  °   n n¯ °  –x¯ ° ¾–f¯° –f¾ %9f¾nf f % .

.9.

  ¯f%f¯$% @½°f fn  f f ..

f€xn €    @–nf   .° f h° €f f°f €f 9¯°f  –f ½€°f    f.

          – –  –  –  –  –  –  – – .