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Universidad Nacional Autónoma de Mexico.

Facultad de Estudios Superiores Cuautitlan.

Porfirio Ruiz Gil
Virología medica. Grupo: 1902. Maestra: María Guadalupe Aviles Robles

ELISA (Ensayo por Inmuno-absorción Ligado a Enzimas).

Conceptos.

Anticuerpo_ Inmunoglobulina capaz de reconocer y unirse a un Ag o Ac.
IgG, IgM. IgD e IgE.

Antígeno_ Molécula extraña al organismo.
Proteínas, CHO´s, Lípidos, ácidos nucleicos y combinaciones.

Detección de antígeno mediante anticuerpo que esta enlazado a una enzima a la cual se le pone un sustrato que genera un color o luz. . para lipidos u otros Ag´s se lleva acabo un procedimiento mas complejo.ELISA. Descrita por Engvall y Perlman en 1971. Generalmente ELISA se lleva acabo con Ag´s hidrosolubles (proteinas).

2.  Sustrato: Cromogénico o fluorogénico conveniente y de fácil preparación. Fosfatasa alcalina. Enzima: L a enzima escogida debe unirse facilmente a Ac. . penicilasa. MUG (4-methyl-umbelliferyl beta D-glucoronido).2-azino-bis (3-etilbenziazoline-6 acido sulfonico). soluble en agua “no toxico”. Ejemplos:     Peroxidasa. Ureasa. Ejemplos:    P-nitrofenil fosfato. Β-galactosidasa.

la acidez y los fosfatos orgánicos • Menor relación de conjugación que la peroxidasa • Necesita tampones especificos • Puede causar impedimento . Cromógeno (Sustrato)  P-nitrofenil fosfato (pNPP)  5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfatonitro  Azulde tetrazolium (BCIP/NBT)  Naftol AS-TR fosfato/fast red RC • • • • Color Amarillo Purpura Purpura Rojo Ventajas • Estable cuando se almacena y manipula adecuadamente • Puede almacenarse a +4 oC durante más de 6 meses • Disponible como enzima libre o como conjugado • Más estable que la peroxidasa • Amplia variedad de sustratos comerciales Desventajas • Se inactiva por agentes quelante.Fosfatasa Alcalina.

etc) • La Peroxidasa endógena y algunos metales interfieren en su actividad.Peroxidasa Cromógeno (Sustrato) • 2.5’-tetrametilbencidina base o dihidrocloruro (TMB) • 3.3’-deaminobencidina (DAB) • 3-amino-9-etilcabazole (AEC) • 4-cloro-1-naftol (4C1N) Color • Verde • • • • • Naranja Azul Marrón Rojo Azul Ventajas • Estable cuando se almacena y manipula adecuadamente • Puede almacenarse a +4 oC. . más de 6 meses • Disponible como enzima libre o como conjugado • Relación de conjugación 4:1 • No causa impedimento estérico • Amplia variedad de sustratos Desventajas • Incompatible con bastantes estabilizantes (azida sódica.3’5.2-azino-bis (3-etilbenziazoline-6 acido sulfonico) • o-fenilamino (OPD) • 3.

β-Galactosidasa Cromógeno (Sustrato) • MUG (fluorescente) • AMPGD (luminiscente) Color • Verde Ventajas • Incrementa su tasa de reacción en presencia de alcoholes Desventajasas • Sufre inhibición inducida por anticuerpos • Tetrámero de 300kDa • Frecuente causa de impedimento estérico. .

. etc. Peroxidasa-Ac. Fraccion purificada. Fosfatasa alcalina-Ac. peptido sintetico. latex.  Fase sólida (soporte o placa).   Conjugado: Enzima-Ac. polivinilo. nylon. sefarosa.Componentes. Ac monoclonales y Ac multiclonales.   Anticuerpo. etc  Antígeno.   Sustrato cromogenico. poliestireno.  Nitrocelulosa. Completo.

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Técnica de ELISA en placa.         Sensibilizar la placa. después lavado. Lavado. Lavado. . Bloqueo de la placa. Finalizar la reacción. después lavado. Se agrega el sustrato cromogenico y se incuba. Se agrega el suero y después se incuba. Se agrega el conjugado y después se incuba.

Bloqueo de placa: Caseina 5%(p/v) leche sin grasa. Puede producir residuos. Generalmente se usa ácido sulfúrico 2 M. . Deteriora rápidamente puede enmascar algunos Ag´s.  Finalizar la reacción.2%.2% (2mg/ml).2. Sensibilizar la placa: Se agrega el Ag o el Ac según sea el caso. Lavado: Se lleva acabo con Buffer fosfato 0.   Gelatina 0. Ácidos o bases fuertes.01M a pH 7. Tween 20 al 0.

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Indirecto.      Directo. Debe incluirse control positivo bajo y alto. Captura. y un blanco. ..Tipos de ELISA. Competitivo. control negativo. Sandwich.

E E Antígeno especifico unido a una enzima Anticuerpo E Sustrato E .ELISA directo con Ac.

ELISA directo con Ag. Antígeno E E E Anticuerpo especifico unido a una enzima Sustrato E .

ELISA indirecto. Antígeno E Anticuerpo especifico E E Sustrato Antianticuerpo especifico unido a una enzima. E .

Sandwich ELISA directo. Sustrato E . Antígeno E E E Anticuerpo Conjugado.

Sandwich ELISA indirecto. E E E E E .

ELISA de captura. E E E .

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Lector de 450-492nm .Lectura de ELISA.

Cuantitativo: nanogramos/ml ó microgramos/ml.Reporte de resultados. se puede construir una curva de calibración usando espectroscópico Unidades internacionales de ELISA. Cualitativo: positivo o negativo. Con el control negativo y positivos alto y bajo. .

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Aplicación en la virología. .

 .Posibles muestras. El tiempo de envío debe ser menor a los tres días y en condiciones de refrigeración. Exudado faringeo.  El hisopo con la muestra se introduce en un tubo de tapón de rosca con 1 a 2 mL de solución salina isotónica estéril. Materia fecal. Se rompe la varilla de madera a la altura del tapón y se tapa herméticamente. con la cantidad de 10 gramos.

 Se lava bien el sitio de la lesión. Para la búsqueda morfológica del agente.  Envío: La muestra debe congelarse para estudios virológicos. Con bisturí estéril. . las costras o escamas se colocan en una caja de petri estéril y se asegurar la tapa con cinta adhesiva para que no se abra. o bien se pueden colocar en sobres de papel que se sellan. Si la epidermis está desprendida se toman porciones de ésta. se raspa el borde de la lesión y se recoje el material que se desprende.Raspado de lesiones o costras. y luego con alcohol al 70%. utilizando gasa (no debe utilizarse algodón) y se deja secar.

.Suero. El suero no debe mostrar indicios de hemólisis. protegiéndolo del calor con hielo o un refrigerante. ni debe estar lipémico y se debe conservar refrigerado o congelado. a menos que se dé otra indicación. Envío: El frasco con la muestra se envía de inmediato.

Suero. ni debe estar lipémico y se debe conservar refrigerado o congelado. . El suero no debe mostrar indicios de hemólisis. a menos que se dé otra indicación. protegiéndolo del calor con hielo o un refrigerante. Envío: El frasco con la muestra se envía de inmediato.

Preparación de Ac policlonales mono específicos para ELISA indirecto. Se hizo cultivo de linea celular RK el cual fue infectada por el virus del herpes simplex. Los sobrenadantes a 100000 rpm/ 1h del sobrenadante se obtiene la fracción soluble proteica por el método de Lowry y dialisis. Despues de su respectivo tratamiento las celulas fueron lisadas por sonicacion y luego centrifugadas a 1000 rpm /10min.    .

finalmente se lleva acabo una sonicacion y se mezcla con un adyuvante. finalmente los Ac´s fueron purificados. Despues por una inmunoelectroforesis se aisla el Ag. Posteriormente se hizo un gradiente de sacarosa y se centrifugo a 40000 rpm/24h a º5C y se obtuvieron 25 fracciones. Se realiza un ELISA indirecto.  Se inocula a 2 conejos cuatro veces con intervalos de 2 semanas. .

El suero puede ser conservado en refrigeración de 2 a 7 ºC no más de 7 días. infección postransfusional. Indicaciones: Para diagnóstico etiológico en los casos clínicos presuntivo a CMV de infección congénita. infección perinatal. Muestra: Suero (procedimiento M22). .Identificacion de Ac IgM anti Citomegavirus por ELISA. postransplante e infección de pacientes inmunodeprimidos. La muestra se obtiene durante la fase aguda de la enfermedad.

Procedimiento: Las placas de ELISA están sensibilizadas con anticuerpos anti IgM humana. Se añaden diluciones del suero problema y se adiciona el antígeno del virus unido a anticuerpos contra el antígeno viral conjugados a peroxidasa. . El resultado es positivo sólo que se haya retenido anticuerpos IgM contra el citomegalovirus.

Indicaciones  Muestra: Suero. esta reacción se interrumpe y se lee a 450nm    . Posteriormente se añade el conjugado anti IgM que se va a fijar al complejo Ag-Ac. El antígeno viral está fijado a los pozos de la placa. La parte enzimática reacciona con su substrato dando una coloración. Procedimiento: Se utiliza un equipo comercial.Identificacion de Ac IgM antivirus de EpsteinBarr pera ELISA indirecto. Se obtiene durante los primeros síntomas (etapa aguda de la enfermedad). se coloca el suero problema diluido y absorbido con anti IgG y se incuba.

.Elisa Para Diagnosticar Sarampión (Se Detectan Anticuerpos IgM).

Fosfatasa alcalina .

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Rotavirus bovino. .

.Elisa Para Diagnosticar Hepatitis C (Se detectan Anticuerpos IgG).

.Elisa Para Diagnosticar Hepatitis C (Se detectan Anticuerpos IgG).

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Susana E. México DF.htm http://www.medic. pag 274-276 ROJAS ESPINOSA.org. Inmunología (de memoria).scribd. 976 pp.ctv. Dr. 204 pp.cultek. R. A. 2001. Editorial Panamericana.. AGUILAR. 2008. Manual del Curso Practico de Inmunología. T.scielo. Ladislao Palomar. Ed.ula. Marco Antonio Vega. DF. 2ª edición. México. 1996. 374 pp.pe/pdf/amp/v24n3/v24n3a05. 2001.com/doc/15834994/Tecnica-de-ELISA-Enzyme-Linked-Inmuno-Sorbent-Assay http://www.. Argentina. Editorial Panamericana. 1998.pag 352-253. España. FUENTES ARDERIU. O.pdf http://www.Bibliografia y referencias. http://es. (et al) MANUAL DE DIAGNOSTICO VIROLOGICO.ve/idic/docs/clases/clase_practica1. 1ª edición.com/inf/otros/soluciones/Soluciones-ELISA-protocolos. Mendoza E. Reverte. Editorial ENCB IPN. Volumen 1. Barcelona. MARGINI.pdf http://www. FESC. Salvador Fonseca. Bioquímica clínica y patología molecular. Inmunología e Inmunoquímica. UNAM. 5ª edición.pdf .es/USERS/fpardo/vih4. MANUAL DE INMUNOLOGÍA ESPECIAL. . Victor Zendejas. F. Buenos Aires.