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ESTANDARIZACIÓN DE UNA TÉCNICA DE PCR MÚLTIPLE (mPCR) PARA LA DETECCIÓN DE Escherichia coli O157:H7, Salmonella spp.

Y Listeria monocytogenes EN PRODUCTOS CÁRNICOS DE AVE Sánchez Chaparro M.M.1, Meza Velázquez F1, Gámez Escobedo I.A1* Unidad de Genómica Aplicada. Escuela de Ciencias Biológicas. Universidad Autónoma de Coahuila. Blvd. Torreón-Matamoros Km. 7.5 Ciudad Universitaria U. A. de C. Campus Torreón, Coahuila, México. Teléfono: (871)75717 85. Correspondencia: anali_gamez@yahoo.com.mx Palabras clave: Estandarización, PCR múltiple, detección de patógenos RESUMEN En el presente trabajo se propuso desarrollar un ensayo de PCR múltiple (mPCR) para la detección simultánea de Escherichia coli O157:H7, Salmonella spp. y Listeria monocytogenes en muestras de alimentos cárnicos. La mPCR emplea primers especie-específicos para los genes Stx2A, Its y Hly de cada una de las bacterias antes mencionadas. Los productos de amplificación fueron de 553, 312 y 210 pares de bases (bp) respectivamente y fueron detectados mediante electroforesis en gel de agarosa. Las bacterias enteropatógenas, se cultivaron y se inocularon en diferentes productos cárnicos procedentes de aves de corral para su análisis por mPCR; fue posible detectar por esta técnica las bacterias propuestas en el presente estudio. La sensibilidad del ensayo se determinó aislando ADN de las tres cepas puras para las cuales se estandarizó la técnica, con el fin de determinar la concentración mínima detectable de ADN, la cual fue de 50 ng/μl. Por último, se realizaron pruebas en muestras de alimento inoculadas artificialmente y se utilizó un cegamiento sencillo en el cual fueron realizados los protocolos de extracción y de amplificación estandarizados, donde se logró identificar las bacterias. Los resultados obtenidos permitieron determinar que la técnica de mPCR es hace viable a ser validada para la identificación rápida y confiable de tres patógenos contaminantes en alimentos derivados de carne de ave. ABSTRACT The aim of this work was to develop a multiplex PCR assay (mPCR) for simultaneous detection of Escherichia coli O157: H7, Salmonella spp., and Listeria monocytogenes in food samples of meat. This technique uses specie-specific primers for Stx2A, Its, and Hly genes from each aforementioned bacterial species. Amplification products were 553, 312 and 210 bp, respectively and they were detected by agarose gel electrophoresis. Enteropathogenic bacteria were grown and inoculated in different poultry meat products and then analized by mPCR; it was possible to realize bacteria by the technique proposed in this study. The sensitivity assay was carried out by DNA isolating from the three inbred strains for which the technique was standardized in order to determine the minimum detectable concentration of DNA, which was 50 ng/ml. Finally, tests were performed on artificially inoculated food samples and a simple blinding was performed in which extraction protocols and standardized amplification were used, from which the bacteria were identified. The results indicated that mPCR technique is feasible to be implemented for a rapid and reliable identification of three food borne pathogens in poultry products.

Introducción Las enfermedades de transmisión alimentaria (ETA’s) es un área de creciente interés dentro del área de la microbiología, debido al consumo generalizado de alimentos preparados o empaquetados y a la gran responsabilidad que implica para los establecimientos dedicados a la preparación y distribución de los mismos, puesto que normativamente se requiere mantener altos estándares de calidad en materia de inocuidad y prevenir la contaminación por organismos comúnmente encontradas en los alimentos como E. coli, Salmonella spp., Staphylococcus, etc. (1) Son infecciones activas resultantes de la ingestión de un alimento contaminado por un patógeno o la ingesta pasiva de toxinas. Los alimentos frescos son alterados por una variedad de microorganismos; en el caso de la carne, las bacterias entéricas son patógenos que viven en el intestino de los animales y que en los mataderos, pueden contaminar la carne (2).

propuesto por Graves y Swaminathan (2000) (6). Microorganismos usados en el estudio Se emplearon tres géneros bacterianos distribuidos de la siguiente manera: 1 cepa de Escherichia coli O157:H7. perteneciente al Departamento de Microbiología. Extracción de ADN cromosomal a partir de cultivos puros Se estandarizó el protocolo universal de aislamiento de ADN total en bacterias.000 de casos de enfermedades gastrointestinales atribuidas al consumo de alimentos derivados de aves. lo que podría ser una desventaja si comparamos estas técnicas con la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). 1 cepa de Listeria monocytogenes y 1 cepa de Salmonella spp. monocytogenes y Salmonella spp. lo que permite el paso de los microorganismos a la carne produciendo una contaminación cruzada (4). se utilizaban geles de agarosa al 1%. siendo un total de tres microorganismos de estudio a analizar. Estos procedimientos apoyarían al control sanitario en las empresas Tipo Inspección Federal (TIF) que exportan carne. en la ciudad de Torreón. puede conducir a su transformación como alimento infeccioso o tóxico según sea el microorganismo que llegue a contaminar (1). se utilizó un espectrofotómetro NanoDrop ND-1000 a una longitud de onda de 260 y 280 nm. aislamiento e identificación de la bacteria con un tiempo mínimo de siete días. La contaminación de estos alimentos por patógenos. se realizó un método estandarizado para la rápida y confiable identificación de cuatro patógenos de relevancia en el área de inocuidad alimentaria.5 g/l). además que alrededor de 6. . coli O157:H7. de la Universidad Autónoma de Coahuila Unidad Torreón (U. L. México. piel.000 muestras provenientes de carne y derivados estaban contaminadas (3). y para la calidad de la muestras. entran en contacto con las instalaciones. La Dirección General de Epidemiología (DGE) reportó que en el 2003 hubo cerca de 800.. Metodología El presente trabajo se realizó en el Laboratorio de Genómica Aplicada la Escuela de Ciencias Biológicas. utilizando la técnica de PCR en su variante de amplificación múltiple. el cual fue modificado para lograr optimizar el tiempo empleado para la obtención del producto. Las condiciones de crecimiento empleadas para estas bacterias fue en cultivos de caldo LB durante 24 horas a 37°C y 150 rpm.. se registraron cerca de 2 millones de casos de salmonelosis.. La contaminación se genera por los microorganismos presentes en las plumas. A. se preservaron en medio Luria-Bertani (LB) suplementados con glicerol a una concentración de 30% (v/v) y almacenadas en nitrógeno líquido. de la Facultad de Medicina de la Universidad Autónoma de Nuevo León (UANL). teñido bromuro de etidio (0. Por lo mencionado anteriormente.Afecciones del tipo de las ETA’s son originadas a partir de una fuente puntual y pueden afectar a cientos de personas. de C. la Comisión Federal para la Protección contra Riesgos Sanitarios (COFEPRIS) reportó que durante la ejecución del Proyecto de calidad microbiológica de los alimentos en el 2005. además de que se obtendrán mejores procesos de diagnóstico que conducirán a una mayor seguridad alimenticia (5). Para la determinación de la concentración de ADN de las muestras obtenidas. conductos intestinales y respiratorios de las aves. Todas las cepas a estudiar. Los métodos microbiológicos desarrollados y aplicados actualmente para determinar inocuidad de alimentos involucran el enriquecimiento. con lo cual se logra tener un método de identificación más eficaz y sensible que las técnicas actuales de identificación.). La carne de ave de corral es un alimento propenso a sufrir una contaminación superficial producida por microorganismos que causan su alteración e incluso intoxicaciones alimentarias. Las cepas fueron obtenidas del Centro Regional de Enfermedades Contagiosas (CRECEI). la cual es considerada como un método alternativo usada en inocuidad alimentaria y con el cual se puede determinar la presencia de patógenos en una muestra en un tiempo de veinticuatro horas y con alta sensibilidad el uso de la PCR. la cual implica la detección simultanea de E. Coahuila. con lo cual ayudaría a cumplir con las regulaciones establecidas por el Servicio de Seguridad de Alimentos del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (FSIS/USDA).

se basó en la bibliografía donde se citan estos parámetros y partiendo de esto. E. Parámetros de reacción de PCR establecidos para las bacterias a estudiar La mezcla para la mPCR contenía 30 l con una mezcla comercial para PCR 2x (JumpStart™ REDTaq®. desnaturalización a 94°C por 40”. con ayuda del programa GelCapture. Las muestras usadas para esta fase fueron carne de pollo. un par por bacteria. A continuación de muestra un cuadro sobre estos datos: Tabla 1. se realizaron gradientes de temperaturas. Utilización de la mPCR en muestras alimenticias Al término de la evaluación de las metodologías anteriores. en la visualización de los geles se utilizó un fotodocumentador MiniBis-Pro DNR Biomaging-Systems bajo luz UV y se obtuvieron imágenes a través de la computadora. Salmonella y Listeria. así como en la duración de cada una de las fases de desnaturalización. se decidió obtener una media en el número de ciclos. alineación y extensión en cada uno de los ciclos. para lo cual en el primer parámetro a considerar que es la fase de alineación. 1l de cada ADN templado de cultivo puro. y 10 pM de cada oligonucleótido para la amplificación. se procedió a aplicar la técnica en muestras de alimentos inoculadas artificialmente con los patógenos involucrados en esta investigación. se ajustaron los parámetros de reacción que correspondían a la temperatura de alineación (Tm) de los primers. las cuales fueron adquiridas en diferentes establecimientos comerciales. coli. Sigma A. En el momento de la compra las . Para la determinación de los números de ciclos y el tiempo en cada una de las fases de la PCR. que aproximadamente contenían de 70 a 400 ng. se agregó anafase de extensión final de 72°C por 3’. desnaturalización previa de 94°C por 3’. de alineación se usa el gradiente de temperaturas por 45” y de extensión de 72°C por 45”. cada par amplifica un gen específico de cada bacteria. Tabla 2. Genes blanco amplificados y secuencias de oligonucleótidos empleados Los ciclos de amplificación para las cepas puras. utilizando la parte de la pechuga y embutidos de pavo (jamón y salchicha).). Para analizar las amplificaciones realizadas se realizaron electroforesis en geles de agarosa al 1.Condiciones de PCR múltiple en cepa pura Para la reacción de mPCR se emplearon diferentes pares de primers. abarcando un rango de 52 a 63°C.5% con 1x TBE (Tris-Borato-EDTA) a 80 V por 1 hora y teñido con bromuro de etidio. por lo cual los parámetros finales establecidos fueron en el número de ciclos un total de 30 y los tiempos en los pasos de la PCR fueron los siguientes. así como con los lapsos de tiempo.

Contaminación artificial de las muestras empleadas en el estudio La metodología de contaminación artificial realizada para este estudio se basó en el protocolo reportado en el manual de procedimientos establecidos Codex Alimentarius determinado por la FDA para la detección de patógenos en carne (7).000 x 5 min y se descartar el buffer. utilizando las muestras mencionadas en el apartado anterior. la pastilla obtenida se lavó con 1. las muestras para extracción de ADN se toman al finalizar la segunda incubación. oscilaban de entre los 400 a 1500 ng/l. Transcurrido el tiempo. Análisis de cuantificaciones de ADN en bacteria pura . se centrifugó a 7. según se describe en la sección “Extracción de ADN cromosomal a partir de cultivos puros”. Evaluación de Repetibilidad Para cada fase de procedimiento ya estandarizado. Una vez homogenizada la suspensión se colocó a otro tubo evitando la toma de los sólidos no disueltos (restos de alimento) y nuevamente se centrifugó a 6. Extracción de ADN a partir de muestras contaminadas artificialmente A partir de un volumen de 1.1. en la que se observa que no existe una diferencia significativa. que representa un 95% de confiabilidad en que se toma la decisión correcta de la prueba. de buffer de suspensión. ni las repeticiones. la cual es reflejada en el histograma resultante (Figura 1).05). El resto del procedimiento se continuó a partir de la lisis celular. ni entre las muestras.1 y se utilizó estadística descriptiva con la finalidad de determinar la variabilidad con la que es obtenido el material genético. se inocularon al azar con las diferentes bacterias para luego ser diagnosticadas por la mPCR estandarizada y verificar la correspondencia entre las bandas obtenidas y las bacterias con las que previamente se contaminó. en ocasiones se obtenían concentraciones mayores a los rangos que normalmente se obtenían.muestras se encontraban a temperatura de refrigeración y debidamente empacadas y se transportaron a 4°C hasta el laboratorio. realizando con el protocolo que se estandarizó. Los resultados fueron analizados en Stata 11. Las muestras que fueron evaluadas. con lo cual de consolida que no existe variabilidad al momento de la extracción.5 ml de un cultivo de 12 horas de crecimiento. Tabla 3. Resultados y discusión Efectividad de protocolo de extracción de ADN para su obtención con calidad La concentración de material genético extraído de las cepas puras y en muestras alimenticias. de este medio se tomaba una alícuota de 1 ml del cultivo e inocular 9 ml de agua peptonada tamponada (fresca) y se incubaba nuevamente por 12 horas a 37°C.5 ml. se procedió a un experimento con 5 personas y tres repeticiones y realizar repeticiones y se llevó a cabo un experimento de ciego sencillo en 5 personas para efectuar todo el protocolo estandarizado y propuesto en este trabajo y el resultado era determinado por la observación de bandas de ADN en geles de agarosa sometidos a electroforesis. Esto fue comprobado con la realización de un análisis de varianza de un diseño de bloques al azar (Figura 2). se homogenizaron en 85 ml de agua peptonada tamponada y 1 ml de una suspensión de cada una de las bacterias (OD = 600 nm) y se incubaba a 37°C durante 24 h (enriquecimiento primario). en que se obtuvo que los bloques (repeticiones). A 10 g de muestra. con un nivel de confianza (=0. no presentaron diferencias estadísticamente significativas. donde fueron analizadas utilizando un diseño de bloques al azar. En la tabla 3 se observa que los resultados obtenidos no tienen un grado de variabilidad.000 rpm por 5 min. Las cuantificaciones de ADN extraídas por esta técnica fueron analizadas en programa Stata/SE 11.

Figura 1. Para probar la especificidad de especie en la amplificación se realizaron reacciones de PCR convencional cruzando los primers especie-específico entre las distintas cepas bacterianas del estudio y con otras dos que se encontraban dentro del laboratorio. Ninguna de las muestras presento bandas de amplificación de ADN (Figura 3). En ninguna de las pruebas se observaron falsos positivos o patrones de bandeo. 2. Planta. Análisis de Varianza (ANOVA) de cuantificación de ADN Especificidad y sensibilidad de la PCR múltiple (mPCR) en cepas puras. extraído con la técnica establecida en este trabajo. 3. se realizó un barrido de muestras con ADN de diferente naturaleza. Además de cruzar entre sí los primers. “Background” de PCR con ADN de diferentes fuentes: M. Carne de pollo. 5. sangre. Suelo. Sangre humana. planta y suelo. Histograma de cuantificaciones de muestras. Carne de cerdo . Brucella abortus y Mycobacterium bovis. 1. Marcador. Se encuentra indicado el grado de desviación entre las muestras Figura 2. para luego determinar si otra fuente podría interferir (“background”) esto se realizó con ADN de distintos tipos de carne. 4. Figura 3.

Figura 5. 3. 312 y 210. calidad en las bandas de amplificación. *Error de manipulación En cuanto a sensibilidad de la técnica se realizaron diferentes escalas de concentraciones de DNA desde 0. 4.0 mM. bp respectivamente. coli O157:H7. En el trabajo de estandarización realizado de Kim y cols. además de que corresponden con los tamaños de fragmento esperado para E. Gradiente de concentración de ADN para la mPCR estandarizada. 7.5 mM hasta 4 mM. Figura 4.La temperatura elegida como óptima fue la de 55°C.0 mM. Salmonella spp. 4.5 mM. (2001) (8). y L. Una vez determinados los parámetros se procedió a realizar 5 repeticiones de la técnica.. 2. resultando positivas cada una de las pruebas. 2.0 mM. 2. 1. 1. monocytogenes. aunque se observó que tiene un excelente rango de temperatura de alineación y manteniéndose de manera uniforme las bandas ya que se logran observar una buena calidad de nitidez en el bandeo presentado para esta temperatura.0 mM. obteniéndose en todas las escalas. 0. 3. 1.5 mM . 6. que son 553. 5. al analizarlas mediante electroforesis en gel (Figura 5).5 mM. mPCR en cepas puras. con gradientes de temperaturas desde 52 a 61°C. En todas las muestras se observa buena nitidez. M: Marcador. utilizaron una temperatura similar (59°C) a la propuesta por esta investigación (Figura 4).

las cuales se separaron en varias alícuotas y cada una se mezcló con una cepa bacteriana en suspensión. observándose que aunque no se visualizaban en todos los casos. Figura 6. encontrándose los tamaños de fragmentos esperados. Junto con las muestras de mPCR. La Figura 6 muestra los resultados de un análisis mPCR. por no fue necesario realizar algún método estadístico (Figura 8). Los productos PCR fueron observados por electroforesis en gel de agarosa. . bandas de alto peso molecular correspondientes a ADN. si se lograban realizar las amplificaciones. pero al realizar la PCR y el análisis electroforético. 4: PCR simple Salmonella spp.Detección de productos por PCR múltiple en cepas puras Cada reacción de amplificación por PCR generó un fragmento de ADN único de los tamaños que estaban esperándose. Estas mismas bandas fueron observadas por Kim y cols (2001) (8). como se indica en la Tabla 1. todos se mostraba el patrón de bandas esperado. Los primers especie-específicos utilizados en este estudio lograron diferencia entre las especies de bacterias estudiadas. 5: PCR simple L. 1: mPCR (+). Al analizar los resultados se comprobó que es posible la detección de las cepas bacterianas presentes ya sea de manera individual o en conjunto. se corrió por electroforesis el ADN extraído previamente. Los resultados obtenidos del experimento de cegamiento con los diferentes analistas fueron positivos y confirmatorios en todos los casos. 3: PCR simple E. coli O157:H7. fueron separados mediante electroforesis en gel con las condiciones ya especificadas. en donde utilizaron los mismos diseños de primer que se utilizaron para esta investigación.. Las pruebas realizadas fueron muy reveladoras. junto con los productos PCR individuales. mPCR de las cepas estandarizada junto con sus PCR simple. Los diferentes tamaños de los productos de amplificación. para la determinación microbiológica por mPCR en kimchi. y corresponden a las mismas bandas que se amplificaron. 2: mPCR (–). además de que fue cotejado el tamaño por medio de la búsqueda de las secuencias genéticas de cada uno de los genes utilizados y se buscaron las secuencias de los primers. de combinaciones diferentes. M: Marcador. Este comportamiento no se encontró reportado en los artículos revisamos pero se logra demostrar que con una mínima cantidad de ADN molde. ya que en ocasiones no se lograba observar ADN sin amplificar. la técnica de mPCR es capaz de detectar presencia de naturaleza bacteriana. monocytogenes Utilización de la mPCR en muestras alimenticias contaminadas artificialmente Se realizó la mPCR en muestras de jamón de pavo.

Se recomienda que esta técnica pase a la fase de validación para ser evaluada en muestras reales. J. Salmonella spp. Manual para el diagnóstico de patógenos en lácteos y carnes mediante PCR. y Listeria monocytogenes. Estados Unidos. no existe variabilidad estadística en el uso de la técnica por factores como manipulación o diferentes manipuladores. 10. Conclusiones Se logró estandarizar la técnica de PCR múltiple para Escherichia coli O157:H7. Vigilancia Tecnológica: de Agroalimentación. 4. Instituto Nacional de Investigaciones Forestales. 5.Figura 10. 3. 2 y 8: Muestra con las tres bacterias. y L. Morales. 2004. Muestra con Salmonella spp. Brock: Biología de los Microorganismos. Instituto Nacional de Investigaciones Forestales. Food and Drug Administration. Agrícolas y Pecuarias. 4–5 7. 6: Muestra con Salmonella spp. 3. dos parámetros esenciales a establecer en una técnica de diagnóstico molecular por PCR. 1–2. Pearson Prentice Hall. Instituto Nacional de Investigaciones Forestales.. . Espinoza. Manual para el diagnóstico de patógenos en lácteos y carnes mediante PCR. 5. 6. 10ª Edición. estudiar el análisis de reproducibilidad y compararla con el “estándar de oro” para la detección de cada una de las bacterias.. Martinko. I.. 2004. 2004. además. A. M: Marcador. Comisión Federal para la Protección contra Riesgos Sanitarios. 1. 2005. T. O. 7 y 9: ADN extraídos. Manual para el diagnóstico de patógenos en láctes y carnes mediante PCR. Agrícolas y Pecuarias. 4 2. Bibliografía 1. Investigación y Gestión de la Innovación y Tecnología. M. además al realizar el “background” para diferentes tipos de muestras de DNA diferentes a las de las especias detectadas y siendo todas negativas. se puede proponer que está técnica puede ser utilizada para la detección de las bacterias mencionadas al inicio del párrafo para diferentes fuentes alimenticias.. tomando en cuenta las temperaturas de alineación y concentraciones de ADN. A. 4. 5. 2009. 5. Prueba de cegamiento de mPCR en muestras contaminadas artificialmente. 2004. Agrícolas y Pecuarias. Martínez-Vázquez. Madigan. 4–5 5. 2003. Bad Bug Book: Introduction Foodborne Pathogenic Microorganisms and Natural Toxins Handbook. J. M. monocytogenes. 4: Muestra con E. coli O157:H7 y Salmonella spp. Esto permitirá su aplicación como una técnica alternativa para la detección de patógenos en diversos alimentos. Parker. 6ta Reunión Nacional de Comunicación Social de Salud.

G.8. R. Kim. Y. Y. Park.. 44:92-97 . Detection of Escherichia coli O157:H7. Lee S. S. Staphylococcus aureus and Listeria monocytogenes in Kimchi by Multiplex Polymerase Chain Reaction (mPCR). Salmonella spp. 2001. Journal of Microbiology..

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