TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN DAN APLIKASINYA DALAM EKSPLORASI MIKROBA LAUT

Dedi NoviendrP ABSTRAK Teknologi DNA rekombinan merupakan teknik penggabungan DNA dari spesies yang berbeda sehingga akan diperoleh organisme baru dengan sltat-sifat yang diinginkan. Pada pengembangan bioteknologi kelautan dan perikanan, teknik DNA rekombinan ini dapat digunakan antara lain untuk melakukan eksplorasl potensi dan biodiversitas organisme laut, seperti mikroba laut. Mikroba laut yang sebelumnya hanya merupakan kekayaan alarn laut yang potensial dan belum memberikan nilai tambah, maka dengan teknologi DNA rekornbinan dapat ditingkatkan nilai tambahnya untuk menghasilkan produk yang sangat prospektif. Secara garis besar, teknologi DNA rekombinan (rekayasa genetika) rnelibatkan penyisipan informasi genetik baru ke dalam organisme, biasanya bakteri, untuk memberikan kemampuan baru, Metode int tidak mengikuti rangkaian prosedur yang pasti. Pernl'ihan metode bergantung kepada gen mana yang akan dipindahkan dan jenis organisme mana yang akan menerima informasi genetik baru. Pilihan tersebut bergantung pada sarnpai sejauh mana keterlibatan pilihan pribadi ilmuwan yang bersangkutan. KATA KUNCI: teknologi DNA rekombinan, transformasi, kloning DNA PENDAHULUAN Tingginya biodiversitas dan kelimpahan mikroba laut menunjukkan potensinya sebagai sumber yang paling menjanjikan dan memberikan peluang besar kepada ahll-ahli bioteknologi kelautan untuk menemukan produk alami yang bernilai ekonomi. Menurut Dahuri (2003), khusus tentang biodiversitas laut, terdapat tidak kurang dari 782 spesies alga, 12 spesies lamun, 38 spesies mangrove, 850 spesies spons, 210 spesies karang lunak, serta ratusan ribu spesies berbagai biota lainnya, balk makro rnaupun mikro yang merupakan kekayaan alam lautan Indonesia. Selain spesies-spesles tersebut, kelompok organisme yang masih sedikit dieksplorasi dan didayagunakan adalah berbagai jenis rnikroba laut. Semua itu merupakan potensi luar biasa sebagai sumber pangan, obat-obatan, bahan diagnostika, maupun aneka produk industri bernilai ekonomi tinggi. Sejak ditemukannya enzlrn endonuklease restriksi yang dapat mengkatalisis pemotongan rnolekul DNA pada bagian atau temp at spesifik pada tahun 1971, rnaka lahirlah teknologi baru dalam bidang biologi molekuler yang disebut teknologi DNA rekombinan atau rekayasa genetika (Murdiyatmo, 1992). Teknologi DNA rekombinan merupakan teknik penggabungan DNA darl spesies yang berbeda sehingga akan diperoleh organisme baru dengan sifat-sifat yang diinginkan (Hala, 1999). Pad a pengembangan bioteknologi kefautan dan perikanan, teknik DNA rekombinan ini dapat digunakan antara lain untuk eksplorasl potensi dan biodiversitas organisme laut.
.) Peneliti pada Balai Besar Riset Pengolahan

Organisme laut (dalam hal ini mikroba laut) yang sebelumnya hanya merupakan kekayaan alam laut yang potensial dan belurn memberikan nilai tambah, maka dengan teknologi DNA rekombinan dapat ditingkatkan nilai tambahnya menjadi produk yang sangat prospektif. Salah satu contohnya adalah dari suatu mikroorganisme (rnikroba laut), dapat diisolasi gen-gen fungsionalnya yang menyandikan satu atau lebih enzim-enzim yang potensial yang dapat digunakan di dalam dunia medis. Adapun enzirn-enzirn yang dipandang penting di dalarn dunia medis di antaranya adalah protease, lisozirn, lipase, invertase, hemiselulase, kolagenase, glukoaminase, dekstranase dan katafase (Suhartono, 1989). Dengan kemajuan teknologi molekuler ini, perpindahan gen dapat terjadi antar organisme yang sama sekali tidak berkerabat dekat, misalnya gen manusia dipindahkan ke bakteri atau gen manusia dipindahkan ke ternak babi dan lain sebagainya (Muladno, 2002). Kemungkinan memindahkan gen dari satu organisme ke organisme lain merupakan prospek yang sangat memikat, karena rekayasa genetika dapat mengurangi biaya dan meningkatkan penyediaan sejumlah besar bahan yang sekarang dipergunakan di dalarn kedokteran, farmasi (Murdiyatmo, 1992), pertanian, dan lndustrl (Prentis, 1990), maupun bidang kefautan. TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN Berhasilnya suatu teknik DNA rekombinan sangat didukung oleh cara-cara bagaimana kita menangani,
Kelaulftn dan Perikanan

Produk dan Bioteknologi

56

2. Langkah-Iangkah dasar dalam kloning gen/DNA membutuhkan beberapa keterampilan manlpulasi. dan memisahkan DNA pada lokasi tersebut.Squalen Vol. Komponen-komponen kepentingannya. tergantung dari jumlah waktu situs pengenalan enzim yang berulang dalarn molekul. Beberapa keterampilan dasaryang dlperlukan untuk melakukan kloning gen/DNA secara sederhana adalah: preparasi sam pel DNA mumi. endonuklease restriksi tipe II adalah enzim pemotong yang begitu penting dalam rekayasa genetika (kegiatan kloning gen). (1997) • 57 . pemotongan molekul DNA dengan enzim restriksi. Di lain pihak. 2 No. Enzim-enzim ini memotong DNA ke dalam fragmen-fragmen dari berbagai ukuran. 1991). endonuklease restriksi. memasukkan molekul DNA rekombinan ke dalam sei inang (cara yang paling umum adalah dengan cara transformasi). DNA ligase. Sebagai contoh. Desember 2007 mengembangkan mikroorganisme atau fage dari seleksi/kloning dari beberapa strain bakteri yang digunakan dalam sistem ini (Artama. dan sel inang (host cel~. Ketiga enzim tersebut masing-masing dibedakan oleh cara kerjanya yang agak berbeda satu sama lain. enzim restriksi ketiga yang diisolasi dari bakteri Haemophilus iniiuenzse strain D (Stanfield et al. vektor. endonuklease restriksi EcoRI artinya adalah enzim restriksi pertama yang diisolasi dari bakteri Escherichia coli strain R. salah satunya berasal dari mikroba laut Enzim digunakan untuk memotong DNA donor dan vektor pada lokasi spesifik. 1997) (TabeI2). dan identifikasi sel yang mengandung molekul DNA rekombinan hasil kloning. Tempat diintroduksikan vektor rekombinan ke dalam sel inang . dari suatu eksperimen kloning Komponen kloning DNA donor (insert) Endonuklease restriksi Fungsi Sumber dari DNA atau gen yang diklon. dan enzim Hina111artinya. bahwa rnolekul DNA plasmid dan fage mempunyai sifat-sifat dasar yang dibutuhkan sebagai vektor kloning.. hanya dua topik yang akan dijelaskan pada tulisan in mengingat urgensinya Tabel1. Endonuklease tipe I dan III agak kompleks dan hanya mempunyai peran yang sangat terbatas dalam rekayasa genetika. Komponen-komponen yang harus dipenuhi tersebut adalah DNA donor (insert). Komponen Eksperimen Kloning Bila melakukan suatu eksperimen kloning. bahwa ada tiga jenis endonuklease restriksi yang telah dikenal. 1991). Menurut Brown (1991). penggabungan molekul DNA dengan enzim ligase. Vektor DNA ligase Sel inang (host cell) Sumber: Stanfield et al. Namun sifat-sifat ini tidak berguna tanpa adanya teknik-teknik eksperimen untuk manipulasi molekul DNA di dalam laboratorium. Dari kelima komponen eksperimen kloning yang disebutkan pada Tabel1 . dan kemudian membentuk suatu vektor rekombinan Biasanya suatu bakteri atau yeast. maka ada lima komponen utama yang harus dipenuhi agar suatu eksperimen dapat berjalan dengan baik. sehingga DNA donor dapat disambungkan ke dalam vektor Plasmid atau bakteriofage yang digunakan untuk mengintroduksi gen untuk diklonkan ke dalam suatu sel inang yang cocok Enzim yang digunakan untuk menggabungkan ujung sambungan (splice) dari vektor dan DNA donor. Endonuklease tipe II yang digunakan dalam eksperimen kloning memiliki panjang sekuen pasangan basa pengenalan dari 4 sampai 8 nukleotida. Endonuklease restriksi merupakan enzim yang umumnya dilsolasi dari mikroorganisme prokariotik (Artama. Enzim ini dinamai berdasarkan sumber spesies bakteri asal isolasinya. Endonuklease restriksi -Endonuklease restriksi adalah enzim bakteri yang mengenal sekuen nukleotida spesitik dalarn suatu molekul DNA double-stranded. Menurut Brown (1991). analisis ukuran fragmen DNA. Fungsi dari masing-masing komponen terse but dapat dilihat pada Tabel1 . Dua komponen eksperimen kloning tersebut adalah endonuklease restriksi dan vektor.

1991). Enzim restriksi ini memiliki dua sifat yang membuatnya sanqat bermanfaat. Pembuatan pustaka eDNA biasanya menggunakan plasmid sebagai vektornya. Artama. biasanya NaGI serta semua endonuklease restriksi tipe II membutuhkan Mg2Tuntuk berfungsi (Brown. Vektor Sejumlah vektor dari prokariotik. dan (9) dengan mudah diisolasi dari sel (Stanfield et a/. yang dapat dipotong dengan enzim restriksi endonuklease tertentu (Artama. yaitu plasmid dengan kontrol replikasi yang tidak begitu ketat. 1997). Kebanyakan endonuklease restriksi akan berfungsi secara memadai pada pH 7. kira-kirasudah 300 jenis enzim restriksi telah ditemukan (Prentis. 1991) serta dapat mengontrol replikasinya sendiri. sehingga dalam satu sel dapat dijumpai 1-20 kopi plasmid (Artama. Mernbuat kondisi yang tepat untuk aktivitas enzim adalah penting misalnya konsentrasi NaGI atau Mg2+. (2) mengandung gen resistensi antibiotik tertentu. (4) memiliki daerah restriksi atau MCS. Vektor kloning harus memiliki situs pengenalan endonuklease restriksi.D. sehingga rnernudahkan seleksi dari gen rekombinan (Artama. (6) dipotong pad a situs tunggal oleh endonuklease restriksi. 1991). Jumlah Tabel2. Noviendri Sejak awal tahun 1970an. (2) plasmid relaxed. yaltu: (1) plasmid stringent. Sifat kedua adalah kemampuan sebagian mereka untuk rnenqhasilkan potongan runcing atau dikenal dengan ujung bangku/ujung lengket (sticky ends) ketika mereka memotong DNA yang beruntai ganda (Marx. kromosom buatan dari khamir (YAG=yeast artificial chromosome) (Suharsono. kosmid atau YAC. dimana hanya terdapat 1 kepi plasmid tiap genom bakteri. eukariotik dan vektor sintesis telah banyak digunakan dalam sistem kloning DNA. yaitu plasmid dengan kontrol replikasi ketat. Dalam hal ini tiap enzlrn men genal dan memotong hanya urutan nukleotida tertentu pada DNA. sehingga pemotongan DNA terjadi pada urutan pengenal tambahan yang tidak baku. 1991). (3) memiliki titik ori (sebagai titik awal replikasi). 1991). Kemudian berdasarkan kemampuan memperbanyak diri secara alami maka plasmid dapat dibagi dua. (7) tidak ditransfer dengan konjugasi. 1990). Karakteristik penting yang harus dimiliki oleh suatu vektor kloning adalah: (1) stabil dalam sel inang. Sifat pertama adalah kekhususannya. (5) berukuran kecil. 2000) dan kosmid (Artama. plasmid tersebut dapat berbiak autonom (Marx. fage. Dengan kata lain.4 dan dalam kekuatan ionik.apabila tidak tepat maka kondisi tersebut dapat menyebabkan tidak saja penurunan aktivitas. dimana informasi genetik dapat disisipkan. 1991). 1991). sehingga bisa bereplikasi atau multiplikasi sendiri. sedangkan pembuatari pustaka genom yang mengandung fragmen DNA besar biasanya menggunakan fage. yang masing-masing mengandung beberapa situs restriksi yang berbeda. Secara garis besar ada 4 vektor yang sering digunakan dalam proses pengklonan gen (sebagai vektor kloning).. yaitu plasmid. 1991. (8) cirinya dengan rnudah dideteksi. Menurut Suharsono (2000). tetapi dapat juga mengubah spesifisitas enzim. penggunaan jenis vektor tergantung dari tujuan pengklonan. Selain itu aktivitas endonuklease tipe II ini seringkali dipaeu pula oleh senyawa pereduksi seperti 2-merkaptoetanol atau ditiotretiol (Suhartono. Nama enzim A/u' BamHI CIa I Eco RI Hae III Hind III Kpn I Not I Pst I Sumber A tthrobecter bakteri futeus Situs pengenalannya AG*CT G*GATCC AT*CGAT G*AATIC GG*CC A*AGCT GGTAC*C GC*GGCCGC CTGCA*G Bacillus emytotiqueieciens Caryphanon latum Escherichia Haemophilus Haemophilus coli aegyptius inffuenzae Kfebsieffa pneumoniae Nocardia otidis-caviarum Provkiencie stuartii Sumber: Stanfield et al. Beberapa enzim restriksi dan situs pengenalannya . (1997) • 58 . 1989). Beberapa vektor kloninq telah direkayasa untuk mengandung suatu situs kloning ganda atau dikenal multiple cloning site (MGS).

Plasmid ini bereplikasi tidak tergantung pada replikasi DNA kromosom sel inang (Nicholl. 1997).Squa/en Vol. 1991).accessexcel/ence. Jumlah kopi ini rnenunjukkan jumlah molekul plasmid masing-masing ditemukan dalam satu sel bakteri (Brown. perlu adanya penanda molekuler dengan menggunakan gen yang mudah diassai penampilan dan ekspresinya.B/GG/p/asmid. Peta vektor plasmid pUC18/19 (A). dengan proses yang disebut transformasi.2.htm/). Penanda Resistensi Antibiotik Untuk mengetahui berbagai aktivltas bakteri di habitat (Iingkungannya). Banyak penanda molekuler yang dapat digunakan untuk menandai bakteri. Keuntungan dari teknik ini adalah dimungkinkan untuk menyeleksi populasl bakteri yang hidup dari bakteri yang ditandai. 2 No. 59 . Gen merupakan suatu segmen DNA yang mampu menyandikan protein (enzim). Sedangkan strinqent control (pengendalian yang kuat) memperbanyak diri dengan kecepatan yang hampir sama dengan kromosom selnya. Penanda resistensi antibiotik adalah penanda yang paling sering digunakan dan telah banyak dibuat sebagai dasar untuk pengembangan teknik penanda yang lainnya. yaitu dapat bereplikasi antara 10-200 kopi setiap sel. Di dalam laboratoriurn. 1994). dan teknik ini dapat dilakukan hanya dengan teknik pencawanan dengan menggunakan menggunakan antibiotik yang sesuai. Tipe plasmid ini berg una untuk penelitian DNA rekombinan karena memiliki jumlah kopi yang banyak (high copy number).org/It. yaitu plasmid dimasukkan ke dalam (A) (B) Gambar 1. 1991). tetapi di dalam laboratorium dapat dipindahkan secara artifisial. baik itu bakteri hasil rekayasa genetika maupun bukan hasil rekayasa genetika. Desember 2007 kopi suatu plasmid dapat merupakan relaxed-control (pengendalian yang lemah). dan tahap tahap kloning DNA (B) (http://www. penanda resistensi antibiotik sering digunakan sebagai suatu selectable markeruntuk memastikan bahwa suatu bakteri dalam kultur mengandung gen penyandi antibiotik tertentu (Brown. dan terdapat hanya dalarn satu atau beberapa kopi plasmid per sel. Gen penanda (marker gene) tersebut nantinya dapat juga berperan sebagai gen pelapor (reporter gene) yang akan menunjukkan aktivitas bakteri tersebut di habitatnya. Transformasi Secara alami plasmid dapat dipindahkan ke sel inang baru rnelalui proses konjugasi atau dengan cara lain. Dengan demikian. aktlvltas bakteri tersebut di lingkungan dapat dipantau sehingga langkah-Iangkah apa yang akan diambil untuk kegiatan selanjutnya dapat ditentukan (Wahyudi.

'::::::::===============-' ng DNA vector-sislpan Jumlah koloni turnbuh (cfu) x 11000 ng x~ ~ FP : Faktor pengenceran cfu : Colony forming unit Seleksi Biru Putih Kebanyakan vektor kloning modern. Senyawa indoksil derivatif ini akan teroksidasi dengan adanya udara membentuk senyawa indigo yang berwarna biru. Enzim ini memecah X-gal menjadi galaktosa dan lndoksil derivatif. maka tidak akan dihasilkan suatu enzim fungsional yaitu enzim a-galaktosidase. Hasil pengamatan koloni pad a media tersebut memperlihatkan adanya koloni berwarna biru Efisiensi Transformasi (cfu/~g) = .coli jika ada laktosa. Hal ini sering digunakan untuk mendeteksi rekombinanrekombinan dengan metode skrining yang dikenal sebagai skrining koloni biru putih (blue-white colony screening) . sel yang digunakan dalam proses transformasi ini biasanya disebut dengan sel kompeten (Muladno. 2002). Reaksi hidrolisis senyawa X-gal yang tidak i'erwarna menjadi suatu senyawa yang 60 .. kemudian dikocok pada suhu 30°C sampai pertumbuhan disekitar fase log (± 3 jam). Dengan kata lain. Menurut Seno & Wirahadikusumah (1992). bahwa sel inang dapat dibuat kompeten dengan cara menginokulasi 30 mL media Luria Bl. dan (3) sel kompeten kemasukan DNA vektor yang membawa gen target (yaitu DNA rekombinan) (Muladno. sehi ngga u ntu k sementara dinding sel bersifat permiabe/ dan dapat dilewati molekul DNA kecll (Artama. dalam hal ini pada posisi gen lacZ. sel kompeten yang dicampur dengan molekul DNA hasll penggabungan akan mengalami tiga kemungkinan. 2000). Plasmid ini merupakan pengembangan dari pBR322. Bagaimariapun. Efisiensi transformasi dihitung berdasarkan rumus berikut (Anwar. 2002) (Gambar 1B). Bila menggunakan plasmid pUC18/19 sebagai vektor. 1991). Untuk mendeteksi tingkat keberhasilan terjadinya transformasi.D. 1997).1 mM. Pasta sel dipisahkan dengan sentrifugasi dingin selama 10 menit pada 8000 rpm. Contoh plasmid yang telah lama digunakan sebagai vektor untuk mengklonkan gen adalah plasmid pUC18/19 (Gambar 1A). memiliki suatu MCS dalam gen lacZ Gen ini dalam keberadaan suatu induser seperti I PTG (isopropil-a-Dtiogalaktosida) akan menghasilkan enzirnagalaktosidase. 1994). Coli yang berumur semalam. Plasmid pUC18/19 mengandung gen lacZ yang dapat menyandikan enzim a-galaktosidase. Warna biru ini disebabkan karena enzim a-galaktosidase yang disandikan oleh gen lacZ yang dikandung pUC18/19 mempunyai kemampuan untuk menghidrolisis X-gal (5-kloro-4bromo-3-indolil-a -D-galaktopiranosida) suatu substrat kromogenik inerlyang tidak berwarna menjadi derivat indigo yang berwarna biru (Artama. maka sel inang harus dibuat kompeten terlebih dahulu. Koloni bakteri yang mengandung plasmid pUC 18/19 akan berwarna biru karena plasmid pUC18/19 mengandung gen lacZ yang dapat menghasilkan a-galaktosidase. Oleh karena itu koloni bakteri yang mengandung plasmid pUC18/19 akan berwarna biru bila ditumbuhkan pad a media pertumbuhan yang mengandung X-gal. yang akan mengkonversi laktosa menjadi galaktosa dan glukosa.'Jrtani LB) dengan ( 1% biakan E. induksi dapat terjadi jika suatu senyawa analog laktosa seperti IPTG digunakan (Nicholl. Kemudian plasmid yang dipakai sebagai vektor untuk kloning semula berasal dari plasmid relaxed yang telah dimodifikasi menjadi berbagai jenis plasmid yang terdapat bebas di pasaran seperti pBR322.1 mM. serta sentrifugasi lagi dalam kondisi yang sama dan endapan sel dilarutkan dengan Yz volume larutan 30% sukrosa dalam CaCI2 0. pUC19 dan derivat-derivatnya. 1999) : Jika segmen dari DNA donor disisipkan pada situs kloning ganda (MCS). Enzim ini dalam kondisi normal akan disintesis oleh E. 1991). menunjukkan terekspresikan gen lacZ tersebut (Wahyudi. dan merubah laktosa menjadi galaktosa dan glukosa (Stryer. lalu dicuci 2 kali dengan volume yang sama CaCI2 0. maka kolonl yang membawa plasmid rekombinan dapat dideteksi dengan menggunakan media tumbuh yang mengandung X-gal. rnaka perlu dihitung efisiensi transformasi yang terjadi. Fenomena ini dikenal dengan dengan inserlional inactivation. Dalam proses transformasi. yaitu: (1) sel kompeten tidak kemasukan molekul DNA apapun. (2) sel kompeten kemasukan DNA vektor yang membawa gen target. Noviendri bakteri yang di buat kompeten. Untuk memudahkan plasmid masuk ke dalam sel inang.

2006). Bentuk ini menurut Nicholl (1994) adalah dasar untuk metode skrining rekombinan secara langsung menggunakan X-gal substrat kromogenik. terutama rnikroba laut telah banyak dilakukan. Seiring dengan penggunaan metode ini dengan tujuan yang bermacarn-rnacarn... (Webb et al."'__-O" t ott j ott (A) (B) (8). 2006). Pemilihan metode bergantung kepada gen mana yang akan dipindahkan dan jenis organisme mana yang akan menerima informasi genetik baru. 2006). Dalam hal ini gen lacZ menjadi tidak berfungsi (tidak akan menghasilkan a-galaktosidase) karena telah disisipi DNA asing. dalam hal ini menemukan dan menghasilkan mikroba yang dapat mendegradasi tumpahan minyak di laut. 2006). Tujuan dari penggunaan teknologi ini terhadap mikroba laut bermacam-macam.Squalen Vol. 2004).. 2004). enzim baru yang memiliki aktivitas antimikrobial (Eck et aI. Contoh seleksi koloni bakteri rekornbinan dengan menggunakan X-gal (dikenal dengan seleksi biru putih)(A). 2006). 1990). senyawa eksopolisakarida (EPS) baru (DelbarreLadrat et aI. 2002) (Gambar 2A). Metode ini tidak mengikuti rangkaian prosedur yang pasti.2. diantaranya untuk konstruksi pustaka gen (Liebl. 2 No. sedangkan apabila koloninya berwarna putih gen lacZ-nya sudah rusak dan tidak berfungsi (Muladno. bila gen lacZ-nya rusak atau dirusak maka sel akan membentuk koloni yang berwarna putih. ..OH O~.Gambar 2. konstruksi gen klaster yang menyandikan enzim poliketida sintase I (PKS-I) (Grozdanov et al. Koloni bakteri akan berwarna putih bila pUC18/19 telah disisipi oieh DNA asing pada bagian gen lacZ. Pilihan tersebut akan bergantung pada sampai sejauh mana keterlibatan pilihan pribadi ilmuwan yang bersangkutan (Prentis. 2006). Namun pada prinsipnya. Jadi. untuk keperluan bioremediasi. Adapun koloni berwarna biru berarti sel kompeten yang tumbuh membawa DNA plasmid saja (tidak disisipi gen terget) (Muladno. 2002). untuk menemukan senyawa metabolit antitumor (Calle. rnaka secara tidak langsung ada moditikasi-moditikasi metode yang dilakukan. penggunaan teknologi ini pada mikroba laut telah banyak dilakukan orang. Dalam prakteknya. contohnya poii-a-hldroksialkanoat (PHA) (Noviendri. selain itu untuk menemukan mikroba penghasil bahan baku plastik biodegradable. 2006). senyawa sitotoksik. untuk perbandingan keragaman genetik (biodiversitas) (Suwanto. APLIKASI TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN Penggunaan teknologi DNA rekombinan untuk eksplorasi mikroba. Dengan kata lain. dengan mata telanjang bisa disimpulkan bahwa apabila sel bakteri membentuk koloni berwarna biru berarti gen lacZ-nya masih beriungsi. inhibitor likopen a-siklase (suatu senyawa antioksidan) (Totighi et al. teknologi DNA rekombinan yang dilakukan adalah sama. Reaksi hidrolisis X-gal oleh enzim a-galaktosidase I 61 . Jadi dengan demikian... Desember 2007 berwarna biru dengan adanya enzim a-galaktosidase dapat dilihat pada Gambar 2S. Terbentuknya koloni berwarna putih berarti sel kompeten membawa DNA rekombinan (DNA plasmid dan gen target). Warna putih pada koloni diakibatkan adanya kerusakan pada gen lacZyang disisipi gen target. mikroba laut yang CK.

dan disentrifus NaOH/SDS. Noviendri semula hanya sebagai penghuni laut yang merupakan kekayaan alam laut potensial. proteinase K. 1995). 10' Diinkubasi selama 15' pada -20oG.. SDS. (Suhartono et et. dikocok Diendapkan dengan sentrifus. Etanol (A). Contoh penggunaan teknologi DNA rekombinan yang telah berhasil dilakukan adalah kloning gen protease Bacillus stearothermophillus DSM297 ke dalam Escherichia coli DH5 alfa (Suhartono et a/. Diagram alir tahap isolasi DNA kromosom Keterangan: LB TE SDS EtOH : Luria bertani : Bufer Tris EDTA : Sodium dodesil sulfat . diforteks. . Isolasi DNA kromosom B. Disentrifus 3'.. diinkubasi 5' pada OoG selama Ditambahkan fenol/kloroform/isoaminalkohol (25:24:1) kedalam supernatan. ditambahkan absoul dingin. Adapun tahap-tahap kloning gen yang telah dilakukannya tersebut dapat dilihat pada Gambar 3 dan4.D.. selama 1 jam Diinkubasi selama 30' pada OoG Ditambahkan Ditambahkan campuran fenol/kloroform/is oaminal ko hal. PENUTUP Pada pengembangan bioteknologi kelautan dan perikanan. teknologi DNA rekombinan ini dapat digunakan untuk eksplorasi potensi dan biodiversitas organisme laut. samalarn (B). disentrifus selama 3' Dilambahkan isopropanol dingin pada supernatannya Lapisan atas diambil. dan isolasi DNA plasmid (B). dikeringkan Pele! dicuci dengan EtOH 70% dingin. dikeringkan DNA kromosom yang diperoleh dilarutkan dalam TE DNA pals mid yang diperoleh dilarutkan dalam TE Gambar 3. 4 jam Diinkubasi semalam. Isolasi DNA Plasmid Koloni pembawa plasmid diturnbuhkan dalarn media LB yang mengandung antibiotik yang sesuai Inokulasi pada media LB yang baru'. diendapkan sentrifus selama 2' dengan Kultur disentrifus Pelet dilarutkan dalam Tris/EDTA/Glukosa Endapan disuspensi dalarn TE. t 62 .. disentrifus selama 3' EtOH Dicuci dengan alkohol . stearothermophillu5 Kultur bakteri diturnbuhkan dalam media LB. Organisme laut (dalarn hal ini mikroba laut) yang sebelumnya hanya merupakan kekayaan (A). maka dengan adanya teknologi DNA rekombinan dapat ditingkatkan nllal tambahnya untuk menghasilkan suatu produk yang sangat prospektif. 1995)..

2 No.Squalen Vol. Pusal Antar Universitas-Bioteknologi. Ugasi DNA kromoson DNA plasmid dan DNA kromosom atau plasmid. 28 pp. 148 pp. Pengklonan Gen-Gen yang Diinduksi Merryl). selama 20'. diinkubasi pada 37oe. selama 414jam Carnpuran Inkubasi pad a suhu 70oe. Transformasi Sel inang (E. Jogjakarta. Disertasi Program Pascasarjana. 1991. T. Drug discovery of marine microorganisms as source of new antitumor compounds at pharmaMar. UGM. maka dengan teknologi DNA rekombinan dapat ditingkatkan nilai tambahnya untuk menghasilkan suatu produk yang sangat prospektif. Brown. D. ditambahkan dH20 dan bufer yang sesuai untuk endonuklease DNA kromoson atau plasmid yang telah dipotong dengan endonuklease tertentu Ditambahkan endonuklease restriksi (EcoRI atau Dicampur dengan dHp dan bufer T4 DNA ligans Hinalll) Suspensi dikocok. dinginkan pada suhu kamar ligasi slap digunakan transformasi untuk proses Carnpuran tersebut slap untuk proses ligasi (e). S. 1995). 1999. Rekayasa Genetika. dan transformasi (C) (Suhartono et al.GoN) yang telah kompeten Ditarnbahkan kedalam 50 uL DNA pada tabung mikro Carnpuran diinkubasi selama 30' pada OoC Campuran dikejutpanaskan selama 2' pada 42°C Segera lnkubasi selama 50' pada OoC Transforman diseleksi pda media SMMLA + IPTG. 1991. Desember 2007 (A). ligasi DNA krornosorn dan plasmid (B). Yogyakarta. L. Yayasan Essentia Medica. F. 274 pp. Pemotongan DNA dengan dengan enzim restriksi (8). Pengantar Kloning Gena. yang mengandung antibiotik yang sesuai. Calle. oleh Aluminium pede Kedetei (Glycine max (L) 63 . : Skim Milk Modified Luria Agar : Isopropil-ii-D-tiogalaktosida alam laut yang potensial dan belum memberikan nilai tam bah. IPB. inkubasi pada 12-15°e. Artarna.. plus X-gal untuk seleksi biru putih Gambar 4. 2006. Conference: From w. semalam Suspensi dikocok. T. Bogor. Keterangan: SMMLA IPTG Diagram alir tahap pemotongan DNA dengan enzim restriksi (A).2. DAFTAR PUSTAKA Anwar.

Seno. Stanfield. McGraw-Hili. J. D. Murdiyatmo. M. Greifswald. C. W. p186-195. Hala.D.2006. Piel. 200 pp. 1994. T. 1990. Bioteknologi Suatu Revolusi Industri yang Baru. p. Conference: From Functional Penuntun Praktikum Pelatihan Teknik Pengklonan Gen dan Pengurutan DNA. 62 pp. H dan Wirahadikusumah. Computer aided test and selection for Iycpene cyclase inhibitors: Molecular docking of Structurally vavasan a- Muladno. Jakarta. 100 pp. 2006. Edisi 1. J. 1997. 2004. 1992. USA. A. S. Suwanto. B.. Lap.. 16 pp. Greifswald.. S. Germany. R.. Greifswald. 2004. Fazeli. Kilimnik.. Dirjen DIKTI. 2006. June 21-24. Hayati. P. Gen penanda moiekuler pad a bakteri (Molecular Marker Gene in Bacteria). 4(1): 27-29. Departemen Pendidikan dan Kebudayaan. Chandra. and Cano.. Rand Mirzae. M. PAU-IPB.. G. PT Gramedia Pustaka Utama. Meurer. 98-109. Dion. Suharsono... 279 pp Conference: From Functional Genomics to Natural Products of Marine Microorganism. Extremophiles: from genomes to enzymes. dan Perikanan Indonesia: "Optimalisasi Pemanfaatan Sumberdaya Laut Melalui Pengembangan Bioteknologi Kelautan dan Perikanan". June 21-24. M. Pen. Noel. Hinkley. Schaum's outline series.. Greifswald. 2006.. EGC. Eck. 2006. LIP!. Bioteknologi untuk menggali potensi mikroorganisme laut. coli. R. D. U. S. Jakarta. and Jouault. M dan Junaidi. 25 Maret 2004. A. Prentis. IPB. S. Bogor. Schulze. L.. U. 1995. Y. Accesing metagenomes for industrial applications. Jakarta. Tesis Program Pascasarjana. S. Enzyme for The Engineering of marine bacterial exopolysacoharldes. PAU-IPB. Dahuri. L. L. D. Conference: From Functional Genomics to Natural Products of Marine Microorganism. T. Greifswald. Hulston. Biokimia. 322 pp. Y. Keanekaragaman Hayati Laut. Stryer. 2006. and Thomson. J. Screening tor cytotoxic compounds for marine bacteria. Sinquin. D. Kloning gen protease Bacillus stearothermophillus DSM297 ke dalam Escherichia coli DH5 alfa dan telaah ekspresinya. Cambridge University Press. R J. M. 3. L.. Erlangga. Pustaka Wirausaha Muda. 2006. A. Penyandi Enzim PHA Sintase. diverse herbicidal Inhibitors in Ounaliella salina CCaP 19/18. C. 2006. 168 pp. T. S. V. Bogor. L. Germany.. An Introduction to Genetic Engineering. June 21-24. 1992. Fieseler. Metagenomic analysis of secondary metabolic gene clusters from marine sponge associated microbial consortia. J. Jakarta. Vol. Conference: From Functional Genomics to Natural Products of Marine Microorganism. 123 pp. Pusat S. Greifswald. 1989. 2006. Theory and Problems of Molecular and CeJlBiology.. Germany. Revolusi Bioteknologi. S. Pusat Bioteknologi. H. 2000. Seputar Teknologi Rekayasa Genetika. and Lorenz. Germany. Wahyudi. DiktiDikbud. Gen Penisilin GAs karta. I. Bogor. Penelitian dan Pengembangan Bogor. S. M. Bogor. Kloning dan over ekspresi struktural dehalogenase dari Pseudomonas cepacia MBA4 pada E. and Hentschel. P. June 2124. 1997. 2000. Bogor. D. Conference: From Functional Genomics to Natural Products of Marine Microorganism. 279 pp. Obor Indonesia. 2006. Noviendri Functional Genomics to Natural Products of Marine Microorganism. 2006. Ratiskol. Suhartono. 412 pp. Kloning W. 2003. 2006. K. Hopf.. Colome. T.. Ed 4.. A. Nicholl. IPB. Noviendri. Germany. Germany. June 21-24. Tesis Program Pascasarjana IPB. Forum Bioteknologi Kelautan Genomics to Natural Products of Marine Microorganism. Liebl. 2002. A. Suwanto. Wu. 2006. June 2124. Delbarre-Ladrat. Germany. Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Penghasil Poli-a-Ndroksialkanoat (PHA) Sebagai Bahan Baku Plastik Biodegradabel dan Deteksi Gen t 64 . S. Enzim dan Bioteknolgi. Greifswald. Tofighi. J. Reader. Penerbit Buku Kedokteran. Webb. Conference: From Functional Genomics to Natural Products of Marine Microorganism. 1991. Penggunaan Gen Penanda Molekular untuk Deteksi Pelekatan dan Kolonisasi Vibrio harveyi pede Larva Udang Windu (Penaeus monodon). June 21-24. Pro siding Seminar Hasil Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi. A. 513 pp. Grozdanov. 78 pp. Marx. 1999. J. Bogor. Antar Universitas Suhartono. C.

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful