Obtencin del colorante de la semilla de achiote (Bixa orellana) utilizando microorganismos celulolticos Achiote (Bixa orellana) seeds colorant

extraction using cellulolytic microorganisms Hernndez Gonzlez Mara1, Tirado Gallegos Juan Manuel1, Ilin Anna2, Lpez Trujillo Ramiro1, Rebolloso Padilla Oscar No1, Ruelas Chacn Xchitl1. Resumen El presente estudio se llevo a cabo con la finalidad de extraer el colorante bixina, presente en la semilla del achiote, ampliamente utilizado por la industria alimentaria, mediante un tratamiento que ofrezca adems de buenos rendimientos, un producto libre de componentes txicos. El proceso se basa en el uso de microorganismos productores de celulasas, capaces de degradar la pared celular de las semillas donde se encuentra el pigmento para facilitar su liberacin en un medio acuoso, obtenindose rendimientos del 81%, mayores a los ofrecidos por extraccin acuosa y ligeramente menores que los obtenidos con tratamiento cidobase, cuestionados por la comunidad Europea, obtenindose una pasta que muestra picos en el intervalo de los 1600 cm-1 representativo de los grupos carbonilos caractersticos de la estructura de la bixina. Palabras clave: Bixina, achiote, microorganismos celulolticos. Abstract This assay was carried out to extract bixine, a colorant attached to achiote seeds, widely used in food industry, by a method which may offer besides good yields, a toxin free product. The process is based on the use of cellulolytic microorganisms able to degrade the seeds cellular wall, where the pigment is attached, in order to facilitate the pigments liberation in a watery medium. 81% of the pigment was recovered, this percentage is higher than the one offered by the aqueous treatment and lower than the one offered by the acid-basic procedure, not well accepted by the European community. The final paste obtained showed peaks near to 1600 cm-1 representative of the carbonyl groups characteristic of the bixine structure. Key words: Bixine, achiote, cellulolytic microorganisms Introduccin El color de los alimentos es un atributo que tiene mucho peso dentro del juicio del consumidor, este puede llegar a ser determinante para que un comestible sea aceptado o rechazado. (Badui, 1993). La industria alimentaria utiliza una serie de sustancias , mejor conocidas como aditivos; que tienen como funcin primordial impartir alguna coloracin en particular o simplemente resaltar la que por la naturaleza tienen las materias primas o, en su caso, de los procesos tecnolgicos en la coloracin del producto final.

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Los aditivos que son utilizados como sustancias colorantes pueden ser
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Universidad Autnoma Agraria Antonio Narro, 2 Universidad Autnoma de Coahuila

obtenidos por sntesis qumica en la industria (colorantes sintticos) o provenir de fuentes naturales como los vegetales (colorantes o pigmentos naturales). En los ltimos tiempos los colorantes sintticos han sido cuestionados debido a sus efectos toxicolgicos, inclusive algunos han sido eliminados de algunas legislaciones. Lo anterior aunado a la tendencia que tienen los consumidores, sobre todo en los pases desarrollados, a consumir alimentos con un mnimo o nulo contenido de sustancias sintticas; ello ha provocado que el uso de colorantes naturales vaya en aumento y sustituyendo a los sintticos (Salas, 2003). Para abastecer la creciente demanda de colorantes naturales sin problemas de legislacin, se procede a la extraccin de los pigmentos presentes en los tejidos vegetales o animales por medio de diferentes mtodos, cada uno presenta sus limitantes y ventajas. El colorante obtenido de las semillas de achiote (Bixa orellana), esta compuesto en su mayora por el carotenoide bixina, que se utiliza en la industria lctica, crnica, condimentara, cosmtica, farmacutica, etc.; es un colorante natural exento de certificacin. La extraccin ms rudimentaria se basa en un lavado con agua en ebullicin y a escala industrial se ha implementado un proceso de extraccin alcalino que es de fcil aplicacin, pero que tiene el inconveniente de que el producto final contiene al mximo 30 a 40% de pigmentos (Vzquez, 2001). Las posibilidades de incrementar el rendimiento y la pureza del colorante obtenido del achiote siguen siendo tema de estudio, se debe buscar un mtodo de extraccin de fcil aplicacin, que eleve el grado de rendimiento, dando como resultado un extracto exento o con un mnimo de impurezas qumicas, que disminuya los riesgos que implica al consumidor el uso de solventes o los tratamientos cido alcalinos. Metodologa experimental
Se trabaj con semillas enteras de achiote procedentes del estado de Chiapas, adquiridas en un mercado del municipio de Acala. Las semillas fueron mantenidas en envases plsticos y almacenados en condiciones de oscuridad.

Para los objetivos de la investigacin, se procedi a realizar anlisis de ceniza, humedad, grasa, fibra cruda, celulosa, lignina y bixina. Todas las determinaciones se realizaron en base a los mtodos establecidos por la AOAC en 1980, excepto las de celulosa, lignina, y fibra que se hicieron de acuerdo a Vansoest, et al. (1968), y la de bixina se realiz de acuerdo a las normas oficiales mexicanas.
Una vez efectuada la caracterizacin de la semilla se procedi a seleccionar e identificar y seleccionar cepas fngicas con probada actividad celuloltica. Se evaluaron 7 cepas, las cuales fueron proporcionadas por la Facultad de Ciencias Qumicas de la Universidad Autnoma de Coahuila, en funcin a la produccin de celulasas.

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Los hongos fueron viabilizados en un medio lquido y posteriormente inoculados en placas de agar carboximelticelulosa (CMC). Despus de 7 das de incubacin a 28C se evalu su actividad sobre la celulosa aplicando la tcnica del rojo congo de acuerdo con los lineamientos propuestos por Ilin (2002). De esta etapa se logr seleccionar tres cepas para su posterior caracterizacin. La caracterizacin de las cepas se realiz observando los microorganismos tanto macroscpica como microscpicamente, mediante anlisis de morfologa, esporulacin y asimilacin de nutrientes. Todos los anlisis fueron realizados de acuerdo a los lineamientos propuestos por Barnett et al., (1987) y Romero (1993). Una vez seleccionadas e identificadas las cepas fngicas se procedi a establecer un proceso fermentativo aerbico en medio acuoso, el cual contena 0.6 g. de NaNO3, 0.1 g. de KH2PO4, 0.1 g. de MgSO4, 0.1 g de KCl y 0.02 g. de K2SO4 y 2.0 g. de semillas de achiote, como nica fuente de carbono en 200 ml de Buffer a pH de 5, 3 y 7 preparado de acuerdo a la tcnica propuesta por Lynch et al (1987). Posteriormente se inocul cada unidad experimental con un inculo que contena 2,000,000 de esporas/ml., y se mantuvo en baos Mara para el control de la temperatura a 25, 30 y 35 C, durante 144 hrs. Durante este tiempo se monitore la formacin de azcares totales y reductores, los primeros se determinaron de acuerdo a los lineamientos propuestos por Dubois (1956) con fenol sulfrico, los azcares reductores se analizaron de acuerdo con Miller (1959). Terminado el proceso de biocatlisis, cada sistema fue esterilizado en autoclave, para detener el crecimiento y actividad fngica. Despus del proceso de esterilizacin se recuper el colorante mediante tratamientos en medio acuoso por calentamiento, prensado y filtrado, hasta obtener la mayor cantidad de colorante posible. El material obtenido en las operaciones antes citadas, fue sometido a un proceso final de evaporacin en horno a una temperatura entre 60-65C hasta la eliminacin completa de la humedad residual. La determinacin del rendimiento se realiz por anlisis gravimtrico. Los datos arrojados por el anlisis gravimtrico fueron sometidos a un anlisis de varianza factorial con p>0.05, esto, para determinar las condiciones que ofrecen una mayor liberacin de colorante. A fin de determinar la pureza del extracto recuperado, se procedi a aplicar un anlisis por espectroscopia infrarroja (IR) a los extractos obtenidos, mediante la preparacin de la pastilla de KBr con la muestra del colorante en polvo y se analiza en un espectrofotmetro Perkin Elmer. Resultados y discusin Los resultados arrojados por el anlisis qumico efectuado a la semilla muestran 1.4% de bixina, 1.61% de humedad, 9.74% de celulosa, 3.76% de lignina, 16.9% de fibra cruda, 3.51% de cenizas y 4.52% de grasa, Se puede observar que el menor componente de la semilla utilizada en la presente investigacin fue el agua, esto se traduce en un elevado contenido de materia seca que se caracteriza por su alto contenido en fibras, por lo cual la semilla pude 73

funcionar en el proceso de Biocatlisis como una fuente de carbono caracterizada por fibras que pueden ser desdobladas por complejos enzimticos presentes en organismos como los hongos. Los resultados obtenidos aplicando la tcnica del rojo congo, para seleccionar la cepa con mayor actividad celuloltica, fueron sometidos a un anlisis de varianza con una p<0.05; esto con la finalidad de elegir con mayor seguridad cual o cuales microorganismo son los que ms se adecuan a la investigacin. Los resultados del anlisis se reportan en el cuadro nmero 1, como las medias analizadas por la prueba de t-Student (p<0.05).
Cuadro 1. Resultados de rojo congo analizados mediante t-Student (p<0.05)

CEPA Cepa 7 Cepa 5 Cepa 2 Cepa 8 Cepa 1 Cepa 4 Cepa 3 Cepa 9 A B B C C C D D D E E

PROMEDIOS CUADRADOS 3,90 cm. 3,40 cm. 3,23 cm. 3,10 cm. 3,05 cm. 2,91 cm. 2,63 cm. 2,43 cm.

DE

MNIMOS

El anlisis de medias permite concluir que la cepa con mayor produccin de celulasas es la cepa 7, ya que en el anlisis estadstico fue la mejor, existiendo diferencia significativa con el resto. Por otro lado, la cepa 5 y la cepa 2 resultaron estadsticamente iguales, presentando menor actividad que la cepa 7, pero mayor que el resto de las cepas. Las cepas 7 y 5 fueron identificadas como genero Aspergillus ssp. y la 2 como una mezcla entre Aspergillus y Penicilium por lo cual solo las dos primeras fueron probadas en el proceso de biocatlisis. Finalmente fue posible establecer que las mejores condiciones para degradar la pared celular de la semilla del achiote fue la interaccin presentada entre la cepa 7 a pH 7 y temperatura de 35C, ya que as se manifest en el monitoreo de azcares el cual mostraba constante formacin y consumo de los mismos a diferencia de las dems interacciones. En la figura 1 se pueden observar los pesos de pasta de achiote obtenidos despus de terminado el tiempo en cada tratamiento. Se observa que la cepa 7 ofrece los mayores rendimientos bajo todas las condiciones de trabajo.

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Efecto de los diferentes tratamientos

1,4 Pasta obtenida en g 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0
pH 3, pH 3, pH 3, pH 5, pH 5, pH 5, pH 7, pH 7, pH 7, 25 C 30 C 35 C 25 C 30 C 35 C 25 C 30 C 35 C

Cepa 7 Cepa 5 Cepa 1 (testigo)

Condiciones de pH y temperatura

Figura 1. Pasta colorante obtenida para cada tratamiento.

De la misma manera que en el anlisis de varianza, se observa que la interaccin que ofrece el mayor rendimiento es cepa 7, pH 7 y temperatura de 35C, presentando 1.2 g de extracto colorante, los cuales contienen 0.022 g de bixina total obtenidos a partir de una muestra de 2 g; por lo que se espera que de 100 g de semilla se obtengan 1.13 g de bixina lo que representa el 80.7 % de extraccin ya que la semilla contiene 1.4 g de bixina por 100 g de semilla como se cit anteriormente. En la figura 2 se muestra un espectro infrarrojo (IR) para la pasta colorante recuperada, destacndose un pico sobresaliente cercano a 1600 cm-1, el cual es representativo de los grupos carbonilos, as como un pico en el intervalo de los 1700 a 1880 cm-1 aproximadamente, representativo de los dobles enlaces presentes en las estructuras orgnicas, caractersticas de la bixina.
105.2 100
1974.96 715.39 825.88 879.51

90

80 m 'b' esporas 70 %T

2927.12 1266.98 772.05

60

3271.00 1373.24

50

1598.96

40
1048.10

30 25.0 4000.0 3000 2000 cm-1 1500

1000

600.0

Figura 2 Espectro de Infrarrojo para pasta obtenida.

Conclusiones En los resultados obtenidos se observ que el mayor constituyente de de la semilla de achiote (Bixa orellana) son las fibras, a las cuales se encuentra adherido el pigmento de inters. De las cepas evaluadas, la que present mayor actividad celuloltca, de acuerdo a la tcnica del rojo congo, fue la designada como 7, identificada como

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Aspergillus, lo cual fue confirmado al monitorear la formacin y consumo de azcares totales y reductores presentando un comportamiento tpico para este tipo de hongos excretando la enzima al medio para obtener carbohidratos simples y asimilarlos constantemente. Fue posible establecer que las condiciones para el ptimo desarrollo fngico, con su consecuente efectividad en la degradacin de la materia en cuestin para facilitar la liberacin del pigmento, fueron de pH 7 y temperatura de 35C, para la cepa 7 identificada como Aspergillus spp. Antes citado. Comparando los procesos usando las otras cepas estudiadas y sin inculo, el tratamiento con Aspergillus result un 30% mas efectivo que los antes mencionados. Las condiciones antes citadas ofrecen un rendimiento de extraccin de bixina de hasta un 80 % comparado a lo obtenido con agua, e inferior al reportado utilizando los mtodos alcalinos, sin contener los residuos qumicos txicos que se presentan en dicha extraccin, cuestionados recientemente por la unin Europea.

Literatura citada
AOAC. 1980. Oficial Methods of Anlisis of the Association of Official Alytical Chemists. Thirteenth edition. 353 p. Badui, D. S. 1993. Qumica de los alimentos. Addison Wesley Longman de Mxico, S. A. DE C. V. Mxico D. F., Mxico. Dubois, M., Guilles, K. A., Hamilton, J. K., Rebers, P. A. and Smith, F. 1956. Colorimetric meted for determination of sugars and related substances. Anal. Chem. 28:530. Ilin A. 2002. Manual de Prcticas de crdito 1 Introduccin a la Biotecnologa U. A. de C. 38 p. Lynch, M. J. R., S. S. Mellor, D. L. Spare, D. P. Inwood, H. M. J. 1987. Mtodos de Laboratorio. 2 ed. Vol 2. Ed. Nueva editorial interamericana. Mxico, D. F. pp. 1446-1447. Salas, G. L. 2003. Educacin Alimentaria, manual indispensable en educacin para la salud. Ed. Trillas. Mxico, D. F. pp. 97. Vansoest, P. J. y Wine, R. H.1968. Determinacin de fibra por el mtodo cido detergente/ determinacin de lignina, celulosa y silicio por el mtodo de permanganato. J. Anal. Chem. 51: 780 p Vzquez, H. C. 2001. Estudio preliminar de la degradacin de bixina en polvo en los diferentes tipos de empaques y temperaturas establecidas. Tesis ING. Instituto Tecnolgico de Villahermosa. Villahermosa, Tabasco, Mxico.

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