Universidad nacional Micaela Bastidad de Apurímac- ingeniería agroindustrial

PRACTICA Nº6 CARACTERIZACIÓN DE COLORANTES DE ACHIOTE Y COCHINILLA I.-OBJETIVO

Identificar los colorantes por medio de espectrometría y cromatografía

II.-INTRODUCCIÓN El conocimiento sobre los parámetros de extracción nos permite optimizar la obtención de colorantes de diverso origen. La caracterización de los colorantes se va mas hacia el conocimiento de las propiedades físico- químicas de estos compuestos, independientemente de la cantidad que se obtenga a partir del uso de una tecnología apropiada. La caracterización de colorantes es una de las etapas importantes en el reconocimiento de aquellas características que debe cumplir un colorante de calidad. Por ello, la presente práctica tiene por finalidad ayudar al estudiante a reconocer las técnicas mas adecuadas aplicadas ala verificación de tales características. III.-FUNDAMENTO TEÓRICO
COLORANTE NATURAL sin les Colorante orgánico natural, pigmento o sustancia que se obtiene a partir de materia vegetal o animal, con un limitado proceso químico o él y sometidos posteriormente a pruebas de identidad y pureza que permita ser utilizados en alimentos, productos de perfumería y belleza, en alguna parte de éstos o en todo y que directamente o a través de su reacción con otras sustancias, es capaz de impartir el color que le caracteriza.

LA CROMATOGRAFÍA La cromatografía es una técnica que se emplea en el fraccionamiento de proteínas. Consiste en la aplicación de una muestra compleja de proteínas a una columna de cristal en la que se ha situado una matriz sólida porosa que está inmersa en el solvente. A continuación se bombea una gran cantidad de solvente a través de la columna. Las diferentes proteínas se van retrasando de manera distinta según sus interacciones con la matriz, por lo que pueden ser recogidas separadas a medida que son eluidas por el fondo de la columna. Según la matriz escogida, las proteínas se pueden separar de acuerdo a su carga, su hidrofobicidad, su tamaño o su capacidad de unirse a grupos químicos particulares.

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TIPOS DE CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA El principio de separación de la cromatografía es la aplicación de un criterio de separación a las proteínas que se desplazan a lo largo de una matriz sólida porosa..Universidad nacional Micaela Bastidad de Apurímac.ingeniería agroindustrial La pureza de las fracciones obtenidas se suele comprobar electroforesis en geles de poliacrilamida. En toda cromatografía hablaremos de los siguientes términos: • mediante la matriz de la columna. Sustancia que está empapada de solvente y que se empaqueta en la columna. y dependiendo del tipo de cromatografía puede ser de 1 a varias veces el volumen de la columna. positiva en el esquema. Es importante en algunos tipos de cromatografía como la de filtración en gel y poco importante en otras como la cromatografía de afinidad. En unas condiciones determinadas serán retenidas en la columna las proteínas que tengan una carga complementaria a la de la matriz del gel 2 . Volumen total de gel que se empaqueta en una columna cromatografía. • • volumen de la columna. Correspondería en el caso de la cromatografía de afinidad al volumen de solvente que contiene las proteínas no afines al ligando. el volumen de solvente más proteínas que atraviesa la columna sin quedar retenido en ella. También se denomina el lecho de la columna. etc. Es. en columnas de intercambio iónico o de afinidad. Coincide con el volumen de solvente que sale de la columna desde que se aplica la muestra hasta que empieza a salir la primera proteína. carga eléctrica. La carga de la matriz de la columna así como la carga de las proteínas dependerá del pH del solvente y de su fuerza iónica (proporcional a la concentración de iones).. • • 'Run Throught'. Longitud del dispositivo en el que se empaqueta la columna. volumen muerto de la columna. En función de cual sea el criterio de separación que se aplique diferenciamos tres tipos de cromatografía en columna: Cromatografía de intercambio iónico La cromatografía de intercambio iónico se realiza sobre que tienen una carga neta. longitud de la columna. afinidad de una de ellas por alguna otra. Este criterio de separación se basa en alguna propiedad que es diferentes entre las proteínas que se quieren separar : peso molecular. Cantidad de solvente que tiene que atravesar la columna para asegurar que se ha reemplazado completamente. En general.

la primera se reparte entre el espacio entre las bolas y el interior de los poros. puede ser un receptor (proteína) unido a las bolas.) con lo que se reduce la intensidad de la interacción hasta anularla.ingeniería agroindustrial (las proteínas cargadas negativamente serán retenidas por una matriz cargada positivamente). una molécula ante la que tiene afinidad una o más de las proteínas presentes en la mezcla a separar. La segunda proteína.. y en segundo lugar las menores. etc. Empleando patrones de proteínas de peso molecular conocido se emplea para determinar el peso molecular de proteínas de tamaño desconocido. La naturaleza del ligando es muy variada. o el antígeno empleado en una inmunización el que recubre las bolas y que retendrá del suero del animal aquellos anticuerpos que lo reconocen (anticuerpos purificados por afinidad). Columnas largas aseguran separaciones de mayor calidad. El flujo de solvente es más elevado entre las bolas que en el interior de los poros de éstas. o en el caso concreto de la inmunoafinidad el ligando que recubre las bolas son anticuerpos que retienen en la columna a aquellas proteínas que contienen los epítopos que reconocen. 3 . Cromatografía de afinidad y de inmunoafinidad En la cromatografía de afinidad las bolas de gel que conforman el lecho de la columna presentan unido en su superficie un ligando. Para eluir las proteínas retenidas se puede variar la carga iónica del solvente o su pH de forma que se alcance el punto matrices isoeléctrico de la proteína de interés o el de la matriz. Al atravesar la columna el ligando secuestra sobre la superficie de las bolas de gel la proteína afín. neutralizando de este modo la fuerza que retiene a las proteínas L en la columna. sólo puede encontrarse entre las bolas. En esta cromatografía se eluyen primero las proteínas mayores.. y tiene una gran influencia en el resultado la longitud de la columna y el volumen de la misma. variando la fuerza iónica del solvente. siendo eluidas las restantes. que seleccionará su/s ligando/s de una mezcla compleja. y deja pasar el resto.Universidad nacional Micaela Bastidad de Apurímac. La elución de la proteína afín se puede conseguir modificando las propiedades de carga del ligando (variando el pH hasta alcanzar su punto isoléctrico. El volumen de los poros es muy elevado y su diámetro está determinado. por tamaño. Cuando penetran en el lecho de la columna dos proteínas de tamaños tales que una penetra en los poros de las bolas de gel y la otra no. reduciéndose la concentración en la fase libre entre las bolas. por lo que el efecto neto es el de acelerar el desplazamiento de las proteínas de mayor peso molecular respecto al de las de menor peso molecular. La cromatografía de filtración en gel se realiza empleando unas matrices formadas por unas esferas porosas.

Aplicar una pequeña cantidad de la muestra con la ayuda de un capilar.ingeniería agroindustrial En ocasiones la cromatografía de afinidad se realiza incubando el gel recubierto con el ligando directamente con la solución que contiene las proteínas a purificar. Colores De La Luz Visible Longitud de onda de la Color absorbido Color observado 4 . Tabla Nº 1. Papel Solvente de desarrollo Técnica cromatografía • • • • Selección de patrones Siembra de la muestra Desarrollo del cromatograma Comparación de las manchas con las de los patrones (Rf y forma). Posteriormente se empaqueta la columna y se procede a la elución. Todas las formas de cromatografía trabajan bajo el mismo principio. o espectrógrafo. La cromatografía es usada para separar mezclas de sustancias en sus respectivos componentes. aplicar soluciones acuosas estándares de colorantes. Es un método rápido y eficaz para la identificación y separación de mezclas de colorantes. A su lado. Se aplica a variados instrumentos que operan sobre un amplio campo de longitudes de onda. Elección de las condiciones de corrida. El esquema general de trabajo comprende las siguientes etapas: • • Preparación de la muestra. Los métodos espectro métricos son métodos instrumentales empleados en química analítica basados en la interacción de la radiación electromagnética. Hacer una capa fina con el papel cromatografito. primero de las proteínas no unidas ('run throught') y posteriormente de las retenidas (eluido específico). Utilizar la mezcla de disolventes n y avanzar la cromatografía. es un aparato capaz de analizar el espectro característico de un movimiento ondulatorio. ESPECTROMETRÍA El espectrómetro. La técnica descripta a continuación sirve para la identificación rápida de los colorantes permitidos por el Código Alimentario. con un analito para identificarlo o determinar su concentración.Universidad nacional Micaela Bastidad de Apurímac. u otras partículas.

Universidad nacional Micaela Bastidad de Apurímac.ingeniería agroindustrial absorción máxima(nm) 380-420 420-440 440-470 470-500 500-520 520-550 550-580 580-620 620-680 680-780 Violeta Azul violeta Azul Verde azuloso Verde Verde amarillento Amarillo Naranja Rojo Púrpura Amarillo verdoso Amarillo Naranja Rojo Púrpura Violeta Azul violeta Azul Verde azuloso Verde Tabla Nº 2 principales colorantes Naturaleza quimica Tetrapiroles (lineales y cíclicos) Carotenoides (tetraterpenoides) Flavonoides ejemplos Ficobilinas Clorofilas Carotenoides Flavonas Flavonoles Blanco-crema Chalconasçauronas Amarillo-blanco Antocianinas Amarillo 330-360 340-390 Amarillo Xantonas Quinonas Xantonas Rajo-azul Naftoquinonas Amarillo Antraquinonas Rojo-azul-verde Derivados indigoides e índoles Pirimidas Uterinas sustituidas Flavinas Blanco-amarillo Fenoxazinas Amarillo fenazinas Amarillo-rojo Amarillo-purpura (betacianinas) Amarillo-rojo 530-554 Indigo Rojo-purpura Betelainas Azul-rosado (betaxantinas) 470-485 420-460 340-400 480-550 380-340 310-350 400-500 Color predominante Azul – verde Amarillo – rojo Verde Amarillo – anaranjado λn m 610-650 (ficocianidinas) 540-570 (ficoeritrinas) 640-660 5 .

1997 IV. Se Coloca el colorante en una fiola de 25ml. de colorante. • Se realizo una homogenización De la solución coloreada (naranja palido). este método esta basado en la determinación de la longitud de onda de máxima absorción de una solución diluida de achiote • V. Enrasamos (96º) con hasta alcohol etílico disolverlo completamente.Universidad nacional Micaela Bastidad de Apurímac. • 6 . tomar una alícuota de 3ml con ayuda de una pipeta y vertimos el contenido en otra fiola de 25ml. Fiola de 25ml Papel filtro Capilar de vidrio Espectrofotómetro Regla Alcohol etílico(96º) • VI.-PROCEDIMIENTO Para la cromatografía de absorción • • • Pesamos dos muestras de exactamente 0.-MÉTODO En esta práctica se desarrolla la caracterización de colorantes a partir de dos métodos que son los siguientes: • Método de Cromatografía de Absorción.5gr. muestra de colorantes (achiote) muestra de colorantes (cochinilla) vaso de precipitado de 250ml. este método esta basado en la separación cromatografía de las especies colorantes.ingeniería agroindustrial Fuente: Lock Sing O.-MATERIALES • • • • • • • • Método de Cromatografía de papel.

Preparamos una tira rectangular de papel filtro. Identifique los puntos de muestra colocados. aun centímetro del borde del lado menor. verter el contenido en una de las celdas del espectrofotómetro para realizar la medición de longitud de ondas de 420 hasta500nm. para ello tomamos los como referencia los valores mas altos. colocamos las muestras en forma de pequeños puntos sobre la línea trazada con lápiz en el papel.723 0. Luego. preparamos las soluciones de colo rante. trazamos una línea con ayuda de una regla y un • • • Luego.-RESULTADOS 1.005 500 495 490 0.001 590 0. • • lápiz. Con ayuda de un capilar de vidrio. Realizamos las rectificaciones de los valores para que sena mas exactos.Los datos tomados son de la muestras de achiote: absorbanc ia longitud de onda 600 0. estas deben ser muy concentradas. Luego.003 595 0. Para cromatografía en papel • • • En un vaso de precipitado vertimos más o menos 10ml de eluente (alcohol etílico 96º). • VII. haciendo la medición cada 5nm.894 7 .551 0. colocamos el papel en el vaso de precipitado y dejamos que el eluente separe las especies colorantes. • Preparamos la muestra patrón (alcohol 96º) Hacemos la medición en blanco.Universidad nacional Micaela Bastidad de Apurímac..ingeniería agroindustrial • • Volvimos a enrasar con alcohol (96º) y agitamos hasta conseguir homogeneidad.

244 1.919 0.018 1.105 0.284 0.102 0.03 0.136 0.063 615 0.064 620 0.062 0.007 0.009 0.392 485 480 475 470 465 460 455 450 445 440 435 430 425 420 415 410 405 0.871 0.103 0.Universidad nacional Micaela Bastidad de Apurímac.002 0.8 0.003 0.024 0.067 610 0.59 0.011 0.102 8 .193 0.173 1.525 absorbocion (A) longitud de onda(nm) 630 0.06 0.064 625 0.106 0.ingeniería agroindustrial 585 580 575 570 565 560 555 550 545 540 535 530 525 520 515 510 505 0.994 0.014 0.643 0.986 0.046 0.954 0.004 0.068 560 555 550 545 540 0.709 0.994 1.144 1.017 0.086 0.997 0.

097 535 530 525 520 515 510 505 500 495 490 485 480 0.9761 9 .muestra obtenida de la cochinilla De la segunda parte: determinando el factor de retención (Rf) Rf =Ls/Le 1.072 0.2 =0.Universidad nacional Micaela Bastidad de Apurímac.2cm Rf =Ls/Le Rf = 4/4.-Del análisis de cochinilla Ls = 8.4cm Rf =Ls/Le Rf = 8.ingeniería agroindustrial 605 600 595 590 585 580 575 570 565 0.2/8.105 0.9523 2.106 0.086 0.104 0..099 0.089 0.086 0.08 0.091 0.093 2.101 0.103 0.071 0.-Del análisis de achiote Ls = 4cm Le = 4.099 0.094 0.4 =0.2cm Le = 8.109 0.098 0.102 0.104 0.

9761 de cochinilla VIII.2/8. una muestra blanco) y en el factor de retención también las muestras fueron eficientes ya que • Los resultados de cada de las muestras fueron los siguientes: Longitud de onda Para achiote = 1.2/8.Universidad nacional Micaela Bastidad de Apurímac.9523 de achiote Rf = 8.2 =0. DISCUCIONES: • Los datos que se obtuvieron en la práctica fueron bastante practico en el caso de la cromatografía fue algo fácil por que solo utilizamos el equipos y la dos muestras ( el colorante(achiote y cochinilla) y caso de obtuvieron resultados óptimos.109nm Factor de retención Rf = 4/4.9523 de achiote Rf = 8. es decir la absorbancia máxima de la cochinilla y en la permisibles es entre (630-480A) • De la misma forma se puede decir que en la cromatografía en papel la retención es de 0. es decir la absorbancia máxima de la achiote y en la permisibles es entre (600 A-405º) • Se puede decir que la cromatografía de absorción. a una longitud de bibliografía el rango 515nm (10.9523 para el achiote y esto esta en el rango de un color naranja y a una longitud de honda entre 450-470 • De la misma forma se puede decir que en la cromatografía en papel la retención es de 0.9761 de cochinilla VI.9761 para el achiote y esto esta en el rango de un color naranja y a una longitud de honda entre 450-470 • El mejor resultado de la retención de agua fue de cochinilla tuvo mayor distancia de recurrido desde el punto de inicio.-CONCLUSIONES • Se puede decir que la cromatografía de absorción.4 =0.4 =0.244nm) la absorbencia alcanza el pico más alto.244nm Para cochinilla = 0.ingeniería agroindustrial Por lo tanto el: Rf = 4/4. a una longitud de bibliografía el rango 465nm (1.109nm) la absorbencia alcanza el pico más alto. 10 .2 =0.

mermeladas. carbonato o fosfato amónico) IV Obtenido calentando el azúcar con sulfito amónico o con una mezcla de anhídrido sulfuroso y amoniaco. La FDA los define como: “Es cualquier colorante.Haga un listado de los colorantes más empleados en la agroindustria. productos cárnicos. II Obtenido calentando el azúcar con anhídrido sulfuroso o sulfito sódico o potásico. o hidróxido o carbonato sódico o potásico.queso fresco. alfalfa Color: verde Utilidad: gomas. al cuerpo humano o a cualquier parte. helados y bebidas refrescantes Toxicidad: no se ha establecido un límite máximo a la ingestión diaria E150 . embutidos..Caramelo Fuentes: calentamiento de sacarosa y otros azucares Color: dorado oscuro Utilidad: Panadería. yogur y queso fresco Toxicidad: minima. aislada o derivada. conservas de pescado. con o sin intermediarios del cambio final de identidad a partir de un vegetal. caldos. yogur. fosfórico o sulfúrico.CUESTIONARIO 1. bebidas alcohólicas y bebidas no alcohólicas Toxicidad: no se conocen efectos adversos para la salud E140 – Clorofila Fuentes: algas.Universidad nacional Micaela Bastidad de Apurímac. III Obtenido calentando el azúcar con amoniaco o con una de sus sales (sulfato. 0 a 3 mg/kg (JEFCA) E101 – Riboflavina Fuentes: lácteos. 11 . chicles.. pastelería. por si misma es capaz de impartir color” A) Naturales Provienen de elementos vegetales. césped. nombre comercial y su origen. animal o mineral u otra fuente y que cuando es añadida o aplicada a los alimentos. conservas vegetales. leche entera y enriquecer alimentos Toxicidad: IDA: 0 a 0.5 mg/kg E120 – Cochinilla – Rojo natural 4 Fuente: hembras dactylopus coccus Color: rojo Utilidad: conservas vegetales. animales o minerales Son permitidos Son inocuos Son obtenidos de material biológico No necesitan certificación E100 – Curcumina – Amarillo natural 3 Fuente: rizoma de la cúrcuma Color: amarillo intenso Utilidad: curry. pigmento u otra sustancia obtenida por síntesis o artificio similar o extraída. medicamentos o cosméticos. mermeladas. indicando el color. cítrico. hígado y pescados Color: amarillo Utilidad: suero de leche. sopas. helados. caramelos. mostazas. gaseosas y bebidas alcohólicas Clases: I Obtenido calentando el azúcar sin más adiciones o bien añadiendo también ácido acético.ingeniería agroindustrial IX. helados.

Universidad nacional Micaela Bastidad de Apurímac. bebidas refrescantes. E153 – Carbón medicinal vegetal Fuentes: carbonización de materias vegetales. sopas y bebidas refrescantes Toxicidad: IDA: 0 a 200 mg/kg X. camote. Toxicidad: no se ha establecido un límite máximo a la ingestión diaria. margarina.163 Antocianos Fuentes: frutas y flores Color: rojos. naranja y rojo Utilidad: mantequilla. vinagres y desodorizar aceites. conservas vegetales. vinos. mermeladas y conservas de pescado Toxicidad: no se conocen efectos nocivos de este colorante y la OMS no ha fijado un límite a la dosis diaria admisible.ingeniería agroindustrial Toxicidad: FAO/OMS para aditivos alimentarios fija la ingestión diaria admisible en 200 mg/Kg de la clase III y IV. capsorrubina E160d – Licopeno Fuentes: Beta caroteno: papaya. helados y productos cárnicos Toxicidad: piel naranja Xantofilas E–161a FlavoxantinaE – 161b LuteínaE – 161c CriptoxantinaE – 161d RubixantinaE – 161e VioloxantinaE – 161f RodoxantinaE – 161g Cantaxantina Fuentes: vegetales. yogur. yogurt. E . norbixina o achiote: Semilla bixa orellana Licopeno: tomate Color: amarillo. queso. cárnicos. alimento de animales Toxicidad: piel naranja E–162 Rojo de remolacha – Betania – betalaína Fuentes: beta vulgaris: beterraga Color: rojo Utilidad: helados.-BIBLIOGRAFÍA 12 . E160 – Carotenoides E160a – Alfa. ají. repostería. salmón y crustáceos Color: amarillo y anaranjado Utilidad: píldoras. Color: verde Utilidad: decolorar parcialmente mostos. derivados lácteos. bebidas refrescantes. azulados o violetas Utilidad: vino. helados. beta y gamma caroteno E160b – Bixina. pimentón Bixina. conservas vegetales. productos de pastelería. yema de huevo. hojas verdes Capsantina: pimiento rojo. nobixina E160c – Capsantina. caramelos.

Colorantes Naturales. Lima. Pontificia Universidad Católica del Perú. • GIBAJA S. Pigmentos Naturales Quínonicos. cuarta edición. Lima. Schnepel y Steiner “análisis de alimentos” fundamentosmétodos-aplicación Pág. 1997.p 13 . Matissek. 1998. • LOCK O. Primera Edición. Primera Edición. Perú.409. 137-163.Universidad nacional Micaela Bastidad de Apurímac.291.ingeniería agroindustrial • • Salvador Badui Dergal. pp. Perú.”química de los alimentos” Pág. Editorial Universidad Nacional Mayor de San Marcos.

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