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UniversidadComplutense FACULTADDEFARMACIA

DEPARTAMENTODE MICROBIOLOGAII

GUADEPRCTICASDE INFECCIONESMICROBIANAS: PATOGNESISYCONTROL

Apellidos,nombre:........................................................................ Fecha: Mdulodeprcticas:

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PRCTICA1:ENSAYOSDEFORMACINDEBIOPELCULAS.

1.1.OBJETIVOS:
1. Cuantificar la capacidad de formacin de biopelculas de diferentes cepas aisladas de muestrasclnicasdelgneroPseudomonas.Dichacaractersticaesunfactordevirulenciade la bacteria ensayada y una caracterstica crucial para los pacientes con enfermedades respiratoriastipoEPOC,sobretodofibrosisqustica. 2. Cuantificar la capacidad de formacin de biopelculas de Candida albicans y de Saccharomyces cerevisiae. Candida albicans es capaz de adherirse a superficies plsticas y provocar as infecciones sistmicas a partir de catteres, sondas, prtesis, etc. Saccharomycescerevisiaeseutilizarcomocontroldelevaduranopatgena,aunqueexisten actualmente cepas de S. cerevisiae capaces de adherirse y provocar tambin infecciones, aunquemenosgravesquelasprovocadasporCandida.

1.2.FORMACINDEBIOPELCULASDEPseudomonas.

1.2.1.TCNICA.
1erDA:InoculacindelascepasdePseudomonas. SeinocularntubosdeLBlquidoconlasdiferentescepasaensayar. 2DA:Formacindelosbiopelculas. 1. Apartirdeuncultivolquidocrecidohastasaturacin,realizardilucionesseriadasenmedioLB. SeutilizarndiferentesdilucionesparacadacepadePseudomonasaensayar. 2. Seaaden100Lacadapocillodeunaplacade96pocillos. 3. Seincubana37Cdurantetodalanoche. 3erDA:Cuantificacindelaadhesin. 1. Seaaden25Lporpocillodeunasolucindecristalvioleta(0,1%enetanol)ysedejaactuar durante5min. 2. Selavaelexcesodecoloranteconagua. 3. Se despegan las biopelculas con una solucin de Tritn X100 (0,25 % en etanol) aadiendo 125Lporpocillo. 4. Semidelaabsorbanciaa570nm.

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1.2.2.RESULTADOS.
Cepa 1 Inculo Blanco 1/100 1/10 2 1/100 1/10 3 1/100 1/10 4 1/100 1/10

Cepa 1 Inculo Blanco Mediadelosdatos 1/100 1/10 2 1/100 1/10 3 1/100 1/10 4 1/100 1/10

Deacuerdoconlosdatosobtenidos, QuaislamientodePseudomonasaeruginosaesmspropensoaformarbiopelculas? Influyeenalgunacepalacantidaddeinculoenlaformacindebiopelcula?

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1.3.ENSAYODEFORMACINDEBIOPELCULASDECandidaalbicansYSaccharomyces cerevisiae. 1.3.1.TCNICA.


1erDA:InoculacindelascepasdeCandidaalbicansySaccharomycescerevisiae. SeinocularntubosdeYPDlquidoconlasdiferentescepasaensayar. 2DA:Ensayodeadhesin. 1. Sehacendilucionesdelasdiferentescepasaensayar. 2. Seinoculan12pocillosporcadacepaensayada. 3. Sedejaincubandoa37Cdurante1hora. 4. Selavanlospocillos. 5. Seaademediomnimo. 3erDA:Cuantificacindelaformacindebiopelcula. 1. Se aaden 25 L por pocillo de una solucin de cristal violeta (0,1 % en etanol) y se deja actuardurante5minutos. 2. Selavaelexcesodecoloranteconagua. 3. SedespeganlosbiopelculasconunasolucindeTritnX100(0,25%enetanol)aadiendo 125Lporpocillo. 4. Semidelaabsorbanciaa570nm.

1.3.2.RESULTADOSOBTENIDOS.
Cepaensayada DO DO DO

Qumicroorganismoseadhierems? Cmocreesqueinfluyeenlapatognesis?

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PRCTICA2.HEMOCULTIVO

2.1.OBJETIVOS.
Labacteriemiaeslaexpresinmsnetayclaradelainfeccinbacteriana,ynohayqueolvidar quelasbacteriassoncausadelmayornmerodeinfeccionesquepuedensertratadasycuradas.Por tanto,unadelastcnicasmstilesenunlaboratoriodemicrobiologaclnicaeslarealizacindeun hemocultivoparaladeteccindedichabacteriemia.

2.2.OBTENCINDELAMUESTRADESANGRE.
Seconsideraidealparaeldiagnsticodecualquierbacteriemialarealizacinde3hemocultivos (3extraccionesdesangreparainocularendosfrascosconmediodecultivocadaunadeellas)tomados con un intervalo de tiempo mnimo de 15 minutos entre ellos, y utilizando lugares de venopuncin diferentesporcadaextraccin. Hay que tener en cuenta que la extraccin de la sangre debe realizarse en condiciones de asepsia para evitar contaminar la muestra con la microbiota que coloniza la piel del paciente o de la personaquerealizalaextraccin.Porestemotivo,antesderealizarlaextraccindelasangresedebe pintarampliamenteconpovidonaiodadalapielprximaalazonaapinchar,ascomolosdedosndice, medioypulgardelamanoutilizadaparalapalpacindelavenaylapartesuperiordelosfrascosconel mediodecultivopordondesevaainocularlasangre. En cuanto al volumen de sangre necesario para la deteccin de la bacteriemia, se considera adecuadalacifrade1020mLdesangreporextraccin(510mLporfrasco)enadultosy2mLennios pequeos (1 mL por frasco). La sangre se inocula en los frascos que se incuban inmediatamente en estufaa37Chasta7das.

2.3.ANLISISMICROBIOLGICOPRELIMINAR.
Los frascos de hemocultivo deben vigilarse diariamente y observar si existe crecimiento. La observacin macroscpica puede indicar la presencia de crecimiento si aparece hemolisis, turbidez, sedimentooproduccindegas. Apartirdelosfrascosquepresentanevidenciadecrecimientodespusdelaincubacinseles deberealizarunatincindeGramyunsubcultivoendiferentesmediosyatmsferasdeincubacin,que permitanelcrecimientodebacteriastantoaerobiascomoanaerobias.

2.4.MATERIAL.
1.Unfrascodehemocultivopreviamenteinoculadoeincubadoa37C. 2.Jeringuillasconaguja. 3.ColorantesparalatincindeGram. 4.Portaobjetos. 6.Unaplacaconmediodeagarsangre. 7.Unaplacaconmediodeagarchocolate.

2.5.TCNICA.
1ERDA 1. Homogeneizarbienelfrascodelhemocultivomedianteinversionesdelmismo. 2. Utilizandolajeringuillarealizarunaextraccindelhemocultivoaparentementepositivoeinocular primero una placa de agar sangre y otra de agar chocolate con 2 3 gotas cada una, y posteriormenteextenderotras23gotasenunportapararealizarunatincindeGram. 3. Extenderelinculoenlasplacasdeagarsangreyagarchocolateconelasaestril,paraobtener coloniasaisladas.

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4. Incubara36CenatmsferadeCO2(jarraconvela). 5. Dejarsecarlaextensinalaireyposteriormentefijaralcalorsuavemente. 6. RealizarlatincindeGram. RESULTADOSOBTENIDOS 1. Anotar los resultados de la observacin macroscpica del hemocultivo. 2.IndicarelresultadodelatincindeGram: 2DA 1. Observarelcrecimientoenlasplacasdeagarsangreyagar chocolate.Anotarsiespositivoenambasyelaspectode lascolonias:tamao,brillo,mucosidad,hemolisisenagar sangre. 2. HacerunatincindeGramdeunacoloniarepresentativa de cada placa y compararla con la de la vspera: 3. Dependiendodelresultado,procedercomosigue: CocosGrampositivosencadenas: El resultado negativo en la prueba de la catalasa permite sospechar que se trata de Streptococcus o Enterococcus.Inocularuntubodebilisesculina,parainvestigar si se trata de Enterococcus, y una placa de agar sangre, colocando discos de bacitracina (si es hemoltico) y optoquina (si es hemoltico), para investigar especies de Streptococcus(Prctica4). CocosGrampositivosenracimos: El resultado positivo en la prueba de la catalasa permite sospechar que se trata de Staphylococcus o de Micrococcus (procedente de una contaminacin de la piel al tomar la muestra). Sembrar un tubo de Kligler en superficie y picadura para distinguir el metabolismo fermentativo de StaphylococcusdeloxidativodeMicrococcus. BacilosGramnegativos: SisesospechalapresenciadeHaemophilus,porlatincindeGramylaausenciadecrecimiento enagarsangre,sembrarunaplacadeagarMuellerHintonyensayarfactoresVyX(Prctica3). Enotroscasos,sembraruntubodeKliglerensuperficieypicadura,paradistinguirsisetratade bacilos no fermentadores (por ejemplo, Pseudomonas, Alcaligenes o Acinetobacter), o de enterobacterias(fermentacindeglucosapositiva). BacilosGrampositivosnoesporulados: Hacerlapruebadelacatalasaysembrarlaspruebasdehidrlisisdeesculina,movilidadyCAMP segnsedetallaenlaPrctica5.

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PRCTICA3.IDENTIFICACINDEHaemophilusspp.

3.1.OBJETIVOS.
LosmicroorganismospertenecientesalgneroHaemophilusson cocobacilos Gram negativos aunque a veces forman filamentos cortos (son pleomrficos). Las especies que con mayor frecuencia producen enfermedades en humanos son Haemophilus influenzae y Haemophilus parainfluenzae. Estos microorganismos son anaerobios facultativos y crecenmejorenunaatmsferaenriquecidaconCO2.Lamayoradelas especies tienen requerimientos nutricionales especiales, por lo que no crecen en medio agar sangre y s en agar chocolate. H.influenzae requiere hemina exgena (factor X) y NAD (factor V), mientras que H.parainfluenzae requiere solamente NAD. En el medio de agar chocolateexisteheminayNADdebidoaqueseliberandelinteriordelos hemates cuando se produce la lisis de los mismos al preparar este medio. Estos factores X y V tambin se pueden proporcionar mediante discosimpregnadosconlosmismos,quedepositadossobrelasuperficie de un agar MuellerHinton, difunden al medio y proporcionan una concentracindehemina,NAD,odeambos,suficienteparapermitirel desarrollo de las diferentes especies de Haemophilus. Si el microorganismo crece alrededor del disco con factores X + V, pero no crece alrededor del disco solamente impregnado con factor X o con factorV,setratadeH.influenzae.Sielmicroorganismocrecealrededor deldiscodefactoresX+V,ydeldiscodefactorV,peronodeldiscode factorX,setratadeH.parainfluenzae.

VX

Fig.3.1.Crecimientode Haemophilusinfluenzaeentorno aldiscoXV

3.2.MATERIAL.
1.UnaplacadeagarchocolateconunaespecieproblemadeHaemophilus. 2.DiscosdepapelimpregnadosconlosfactoresX+V,XyV. 3.UnaplacadeagarMuellerHinton. 4.Untubocon5mLdeaguadestiladaestril. 5.Unatorundaestrildealgodn. 6.PortaobjetosycolorantesparalatincindeGram. 7.JarrasyvelasparaobteneratmsferaenriquecidaenCO2.

3.3.TCNICA.
1.Realizarunasuspensinhomogneadelmicroorganismoproblemaeneltuboconagua. 2.Impregnarlatorundaconlasuspensindelinculoysembrarconellatodalasuperficiedelaplaca deMuellerHinton. 3. Con la ayuda de las pinzas (previamente flameadas y fras) coger un disco de factor V y colocarlo sobrelasuperficiedelagarenunextremodelaplaca.CogerundiscodefactorXyotrodefactores X+Vycolocarlosenlosotrosextremosdelaplaca.Debeprocurarseobtenerlamayordistanciaentre los3discos. 4.Incubara37C,1824horasenatmsferaenriquecidaenCO2yobservarculessonlosfactoresque necesitaelmicroorganismoparacrecer. 6

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3.4.RESULTADOSOBTENIDOS.
1. IndicarlaespeciedeHaemophilusdequesetratayporqu. 2. Indicar en qu medios crece el microorganismo problema y en culesno. 3. AnotarlamorfologaobservadaenlatincindeGram.
V X

3.5.DETECCINDELACTAMASA.

VX

3.5.A.OBJETIVOS.
Las pruebas de deteccin rpida de enzimas modificantes de Fig.3.2.Dibujarelcrecimiento antibiticos, como la deteccin de lactamasa, proporcionan una observado. informacin clnica muy rpida y muy til. Cuando se realiza esta prueba, una reaccin positiva indica que el microorganismo es resistenteatodaslaspenicilinassensiblesapenicilinasas(penicilina,ampicilina,amoxicilina,azlocilina, carbenicilina,mezlocilina,piperacilinayticarcilina).Unadelastcnicasmsutilizadasenloslaboratorios demicrobiologaclnicaparaladeteccindelactamasaeslapruebadelacefalosporinacromognica (nitrocefn). Consiste en un disco impregnado con nitrocefn; esta cefalosporina cromognica en presencia de lactamasa, se hidroliza produciendo un cambio de electrones, lo que resulta en un productocoloreado.

3.5.B.MATERIAL.
1. 2. 3. 4. 5. 6. Unaplacaconelmicroorganismoproblema. Discosdenitrocefn. Portaobjetos. Untuboconaguaestril. Pinzas. PipetaPasteurestril.

3.5.C.TCNICA.
1. Conlaayudadelaspinzaspreviamenteflameadasyfras,cogerundiscodenitrocefnydepositarlo sobreunportaobjetos. 2. ConlaayudadeunapipetaPasteurestrilhumedecereldisco. 3. Coger un asa del cultivo del microorganismo problema, depositarlo sobre el discodenitrocefny dejaratemperaturaambiente5minutos. Observar si existe un cambio de color. La aparicin de un color rojo indica un resultado positivo, es decir,elmicroorganismoproducelactamasayportanto,esresistenteatodaslaspenicilinassensibles apenicilinasas.

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PRCTICA4.IDENTIFICACINDE Streptococcuspneumoniae.
4.1.OBJETIVOS.
El neumococo es un importante agente causal de neumona que en muchas ocasiones se acompaa de bacteriemia. Tambin puede producir otitis media, sinusitis, meningitis y endocarditis. Este microorganismo necesita para su crecimiento medios ricos como el agar sangre y es sensible a optoquinaysolubleenbilis(desoxicolatosdico),caractersticasqueseutilizanparasuidentificacin. Estos microorganismos son cocos Gram positivos que habitualmente se disponen en parejas conunamorfologalanceoladaaunquetambinsepuedendisponerencadenas.Lascoloniaspresentan hemolisisalfa,esdecirhemolizanparcialmenteloshematesenmediodeagarsangre,loquelesdaun aspecto verdoso. Tambin suelen ser umbilicadas y mucosas, aunque a veces no presentan estas caractersticas.

4.2.MATERIAL.
1.UnaplacadeagarsangreconcrecimientodeStreptococcuspneumoniae. 2.Discosdeoptoquina. 3.Unaplacadeagarsangre. 4.Solucindedesoxicolatosdicoal10%. 5.Pinzas. 6.Portaobjetos. 7.ColorantesdetincindeGram.

4.3.TCNICA.
1.Realizarunasiembradelneumococoenlaplacadeagarsangre. 2. Sensibilidad a la optoquina (etildihidrocuprena). Con la ayuda de unas pinzas previamente flameadasyfrascogerundiscodeoptoquinaycolocarlosobrelasuperficiedelmediodeagarsangre previamentesembradaconelneumococo.Incubar1824horasa37C,yobservarelhalodeinhibicin (cuandoseutilizandiscosde6mmdedimetro,seconsiderasensiblecuandoelhalodeinhibicines 14mm,ysiseutilizandiscosde10mmdedimetrocuandoes16mm). 3. Prueba de solubilidad en bilis. Sobre la placa con el microorganismo crecido aadir 1 gota de desoxicolato sdico al 10% e incubar 1520 minutos a 37 C. S.pneumoniae experimenta autolisis inducidaporeldesoxicolato,ylascoloniassecolapsan,desapareciendo.

4.4.RESULTADOSOBTENIDOS.
1.Anotareltamao(enmm)delhalodeinhibicindelaoptoquina. 2.Anotarlascaractersticasdelascoloniasdeneumococo. 3.Anotarelfenmenoobservadocuandoseincubanlascoloniasenpresenciadebilis. 4.AnotarlamorfologadelmicroorganismoenlatincindeGram.

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PRCTICA5.IDENTIFICACINDEBACTERIASGRAMPOSITIVASDE IMPORTANCIACLNICA.
5.1.OBJETIVOS.
IdentificacindealgunosbacilosycocobacilosGrampositivosnoesporuladosqueseaslan conpocafrecuenciaenclnica,peroquetienenimportanciaeninfeccioneshumanas.

5.2.MATERIAL.
Cultivopurodelabacteriaproblema. ColorantesparalatincindeGram. Aguaoxigenadade30volmenes. Tubosdemediobilisesculina. Placadeagarsangre. CepadeStaphylococcusaureusproductorade toxina. 7. Tubosdeagarmovilidad. 8. TubosdeureadeChristensen. 1. 2. 3. 4. 5. 6.

5.3.TCNICA.
Unavezcomprobadoquesetratadecocos obacilosGrampositivosnoesporuladosyrealizada la prueba de la catalasa, se siembran los medios para detectar movilidad, hidrlisis de esculina, ureasaypruebaCAMP. Lapruebademovilidadserealizarendos tubos, incubando uno de ellos a 2225 C durante 4872h,yelotroa3537Cdurante48h. Movilidad Catalasa

Fig.5.1.PruebaCAMP

hemolisisa

Hidrlisis esculina

Ureasa

Morfologa

CAMP

Listeriamonocytogenes Corynebacteriumurealyticum Arcanobacterium haemolyticum Actinomycespyogenes Rhodococcusequi Streptococcusagalactiae


a b

Bacilosrectos Bacilosirregulares Bacilosirregulares Bacilosirregulares Cocosobacilos Cocos


e

+ + +

+/b

+ +

+ +/ +

+
c

Moderada Inversad Intensa Intensa

+ + +

Lahemolisispuedenoseraparentehastalas48h. L.monocytogenespresentaunamovilidadcaracterstica,enformade"paraguas",a2225C.Esinmvila3537C. c Dependedelaespecie;C.hemolyticumeshemoltico. d InhibeligeramentelahemolisisproducidaporS.aureus. e CocobaciloGrampositivopleomrficovariandoelporcentajedepresentacindelaformacocoideobacilarsegnlas condicionesdecrecimientoylafaseenquesteseencuentre.

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5.4.RESULTADOSOBTENIDOS.
Identificacin: Tincinde Gram Catalasa Movilidad Ureasa Hidrlisis esculina Hemolisis

DibujarelresultadodelapruebaCAMP

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PRCTICA6.IDENTIFICACINDEOTROSMICROORGANISMOSPATGENOS
6.1.INTRODUCCIN.
Seofrecenaqumtodossencillosparalaidentificacindelosmicroorganismosquepueden haber sido aislados en las prcticas anteriores. La identificacin completa puede requerir otras pruebas,descritasenlosmanualesdelaboratoriodeMicrobiologaClnica(verBibliografa). Recurdesequeparaprocederalaidentificacindebepartirsesiempredeuncultivopuro,o porlomenosdeunacoloniaaislada. Debetenersesiempreencuentaladiversidadquepresentanlosmicroorganismos,quehace queunacepaenconcretonopresenteexactamentelascaractersticasquedefinenalaespecie.Por tanto,hayqueconsiderarlatotalidaddelosresultadoscoincidentesynocoincidentes,yvalorarla importanciataxonmicadecadauno.

6.2.TCNICA.
ElprimerpasoeslatincindeGramapartirdeunacoloniaaislada,quenosinformarsise tratadeunabacteria,desumorfologa,ydesiesGrampositivaoGramnegativa.Apartirdeestos datospuedenseguirselosprotocolosdelossiguientesapartados.

6.3.COCOSGRAMPOSITIVOS.
SlosedescribenaqulospatgenospertenecientesalosgnerosStreptococcusyStaphylococcus. Materialnecesario: Cultivopurodelabacteriaproblema. ColorantesparalatincindeGram. Aguaoxigenadade30volmenes.

Tcnica: a) Forma y disposicin: Se realiza una tincin de Gram. Los estreptococos suelen aparecer en cadenas,losestafilococosenagrupacionesirregularescomoracimos. b)Catalasa:Ponerenunportaobjetosunagotadeaguaoxigenadade30volmeneseintroducirel asaconlasbacterias.Encasopositivosedesprendenburbujas. CATALASA(+):Staphylococcus COCOSGRAM(+) CATALASA():Streptococcus 6.3.1.Identificacindeestafilococos. Materialnecesario: 1tubocon0,5mLdecaldocomn. Plasmadeconejo. 1placaconmedioChapmanManitol(ManitolSal).EstemedioesselectivoparaStaphylococcus alcontenerun7,5%deClNa,ysedetectalafermentacindelmanitolalvirarelindicadordepH (rojodefenol)derosaaamarillo.

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Tcnica: Identificarlascoloniassospechosas(catalasapositiva)segnelsiguienteesquema:

COAGULASA

MANITOL+: MANITOL+

Staphylococcusaureus NOVOBIOCINAR:Staphylococcussaprophyticus NOVOBIOCINAS:Staphylococcusepidermidis

a) Fermentacin del manitol: Sembrar la bacteria en placa de Chapmanmanitol. Incubar a 37 C, 2448horas.Observarsihayfermentacinporvirajedelindicadoracoloramarillo. b) Coagulasa: Sembrar la colonia en 0,5 mL de caldo comn. Incubar 18 horas a 37 C. Aadir una gotadeplasmadeconejo.Incubara37C.Encasopositivoapareceuncoguloalaspocashoras (puedeleerselapruebaaldasiguiente). c) Sensibilidad a novobiocina: Inocular una placa segn la tcnica del antibiograma de difusin (Prctica7.2.B.2.).Colocarundiscode5gdenovobiocina.Incubarunanochea37C.Unhalo menorde16mmsignificaresistencia. 6.3.2.Estreptococos. La identificacin de estreptococos, una vez comprobada la tincin de Gram y el carcter catalasanegativapartedelaobservacindelahemolisisenagarsangre: Examinar las colonias crecidas 24 horas en una placa de agar sangre. Observar si hay hemolisis:halotransparentealrededordelascolonias(S.pyogenes);hemolisis:haloverdoso(los grupos Streptococcus milleri, S. mutans, S. salivarius y S. sanguis, denominados globalmente estreptococosviridans,yStreptococcuspneumoniae);onohayhemolisis(S.lactisyotros). hemolisis:

BacitracinaS BacitracinaR

S.pyogenes(GrupoA).Confirmarserolgicamente.

OptoquinaS hemolisis: OptoquinaR BacitracinaR Sinhemolisis, OptoquinaR ovariable

{
{

S.agalactiae(GrupoB).HacerpruebaCAMPehidrlisisdelhipurato. Otrosserogrupos(C,G) S.pneumoniae.Confirmarporsolubilidadenbilisoserologa. Bilisesculina():estreptococosviridans. Bilisesculina(+):Enterococcus(GrupoD).

{
{

Enterococcus spp. puede producir cualquier tipo de hemolisis (aunque no suele ser hemoltico),ysisesospechasupresencia(porejemplo,enorina)noesprecisoesteprimerpaso. Materialnecesario: 12 Placaconagarsangre. Discosdeoptoquinaybacitracina. Pinzas. 1tubocon0,5mLdecaldoglucosado. NaOH0,5N. Desoxicolatosdicoal10%. Pipetasde1mLestriles. 1tubodeagarbilisesculina.

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Tcnicas: Sensibilidad a la bacitracina: Sembrar la bacteria por estra apretada en placa de agar sangre, poniendo en la superficie un disco impregnado con 0,2 U de bacitracina en la zona donde se espera crecimiento confluente. Incubar 24 horas a 37 C. Streptococcus pyogenes (Grupo A) es sensible,producindoseunhalodeinhibicinalrededordeldisco. Sensibilidad a la optoquina: Se siembra la bacteria en la superficie de una placa de agar sangre donde se deposita un disco impregnado con una solucin de 1/4000 de optoquina. Incubar a 37C, 24 horas. Streptococcus pneumoniae no crece en la zona de accin de la optoquina, los demsestreptococoss. Solubilidadenbilis:Seresiembralabacteriaen0,5mLdecaldoglucosado.Incubara37C,18horas. Aadirunagotadesosa0,5Nyunagotadedesoxicolatosdicoal10por100.Encasopositivose observarinmediatamenteelaclaramientodelasuspensin.Streptococcuspneumoniae se lisa enpresenciadebilis,losdemsestreptococosno. Hidrlisis del hipurato: Streptococcus agalactiae da positiva esta prueba; son los nicos estreptococoshemolticosquelohacen. Materialnecesario:
Cultivopurodelabacteriaproblema. Cultivopurodeunabacteriahipuratonegativa(Enterococcusfaecalis). Solucindehipuratosdicoal1%enaguadestilada(recinpreparadaoconservadacongeladacomo mximodurante6meses). Reactivodeninhidrina:3,5gdeninhidrinaen100mLdeacetona/butanolapartesiguales(v/v).

Tcnica:
Inocular una suspensin densa de bacterias en un tubo de hipurato. Preparar tambin un control negativo.Incubar12horasa35Cenbaodeagua. Aadir 0,2 mL de reactivo de ninhidrina. Si aparece un color morado intenso la prueba es positiva (puedenecesitar15minutosmsdeincubacin).

Pruebadebilisesculina:Sembrarporestraenlasuperficiedelagarinclinadobilisesculina.Incubar 24 horas. Si la bacteria crece e hidroliza la esculina, el producto de su hidrlisis (esculetina) reaccionaconelcitratodehierrodandocoloracinnegruzca.Losenterococosdanpositivaesta prueba. Prueba CAMP: Inocular una cepa de Staphylococcus aureus productora de lisina en una placa de agar sangre, trazando una sola estra siguiendo un dimetro. Inocular las bacteriasaidentificartrazandoestras Staphylococcus Streptococcus perpendicularesalaprimera,peroque aureus agalactiae nolleguenatocarla(Figura5.16.1). Incubara37Cdurante1824h. Elresultadopositivosemanifiestapor una zona de hemolisis intensa en la confluencia de las estras, en forma de flechaapuntandoalaestradeS.aureus. Los estreptococos del grupo B (Streptococcus agalactiae) producen una hemolisinacuyoefectoespotenciadopor la lisina de S. aureus, una fosfolipasa C que afecta a la membrana de los hemates. Figura6.1.PruebaCAMP.

Listeria monocytogenes

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6.4.COCOSGRAMNEGATIVOS.
NosreferiremossloalospertenecientesalosgnerosNeisseriayMoraxella. Se caracterizan preliminarmente por su morfologa de cocos Gramnegativos en parejas, semejandogranosdecaf,ypordarpositivaslaspruebasdelacatalasaydelaoxidasa. Laidentificacinsecompletaramediantepruebasbioqumicas.Losensayosdeoxidacinde azcares son difciles de realizar, y se recomienda el empleo de alguno de los mtodos comercialmentedisponibles. 6.4.1.Materialnecesario: Coloniasaisladasdelabacteriaproblema. ColorantesparatincindeGram. Aguaoxigenadade30volmenes. Tiradepapelconreactivodeoxidasa.

6.4.2.Tcnica: Catalasa:Yadescritaenelapartado6.3. Oxidasa: Se trazan rayas con el asa cargada de bacterias sobre tiras de papel impregnadas en solucinacuosaal1por100detetrametilpfenilndiamina.Encasopositivoelpapelcambiade colorpasandoaazuloscuroonegro.

6.5.BACILOSGRAMNEGATIVOS.
Dadalavariedaddeespeciesexistentes,esprecisotenerencuentaelorigendelamuestra, laetiologaposibleylosmediosdecultivoempleadosensuaislamiento. Enprincipiopuedendistinguirseaquellasquecrecenenmediosnoenriquecidosyenmedios propiosparaenterobacterias,quepuedenperteneceralgrupodelasenterobacteriasoaldelosno fermentadoresdeazcares.Sonbacteriasqueseaslanmuyfrecuentementeenlaboratoriosclnicos. Otrasbacteriasseaslanslocomoresultadodeunabsquedaespecfica,utilizandomedios especiales; podemos citar Vibrio y Campylobacter, y por otra parte los nutricionalmente exigentes comoHaemophilus,Brucella,BordetellayLegionella. Consideraremos aqu nicamente la identificacin de enterobacterias y de algunos otros bacilosGramnegativos. 6.5.1.IdentificacindebacilosGramnegativosnofermentadores. Laidentificacinpuedeiniciarseporlapruebadelaoxidasayladeoxidacin/fermentacin de glucosa (O/F) como se indica a continuacin, pero a menudo las bacterias no fermentadoras se identificantrasunfracasoenelintentodeclasificarlascomoenterobacterias,alcomprobarqueno fermentannilactosaniglucosaenelmediodeKligler(tubo"rojo/rojo"). Materialnecesario: Cultivopurodelabacteriaproblema. Tirasdepapelconreactivodeoxidasa. DostubosconmediodeHughyLeifson.Estemediocontieneglucosayazuldebromotimol,como indicadordepH.Sedispensaentubosestrechosylargos,paradificultarladifusindeloxgeno,y sehiervebrevementeantesdeutilizarlo,paraeliminareloxgenodisuelto.Permitedistinguirel metabolismooxidativodelfermentativo. Vaselinaestril. PipetasPasteurestriles.

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1placaconmedioagarF(medioKingB). 1placaconmedioagarP(medioKingA).

Tcnicas: a) Oxidasa: Se realiza como se explic en 6.4.2. El resultado de esta pruebapermiteiniciarla clasificacinatendiendoalsiguienteesquema: OXIDASA O/F BACTERIA + +/ Pseudomonas + / Alcaligenes + +/+ Vibrio +/ Acinetobacter(INMVIL) +/ Stenotrophomonasmaltophilia(MVIL) +/+ Enterobacteriaceae b) Oxidacin/Fermentacin (O/F): Sembrar la bacteria en picadura en dos tubos con medio HughyLeifson,utilizandounapipetaPasteurconlapuntacerrada.Cubrirunodeelloscon vaselinaestril.Incubara37C,48horas. Las bacterias fermentadoras producen cido de la glucosa independientemente de la existenciadeoxgeno;portanto,losdostubosviranaamarillo(+/+). Las bacterias oxidativas (metabolismo respiratorio) slo utilizan la glucosa en el tubo descubierto;elmedioescapazdedetectarlaacidificacinproducidaporelCO2disueltoypor tantoviraalamarillosloelqueestsincubrirdevaselina(+/). Sinoviraninguno(/),labacterianoutilizaazcares. c) Deteccindepigmentos:Apartirdeunacoloniaaisladasembrardosotresestrasparalelas enunaplacadeagarFyotradeagarP.Incubara37C. La presencia de Pseudomonas aeruginosa sobre la placa de agar F se manifiesta por la aparicin de un pigmento amarillo fluorescente (fluorescena) difusible en el medio, y un pigmentoazul(piocianina)sobrelaplacadeagarP.Pseudomonasfluorescenssloproduce fluorescena.Lacomposicindesalesdecadaunodeestosmediospotencialaproduccinde unodelospigmentoseinhibeladelotro. Extraccindepiocianina:aadir12mLdecloroformoalmedioparaextraerelpigmento piocianina que es soluble en cloroformo. Dejar en reposo el tubo y esperar a que se formendoscapas:enlapartesuperiorquedarelcloroformoconelpigmento. Observacindefluorescencia:Iluminarlasplacasconunalmparadeluzultravioleta,en laoscuridad.Lafluorescenaemitefluorescencia,lapiocianinano. P.aeruginosa:CRECEA42C;PIOCIANINA+;FLUORESCEINA+ Pseudomonas P.fluorescens:CRECEA4C;PIOCIANINA;FLUORESCEINA+ Otrasespecies

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6.5.2.Identificacindeenterobacterias(Enterobacteriaceae). SonbacilosGramnegativos,anaerobiosfacultativos,oxidasanegativa,catalasapositiva,que fermentan la glucosa y reducen los nitratos. Su identificacin se basa en pruebas bioqumicas, que puedenrealizarseenunabateradetubosoutilizandounsistemacomercial.Confinesdidcticos,la bateradepruebassedividirendospartes,escogiendolaspruebasdelasegundaparteenfuncin delosresultadosdelaprimera.LapruebamsimportanteeslaqueserealizaenmedioKligleroT.S.I. 6.5.2.1.Primerabateradepruebasdeidentificacin. Materialnecesario: 1tuboconmediodeKligleroT.S.I.(HierroTresAzcares). 1tuboconaguadepeptona. 1tuboconmedioagarmovilidad. 1tuboconagarcitratodeSimmons. 1tuboconagarureaChristensen. ReactivodeEhrlich(pdimetilaminobenzaldehdo).

Tcnicas: a) Siembra en medio Kligler: Con el hilo recto se toma una pequea cantidad de la colonia y se siembraenpicadura;despussesiembraenlasuperficieporestra.Incubara37Cdurante24 horas.Observarlosresultados: Fermentacindeglucosa:fondoamarillo. Fermentacindelactosa:superficieamarilla. ProduccindeSH2:picaduranegra. Produccindegas:burbujasoroturadelagar. Comolaconcentracindeglucosaesbaja,sufermentacinafectasloalfondodeltubo,en condicionespocoaerbicas.Enlasuperficiedelagarlabacteriarespira,conloquelaproduccin decidoesmenor,yaqueelCO2seelimina.Laconcentracindelactosaesdiezvecesmayor,con loquelaproduccindecidoessuficienteparaelvirajedelindicadorinclusoenlasuperficiedel agar inclinado. En realidad, la fermentacin de lactosa enmascara la de glucosa, pero esto no importa,puesparaqueunabacteriafermentelactosadebesercapazdefermentarglucosa. ElSH2producidosedetectaenformadesulfurodehierro. b) Produccin de indol: Se siembra en agua de peptona. Incubar a 37 C, 2448 horas. Tras la incubacin, aadir unas gotas de reactivo de Ehrlich resbalando por la pared del tubo. En caso positivoapareceunanillorojoenlainterfase.Estoesdebidoalareaccinconelindolproducido porlabacteriaapartirdeltriptfano. c) Movilidad: Sembrar por picadura con hilo recto en medio agar movilidad. Incubar a 37 C, 48 horas.Traslaincubacin,observarsielcrecimientoestsloenlapicaduraoseextiendealos lados de ella. La baja concentracin de agar de este medio (3 ) permite que las bacterias lo invadansisonmviles. d)Crecimientoencitrato:SembrarenlasuperficieinclinadadelmediodeSimmons.Cultivara37C, 24horas.Traslaincubacin,observarsielmedioviradeverdeacolorazul(resultadopositivo).El mediocontienecitratosdicocomonicafuentedecarbono.Lasbacteriascapacesdeutilizarlo alcalinizan el medio, y hacen virar el indicador azul de bromotimol, a la vez que muestran crecimientoensuperficie. e)Produccindeureasa:SembrarenestraenlasuperficieinclinadadelagarureadeChristensen. Incubara37C,24horas.Encasopositivoaparececolorrojocereza.Esdebidoalaalcalinizacin delmedioporproduccindeamonioapartirdelaureaquecontieneelmedio,loquehacevirarel rojodefenol.

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IntentarlaidentificacinmediantelaTabla6.1.Sinosepuedecompletar,prepareunasegunda bateradepruebascomoseindicaacontinuacin. 6.5.2.2.Segundabateradepruebasdeidentificacin. SilabacterianohafermentadolalactosaenelmediodeKligleresimprescindiblehacerlapruebadel O.N.P.G.paradeterminarsiesfermentadoralentaosirealmentenoesfermentadoradelactosa.Las demspruebasseescogernsegnnecesidadesdeidentificacin. Materialnecesario: 2tubosconmediodeClarkyLubs(caldotamponadoconglucosa) 1tuboconagardefenilalanina. 1tubocon0,5mLdeaguadestiladaestril. 1discodepapelimpregnadoconO.N.P.G. Solucindealfanaftolal6%enetanolde60. Solucindesosaal16por100. Solucinderojodemetiloal0,5%enetanolde60. Solucindeclorurofrricoal10%.

Tcnicas: a) O.N.P.G. (ortonitrofenilDgalactopiransido): Hacer una suspensin espesa de la bacteriaen 0,5 cm3 de agua destilada estril, poner un disco de O.N.P.G. Incubar a 37 C, 2 horas. En caso positivo aparece color amarillo. El O.N.P.G. penetra en la bacteria y es hidrolizado por la galactosidasa,liberndosenitrofenoldecoloramarillo. b)Rojodemetilo:SembrarenmedioClarkyLubseincubar48ha37C.Traslaincubacin,a2mL delcultivoseaadendosgotasdelasolucinderojodemetilo.Encasopositivoaparececolor rojo. El rojo de metilo vira a pH muy bajo, detectando nicamente la produccin de grandes cantidadesdecidos,tpicodelarutafermentativacidomixta. c)VogesProskauer:SembrarenmedioClarkyLubseincubar48ha37C.Traslaincubacin,a1mL delcultivoseagrega0,5mLdesolucindealfanaftoly1mLdesolucinsosa.Seagita.Encaso positivo a los 10 minutos aparece un color rosa. El alfanaftol da un complejo coloreado al reaccionarconla2,3butanodiona,formadaporoxidacinenmedioalcalinodel2,3butanodiol, quehanproducidolasbacteriasquellevanacabolafermentacinbutilngliclica. d) Desaminacin de la fenilalanina (APP): Sembrar la bacteria en la superficie del medio agar fenilalanina.Incubara37C,24horas.Traslaincubacin,aadirunasgotasdesolucindecloruro frrico. En caso positivo aparece coloracin verde. Las bacterias que poseen fenilalanina desaminasa transforman dicho aminocido en cido fenil pirvico (APP), que da reaccin coloreadaconelclorurofrrico.Estapruebapuedesustituirseporladesaminacindeltriptfano (TDA:triptfanodesaminasa),quedalugaralaformacindecidoindolilpirvico. Unavezrealizadastodaslaspruebas,determinarelgneroylaespecieconayudadelaTabla6.1.

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Escherichiacoli Klebsiellaspp. Enterobacterspp. Citrobacterfreundii Citrobacterdiversus Serratiaspp. Shigellaspp. Salmonellatyphi Salmonellaspp. Proteusmirabilis Proteusvulgaris Yersiniaenterocolitica

MEDIODEKLIGLEROTSI INCLINADO A A A V V K K K K K K K* FONDO A A A A A A A A A A A A GAS + + + + + /+ /+ SH2 + + +/ + +

INDOL + /+ + V + +/

CITRATO + + + + V + +/ /+

UREASA +/ V +/ +/ /+ + + +/

APP + +

ONPG + + + + + + /+ +

MVIL + + + + +/ + + + + **

RM + V + + V + + + + + +

VP V + V +/

TABLA6.1.CLASIFICACINDEALGUNASENTEROBACTERIASSEGNDIVERSASPRUEBASBIOQUMICAS A:acidifica;K:alcaliniza;V:variablesegnespecies(losresultadospuedenvariarsegnlacepa,ymuchosdeellosslopuedenconsiderarseorientativos). RM:Rojodemetilo;VP:VogesProskauer.

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PRCTICA7.TIPADODEEnterococcusPOR BACTERIOCINOTIPIAYANTIBIOTIPIA

7.1.OBJETIVOS.
Diferenciar cepas de Enterococcus basndose en las propiedades de produccin y sensibilidad a bacteriocinasyenelperfildesensibilidadaantibiticos. ParalabacteriocinotipiaseutilizancomoindicadoresvariascepasdeEnterococcusconsensibilidad conocida a bacteriocinas. Las cepas a estudiar se ensayan para determinar si producen bacteriocinas capacesdemataraunaovariasdelascepasindicadoras.Elperfildeactividaddeunacepaproblemasobre lascepasindicadorasnosdasuperfilbacteriocinognico. Paralaantibiotipiaserealizaunantibiogramanormalenplaca.Lacombinacindelosdosperfiles nospermiteidentificarlacepaconfinesepidemiolgicos.

7.2.A.BACTERIOCINOTIPIA.

7.2.A.1.MATERIAL.
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. TubosdeBHIde3mL(tantoscomomicroorganismosindicadores). PlacasdeTSAcon0,3%extractodelevadura. Tuboscon45mLdemedioTSAsemislido(TSB+0,7%deagar)con0,3%deextractodelevadura. Tubosdesolucinsalina. Palillosmondadientesestriles. PlacasdeAgarMuellerHinton. Torundasdealgodn. Discosconantibiticosypinzas.

7.2.A.2.TCNICA.
1erDa: 1. Inocular3mLdeBHIconcadaunadelascepasindicadorasycultivarloa37Ctodalanoche. 2Da: 2. RotularunaplacadeTSAporlacarainferior,marcandoconunnmerolaposicinenlaquesevaa inocularcadamicroorganismoproblema. 3. FundirlostubosdeTSAsemislidoydejarlosatemperara50C.Aadir50LdelasuspensindeBHI delascepasindicadorasacadaunodelostubos,mezclarbienconvrtexyvolcarloenlaplacarotulada deTSA,repartindolouniformemente.Dejarsolidificaratemperaturaambiente. 4. Tocarconelpalillounacoloniadecadaunadelascepasquevamosaensayarparalaproduccinde bacteriocinasypincharlaenlaplacadeTSAconelmicroorganismoindicadorsobrelaposicinrotulada. (Precaucin:Tenerencuentaqueconelmismopalillonosepuedepincharenmsdeunaplacaporque secontaminanlosindicadores,asqueusarunpalillodiferenteporcepayporindicador). 5. Incubarlasplacasa37Cdurante24h. 3erDa: 6. Observarlaaparicindehalosdeinhibicinyanotarparacadacepaproblemaculessonlascepas indicadorasqueseinhibenyculesno.

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7.2.B.ANTIBIOTIPIA.

7.2.B.1.MATERIAL.
1. 2. 3. 4. Tubosdesolucinsalina. PlacasdeAgarMuellerHinton. Torundasdealgodnestril. Discos con antibiticos (Pencilina Trimetoprim/Sulfametoxazol)ypinzas.

G,

Eritromicina,

Clindamicina,

Vancomicina

7.2.B.2.TCNICA.
1. Tomarconelasaunapequeacantidaddeuna colonia aislada, y resuspender en el tubo de solucin salina frotando en la pared del tubo, hasta obtener una suspensin homognea de turbidezapenasvisible. 2. Impregnar una torunda con la suspensin, escurrirla contra la pared del tubo y sembrar conellatodalasuperficiedelaplaca,medianteestrascruzadasentresdirecciones. 3. Antesde15minutosdebencolocarselosdiscosdeantibiticos. 4. Leerlosdimetrosdeloshalostras20horasdeincubacina36C. 5. Interpretarelantibiogramaconlasiguientetabla: R(mm) S(mm) Antibitico Cargadeldisco PenicilinaG 10U 14 15 Eritromicina 15g 13 22 Clindamicina 2g 14 21 Vancomicina 30g 9 12 Trimetoprim/Sulfametoxazol 1,25/23,75g 10 16 20

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7.3.RESULTADOS.
Cepaindicadora: Cepaproblema: 1 2 3 4 5 6 7 8 A B Inhibicin(1/0) C PG Perfilderesistencia(R/I/S) ER CD V SXT

Enfuncindeestosresultados,indicarqucepasestnrelacionadasosonidnticasentres.

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CALENDARIODEPRCTICAS
GRUPONICO LUNES MARTES MIRCOLES JUEVES Fijacinytincinde placasde96. Cuantificarpor intensidaddetincin. Fijacinytincinde placasde96. Cuantificarpor intensidaddetincin.

FormacindebiopelculasdePseudomonas.

Siembradelascepas Inoculacindelasplacaspara dePseudomonasa laformacindebiopelculas. ensayar.

EnsayodeformacindebiopelculasdeCandiday Saccharomyces.

Siembradelascepas deCandidaalbicans.

Inoculacindelasplacas +lavado.

Siembraenagarsangre yagarchocolate. Hemocultivo. TincionesdeGram. Inocularcepas indicadorasde Enterococcusentubos deBHI. Ensayode bacteriocinotipia. Antibiograma. Leerresultados. Elaborarconclusiones. Siembradepruebas deIdentificacin Lecturadelaspruebasde identificacin. Lecturadepruebas complementarias.

TipadodeEnterococcus.