Determinacin del nmero de Mesfilas en Muestra de Agua de Trolelote

Objetivo
Esta prctica se realiza como prueba de la calidad de una muestra de agua, realizando para esta, un anlisis microbiolgico en cual se determinaran los microorganismos mesofilos que crezcan en un medio de cultivo en agar nutritivo por el mtodo de siembra de placa invertida.

Fundamento
Para un anlisis de una muestra de agua de trolelote en la que se comprueba su calidad y pureza a travs de la determinacin de microorganismos mesofilos se toman como base tres NOMs, las cuales se justifica su uso a continuacin: NOM -109-SSA1-1994 Procedimientos para la toma, manejo y transporte de muestras de alimentos para su anlisis microbiolgico En esta NOM se habla Sobre los siguientes puntos: Como seleccionar la muestra, La cual fue totalmente aleatoria. La recoleccin de la muestra, que se debe efectuar evitando toda contaminacin externa, tanto ambiental como humana, para asegurar la integridad de la misma. Como se debe conservar. Por esto, la muestra fue almacenada en un frasco estril, el cual se abri en el momento que la muestra se deposit cerrndola lo ms rpido posible. Y dejndola en refrigeracin, no congelacin, puesto que sera usada un da despus Las formas de cmo transportarla siendo estas tal manera que se impida su ruptura, alteracin o contaminacin, evitando su exposicin a la luz solar directa. Los alimentos perecederos se transportarn bajo condiciones de temperatura de 2 a 8C; y deben mantenerse a esa temperatura hasta el momento de realizar las pruebas, las cuales deben iniciarse dentro de las 24 horas siguientes a su recoleccin. Al llegar al laboratorio y comenzar el anlisis, la aplicacin de esta NOM termina. NOM-110-SSA1-1994, Preparacin y dilucin de muestras de alimentos para su anlisis microbiolgico. El campo de aplicacin de esta NOM comienza al momento del anlisis de la muestra por el mtodo de dilucin primaria Y las diluciones decimales adicionales para permitir la observacin de la cuenta de colonias en el caso de placas. y las especificaciones de la solucin de trabajo. Las cuales son usadas a lo largo de toda la prctica. NOM-127-SSA1-1994, "Salud ambiental, agua para uso y consumo humano-lmites permisibles de calidad y tratamientos a que debe someterse el agua para su potabilizacin". Que establece los lmites permisibles de calidad y los tratamientos de potabilizacin del agua para uso y consumo humano, que deben cumplir los sistemas de abastecimiento pblicos y privados o cualquier persona fsica o moral que la distribuya, en todo el territorio nacional. Por lo cual esta NOM es utilizada para evaluar la calidad de nuestra muestra.

Introduccin
La dilucin primaria tiene por objeto obtener una distribucin lo ms uniforme posible de los microorganismos contenidos en la muestra destinada para el anlisis. La preparacin de diluciones decimales adicionales, si son necesarias, tiene como objetivo reducir el nmero de microorganismos por unidad de volumen, para permitir, despus de la incubacin, la observacin de la prueba en el caso de tubos o matraces y la cuenta de colonias en el caso de placas. Dichas diluciones se utilizaran en conjunto con la solucin de trabajo siendo depositada 90ml en un matraz y 9 ml en cada tubo de ensayo.

La solucin de Trabajo o Solucin reguladora de fosfato contiene: Fosfato de sodio monobsico 34,0 g Agua 1,0 l Y se prepara Disolviendo el fosfato en 500 ml de agua y se ajusta el pH a 7,2 con solucin de hidrxido de sodio 1,0 N. Despues Llevar a un litro con agua. Esterilizar durante 15 minutos a 121 1,0C.Conservar en refrigeracin (solucin concentrada).Tomar 1,25 ml de la solucin concentrada y llevar a un litro con agua (solucin de trabajo).Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 ml segn se requiera.Esterilizar a 121 1,0C durante 15 minutos. Cabe destacar que las anteriores soluciones sern vertidas junto con el Agar Nutritivo creando asi un medio de cultivo el cual consiste en un gel o una solucin que cuenta con los nutrientes necesarios para permitir (bajo condiciones favorables de pH y temperatura) el crecimiento de virus, microorganismos, clulas. El Agar nutritivo es un medio de cultivo usado normalmente como rutina para todo tipo de bacteria. Es muy til porque permanece solido incluso a relativas altas temperaturas. Adems, el crecimiento bacteriano en este agar lo hace en la superficie, por lo que se distinguen mejor las colonias pequeas. En un caldo de nutrientes, la bacteria crece en el lquido, y aparece como una sustancia espesa, con colonias dificilmente observables. A principios de 1900 la APHA (American Public Health Association) sugiri esta formulacin como un medio de cultivo estndar para el anlisis de agua. a. El Agar Nutritivo se encuentra descrito en los Mtodos Estndar de la APHA y de la AOAC (Association of Oficial Analytical Chemists) para el anlisis de agua, leche y sus derivados, alimentos y otros materiales. El Agar Nutritivo sigue siendo un medio ampliamente utilizado para el cultivo de microorganismos no fastidiosos. Este medio de cultivo est formado por: Peptona de Gelatina 5.0 Extracto de Carne 3.0 Agar Bacteriolgico 15.0 El extracto de carne y la peptona aportan la fuente de nitrgeno, vitaminas y carbono. El agar es adicionado como agente solidificante. Para lograr una correcta homogenizacin del medio de cultivo se utiliza el mtodo de extensin de placa el cual consiste en movimientos suaves pero firmes ya que si se agita demasiado las colonias podran crecer en las paredes. Los movimientos sern en cualquier orden pero en esta cantidad: 5 arriba 5 abajo 5 derechas 5 izquierdas Con el fin de que las colonias de bacterias queden distribuidas y separadas lo mejor posible, Con todo esto podremos observar el crecimiento de organismos mesofilos Un cuerpo mesfilo se desarrolla mejor bajo condiciones de temperatura moderada, ni muy caliente ni muy fro, entre 15 y 40 C. Es un trmino que se aplica sobre todo los microorganismos. El hbitat de estos organismos figura el suelo, el cuerpo humano, animales, etc. La temperatura ptima para muchos mesfilos patgenos es de 37 C, la temperatura normal del cuerpo. Algunas agencias tienen un papel importante en la preparacin del mesfilo de alimentos, especialmente quesos, yogurt, cerveza y vino. Los organismos que prefieren los ambientes fros son llamados psicrfilos , los que prefieren temperaturas ms altas son termfilos y los que viven en ambientes extremadamente calientes se llaman hipertermfilos

Material y Reactivos
Materiales: 5 cajas Petri 4 tubos de ensaye con rosca 1 pipeta de 10ml 6 pipetas de 1ml 1 matraz Erlenmeyer de 250ml 1 Parrilla 4 Mecheros de Bunsen Reactivos Muestra de Agua de Trolelote Solucin de Trabajo (Agua Estril) Agar Nutritivo Mezcla Crmica

Mtodo
Procedimiento:
Comenzamos Preparando el Agar Nutritivo en cantidades suficientes para las 5 cajas Petri que incubaremos. Posteriormente este es repartido a los equipos 175ml y se empaca en un Matraz Erlenmeyer para su esterilizacin. Asimismo se preparan 200ml de Mezcla Crmica para el destapamiento de pipetas con sarro y As mismo se prepara una Solucin de Trabajo. Se lava todo el material restante, se empaca y se procede con la esterilizacin por autoclave. Se selecciona y se toma la muestra de Agua a analizar, una vez en el laboratorio se comienza el anlisis desinfectando el rea de trabajo y encendiendo 4 mecheros bunsen y en una parrilla se comienza a calentar el agar, (pues este ya se encontrara solido siendo que la prctica no se realizara en un solo da) para que en el momento de su futuro vaciado el agar, no est muy caliente. Se vierte en un matraz Erlenmeyer 90 ml de Solucin de trabajo, y en 4 tubos de ensayo con rosca 9 ml de Solucin de trabajo, una vez hecho esto, se agita la muestra de Agua, se abre el frasco y se destapa una pipeta envuelta, se toman 10 ml y se depositan en el matraz, formando as 100ml., la cual es la dilucin 10-1. Se toma otra pipeta estril y se pipetean 2ml. depositando uno en un tubo de ensayo y otro en la caja Petri. Se toma otra pipeta estril y se pipetea del tubo anterior 2 ml, se deposita 1ml en un tubo diferente y 1 ml en otra caja la cual se rotula como 10-2. Se toma otra pipeta estril y se pipetea del tubo anterior 2 ml, se deposita 1ml en un tubo diferente y 1 ml en otra caja la cual se rotula como 10-3. Se toma otra pipeta estril y se pipetea del tubo anterior 2 ml, se deposita 1ml en un tubo diferente y 1 ml en otra caja la cual se rotula como 10-4. Se toma otra pipeta estril y se pipetea del tubo anterior 2 ml, se deposita 1ml en un tubo diferente y 1 ml en otra caja la cual se rotula como 10-5. Una vez terminado este proceso de 1 ml a Caja petri incubar diluciones, se vacia el agar, se deja solidificar y se cierran las cajas Petri, se sellan y se incuban en una estufa por 24 horas.

Observaciones

10-1 10
-1

Da 2

Da 1

Contaminacin (Agar turbio) No contiene colonias

Contaminacin (Agar turbio y hongo) Crecimiento de 1 colonia grande (Hundida, forma circular bordes ondulados) 12 colonias pequeas (puntiformes y hundidas, anaerobias)

10-2 Sin contaminacin No contiene colonias

Da 1 10-2 Sin contaminacin No contiene colonias Da 2

10-3

Da 1 10-3 Da 2 Contaminacin (Agar turbio) No contiene colonias

Contaminacin (Agar turbio) No contiene colonias

10-5

Da 1

10-5

Da 2

Contaminacin (Agar turbio) No contiene colonias

Contaminacin (Agar turbio) No contiene colonias

Nota: La caja Petri 10-4 se rompi y por lo tanto no se tomaron datos de la misma.

Resultados
Se encontr que solo en la caja Petri 10-1, se obtuvo un crecimiento de mesofilas, Siendo la encerrada en rojo, la nica colonia que pudo ser captada por nuestras cmaras. Formando solo un numero de 12 colonias en total.

Conclusin
Siendo que el nmero de colonias que crecieron en todos los medios de cultivos son solo 12 en la dilucin 10-1 Puedo concluir que la muestra de agua es casi por completo limpia. Aunque no sabemos si la razn de que no haya crecido nada en nuestras cajas Petri es debido al aseo en el momento de la preparacin del elote, o que al hervir esta agua en una olla elimine ms bacterias de las que creemos, o por el hecho de que hayamos vertido el agar muy caliente en nuestra practica podemos decir que con estas pruebas bajo las lneas de la NOM-127-SSA1-1994 nuestra muestra de agua est dentro de los lmites permisibles.