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UNIVERSIDAD DE COLIMA

DIRECCIN GENERAL DE EDUCACIN MEDIA SUPERIOR

MANUAL DE PRCTICAS DE MICROBIOLOGA

Elaborado por: Q.F.B. Mnica Alcaraz Mungua Aprobado por la Academia Estatal de Microbiologa: M.V.Z. Eduardo Aguilar Torres M.V.Z. Gustavo Valpuesta Vega QFB. Mara Mercedes Surez Bravo QFB. Patricia Edwigis Valladares Celis Supervisado por: Licda. Laura Araceli Jimnez Cobin
AGOSTO DEL 2009

JUSTIFICACIN
El presente trabajo se elabor con la finalidad de proporcionar un material ordenado y de fcil acceso al trabajo acadmico el cual se complementa con la actividad cientfica en el laboratorio. Actualmente no se encuentra un manual de prcticas de microbiologa en el nivel medio superior dentro de la pgina de la Universidad de Colima ni en bachilleratos que tengan el rea Qumico Bilogo o un rea en comn en donde se contemple la asignatura de microbiologa general en el nivel medio superior. La intencin de este manual es satisfacer las necesidades del docente en los aspectos tericos llevados en el aula con la actividad cientfica desarrollada en el laboratorio de tal forma que se nos facilite el trabajo ordenado y uniforme en todos los bachilleratos. El manual consta de quince prcticas y fue elaborado tomando en cuenta las referencias bibliogrficas que marca el programa de educacin media superior de la Universidad de colima para la asignatura de Microbiologa. La elaboracin del manual se realiz en varias etapas mediante la recopilacin de prcticas. Cada prctica inicia con el ttulo en la parte central el cual se seleccion de acuerdo a la dosificacin del programa por semana. El objetivo hace referencia al aspecto significativo que se pretende que los alumnos logren al final del experimento. La introduccin es la parte terica de cada una de las prcticas, fue tomada de diversas referencias bibliogrficas. En la parte experimental el procedimiento se tom de diversos manuales de otras Universidades y de la misma Universidad de Colima. El cuestionario en el que el alumno demuestra su aprovechamiento logrado al final de la secuencia de aprendizaje se elabor basado

en el aspecto introductorio y resultados experimentales que se esperan de cada prctica. As mismo se complementa con observaciones que el alumno realizar mediante dibujos o esquemas y finalizar con conclusiones personales del mismo.

INDICE DE PRCTICAS
Pgina Prctica No 1 Empacado del material y esterilizacin por calor seco.............................................................................. Prctica no 2 Prctica No 3 21 Prctica No 4 . 21 Sembrado en placa de microorganismos del medio ambiente..................................................................... Prctica No 6 Aislamiento de Hongos mediante el mtodo extensin en placa.......................................................... Prctica No 7 32 Aislamiento de bacterias mediante el mtodo sembrado en placa por estras........................................ Prctica No 8 35 Manejo y uso del microscopio ptico Compuesto 28 Preparacin de medios de cultivo Lquidos...................................................................................... Prctica No 5 Esterilizacin por calor hmedo Preparacin de medios de cultivo Slidos........................................................................................ 7

4 Prctica No 9 Prctica No 10 Prctica No 11 Prctica No 12 Prctica No 13 Tincin de la cpsula 40 42 46 Tinciones Tincin de Tincin cido-Alcohol 49 Efecto de la presin osmtica sobre la viabilidad y el crecimiento de los microorganismos.................................. Prctica No 14 mortal en microorganismos....................................................... Prctica No 15 Inhibidores 58 bacterianos.............................................................. 54 51 Determinacin del tiempo y punto trmico

bacteriana..................................................

selectivas..................................................................... Gram........................................................................ resistente.................................................

RECOMENDACIONES GENERALES

1.-La hora de entrada tendr 10 minutos de tolerancia, despus de este tiempo, no se permitir al acceso al laboratorio 2.-Al entrar al laboratorio, el alumno deber ponerse la bata y abotonarla completamente, slo podr quitrsela al salir de ste. 3.- Las mesas debern estar siempre limpias y desocupadas, las mochilas debern ser colocadas en los cajones de las mesas de trabajo. 4.- No comer ni fumar en el laboratorio, no introducirse ningn objeto a la boca.

5.- Recogerse el pelo para efectuar el trabajo de laboratorio. 6.- Limpiar y desinfectar el rea de trabajo antes y despus de usarla. 7.- No pasear entre las mesas del laboratorio, el trabajo deber efectuarse sentado y en su equipo de trabajo. 8.-Hablar slo lo necesario con los compaeros. 9.- Das antes de iniciar la prctica lea cuidadosamente que es lo que se va a realizar, si no entiende pregunte al profesor. 10.- Si hay necesidad de llevar material biolgico para la realizacin de la prctica, es necesario conseguirlo de lo contrario la prctica se suspender para todo el equipo. 11.- El asa utilizada para el cultivo de microorganismos deber esterilizarse en la flama del mechero, antes y despus de su uso. 12.-Informe al profesor de cualquier accidente que ocurra. 13.-En caso de derramar material que contenga microorganismos, cbralo con fenol o benzal y deje actuar diez minutos y de aviso al profesor. 14.- Todo el material que se va a incubar o desechar, debe colocarse en el sitio indicado por el profesor. 15.-Etiquete todo el material que va a incubar con los siguientes datos: equipo, grupo, fecha, nombre del alumno. 16.- Despus de la incubacin es necesario la esterilizacin del material para eliminar microorganismos que pudieran hacernos dao a nuestra salud. nombre del material e iniciales del

17.- Lvese las manos con agua y jabn antes de salir del laboratorio. 18.- Es obligacin de cada equipo entregar todo el material limpio.

FRMULA Y PREPARACIN DE REACTIVOS USADOS EN LAS DIFERENTES PRCTICAS DE ESTE CURSO


1.- SOLUCIN DE AGUA OXIGENADA AL 10% PREPARACIN Preparar antes de usarse. Colocar 1 ml de agua oxigenada en 9 ml de agua destilada 2.- COLORANTE DE AZUL DE METILENO AL 5% PREPARACIN

7 Azul de metileno 5.0 gr Agua destilada 100 ml 3.- REACTIVOS DE LA TCNICA DE GRAM COLORANTE CRISTAL VIOLETA FRMULA: Cristal violeta 2.0 gr Etanol al 95% ml Oxalato de amonio 0.8 gr Agua destilada 80 ml PREPARACIN: 1.- Disolver el cristal violeta en el etanol 2.- Disolver el oxalato en el agua 3.- Mezclar las dos soluciones SOLUCION DE LUGOL FORMULA Yoduro de potasio 10.0 gr Agua destilada 20.0 ml Yodo metlico gr Etanol, aforar a 100.0ml PREPARACIN: 1.- Disolver el yoduro de potasio en el agua 2.- Agregar el yodo metlico y disolver 3. Aforar a 100 ml con etanol SOLUCIN DE ALCOHOL ACETONA FORMULA Acetona volumen Etanol al 95% volmenes COLORANTE SAFRANINA FORMULA Safranina 0.5 gr

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5.0

1 2

8 Agua destilada 100.0 ml PREPARACIN Disolver la safranina en aproximadamente 20 ml de agua, despus aforara a 100 ml con ms agua. 4.- REACTIVOS DE LA TCNICA DE ZIEHL- NEELSEN A) COLORANTE FUCSINA FENICADA FORMULA: Fucsina bsica 5.0 gr Fenol 25.0 grs Etanol al 95% 50 ml Agua destilada aforar a 500 ml PREPARACIN 1.- Colocar el fenol en 100 ml de agua destilada y calentar en bao a ebullicin 2.- Aadir la fucsina bsica y disolver 3.- Aadir el etanol y mezclar 4.- Aforar la solucin a 500 ml con agua destilada B) SOLUCIN DE ALCOHOL CIDO FORMULA cido clorhdrico 3.0 ml Etanol al 95 100.0 ml PREPARACIN Adicionar el cido clorhdrico al etanol, lentamente y agitando C) COLORANTE AZUL DE METILENO FORMULA Azul de metileno 5.0 gr Agua destilada 100.0 ml 5.- MEZCLA CRMICA Dicromato de potasio 20.0 gr cido sulfrico concentrado 20.0 ml. Agua destilada 250.0 ml.

EMPACADO DEL MATERIAL Y ESTERILIZACIN POR CALOR SECO


Prctica No 1 Nombre Del Alumno:__________________________________Semestre______ Grupo______ Nombre del titular_____________________________________Fecha____________________ Nombre del Profr. de Laboratorio__________________________________ Calif:__________

OBJETIVO:
El alumno aprender el procedimiento para empacar diversos materiales de uso en microbiologa as como el procedimiento de la esterilizacin por calor seco de estos.

SUSTANCIAS MATERIAL
Detergente Extran Matraces Agua destilada de ensaye Horno a 170C Termmetro petri estraza

QUIMICAS

Tubos Pipetas Cajas de Papel Algodn Escobillo

nes

INTRODUCCION.
EMPACADO DEL MATERIAL Antes de iniciar un empaque del material que se desea esterilizar, es necesario que todas las prcticas que se realicen estn en condiciones de esterilidad y se debe, en primer lugar, limpiar el rea de trabajo con alguna sustancia desinfectante y encender el mechero. Se emplearn distintos agentes germicidas y desinfectantes (soluciones de hipoclorito de sodio, cloroxilenol, formaldehdo, etc.) para desinfectar superficies. El material a esterilizar se deber de empacar correctamente con papel estraza Una de las razones de la importancia del papel en nuestra vida cotidiana es la enorme cantidad de usos que se le pueden dar a este producto.

10 De la misma manera, el papel puede adaptarse a las diferentes utilidades que se vayan a realizar llegando a contabilizarse hasta 457 variedades diferentes de papel. Las variedades dependen de una serie de caractersticas fsicas que hacen que el papel se pueda adaptar a diferentes usos como: Impedir el ingreso de microorganismos al interior, Sellar en forma completa para evitar contaminacin, Soportar la traccin y manipulacin habitual sin sufrir deterioro y hacer permeable al mtodo de esterilizacin seleccionado. Todo esto se logra Empacando en primer lugar en campo de algodn, y posteriormente en empaque mixto o en polipropileno de acuerdo con el tamao del material.

ESTERILIZACIN POR CALOR SECO La muerte microbiana se produce por una esterilizacin, ya sea como consecuencia de mecanismos de transferencia de energa, adems de la oxidacin. En la esterilizacin por Calor seco existe una destruccin de los microorganismos oxidando sus constituyentes qumicos, desnaturalizando las protenas y los cidos nucleicos de las clulas as como fragmentando las membranas celulares. Para materiales que deben permanecer secos como ciertos instrumentos de vidrio de laboratorio tales como: cajas de petri, pipetas, as como aceites, polvos ( por ser impermeables al vapor), los materiales que no se pueden esterilizar por calor seco son: Material textil (algodn, sedas, lino, etc.), Gomas y Materiales sintticos Todo material que se altere a la temperatura de trabajo se dispone de hornos elctricos por los que circula aire caliente, en vista de que el calor es menos eficaz en materiales secos, se acostumbra a aplicar una temperatura de 160C a 170C durante una hora o ms. Para materiales de vidrio de laboratorio es suficiente una exposicin de dos horas de duracin a 160C ( 320 F) para que quede esterilizado. Otras formas tiles de calor seco incluyen incineracin para objetos que deben ser destruidos y flameados por pasaje de agujas o pequeos instrumentos a travs de la llama de un mechero bunsen

PROCEDIMIENTO
I) EMPACADO DEL MATERIAL l.- Lava el material de laboratorio, principalmente la cristalera con detergente Extran o Alkox (Fcilmente se contamina con esporas difciles de eliminar) enjuaga con abundante agua de la llave y en seguida con agua destilada. 2.- Secar el material utilizando papel absorbente para acelerar el secado 3.-Empaca el material correctamente A) CAJAS DE PETRI Corta el papel estraza, en forma de rectngulos adecuados para la cantidad de 2 a 3 cajas. Colcalas en la parte central y Envulvelas segn te indique tu profesor.:Se toman los extremos de Papel y se unen , Se hace un

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11 nuevo doblez recargando ligeramente en la caja para marcarlo, Los extremos se doblan en forma triangular .Ya en forma triangular se doblan hacia atrs quedando listas para esterilizar. B) PIPETAS Introduce una pequea porcin de algodn en el cuello de la pipeta, procurando que quede lo suficientemente apretada. Con tiras de papel de 3 cm de ancho envulvelas, comenzando por la punta y en forma de espiral gira hacia arriba hasta el final de la pipeta. C) TUBOS DE ENSAYE. Se toma el tubo con la mano izquierda y con la derecha el tapn de algodn. Coloca algodn en la boca del tubo a 1/5 parte de la longitud del mismo procurando que quede bien apretado, depostalos en recipientes adecuados, tpalos con papel estraza y talos. D) MATRACES. Tapa el cuello del matraz con algodn, lo suficientemente apretado para evitar que se destape ( se tapa en la misma forma que el tubo). Como proteccin coloca un gorrito de papel estraza y talo con cinta. E) MATERIAL METLICO El asa de platino, tijeras, bistur, material quirrgico no es necesario empacarlo para su esterilizacin. II) ESTERILIZACIN POR CALOR SECO 1.-Las normas de Procedimiento de la Institucin establecern las condiciones de trabajo segn la carga, volumen, peso, resistencia trmica del material. Es imprescindible respetar los parmetros obtenidos en la validacin del procedimiento. La temperatura de esterilizacin por Calor Seco deber estar entre 160C a 170 C. y el tiempo de aplicacin ser de una hora o ms. 2.- El material a esterilizar se deber cargar con el esterilizador fro, teniendo en cuenta las siguientes recomendaciones: Cada unidad deber quedar separada de las vecinas Los materiales no debern estar en contacto con las paredes, piso y techo del esterilizador La carga del esterilizador ser homognea y no deber superar el 80% de la capacidad total de la cmara 3.-Colocar el material dentro del Esterilizador. Encender el Esterilizador, Verificar que los instrumentos de control de ciclo, tiempo ( l hora) y temperatura( 170C) se encuentren en la posicin correcta. Esperar hasta que los instrumentos de medicin alcancen la temperatura seleccionada para el ciclo

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12 4.- Cuando se alcance la temperatura seleccionada, se comenzar a descontar el tiempo de esterilizacin. Cumplido el tiempo de exposicin se apagar el Esterilizador La descarga del Esterilizador se efectuar una vez que el material se haya enfriado. 5.-Durante el ciclo de Esterilizacin no deber abrirse la puerta del Esterilizador porque ello implicara abortar el ciclo, debiendo en este caso recomenzarlo, adems de que el cambio de temperatura rompera la cristalera 6.- una vez alcanzada la temperatura de 160C en el horno con aire caliente coloca todo el material que se empac y toma el tiempo de 2 horas para su esterilizacin

CUESTIONARIO:
1.- Porqu antes de una esterilizacin es necesario lavar y desinfectar el material? ________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ 2.- Es necesario un secado del material en el horno antes del empacado con papel estraza? Porque? ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________ 3.- Qu finalidad tiene el empacado antes de la esterilizacin? ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ 4.- Puede ser utilizado otro tipo de papel que el de estraza? Por qu? ____________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ 5.- Qu finalidad tienen los tapones de algodn que se colocan en los extremos de las pipetas y de los Matraces Erlen Meyer__________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ 6.- Qu desventaja tiene el utilizar la esterilizacin por calor seco en este laboratorio? ________________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________

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13 7.- Cmo acta la esterilizacin por calor seco en los microorganismos? ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ 8.- A qu temperatura y cunto tiempo tendrs que emplear para esterilizar por calor seco el material de laboratorio para asegurar la destruccin de microorganismos patgenos y esporas? ________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________

OBSERVACIONES
Realiza los dibujos correspondientes del procedimiento de empacado que realizaste para cada tipo de material de laboratorio. As mismo dibuja el horno en donde realizaste la esterilizacin por calor seco.

CONCLUSIONES
________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________

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ESTERILIZACIN POR CALOR HMEDO


Prctica No 2 Nombre Del Alumno:_________________________________Semestre______ Grupo______ Nombre del titular_____________________________________Fecha____________________ Nombre del Profr. de Laboratorio_______________________________ Calif:_____________

OBJETIVO:
El alumno conocer y aplicar el procedimiento de esterilizacin por calor hmedo, as como las ventajas del procedimiento.

MATERIAL SUSTANCIAS
Reloj la llave Autoclave u olla de presin 3 Soporte universal 2 mechero fischer Material de cristalera limpio, seco y empacado Agua de Extran Alkox

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15 Asa de platino INTRODUCCIN AGENTES FSICOS ANTIMICROBIANOS. A) CALOR HMEDO.- La temperatura elevada, combinada con una humedad elevada, es uno de los mtodos ms efectivos para matar microorganismos. El calor hmedo mata a los microorganismos coagulando sus protenas. Es mucho ms rpido y efectivo que el calor seco. El vapor a presin proporciona temperaturas por encima de las que se pueden obtener al hervir. Tiene la ventaja de un calentamiento rpido, as como penetracin rpida y abundante humedad.. El aparato a esterilizar que utiliza vapor de agua a presin regulada se denomina autoclave. Consta de una cmara de doble pared que se llena de vapor saturado libre de aire y se mantiene a la temperatura indicada y a la presin establecida durante un periodo de tiempo determinado. Generalmente el autoclave funciona a una presin de 15 libras/ pulgada cuadrada a 121C ( 249F). El tiempo de funcionamiento para lograr la esterilidad depende de la naturaleza del material que se va a esterilizar, del tipo de envase y del volumen del material. Una temperatura de l00C es la suficiente para matar a todas las formas bacterianas en 2 o 3 minutos, excepto a las esporas, para matar a estas se requiere una temperatura de 121C durante 15 minutos y a una presin de 15 libras. Este mtodo es adecuado para esterilizar aparatos que tienen hule, jeringas que contienen metal, para medios de cultivo que contienen un azcar especial dextrosa. El autoclave se puede sustituir por la olla de presin. B) CALOR SECO.- En este tipo de esterilizacin existe una destruccin de los microorganismos oxidando sus constituyentes qumicos, desnaturalizando las protenas y los cidos nucleicos de las clulas as como fragmentando las membranas celulares. Para materiales que deben permanecer secos como ciertos instrumentos de vidrio de laboratorio tales como: cajas de petri, pipetas, as como aceites, polvos ( por ser impermeables al vapor), los materiales que no se pueden esterilizar por calor seco son: Material textil (algodn, sedas, lino, etc.), Gomas y Materiales sintticos Todo material que se altere a la temperatura de trabajo se dispone de hornos elctricos por los que circula aire caliente, en vista de que el calor es menos eficaz en materiales secos, se acostumbra a aplicar una temperatura de 160C a 170C durante una hora o ms. Para materiales de vidrio de laboratorio es suficiente una exposicin de dos horas de duracin a 160C ( 320 F) para que quede esterilizado. Otras formas tiles de calor seco incluyen incineracin para objetos que deben ser destruidos y flameados por pasaje de agujas o pequeos instrumentos a travs de la llama de un mechero bunsen

PROCEDIMIENTO
C) ESTERILIZACIN POR CALOR HMEDO (vapor a presin)

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16 1.- Lava el material que te proporcione tu profesor con mezclas adecuadas como Extran, mezcla Crmica con concentraciones adecuadas tomando en cuenta lo sucio del material, seca en estufa o en forma manual con papel absorbente y empcalo. Tenlo listo para su esterilizacin. 2.- Coloca el agua necesaria en la autoclave u olla de presin hasta la marca e introduce unas gradillas metlicas que servirn de base al material a esterilizar. Coloca el material a esterilizar dentro de la autoclave u olla de presin, evitando que el material toque las paredes. 3.- Cierra la autoclave u olla de presin, cuidando de dejar abierta la vlvula de salida de vapor que ayudar a expulsar el aire contenido dentro y que ste es desplazado por el vapor que se produce. .- si el aire no fue eliminado totalmente de la autoclave, el manmetro aumentar a 15 libras. Pero la temperatura no habr alcanzado los 12lC. Por esto se debe medir el tiempo cuando la temperatura llegue a l12C 4.- Cierra la vlvula cuando el vapor sea continuo. La temperatura de l05C indica que est libre de aire. Vigila el termmetro. Cuando vaya en 120C, mantenla durante 15 minutos para que se efecte la esterilizacin (15 libras de presin). Transcurrido este tiempo se corta la fuente de calor. 5.-Deja enfriar hasta que el manmetro marque cero. Abre la vlvula de salida de vapor, para expulsar el vapor restante. Abre el autoclave y retira el material 6.- Si el material no est en estado lquido la vlvula se puede abrir rpido a la salida de vapor, pero si est en estado lquido la rpida prdida de presin las hace hervir o bien saltar los tapones. Por lo tanto se espera unos minutos a que se enfre perfectamente

CUESTIONARIO.
1.- Cul material se puede esterilizar por calor seco y cul no. Porqu? _______________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ 2.- Qu tipo de material se puede esterilizar por calor hmedo? ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________ 3.- A qu condiciones de temperatura y presin se destruyen todas las formas vegetativas? ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ 4.- A qu condiciones de temperatura y presin se destruyen las esporas? ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________

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17 5.- Cules son las condiciones necesarias de tiempo y temperatura para esterilizar por calor seco? ___________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ 6.- Cules son las condiciones necesarias de tiempo y temperatura para esterilizar por calor hmedo? ________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ 7.-Cmo acta la esterilizacin por calor seco en los microorganismos? ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ 8.- Cmo acta la esterilizacin por calor hmedo en los microorganismos? ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ 9.- Qu tipo de esterilizacin es ms recomendable y por qu? ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________

OBSERVACIONES:
Realiza esquemas y dibujos correspondientes a la esterilizacin por calor hmedo que realizaste en la prctica

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CONCLUSIONES:
________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________

PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO SLIDOS


Prctica No 3 Nombre Del Alumno:_________________________________Semestre______ Grupo______ Nombre del titular_____________________________________Fecha____________________ Nombre del Prof. de Laboratorio_________________________________ Calif:___________

OBJETIVO:
Adiestrar al alumno en la preparacin de diferentes medios de cultivo

MATERIAL SUSTANCIAS
4 Matraz Erlen Meyer de 250 ml Agar nutritivo

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19 1 Bao mara 3 Tripies sangre 2 Mecheros Fisher Macconkey 3 Telas de asbesto Sal- Agar Agitador 4 Vaso de precipitado de 250 ml 1 Esptula 1 Vidrio de reloj Cajas de petri Tapones de algodn Autoclave u olla de presin Papel estraza Tubos de ensayo 16X150 Miuller Hinton Agar base Agar Agar- Manitol-

INTRODUCCIN
Uno de los sistemas ms importantes para la identificacin de microorganismos es observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio. El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio de Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el Cultivo.. Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presin de oxgeno adecuado, as como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe estar exento de todo microorganismo contaminante. La mayora de las bacterias patgenas requieren nutrientes complejos similares en composicin a los lquidos orgnicos del cuerpo humano. Por eso, la base de muchos medios de cultivo es una infusin de extractos de carne y Peptona a la que se aadirn otros ingredientes. El Agar es un elemento solidificante muy empleado para la preparacin de medios de cultivo. En los diferentes medios de cultivo se encuentran numerosos materiales de enriquecimiento como hidratos de carbono, suero, sangre completa, bilis, etc. Los hidratos de Carbono se adicionan por dos motivos fundamentales: para incrementar el valor nutritivo del medio y para detectar reacciones de fermentacin de los microorganismos que ayuden a identificarlos. El suero y la sangre completa se aaden para promover el crecimiento de los microorganismos menos resistentes. Por su aspecto fsico. Los medios de cultivo preparados pueden ser clasificados por su aspecto en: : Lquidos, Semislidos, Slidos. Y por su uso en: I.- Medios de cultivos bsicos II:_ Medios de cultivos especiales como: mejorados, selectivos, diferenciales, de transporte.

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20 PROCEDIMIENTO: 1- Primeramente se desinfecta el rea de trabajo con fenol al 5% o alcohol y se enciende el mechero PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO SLIDOS 1.- Leer las instrucciones del fabricante para cada medio de cultivo y pesar la cantidad necesaria segn el volumen requerido. 2.- Colocar el medio en un vaso de precipitado que contenga el agua destilada en el volumen requerido, agitar y calentar a ebullicin para disolver el Agar. En el ltimo paso se debe tener cuidado ya que el recipiente se calienta en exceso y el producto tiende a hervir y proyectarse, lo cual puede producir serias quemaduras. El Agar disuelto hace transparente al medio que originalmente estaba turbio. Puede utilizarse un bao mara para aumentar la solubilidad. 3.- Si se va a envasar en cajas de petri, es necesario conservar el medio en un matraz y esterilizarlo a 121C durante 15 minutos. Al terminar, es conveniente mantener el mechero encendido para formar un rea de esterilidad al momento del vaciado en las cajas de petri aproximadamente de 15 ml. A 20 ml De Agar por caja procurando que no se forman burbujas. Tapar la caja inmediatamente 4.- Si se desea que el Agar quede en tubos, entonces se esterilizar el Agar directamente en ellos a 121C durante 15 minutos tapados con algodn, gasa y papel estraza. Si desea que solidifiquen inclinados, colocarlos en una superficie lisa inclinndolos en un ngulo de 20 a 30 sobre una varilla de vidrio. 5.- . Para preparar el Agar base Sangre es necesario Adicionar en condiciones de asepsia sangre desfibrinada estril en concentracin final de 15%. Despus de la esterilizacin del Agar base Mezclar cuidadosamente y poner en cajas petri estriles.

A) VACIADO EN CAJAS DE PETRI 3.- No destapar las cajas de petri, sino hasta el momento que vayan a ser utilizadas. Es conveniente colocarse un cubre bocas la persona que va a realizar el vaciado y evitar hablar en todo momento para no contaminar el medio de cultivo. 4.- Es conveniente mantener el mechero encendido y trabajar cerca del rea estril al momento del vaciado en las cajas de petri. Levantar la tapadera de la caja petri con la mano izquierda , sin soltarla y sin retirarla demasiado de la

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21 base de la misma caja mientras que con la mano derecha tomar el matraz que contiene el medio de cultivo y realizar el vaciado de aproximadamente 15 ml. A 20 ml de Agar por caja procurando que no se forman burbujas, se procede a tapar la caja inmediatamente 5.- Si se forman burbujas, tomar el mechero, flamear el medio de cultivo sobre la superficie de la caja de petri y de manera rpida. Se procede a tapar la caja. 6.- Esperar a que el medio solidifique, Se rotulan los medios de cultivo, anotando la fecha y con iniciales el tipo de medio de cultivo. Si las placas no se van a utilizar el mismo da se sujetan con cinta y se colocan en el refrigerador de manera invertida para evitar que el vapor condensado caiga sobre el medio de cultivo y lo pueda contaminar 7.- Cuando se vayan a utilizar los medios de cultivo preparados, ser necesario secar las placas invertidas en estufa a 37 C. Antes de realizar el sembrado de microorganismos.

CUESTIONARIO 1.- Qu es un medio de cultivo? ________________________________________________________________________________ 2.- Qu es un cultivo de microorganismo? ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ 3.- Qu finalidad tiene utilizar medios de cultivo slidos? ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ 4.- Escribe el nombre de 5 medios de cultivo que pueden ser empleados en el laboratorio de microbiologa. ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ 5.- De dnde es obtenido el extracto Agar- Agar para la preparacin de medios de cultivos? ________________________________________________________________________6.- Por qu es necesario esterilizar la mesa entes de realizar el vaciado del medio de cultivo en las cajas de petri?

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22 ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ 7.-Por qu la base de muchos medios de cultivo es una infusin de extractos de carne y Peptona? ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________8.Escribe la composicin qumica para cada medio de cultivo que utilizaste. Agar nutritivo Miuller Hinton

Agar base sangre Macconkey

Agar

Agar- Manitol- Sal- Agar

OBSERVACIONES. Dibuja todos los pasos realizados en la preparacin de los medios de cultivo.

CONCLUSIONES:
________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________

PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO LQUIDOS

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Prctica No 4 Nombre Del Alumno:_________________________________Semestre______ Grupo_______ Nombre del titular_____________________________________Fecha____________________ Nombre del Prof. de Laboratorio_________________________________ Calif:___________

OBJETIVO: El alumno aprender la tcnica del vaciado en placa del medio de cultivo preparado en la sesin anterior en cajas de petri ya esterilizadas adems preparar medios de cultivo lquido estril. MATERIAL 3 Telas de asbesto 3 Tripies o soportes Universales 2 Mecheros Fisher 2 Agitadores nutritivo 2 Vasos de precipitado de 250 ml triptona 2 Esptulas 2 Vidrio de reloj Tubos de ensaye 20 X 200 mm Tapones de algodn Autoclave u olla de presin Papel estraza Equipo para Bao Mara SUSTANCIAS

Medio de cultivo para caldo Medio de cultivo para caldo Fenol al 5%

INTRODUCCIN
CLASIFICACIN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO: Para el aislamiento, estudio y clasificacin de los microorganismos, es necesario utilizar un medio de cultivo en el que dispongan de las sustancias orgnicas e inorgnicas necesarias indispensables para el normal desarrollo de su metabolismo. En estos medios, los microorganismos adems de poder multiplicarse, pueden manifestar caractersticas de crecimiento y propiedades bioqumicas; aspectos de gran importancia para su clasificacin. Estos preparados estriles que poseen los elementos necesarios para el desarrollo de un microorganismo, se denominan medios de cultivos y pueden dividirse por su:

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24 A) ASPECTO: Medios lquidos. Se emplean fundamentalmente para:- Cultivar los microorganismos y obtener grandes cantidades de los mismos o bien la produccin de metabolitos especficos La multiplicacin bacteriana en los medios de cultivos lquidos se manifiesta generalmente por el enturbiamiento de ste;.- Estimular y promover la seleccin de algn o algunos microorganismos e impedir que otros se multipliquen.- Identificar al microorganismo estudiado mediante pruebas bioqumicas. Medios semislidos.- Se utilizan para identificaciones bioqumicas y averiguar si el germen estudiado es mvil. Los medios semislidos tienen una consistencia blanda. Medios slidos.- Se utilizan para obtener colonias aisladas de microorganismos. Los medios slidos constituyen la mayor parte de los medios de cultivo que se emplean en Microbiologa. , En los medios de cultivos slidos la multiplicacin bacteriana se manifiesta por una formacin macroscpica denominada colonia bacteriana, que es el resultado de la multiplicacin de una sola clula bacteriana. B) USO I.- Medios de cultivos bsicos. Se caracterizan por ser pobres en material nutritivo, de manera que su uso es muy restringido, constituyen la base para la preparacin de otros medios. Como ejemplo pueden citarse el caldo peptonado y el Agar-Agar corriente. II:_ Medios de cultivos especiales. Entre estos se encuentran: a) Medios mejorados. En general son los mismos medios bsicos a los que se les agrega una sustancia enriquecedora como sangre, suero, etc. El uso de estos medios es universal y est orientado especialmente a obtener buen desarrollo de cualquier tipo de bacteria, se utilizan en primera instancia en el aislamiento bacteriano, ya sea a partir de otros cultivos o de productos patolgicos.Los medios de este tipo de uso ms frecuente son: Agar tripticasasangre, caldo tripticasa, Agar chocolate, medio de Mueller-Hinton.

b) Medios selectivos. Son medios que contienen sustancias que impiden o


limitan el crecimiento de algunas especies microbianas y permiten el desarrollo de otras. consiste en aislar un microorganismo de un sustrato que contiene numerosas otras especies.Se incluyen en este grupo el agar cristal violeta para el aislamiento de bacterias Gram(-) y el agar telurito de potasio para el aislamiento de bacterias Gram(+).

c) Medios de cultivos diferenciales. Se emplean para demostrar alguna


propiedad bioqumica de la bacteria como degradacin de hidratos de carbono, protenas, hidrlisis de la urea, etc., contienen indicadores de cido base, redox o sustancias que detectan cambios en el medio o en las caractersticas tpicas de las colonias el estudio en estos medios debe realizarse empleando cepas bacterianas puras. Existen numerosos medios de este tipo, de uso preferencial en la bioidentificacin de bacilos Gram(-) ya que

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25 ellos no tienen caractersticas muy distintivas en las colonias o cultivos en general. Entre los de uso ms corriente se encuentran: Agar fierro-triple-azcar (TSI agar Medio de SIM, Caldo glucosado fosfatado, Voges-Proskauer o del rojo de metilo, Medio agar-citrato de sodio (Medio de Simmons- Medio caldo urea, d) Medios de transporte. Sirven para transportar los especimenes que contienen a los microorganismos, del sitio de la toma del producto hasta el laboratorio donde va a efectuarse el estudio. Estos medios impiden que se altere la proporcin original de la flora microbiana en los especimenes.

PROCEDIMIENTO:
B) PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO LQUIDOS * Preparar caldo nutritivo y caldo triptona 1.- Leer las instrucciones del fabricante y pesar la cantidad necesaria segn el volumen de medio de cultivo requerido. 2.- Disolver el medio en agua destilada agitando el recipiente 3.- Envasar el volumen necesario en matraces, tubos u otros recipientes. Procurar que el volumen del medio no rebase la mitad de la capacidad del recipiente, pues de otra manera el medio se puede regar 4.- Tapar el recipiente con algodn, gasa y papel estraza. 5.- Esterilizar en autoclave a 121C durante 15 minutos, a menos que se indique otra cosa. 6.- antes de usar el medio de cultivo, se debe someter a una prueba de esterilidad, para lo cual se debe meter a una estufa a 37C durante 24 horas. El medio debe permanecer libre de crecimiento.

CUESTIONARIO
1.- Qu es un medio de cultivo? ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ 2.- Qu tipo de nutrientes requieren los microorganismos para poder crecer en un medio de cultivo? ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ 3.- Cmo nos podemos dar cuenta que existi crecimiento de microorganismos en un medio lquido? 4.-Cmo se manifiesta el crecimiento

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26 de los microorganismos en un medio de cultivo slido? ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ 5.-Cul es el elemento principal del medio de cultivo que favorece su solidificacin? ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ 6.- De acuerdo a su uso Qu tipo de medios de cultivos podemos encontrar en el mercado? ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ 7.- Escribe dos ejemplos de medios selectivos encontrados en el laboratorio en donde puedan desarrollarse los microorganismos ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ 8,. Qu finalidad tiene guardar invertidos los medios de cultivo ya preparados en las cajas de petri en el refrigerador o en la estufa de incubacin? ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ 9.- Escribe dos medios de cultivos que nos permiten determinar alguna prueba bioqumica_____________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ _

OBSERVACIONES:
Dibuja todos los pasos del proceso de vaciado del Agar en cajas de petri esterilizadas

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27 CONCLUSIONES:_____________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ __

SEMBRADO EN PLACA DE MICROORGANISMOS DEL MEDIO AMBIENTE


Prctica No 5 Nombre Del Alumno:_________________________________Semestre______ Grupo_______ Nombre del titular_____________________________________Fecha____________________ Nombre del Profr. de Laboratorio_________________________________ Calif:___________

OBJETIVOS
Observar la gran variedad de microorganismos presentes en el medio ambiente, determinando las diferentes morfologas de colonias que se obtienen. Los efectos de un desinfectante por medio del crecimiento de colonias de bacterias en un medio de cultivo en cajas de Petri.

MATERIAL

3 cajas de Petri estriles preparadas con Agar nutritivo Caja de hisopos estriles sin abrir toallas de papel 3 cajas de petri estriles preparadas con Agar sangre. Cinta pegante Marcador permanente o lpiz de cera Un desinfectante con 70% de solucin de alcohol, 10% de una solucin blanqueadora , jabn lquido Extran o alkox.

INTRODUCCIN
La poblacin microbiana existente en nuestro entorno es grande y compleja. Cientos de especies microbianas habitan normalmente en distintas partes de nuestro cuerpo, incluidas la boca, el tracto intestinal y la piel. Al nacer, los microbios inmediatamente empiezan a colonizar nuestros cuerpos, as como a casi todos los objetos del mundo. Ellos flotan alrededor hasta que entran en contacto con una superficie que ofrezca comida y resguardo. Se encuentran ms frecuentemente en la oscuridad, en objetos hmedos que a menudo

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28 entran en contacto con la comida, la suciedad o la vegetacin. Las superficies del bao, los cepillos para el cabello, los refrigeradores, los lavaplatos y las tablas de cocina tienen a menudo muchos microbios. Las manijas y las paredes tienen menos porque son pobres en nutrientes y secos. Un estudio adecuado de microorganismos que hay en estos hbitat requiere tcnicas que permitan conocer y ordenar la compleja poblacin mixta o cultivo mixto, separndole en sus distintas especies como cultivos puros. Un cultivo puro consta de una poblacin de clulas derivadas todas ellas de una clula parental. Los microorganismos se cultivan en el laboratorio sobre materiales nutritivos denominados medios. Se dispone de una gran cantidad de medios y la clase que se debe de utilizar depende de muchos factores, uno de los cuales es la clase de microorganismos que se va a cultivar. El material que se inocula sobre el medio se denomina inculo mediante alguna tcnica (siembra por estra en placa o siembra en masa en placa). Durante la incubacin a 37:C , las clulas microbianas individuales se reproducen tan rpidamente que en un lapso de 18 a 24 horas producen masas visibles de clulas denominadas colonias. Una colonia es visible a simple vista. Cada colonia diferente es presumiblemente un cultivo puro de una sola clase de microorganismo. Si dos clulas microbianas procedentes del inculo original quedan muy cerca una de otra sobre el medio de Agar, la masa de clulas observables no ser un cultivo puro. La mayora de los microbios en nuestro cuerpo y otras superficies son inofensivas, pero algunos son patgenos o causan enfermedad. Por esta razn, queremos controlar el nmero de microbios que nos rodea. La posibilidad de infectarnos aumenta con el nmero de microbios en los objetos circundantes. Pero qu podemos hacer para reducir el nmero de microbios en las superficies que nos rodean?

PROCEDIMIENTO
En esta actividad escogers un fomite (cualquier objeto inanimado que pueda causar enfermedad en los organismos por contener microorganismos como: la manija, el marco, el control remoto de la televisin, una moneda). Este fomite ayudar a confirmar la presencia de microbios y los efectos de un desinfectante por medio del crecimiento de colonias de bacterias en un medio de cultivo en cajas de Petri. 1. Si tienes el cabello largo, recgetelo para mantenerlo lejos de las cajas de Petri cuando ests trabajando. Lava tus manos. Limpia t rea de trabajo frotando suavemente, con la solucin desinfectante en una toalla de papel. Saca tus cajas de Petri pero no abras las cajas hasta que se te indique. 2. Escoge un objeto del saln de laboratorio (la manija, el marco, el control remoto de la televisin, una moneda, etc.). Toma una caja de Petri sin abrir y con t lpiz de cera o marcador, divide la base de la caja en cuatro secciones iguales.

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29 Escribe el nombre del objeto al otro lado y designa las secciones de 1 hasta 4. Abre la caja de hisopos de algodn y escoge uno con cuidado para no tocar la punta. Limpia t objeto escogido con todos los lados de la punta del hisopo voltendolo y retorciendo el hisopo a medida que lo mueves por la superficie del objeto. 3. Ahora abre la tapa de la caja y suavemente haz cuatro siembras sobre la superficie de la caja como se muestra en la ilustracin, empezando en la seccin designada "1" y continuando en el orden de las secciones, de manera que la ltima siembra est en la seccin 4. Presiona firme pero suavemente y no retias las siembras anteriores. Tus siembras slo deben dejar una impresin muy ligera en el Agar. Cierra la caja y sllala con dos pedazos de cinta. No cubras la caja con cinta o no podrs verla bien. 4. Divide una segunda caja de Petri en 4 secciones numeradas de 1 hasta 4 y desgnala Control. Limpia la mitad del objeto que escogiste anteriormente con una toalla de papel humedecida con agua-solo frtala un par de veces; no la restriegues. Con un nuevo hisopo estril, toma muestra del rea limpiada. Abre la tapa de la segunda caja y haz SUAVEMENTE 4 siembras en la superficie de la caja, siguiendo el orden de las secciones numeradas como lo hiciste previamente. Cierra la caja y sllala. 5. Divide la tercera caja de Petri en 4 secciones numeradas y desgnalas con el nombre del desinfectante que escogiste (por ejemplo "blanqueador"). Usa el desinfectante escogido para limpiar la otra mitad del objeto que trabajaste antes. Con un nuevo hisopo estril, toma muestra del rea. Repite el proceso de sembrar la caja. Cirrala y sllala. 6. Esteriliza los hisopos usados con desinfectante y descrtalos. Pon las cajas en un lugar apartado y djalas incubar a la temperatura de 37C durante 24 a 48 horas. Limpia tu rea de trabajo con la solucin desinfectante y lava tus manos. 7.- Repite todo el experimento utilizando Cajas de cultivo con Agar sangre slo que ahora selecciona otro Fomite que no hayas empleado 7. Despus de que hayan pasado dos das, mira las cajas de Petri iniciales. No la abras. A la vez examina las otras cajas de Petri sin abrirlas. Crea una tabla que compare las cajas sembradas antes y despus de limpiar el objeto (mira la tabla de ejemplo). Asegrate de indicar si los microbios crecieron en cada siembra. 8. Nota: un adulto supervisor debe hacer este paso preferiblemente. Cuidadosamente abre las cajas de Petri en un lavaplatos e inndalas con blanqueador o alcohol sin diluir. Djalas por una hora y enjugalas completamente; colcalas en una bolsa plstica, amrrala y descrtala.

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30 Asegrate de no tocar la superficie de las cajas cuando las abras y lava tus manos cuidadosamente despus de manipularlas. Limpia t rea de trabajo con la solucin desinfectante.

CUESTIONARIO
1.- Qu es un cultivo puro de microorganismos? ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ 2.- Qu es in inculo? ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ 3.- Fsicamente en un medio de cultivo de microorganismos cuando se dice que no forma un cultivopuro? ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ 4.- Qu tipo de tcnica empleaste para la siembra de microorganismos? ________________________________________________________________________________ 5.- En cul caja crecieron ms y ms grandes las colonias? Por qu piensas eso? ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ 6.-Cmo es el patrn que observas en el tamao y cantidad de colonias en cada caja? ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ 7.- Cmo podemos controlar la contaminacin microbiana? ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ 8.- Completa en la siguiente tabla anotando X en los espacios correspondientes a las divisiones realizadas en donde hayan crecido los microorganismos A) MEDIOS DE CULTIVO CON AGAR NUTRITIVO Caja 1 Siembra Crecimient o B)MEDIOS DE CULTIVO CON AGAR SANGRE
1 2 3 4

Caja 2
1 2 3 4

Caja 3
1 2 3 4

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31 Caja 1 Siembra Crecimient o


1 2 3 4

Caja 2
1 2 3 4

Caja 3
1 2 3 4

OBSERVACIONES: Dibuja todos los pasos empleados en el sembrado de


las cajas de petri con Agar nutritivo. Y los resultados de las colonias bacterianas que crecieron.

CONCLUSIONES___________________________________________________________
________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ __

AISLAMIENTO DE HONGOS MEDIANTE EL METODO EXTENSIN EN PLACA


Prctica No 6 Nombre Del Alumno:_________________________________Semestre______ Grupo_______ Nombre del titular_____________________________________Fecha____________________ Nombre del Profr. de Laboratorio_________________________________ Calif:___________

OBJETIVO:
El alumno aislar actinomiceto del suelo mediante el mtodo extensin en placa utilizando una varilla angular de vidrio MATERIAL 1 varilla de vidrio doblada 2 pipetas de 1 ml MATERIAL BIOLGICO Muestra de suelo 2 caja con medio de cultivo estril Czapeck

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32 5 tubos de ensayo 2 caja con medio estril de Gelosa glicerol extracto de levadura (GGL) Asa bacteriolgico 2 caja con medio estril Gelosa peptona Dextrosa extracto de levadura (GPDL) Alcohol al 70%

INTRODUCCION
Uno de los problemas ms frecuentes en Microbiologa es el aislamiento de un cultivo puro de una especie bacteriana dada. A pesar de que es muy difcil aislar una sola clula, existen tcnicas capaces de aproximar este ideal En Microbiologa, todas las manipulaciones deben ser llevadas a cabo de modo que se impida cualquier tipo de contaminacin en el rea de trabajo. Los procedimientos utilizados par conseguirlo se conocen con el nombre de tcnica asptica, y se citan a continuacin: -Las asas deben esterilizarse antes de utilizarlas y enfriarse sobre el agar o el material de vidrio (en zonas estriles) antes de tomar la muestra de microorganismos, con objeto de no destruirlos por calor. -Despus de utilizarlas, las asas se vuelven a esterilizar. -Las bocas de los tubos y matraces de vidrio se flamean ligeramente una vez destapadas, y despus de la inoculacin. -Durante la inoculacin, los tapones se mantienen en la mano sujetndolos por la parte que no entra en contacto con tubos y matraces. -Los tubos abiertos deben mantenerse en posicin inclinada para que el riesgo de contaminacin sea mnimo. -Las tapas de las placas Petri no deben colocarse nunca sobre la mesa de trabajo. Tcnicas de siembra La siembra de microorganismos puede realizarse en medios lquidos o en medios slidos. En el primer caso, para la inoculacin se utilizar asa estril si el medio de partida es slido, o pipeta estril (Pasteur o graduada) si es lquido. En el segundo caso, cuando se parte de otro medio slido, se utiliza el asa de platino normal para siembra en placa o tubo inclinado y el asa recta para siembra en picadura en tubos rectos o, en general, cuando se quiere introducir el microorganismo en el seno del medio de cultivo slido; cuando el medio de partida es lquido, se puede pasar al medio slido con un asa de platino calibrada, con la que se extiende la muestra directamente, o con pipeta (Pasteur o graduada), depositando la muestra que luego se extender sobre la placa con un asa de Digralsky. O con una varilla doblada. En general, en Microbiologa se trabaja con cultivos puros de microorganismos. Un cultivo puro es aqul en que todas las clulas provienen de una sola clula inicial. Una colonia de cualquier microorganismo es un cultivo puro, ya que todas sus clulas proceden de una inicial; por lo tanto, cuando se desea aislar un microorganismo de una muestra cualquiera, es preciso ver colonias del mismo, lo que implica que el aislamiento ha de realizarse en medio slido en placa.

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33 Los pasos de un proceso de aislamiento de una especie microbiana se pueden resumir en los siguientes: -Siembra en placa de la muestra de partida. -Tomar una colonia de la placa una vez incubada, resuspenderla en agua estril y sembrar una segunda placa, en la que todas las colonias que crezcan deben ser idnticas. -A partir de la segunda placa se puede resuspender una de las colonias en medio lquido, consiguindose ya un cultivo puro. -Para la conservacin de los cultivos puros de un microorganismo existen diversos mtodos, el ms simple es la resiembra en tubos inclinados que se mantienen, normalmente refrigerados, durante 3-6 meses.

PROCEDIMIENTO
1.- Hacer diluciones decimales a partir de la muestra de suelo hasta 10-5 2.- Slo vas a necesitar las ltimas dos diluciones es decir: 10 -4 , 10 5 las dems se desecharn. 3.- Rotula dos cajas de petri con el nombre del medio de cultivo Czapeck en una anota la dilucin 10-4, y en la otra anota la dilucin 10-5 4.- Rotula dos cajas de petri con el nombre del medio de cultivo (GGL) en una anota la dilucin 10-4, y en la otra anota la dilucin 10-5 5.- Rotula dos cajas de petri con el nombre del medio de cultivo (GPDL) en una anota la dilucin 10-4, y en la otra anota la dilucin 10-5 6.- Esteriliza el asa bacteriolgica en el mechero, espera que se enfre cerca del rea estril e introdcela en la dilucin 10-4 7.- Coloca una gota de esta dilucin 10-4 en el centro de la superficie del Agar en el primer medio de cultivo Czapeck., tapa la caja de petri 8.- Vuelve a introducir en la misma dilucin 10-4 y coloca una gota en el siguiente medio (GGL), repite lo mismo y coloca una gota en el tercer medio de cultivo (GPDL) . No olvides tapar las cajas para evitar que se contamine. 9.-Esteriliza el asa bacteriolgica y ahora introdcela en la dilucin 10-5 repite los pasos anteriores, pero ahora para todas las cajas que estn rotuladas con la dilucin 10-5 No olvides tapar los medios de cultivo. 10.- Vierte una o dos gotas de alcohol al 70% sobre el brazo ms corto de la varilla de vidrio y con el mechero enciende el alcohol que se encuentra en la varilla . Permite que arda hasta que se queme todo el alcohol. Deja que la varilla de vidrio se enfre por un minuto 11.- Utiliza el brazo corto de la varilla para dispersar uniformemente la gota de cada dilucin sobre toda la superficie de cada placa de Agar inicia con las diluciones 10-5 12.- Invierte la caja de petri, incbala a temperatura de 37C por 24 horas.

CUESTIONARIO
1.- A qu grupo de microorganismos pertenecen los actinomicetos? _______________________________________________________________________________

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2.- Para qu son utilizados en el rea mdica los actinomicetos? ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ 3.-Qu tipo de tcnica utilizaste para sembrar a estos microorganismos? ________________________________________________________________________________ 4.- Menciona otra tcnica para aislar cultivos puros de microorganismos? ________________________________________________________________________________ 5.- Cul fue la finalidad de quemar el alcohol sobre la varilla de vidrio? ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ 6.- Por qu iniciaste a distribuir con la varilla en forma uniforme las diluciones l0-5 que contenan a los microorganismos y no con las diluciones de l04? ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ 7.-Qu apariencia presentaron las colonias despus del tiempo de incubacin? ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ 8.- Esquematiza el proceso de dilucin para la muestra de tierra que realizaste

OBSERVACIONES
Dibuja todo el proceso llevado a cabo para el aislamiento del cultivo puro de microorganismo por extensin en placa, as como los resultados obtenidos al cabo de 24 horas.

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CONCLUSIONES
________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________

AISLAMIENTO DE BACTERIAS MEDIANTE EL METODO SIEMBRA EN PLACA POR ESTRAS


Prctica No 7 Nombre Del Alumno:_________________________________Semestre______ Grupo_______ Nombre del titular_____________________________________Fecha____________________ Nombre del Profr. de Laboratorio_________________________________ Calif:___________

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OBJETIVO:
Demostracin de los medios de defensa del husped en la piel y garganta mediante el mtodo de siembra en placa por estra.

MATERIAL BIOLGICO
Cajas de petri con faringeo Cajas de petri con salina estril Cajas de petri con piel Cajas de petri con Mechero Fisher Asa de platino Hisopos estriles Agar- Sangre (GS) Manitol sal Agar (MSA) Agar vogel y Jonson (AVJ) Agar Estafilococo S110

MATERIAL
Exudado Solucin Raspado de

INTRODUCCIN
La piel (en condiciones normales) es una barrera que impide la penetracin de los grmenes, por ello acta como mecanismo de defensa. Los mamferos son frecuentemente infectados por algunas de las bacterias preexistentes en su medio ambiente, aunque en general viven en equilibrio con estos microorganismos, mantenindoles limitados a zonas relativamente superficiales de su organismo. Sin embargo las bacterias infecciosas producen enfermedades al invadir tejidos ms profundos. Por lo tanto para mantener la salud, el husped debe defenderse constantemente frente a la invasin por parte de las bacterias. Los factores mecnicos, qumicos y microbianos desempean un papel importante al restringir la colonizacin de las bacterias a las superficies corporales. Factores mecnicos: Las superficies epiteliales de la piel y de las mucosas constituyen barreras que resultan ms o menos impermeables a las bacterias. La impermeabilidad de la piel es mayor que en la mayora de las mucosas. Cuando se altera la integridad de la superficie epitelial, pueden desarrollarse infecciones subcutneas. Las bacterias que causan ms frecuentemente estas infecciones son las que existen habitualmente en la superficie cutnea, folculos pilosos y glndulas sudorparas en la piel, es decir los estafilococos. Factores qumicos: La acidez de las secreciones gstricas mantienen sin duda la esterilidad habitual del estmago. El Ph bajo de la piel (3-5), debido en gran parte a los productos cidos del metabolismo bacteriano, frena sin duda el crecimiento de muchos microorganismos que toman contacto con sus superficie

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37 Factores microbianos: El antagonismo microbiano inhibe el crecimiento de muchas bacterias y hongos potencial mente patgenos en lugares superficiales donde de no ser as, podran producirse enfermedades. La flora de la regin farngea presenta problemas peculiares para el aislamiento e identificacin de microorganismos, por lo tanto se refiere a los componentes de la flora normal como a microorganismos con accin patgena. Es importante recordar que algunos microorganismos tienen capacidad patgena definida y su presencia es un indicio claro de enfermedades, en tanto que otros, llamados oportunistas, guardan una posicin ambigua y pueden encontrarse tanto como componentes de la flora normal, como asociados a procesos patolgicos, causados por otros microorganismos que son verdaderos responsables (por ejemplo los virus) Los estafilococos estn entre las primeras bacterias que se reconocieron como patgenas, y se descubrieron por primera vez a principios de la dcada de1880. Se encuentran ampliamente distribuidos por la naturaleza, y a menudo forman parte de la flora bacteriana de la piel y el tracto respiratorio superior; muchas de las especies que se encuentran en el hombre son comensales. La especie predominante patgena para el hombre es el staphylococcus aureus, constituye la causa ms comn de las infecciones supurativas para el hombre. El aislamiento de S. aureus a partir del exudado farngeo y exudado de piel, no tiene importancia diagnstica, ya que se considera parte de la flora normal de la faringe y nasofaringe, por lo que no tiene significado clnico.

PROCEDIMIENTO:
1.- Limpiar y esterilizar el rea a trabajar con fenol al 5% 2.- Prender el mechero fischer cerca de donde se va a trabajar, si es posible colocar otro 3.- Humedecer el hisopo en solucin salina estril, pasarlo sobre la superficie de la piel (con o sin pelo) 4.- Descargar el hisopo en dos cajas de petri con el medio ya preparado. (Es recomendable que para cada dos cajas se utilice un solo hisopo con muestra). No retires completamente las tapas de los medios de cultivo para evitar que se contaminen 5.- quemar el hisopo y tirarlo. 6.- Esteriliza el Asa de platino hasta el rojo vivo, enfralo introducindolo en un extremo del Agar 7.- Realiza el sembrado de los microorganismos por el mtodo de estra utilizando el asa y como se muestra en la figura. Evita destapar completamente la tapa de los medios de cultivo. 8- Repetir el mismo proceso con otro hisopo estril y con solucin salina para otras dos cajas . siembra por estra utilizando el Asa de platino y as hasta que se terminen se sembrar todos los medios preparados. 9.- Incubar a 37C por 24-48 horas y observar resultados. 10.- Repite el mismo procedimiento pero ahora toma muestra de la faringe con hisopos estriles en las zonas afectadas como: amgdalas, pared posterior

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38 de la faringe, en general cualquier rea que manifiesta signos de inflamacin, exudados y lceras, procurando no tocar con el hisopo la lengua.

INTERPRETACIN DE RESULTADOS:

A) REACCIONES POSITIVAS EN DISTINTOS MEDIOS


GELOSA SANGRE Para el aislamiento, cultivo y deteccin de actividad hemoltica de Staphylococcus, Streptococcus y otros microorganismos fastidiosos. Se observan colonias blancas casi grises, Grandes, convexas de consistencia butircea, Presentan bordes regulares. Se observa que Presenta hemlisis. Las colonias en medio slido son redondeadas, uniformes, Estos crecen rpidamente a 37 C pero tienden a formar pigmentos mejor a temperatura ambiente (20 C). MANITOL SAL AGAR (MSA) Se utiliza como medio selectivo, para cultivar y enumerar especies clnicas de estafilococos El manitol cuando es utilizado por los microorganismos, vira de su color original rojo a amarillo. Se observan colonias chicas, blancas, convexas, de consistencia butircea , presentan bordes irregulares. S. aureus Manitol sal Colonia amarilla S. epidermidis Manitol sal Colonia incolora AGAR VOGEL Y JONSON (AVJ) Para la deteccin de Staphylococcus aureus coagulasa-positivo, se observan colonias negras Pequeas. bordes irregulares con halo amarillo. Para S. epidermidis y otros Pequeas, negro-grisceos, sin halo, El medio presenta un vire de rojo plido a amarillo.

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39 ESTAFILOCOCO S110 S110 Colonias blancas un poco amarillentas, Se observan colonias chicas, convexas, De consistencia butircea y bordes Regulares.

B) DESCRIPCIN DEL TIPO DE COLONIAS OBTENIDAS


Observar las colonias obtenidas y describirlas teniendo en cuenta las siguientes caractersticas: .FORMA: puntiforme, circular, rizoide, irregular, filamentosa. .TAMAO: grande (ms de 3 Mm.), mediana (2-3 Mm.), pequea (1-2 Mm.) .COLOR. Reportar el color final despus de la incubacin .BORDE: entero, ondulado, lobulado, filamentoso, ondeado .ELEVACIN: plano, elevado, convexo, pulvinado, umbonado .SUPERFICIE: suave, brillante, rugosa, plegada, seca, polvorienta

CUESTIONARIO: 1.- Cundo los microorganismos pueden causar dao en nuestro


organismo? _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ 2.- Qu tipo de bacterias son encontradas con mayor frecuencia en nuestra piel y que pretenden aislarse en esta prctica? _____________________________________________________________________________ 3.- Qu finalidad tiene humedecer el hisopo con solucin salina estril? _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ 4.- Por qu no es recomendable utilizar el mismo hisopo para descargar en

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40 las cinco cajas de petri con los medios ya preparados? _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ 5.- Por qu se recomienda enfriar el asa de platino en el medio de cultivo ya preparado antes de realiza el sembrado por estras de los microorganismos? _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ 6 En qu cosiste el aislamiento por estras? _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ 7.- Despus de haber incubado a 25C por 48 horas describe las colonias obtenidas en cada medio de cultivo utilizado GELOSA SANGRE (MSA) .FORMA: .TAMAO: .COLOR. .BORDE: .ELEVACIN: AGAR VOGEL Y JONSON (AVJ) .FORMA: .TAMAO: .COLOR. .BORDE: .ELEVACIN: MANITOL SAL AGAR FORMA: TAMAO: COLOR: BORDE: ELEVACIN: ESTAFILOCOCO S110 FORMA: TAMAO: COLOR: BORDE: ELEVACIN:

OBSERVACIONES:.
Dibuja y colorea todos los resultados obtenidos despus de las 48 horas de haber sido incubados.

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CONCLUSIONES:
________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________

MANEJO Y USO DEL MICROSCOPIO PTICO COMPUESTO


Prctica No 8 Nombre Del Alumno:_________________________________Semestre______ Grupo_______ Nombre del titular_____________________________________Fecha____________________ Nombre del Profr. de Laboratorio__________________________________ Calif:__________

OBJETIVO
El alumno reconocer el microscopio compuesto, identificar cada una de sus partes y lo manejar correctamente observando la Presencia de microorganismos en muestras biolgicas MATERIAL. SUSTANCIAS Microscopio compuesto al 0.85% Porta y cubre objetos lugol Palillo Hisopo MATERIAL BILGICO Sarro dental Muestra de orina Muestra de Excremento Sol. Salina. NaCl Sol. de yodo-

INTRODUCCION.

El microscopio es el instrumento ms frecuentemente utilizado y el ms til en un laboratorio de microbiologa, proporciona la amplificacin o agrandamiento que nos permite ver organismos y estructuras invisibles a simple vista. Los microscopios permiten una amplia gama de amplificaciones, desde cien veces a cientos miles de veces. Las dos categoras de microscopios disponibles son los microscopios pticos y los microscopios electrnicos. Los microscopios pticos utilizan un sistema de lentes pticas y comprenden los microscopios de campo claro, campo oscuro, fluorescencia y contraste de fases. Los microscopios electrnicos emplean haces de electrones en lugar de ondas de luz para producir una imagen ampliada.

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MANEJO Y USO DEL MICROSCOPIO PTICO 1. Colocar el objetivo de menor aumento en posicin de empleo y bajar la platina completamente. Si el microscopio se recogi correctamente en el uso anterior, ya debera estar en esas condiciones. 2. Colocar la preparacin sobre la platina sujetndola con las pinzas metlicas. 3. Comenzar la observacin con el objetivo de 4x (ya est en posicin) o colocar el de 10 aumentos (10x) si la preparacin es de bacterias. 4. Para realizar el enfoque: a. Acercar al mximo la lente del objetivo a la preparacin, empleando el tornillo macromtrico. Esto debe hacerse mirando directamente y no a travs del ocular, ya que se corre el riesgo de incrustar el objetivo en la preparacin pudindose daar alguno de ellos o ambos. b. Mirando, ahora s, a travs de los oculares, ir separando lentamente el objetivo de la preparacin con el macromtrico y, cuando se observe algo ntida la muestra, girar el micromtrico hasta obtener un enfoque fino. 5.- Pasar al siguiente objetivo. La imagen debera estar ya casi enfocada y suele ser suficiente con mover un poco el micromtrico para lograr el enfoque fino. Si al cambiar de objetivo se perdi por completo la imagen, es preferible volver a enfocar con el objetivo anterior y repetir la operacin desde el paso 3. El objetivo de 40x enfoca a muy poca distancia de la preparacin y por ello es fcil que ocurran dos tipos de percances: incrustarlo en la preparacin si se descuidan las precauciones anteriores y mancharlo con aceite de inmersin si se observa una preparacin que ya se enfoc con el objetivo de inmersin.

PROCEDIMIENTO
TECNICAS DE MONTAJE HMEDO La gota pendiente o las preparaciones hmedas permiten examinar organismos vivos suspendidos en un fluido. Las preparaciones hmedas se hacen colocando una gota del fluido que contiene el organismo sobre una lmina de vidrio y cubrindola con una fina pieza de vidrio (cubreobjetos): para reducir la tasa de evaporacin y eliminar corrientes de aire, generalmente se rodea la gota con vaselina. Cuando se examinan las preparaciones hmedas por microscopa de campo claro, es importante ajustar la fuente de luz de forma adecuada. Es posible disminuir la intensidad de la luz mediante la utilizacin de filtros especiales.

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43 MONTAJE EN SOLUCION SALINA FISIOLGICA (NaCl 0.85%) O AGUA Utilizada para estudiar la movilidad de las bacterias A) 1.- En el centro de un portaobjetos coloca una gota de solucin salina 2.- Con un hisopo toma muestra de sarro dental de un compaero que no se haya lavado los dientes y colcala en la solucin salina mezclando cuidadosamente 3.- . Examinar con objetivos de 40X y 60 X. B) 1.- Centrfuga aproximadamente 10 ml de orina a 2,500 rpm durante 5 minutos. 2.- Desecha el lquido sobrenadante y procede a mezclar el sedimento urinario 3.- Coloca una gota del sedimento mezclado en el centro de un portaobjetos limpio y seco 4.- Sobre el sedimento pon un cubreobjetos y observa con el objetivo de 40X y 60X C) 1.- En un tubo de 13 X 100mm coloca las tres cuartas partes de solucin salina fisiolgica 2.- Con un aplicador de madera toma muestra de excremento de varias partes de la muestra y depostalo dentro del tubo con la solucin salina, agita uniformemente. 3.- En un portaobjetos limpio y seco, coloca una gota de muestra preparada en los pasos anteriores 4.-Coloca un cubreobjeto sobre la preparacin y observa en el microscopio con objetivo 40X y 60X MONTAJE EN SOLUCIN YODO LUGOL Utilizada para identificar en heces fecales Protozoos intestinales con sus organelos citoplasmticos 1.- En un portaobjetos limpio y seco, coloca una gota de solucin de yodo lugol 2.- Con un palillo de madera toma una pequea cantidad de muestra fecal y depostala en el portaobjetos mediante movimientos de rotacin y extendiendo la muestra por toda la gota En el paso No 2 Puedes utilizar la muestra salina preparada en el inciso C en lugar de la muestra de excremento en forma directa 3.-Coloca un cubreobjeto sobre la preparacin y observa en el microscopio

CUESTIONARIO:
1.- Que es poder de resolucin? 2.- Qu finalidad te proporciona el utilizar microscopio compuesto: ________________________-_______________________________________________________ ________________________________________________________________________________

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44 3.- Cul es la importancia que tiene el diafragma en el microscopio? ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ 4.- Qu tipo de bacterias pudiste observar en las muestras que se estudiaron ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ 5.- Qu importancia tiene el estudiar y observar los microorganismos en muestras biolgicas? ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ 6.- Escribe el nombre de cada una de las partes del microscopio compuesto

OBSERVACIONES.

Dibuja lo observado en los muestra que preparaste

diferentes objetivos para cada durante el experimento.

CONCLUSIONES
________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________

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TINCIN DE LA CPSULA BACTERIANA


Prctica No 9 Nombre Del Alumno:_________________________________Semestre______ Grupo_______ Nombre del titular_____________________________________Fecha____________________ Nombre del Profr. de Laboratorio_________________________________ Calif:___________

OBJETIVO
El alumno aprender diversas tcnicas para la tincin de la cpsula bacteriana en distintos cultivos bacteriolgicos.

MATERIAL
Cultivo de 24 horas de Klebsiella Rhinoscleromatis en Macconkey o citrato de simmons (puede aislarse del excremento seco de palomas) Cultivo de 24 horas de Staphylococcus aureus en manitol sal Agar (msa) Cepa de 24 horas en Agar Saboraud Cryptococcus neoformans. Tinta china ( recientemente filtrada) Frasco con mordente de Knaysi Frasco con rojo congo Frasco con mordente de cpsula

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INTRODUCCION
La cpsula bacteriana es una capa de material viscoso o mucoide. El tamao de estas cpsulas est influenciado por el medio en el que crece la bacteria. En algunos casos el grosor de la cpsula es slo una fraccin del dimetro de la clula, en otros casos la cpsula es mucho mayor que la clula. Las cpsulas bacterianas son importantes tanto para la bacteria como para otros organismos. A las bacterias les proporcionan una cubierta protectora y adems sirven de reservorio de alimento almacenado. Tienen Propiedad Antifagocitaria : Dificulta o impide la fagocitosis, lo cual potencia su virulencia ya que favorece la multiplicacin y facilita la invasin. Brinda Proteccin frente a Fagos.: Dificulta la fijacin de bacterifagos e impide el pasaje su pasaje que puedan afectar a la bacteria Las cpsulas de ciertas bacterias productoras de enfermedades aumentan la capacidad infectiva de las bacterias. Si la bacteria pierde totalmente su cpsula, puede perder su virulencia y por lo tanto su capacidad de producir enfermedad Algunos ejemplos de bacterias productoras de cpsulas son: neumococos, Klebsiella., aunque tambin puede estar presente en bacterias gram positivas y Gram. negativas Sin embargo las cpsulas tiene diversas propiedades como: Induce la produccin de anticuerpos protectores (esto es til en la produccin de algunas vacunas) y Permite la diferenciacin de tipos serolgicos dentro de la misma especie ya sea por aglutinacin con sueros

PROCEDIMIENTO
TINCION DE CPSULA A) METODO DE DUGUID 1.- Poner con el asa una gota pequea de tinta china en el centro de un portaobjetos limpio. 2.-Poner una gota de agua del mismo tamao junto a la gota de tinta china 3.- Tomar con el Asa bacteriolgica un pequeo fragmento del cultivo de bacterias 4.- Hacer una suspensin ( sin extenderla) en la gota de agua 5.- Mezclarla con la tinta china 6.- Colocar un cubreobjetos sobre la suspensin, evitando que queden burbujas 7.- Observar la preparacin al microscopio con el objetivo seco fuerte y de inmersin. La cpsula se observa como una zona brillante alrededor de la bacteria en un campo oscuro. B) METODO DEL ROJO CONGO 1.- Poner una gota pequea de rojo congo en el centro de un portaobjetos limpio 2.-Tomar con el asa bacteriolgica un pequeo fragmento de crecimiento de colonia bacteriana

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47 3.- Suspender la muestra en la gota de rojo congo y hacer un frotis 4.- cubrir el frotis ( SIN FIJARLO A LA FLAMA DEL MECHERO) con una gotas del mordente de cpsula y dejarlo actuar durante un minuto. 5.-Lavar el frotis con agua destilada y dejarlo secar al aire 6.- Observar la preparacin al microscopio con el objetivo de inmersin La cpsula se observa como una zona brillante alrededor de la bacteria de color rojo en un campo de azul oscuro.

CUESTIONARIO
1.- Qu importancia mdica tiene la cpsula bacteriana? ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ 2.-Qu caractersticas presenta la cpsula en las bacterias? ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ 3.- Qu importancia tiene la presencia de la cpsula en las bacterias? ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ 4.- Qu sucede con las bacterias cuando estas llegan a perder la cpsula? ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ 5.- Investiga de qu est compuesta la capa de material mucosa que forma la cpsula ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________

OBSERVACIONES
Dibuja lo que observaste en ambos objetivos indicados en la prctica con el microscopio compuesto

CONCLUSIONES:

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48 ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________

TINCIONES SELECTIVAS
Prctica No 10 Nombre Del Alumno:_________________________________Semestre______ Grupo_______ Nombre del titular_____________________________________Fecha____________________ Nombre del Profr. de Laboratorio_________________________________ Calif:___________

OBJETIVO
El alumno aplicar la tcnica de tincin especfica para lograr observar en el microscopio la pared celular y endoesporas en distintas muestras bacteriolgicas MATERIAL Cultivo de 12 a 18 horas de Bacillus Suptillus ( lacto bacilos) en Agar nutritivo y Agar sangre Cultivo de Bacillus cereus ( tierra contaminada y tratada a 80C por 10 minutos) en Agar nutritivo y Agar sangre Cultivo de 24 horas de Staphylococcus aureus en manitol sal Agar (msa)

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49 Solucin de cido fosfomolbdico ( 1%) Solucin acuosa de verde de metilo ( 1%) Verde malaquita ( solucin acuosa al 5%) Safranina ( solucin acuosa al 5% ) Portaobjetos Cubreobjetos Microscopio compuesto Asa bacteriolgica Mechero Bunsen

INTRODUCCIN
PARED CELULAR Debajo de las sustancias extracelulares tales como las cpsulas o capas mucosas y externas a la membrana citoplasmtica est la pared celular que es una estructura muy rgida y que da forma a la clula. El espesor de la pared celular oscila entre 10 y 35 nm, sin embargo algunas paredes celulares son considerablemente ms gruesas. Las paredes celulares bacterianas son esenciales para el crecimiento y la divisin. Todas las bacterias poseen paredes celulares rgidas que protegen a la clula de explotar en medios de baja presin osmtica. Composicin qumica de las paredes celulares.- Los peptidoglicanos proporcionan a la pared celular una estructura rgida. Estos grandes polmeros, estn compuestos de tres clases de bloques estructurales: N- AcetilGlucosamina, cido N- Acetil-Murmico y un pptido que consta de cuatro o cinco aminocidos que son: L- alanina, D-Alanina, _D-cido Glutmico y Lisina. Adems contiene protenas con polisacridos, lipoprotenas y lipopolisacridos Propiedades y Funciones: 1= Brinda proteccin y resistencia a la bacteria frente a los posibles cambios de presin osmtica del medio en el que se encuentra y a la accin de ciertos agentes externos.2= Presenta Poros que actan como filtros, permitiendo el pasaje de agua y metabolitos esenciales.3= Presenta antgenos de tipo y grupo especficos.4= Participa en la divisin (multiplicacin) bacteriana (se invagina junto con la membrana plasmtica)5= En las bacterias Gram .negativas tiene poder patgeno debido a que presenta endotoxinas (Lpido A).6= Es el sustrato donde actan los - Lactmicos y otros antimicrobianos. La tincin para la pared celular se aprovecha del hecho de que los contenidos citoplasmticos se pueden hidrolizar diferencialmente con cido fosfomolbdico, dejando la pared sin afectar. Despus de teir se puede observar la pared celular con citoplasma como ahuecado ESPORAS Son elementos de reproduccin y/o de resistencia a un medio adverso que presentan algunas bacterias , especialmente del gnero bacilar. Su forma, tamao y ubicacin vara segn la especie. Estos cuerpos son producidos en el ltimo estado del crecimiento celular, que bajo condiciones apropiadas, germinan y producen la clase original de clula en crecimiento o vegetativa.

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50 Las esporas son resistentes a muchos agentes qumicos y fsicos. Hesiten dos tipos de esporas: Endosporas : espora presente en el interior de la bacteria. Destinada a germinar originando la forma vegetativa de la que deriva. Es un cuerpo de pared gruesa muy refringente y sumamente resistente. Son producidas por especies Bacillus, clostridium y Sporosarcina. Las endoesporas resisten las condiciones ambientales adversas de desecacin, calor y mal suministro de nutrientes ( agentes qumicos como desinfectantes) Exosporas : esporo que permanece libre en el ambiente, constituyendo la forma de resistencia bacteriana ante condiciones adversas o desfavorables (nutricin, desecacin, temperatura, presencia de agentes qumicos, presiones, etc.)

PROCEDIMIENTO
A) TINCIN DE LA PARED CELULAR 1.- Prepara un frotis hmedo relativamente concentrado de Bacillus Suptillus sobre un portaobjetos limpio . NO LO FIJES A LA FLAMA. Prepara otro con B. cereus 2.-Antes de que la suspensin bacteriana se seque sobre el portaobjetos, adicinale la solucin del cido fosfomolbdico cubrindola por completo. 3.- Djalo reaccionar 4 minutos. 4.- Inclina completamente el portaobjetos sobre el fregadero para eliminar totalmente el cido fosfomolbdico 5.-Agrega el verde de metilo directamente sobre el frotis hmedo y djalo reaccionar 5 minutos. 6.- Lava suavemente en la llave. Es inevitable que al lavar en la llave, algo del material se desprenda del frotis, trata de minimizar el desprendimiento pero al mismo tiempo lava bien, hasta que el agua ya no arrastre colorante. 7.- Seca al aire y despus examina con aceite de inmersin 8.- Si se ti correctamente, las paredes celulares aparecern de verde oscuro o azul, mientras que el citoplasma se ver de un verde claro o incoloro. TINCIN DE LA PARED CELULAR (TCNICA DE KNAYSI) 1.- Hacer un frotis de Bacillus subtilis en la forma usual y fijarlo con calor. Prepara otro con Bacillus cereus 2.- Cubrir el frotis con mordente de Knaysi y dejarlo actuar durante 10 minutos. 3.- Lavar la preparacin con agua 4.- Colocar con el asa bacteriolgica una gota de fuscina fenicada sobre la preparacin. 5.- Poner un cubreobjetos sobre la preparacin y observar al microscopio con el objetivo de inmersin. La pared celular se observa de color rojo intenso alrededor de la bacteria, cuyo citoplasma se ve de un color rosa o rojo tenue.

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51 A) TINCIN DE ESPORAS ( TCNICA DE SHEAFFER Y FULTON) 1-Prepare un dos extendidos del microorganismo aislado del cultivo de microorganismo uno de Bacillus Suptillus y otro de Bacillus cereus 2-Fijar por calor y cubrir todo el portaobjeto con una solucin de verde de Malaquita. 3-Calentar hasta emisin de vapores y seguir dicho calentamiento durante 3 minutos (no permitir que se seque el colorante. Si esto ocurriera, agregar colorante, sobre el preexistente y no sobre la parte seca, hasta cubrirlo nuevamente.) 4-Lavar con agua y cubrir con solucin de Safranina. Dejar actuar 30 segundos. Lavar con agua, secar y observar con objetivo de inmersin. 5-Informar: morfologa, color y tipo de espora. El colorante Verde malaquita: capaz de teir las esporas en caliente.. La Safranina: colorante de contraste que tie las formas vegetativas. Las endosporas, tras la primera tincin, no perdern el colorante en el lavado con agua, y s lo harn las formas vegetativas, que quedarn teidas con el segundo colorante TINCIN DE ESPORAS ( TCNICA DE COLORACIN DE GRAM) 1.- Hacer un frotis de B.suptilis de la forma usual y otra de B. cereus 2.- Teir con la coloracin de Gram 3.-Observar al microscopio con el objetivo de inmersin las esporas se pueden observar sin teir o si se encuentra dentro del bacilo, la espora no se tie y el citoplasma se ve de color morado

Localizacin y morfologa de las esporas en Bacillus

CUESTIONARIO
1.- Menciona dos funciones que tiene la pared celular en las bacterias ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ 2.-Cules son los principales compuestos orgnicos de las paredes celulares?

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52 _______________________________________________________________________________ 3. Qu caracterstica y que color tieron las paredes celulares de las bacterias que lograste observar? _______________________________________________________________________________ 4.- Investiga las diferencias de la pared celular de las bacterias Gram positivas y Gram negativas _______________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________________ 5.- Describe dos diferencias para distinguir a una endospora de una exospora _______________________________________________________________________________ 6. Qu caracterstica y que color tieron las esporas observadas en las distintas muestras microbiolgicas? ______________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ 7.- Menciona algunos microorganismos capaces de producir esporas ________________________________________________________________________________

OBSERVACIONES
Dibuja las estructuras celulares que lograste observar con el objetivo de inmersin

CONCLUSIONES

________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________

TINCIN DE GRAM
Prctica No 11

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53 Nombre Del Alumno:_________________________________Semestre______ Grupo_______ Nombre del titular_____________________________________Fecha____________________ Nombre del Profr. de Laboratorio_________________________________ Calif:___________

OBJETIVO
El alumno aplicar una tcnica de coloracin diferencial para la identificacin de bacterias Gram positivas y Gram negativas..

MATERIAL
Asa de platino coli Microscopio aureus Porta objetos albicans Aceite de inmersin autoclave SUSTACIAS COLORANTES Colorante violeta cristal de Gram Solucin decolorante alcohol acetona Safranina de Gram Yodo de Gram o lugol para gram Cultivos de Escherichia Cultivo de Staphylococcus Cultivo de Cndida Esputo de tuberculoso procesado en

INTRODUCCIN TINCION DE GRAM.


Tincin empleada en microbiologa para la visualizacin de bacterias en muestras clnicas. Tambin se emplea como primer paso en la diferenciacin bacteriana. El examen con microscopio ptico de preparacin con tincin de Gram se emplea de rutina para determinar la forma de las bacterias. Las formas comunes son cocos ( esfricas), bacilos (alargadas) y formas espiraladas Las bacterias pueden diferenciarse con esta tincin en dos grupos. Los microorganismos Gram. positivos se tien de azul, mientras que aproximadamente un tercio de los cocos, la mitad de los bacilos y todos los organismos espira lados se tien de rojo y se dice que son gramnegativos. Las aplicaciones ms comunes de la coloracin de Gram son las siguientes:

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54 La presencia de cocos grampositivos agrupados sugiere estafilococos; en cadenas sugiere estreptococos; en forma de lanceta a los diplococos La presencia de diplococos gramnegativos son caractersticas de especies de Neisseria Los bacilos Gram. positivos grandes sugieren especies de Bacillus o clostridium, los bacilos Gram. positivos pequeos sugieren especies de Listeria o una de las corineiformes ( difteroides) Los bacilos Gram. negativos son las bacterias mas comunes halladas en los laboratorios clnicos e incluyen a Enterobacteriaceae, bacilos no fermentados y especies de Haemophilus. El valor diagnstico de esta tincin es variable; normalmente permite una buena orientacin al microbilogo para seleccionar las tcnicas de cultivo ms adecuadas y tambin tiene valor en orientar hacia un diagnstico etiolgico, en especial para instaurar un tratamiento inicial.

PROCEDIMIENTO REALIZACIN DEL FROTIS


1. Colocar una pequea gota de agua en el centro de un portaobjetos limpio. Es necesaria muy poca cantidad de agua, por lo que se puede usar el asa de siembra, ya que en el extremo curvo de su filamento queda retenida una mnima gota de agua, que resulta suficiente. 2. Flamear el asa de siembra, tomar, en condiciones aspticas, una pequea cantidad del cultivo bacteriano en medio slido y transferirlo a la gota de agua. Remover la mezcla con el asa de siembra hasta formar una suspensin homognea que quede bastante extendida para facilitar su secado. Si la muestra se toma de un cultivo en medio lquido, no es necesario realizar los dos primeros pasos ya que basta con colocar y extender una gota de la suspensin bacteriana, que se toma con el asa de siembra, directamente sobre el portaobjetos. 3. Esperar hasta que el lquido se evapore o acelerar su evaporacin acercando el porta a la llama del mechero. En este caso hay que tener mucha precaucin de no calentar demasiado el porta pues las clulas pueden deformarse o romperse. A) TINCIN DE GRAM 1. Realiza la preparacin del frotis bacteriano como se explic en el paso anterior 2. Teir con cristal violeta 1min. 3. Lavar con abundante agua el exceso de colorante. 4. Cubrir con Lugol 1min. 5. Lavar con agua el exceso de Lugol. 6. Decolorar con alcohol-acetona o simplemente con alcohol hasta que la preparacin deje de perder color (30seg) 7. Lavar con abundante agua para eliminar el resto de disolvente.

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55 8. Teir con safranina 1min. 9. Lavar con agua para eliminar el colorante de contraste. 10. Secar la preparacin. 11. Examinar al microscopio con aceite de inmersin y fijndose sobre todo en el color de cada preparacin.

CUESTIONARIO
1.- Qu es un frotis? ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ 2.- Con qu finalidad se fija la muestra de microorganismos en el porta objetos? _____________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ ___ 3.-Qu importancia tiene teir las muestras bacterianas? ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ 4.- Por qu es necesario emplear aceite de inmersin para la observacin de los microorganismos? ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ 5.-De los reactivos que utilizaste para la tincin de Gram, cul es el que funciona como colorante primario? ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ 6.-Qu funcin tiene el Yodo en la tincin de Gram? ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ 7.-Qu coloracin tien las bacterias Gram positivas? ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ 8.- Qu coloracin tien las bacterias Gram. negativas?

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9.- Menciona tres bacterias que tien Gram positivas y escribe la enfermedad que causa cada una de ellas ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ 10.- Menciona tres bacterias que tien Gram negativas y escribe la enfermedad que causa cada una de ellas. ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________

OBSERVACIONES:
Realiza los dibujos y esquemas correspondientes a las tinciones realizadas

CONCLUSIONES:
________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________

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TINCIN CIDO-ALCOHOL RESISTENTE


Prctica No 12 Nombre Del Alumno:_________________________________Semestre______ Grupo_______ Nombre del titular_____________________________________Fecha____________________ Nombre del Profr. de Laboratorio_________________________________ Calif:___________

OBJETIVO:
El alumno aplicar las tcnicas de coloracin de microorganismos cido-resistentes para diferenciarlos e identificarlos, en base a sus propiedades morfolgicas

MATERIAL:
*Un cultivo de 72 horas de mycobacterium. Si es posible se les facilitar un esputo de tuberculoso procesado en autoclave. * Un cultivo de 24 horas de streptococcus

REACTIVOS
* Fucsina de Ziehl- Neelsen * Azul de metileno * Alcohol acidulado

INTRODUCCIN
Los microorganismos pertenecientes al gnero Mycobacterium se caracterizan por tener una pared celular completamente diferente a las restantes bacterias. La pared de las Mycobacterias posee un alto contenido de lpidos que la hace impermeable a los agentes hidroflicos, por lo tanto estos microorganismos no se tien adecuadamente con los reactivos utilizados en la coloracin de Gram y no pueden ser clasificados como Gram positivos o negativos. Las Mycobacterias son teidas adecuadamente por el mtodo de Ziehl-Neelsen (Tincin cido-Rpida o Acid-Fast Stain) que utiliza como solucin decolorante una mezcla de etanol y cido clorhdrico. Son bacilos

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58 cido-alcohol resistentes por lo que la tincin de Zieh1Neelsen es til para la coloracin de estos microorganismos obtenidos de muestras clnicas o de cultivo. Con esta tincin, los bacilos aparecen de color rojo brillante sobre un fondo azul. Los bacilos tuberculosos son difciles de teir con la tincin de Gram, y se observan como bacilos gram positivos con tincin irregular. Estos microorganismos una vez coloreados son resistentes a la decoloracin cidoalcohlica y por eso se denominan Bacilos cido Alcohol Resistentes (BAAR). El gnero Mycobacterium incluye ms de 100 especies que pueden clasificarse en seis grupos desde el punto de vista bacteriolgico, pero con fines didcticos se dividen en tres apartados: Complejo tuberculosis. Incluye las especies M. tuberculosis, Mycobacterium bovis (incluida la cepa BCG) y Mycobacterium africanum, productoras todas ellas de tuberculosis. Se incluye tambin Mycobacterium microti, productor de tuberculosis en rata Complejo lepra. En el que se incluyen las especies M. leprae, productor de la lepra humana, y Mycobacterium lepraemurium, que produce lepra en roedoresel. El Mycobacterium leprae que es un parsito intracelular obligado que se multiplica lentamente en clulas fagocitarias mononucleares como los histiocitos de la piel y en las clulas de Shwan de los nervios Otras Micobacterias. Micobacterias no comprendidas en los dos grupos anteriores. Slo algunas de ellas suelen ser patgenas, otras pueden ser patgenas oportunistas y finalmente otras suelen ser saprofitas. Producen las denominadas micobacteriosis las infecciones producidas por M. avium, M. kansakii, M. fortuitum y M. chelonei son consideradas oportunistas y no tuberculosas

PROCEDIMIENTO
1. Prepara un frotis bacteriano. Haciendo un delgado extendido del material para su estudio y permitir que se seque al aire. 2. Fijar el frotis con calor, evitar que hierva 3. Cubrir la preparacin con carbofucsina. o fuscina fenicada 4. Calentar la preparacin en un mechero Bunsen durante 5 min. No debe hervir. Si se evapora, se aade ms carbofucsina para que no se seque en ningn momento. 5. Lavar con agua el resto de colorante. 6. Decolorar con la mezcla cido-alcohol. Hasta que solo permanezca un tenue color rosa. 7. Lavar con agua para que no prosiga la decoloracin. 8. Teir con azul de metileno 1 min. 9. Lavar con agua el resto de colorante. 10. Secar la preparacin. 11. Examinar al microscopio. Con objetivo de inmersin por 100 X ( aceite) La tincin es positiva para bacilos rojos contra un fondo azul claro

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CUESTIONARIO
1.- Qu Clasificacin de bacterias pueden ser encontradas en este tipo de tincin? ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ 2.- Qu otro nombre recibe la tincin cido- alcohol- resistente? ________________________________________________________________________________ 3.- Qu coloracin se tien las bacterias bacilares en la tincin cido- alcoholresistente que da como resultado la reaccin positiva? ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ 4.-Qu funcin tiene el alcohol en la tcnica de tincin? ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ 5.-Qu especies de Mycobacterium son los causantes de la tuberculosis? ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ 6.- Qu especie de Mycobacterium es el responsable de la lepra? ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________

OBSERVACIONES:
Haz un esquema de los pasos que realizaste durante la realizacin de la prctica, as como el dibujo de las bacterias bacilares observadas en el microscopio.

CONCLUSIONES:

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EFECTO DE LA PRESIN OSMTICA SOBRE LA VIABILIDAD Y EL CRECIMIENTO DE LOS MICROORGANISMOS


Prctica No 13 Nombre Del Alumno:_________________________________Semestre______ Grupo______ Nombre del titular_____________________________________Fecha____________________ Nombre del Profr. de Laboratorio_________________________________ Calif:___________

OBJETIVO:
El alumno manejar las tcnicas para observar el efecto de la presin osmtica que ejerce el Cloruro de sodio y la Sacarosa sobre el crecimiento microbiano

MATERIAL:
3 Tubos de 16X 150 . En cada uno 10 ml de caldo nutritivo adicionado con: 2ml de cloruro de sodio al 1%, 2ml de cloruro de sodio al 10%, 2ml de cloruro de sodio al 20% 3 Tubos de 16X 150. En cada tubo 10 ml de caldo nutritivo adicionado con: 2ml de Sacarosa al 1%, 2 ml de Sacarosa al 10%, 2 ml de Sacarosa al 20% Nefelmetro de Mac Farland Pipetas de 5 ml , y de 1 ml estriles

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61 Agua destilada estril CEPAS: Escherichia Coli Staphylococcus aureus Klebsiella pneumoniae INTRODUCCIN: A) PRESIN: La osmosis es la difusin a travs de una membrana semipermeable que separa a dos soluciones con distintas concentraciones de sustrato. El proceso tiende a igualar la concentracin de soluto a ambos lados de la memoran. Cuando a ciertas clulas bacterianas se les suspende en una solucin que contiene una concentracin elevada de cloruro de sodio (20%), el agua pasar desde la regin de menor concentracin de sustancia disuelta ( el interior de la clula tiene una baja concentracin salina) a travs de la membrana citoplasmtica que es semipermeable a la solucin que rodea a la clula. As la clula se deshidrata producindose plasmlisis. Si las bacterias se colocan en una solucin que contiene menos del 1% de cloruro de sodio, el flujo de agua se invertir, es decir ocurrir la difusin, ya que fluir el agua desde la solucin externa al interior de la clula y originar la plasmotipsis. Dentro de la clula se establece una presin osmtica a causa de la gran cantidad de agua que se acumula all, esta presin har que se hinchen e incluso las clulas pueden reventar. El mecanismo de inhibicin microbiana es la plasmlisis: las clulas se deshidratan y por lo tanto Son incapaces de metabolizar o crecer, pueden morir o permanecer vivas pero en condiciones durmientes. Sin embargo tambin existen microorganismos que requieren altas concentraciones salinas y son denominadas halfilos, y los que requieren presiones osmticas elevadas se les conoce como osmfilos. La mayor parte de las bacterias pueden tolerar una amplia gama de presiones osmticas externas y fuerzas inicas debido a su capacidad de regular la osmolaridad interna y la concentracin inica. La osmolaridad est regulada por el transporte activo de iones potasio al interior de la clula A) En medios hipotnicos (con una aw>aw del citoplasma) es la pared celular la que ejerce todo el papel: su rigidez se opone a la entrada de agua, y por lo tanto, evita que la membrana citoplsmica tienda a sufrir una presin de turgor excesiva. B) En medios hipertnicos (cuando la aw del exterior es menor que la del citoplasma). Las bacterias poseen mecanismos compensatorios por los que tienden a aumentar la osmolaridad interior por encima de la del medio (para garantizar la entrada de agua del ambiente y mantener su metabolismo). Ello se logra esencialmente aumentando la concentracin de un soluto muy soluble en agua en el interior celular, soluto llamado genricamente soluto compatible, lo cual se puede lograr por varios posibles mecanismos: AGARES * Agar sangre * Agar Nutritivo * Caldo nutritivo

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62 bombeando iones al interior; sintetizando una molcula orgnica osmticamente activa; bombeando sustancias osmoprotectoras.

PROCEDIMIENTO:
PREPARACIN DE LA CEPA A ESTUDIAR Suspender la cepa bacteriana en agua destilada logrado obtener una turbiedad del No 10 del nefelmetro de Mac- Farland. En caso de no tener el nefelmetro solo cuidar la turbiedad a manera de suspensin. A) EFECTO DEL CLORURO DE SODIO 1.- Colocar en una gradilla en orden creciente de concentracin una serie de 3 tubos con 10 ml cada uno con caldo nutritivo y adiciona 2 ml de cloruro de sodio con las distintas concentraciones ( al 1%, 10% y 20 % de NaCl) 2.-Rotularlas de acuerdo a la concentracin y nombre de la cepa que se va a inocular en ellos 3.- Inocular en cada tubo 0.l ml de la suspensin bacteriana correspondiente 4.- repetir los pasos del 1 al 4 para cada cepa proporcionada 5.- Incubar los tubos a 37C durante 24- 48C6.- Homogenizar el cultivo y leer el resultado de cada tubo en base a su turbiedad, comparndola con las ampolletas del nefelmetro de Mac- Farland

B) EFECTO DE LA SACAROSA 1.- Colocar en una gradilla en orden creciente de concentracin una serie de 3 tubos con 10 ml cada uno con caldo nutritivo y adiciona 2 ml de sacarosa con las distintas concentraciones ( al 1%, 10% y20% de Sacarosa) 2.-Rotularlas de acuerdo a la concentracin y nombre de la cepa que se va a inocular en ellos 3.- Inocular en cada tubo 0.l ml de la suspensin bacteriana correspondiente. 4.- repetir los pasos del 1 al 4 para cada cepa proporcionada. 5.- Incubar los tubos a 37C durante 24- 48C. 6.- Homogenizar el cultivo y leer el resultado de cada tubo en base a su turbiedad, comparndola con las ampolletas del nefelmetro de Mac- Farland.

CUESTIONARIO:
1.- Cmo se define la smosis? ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ 2.- Qu es plasmlisis y cuando ocurre?

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63 ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ 3.- Qu sucedi con las bacterias al incrementar la concentracin del NaCl y sacarosa en los distintos caldos nutritivos? ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ 4.- Qu nombre reciben las bacterias que soportan grandes presiones osmticas? ________________________________________________________________________________ 5.- Quin es el responsable en la clula bacteriana controlar la presin en medios hipotnicos? ________________________________________________________________________________ 6.- Cundo se establece un medio hipotnico? ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ 7.- Cundo se establece un medio hipertnico? ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________

RESULTADOS:
Anota los resultados del efecto del cloruro de sodio y de la sacarosa sobre el crecimiento, indicando el nmero de ampolleta del nefelmetro a que corresponda dicho crecimiento. En caso de no contar con el Nefelmetro registra a manera de cruces dicho crecimiento bacteriano
CEPAS E.COLI S.AUREUS K.PNEUMONIAE CEPAS EFECTO DE LA PRESIN OSMTICA 1% NaCl 10% NaCl 20% NaCl

EFECTO DE LA PRESIN OSMTICA 1% 10% 20% Sacarosa sacarosa Sacarosa

E.COLI S.AUREUS K.PNEUMONIAE

OBSERVACIONES

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64 Dibuja a manera de esquema los pasos realizados en la elaboracin de la prctica, as como los resultados obtenidos despus del tiempo de incubacin.

CONCLUSIONES:
________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________

DETERMINACIN DEL TIEMPO Y PUNTO TRMICO MORTAL EN MICROORGANISMOS


Prctica No 14 Nombre Del Alumno:_________________________________Semestre______ Grupo_______ Nombre del titular_____________________________________Fecha____________________ Nombre del Profr. de Laboratorio__________________________________ Calif:__________

OBJETIVO
El alumno aplicar un mtodo que le permitir conocer la temperatura y el tiempo mnimos necesarios para esterilizar una suspensin, as como el efecto que tienen diferentes diluyentes sobre dichas determinaciones.

MATERIAL

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65 Tubos de 13 X 100 estriles Pipetas de 5 ml estriles Pipetas de l ml estriles Cajas de Agar Nutritivo o Agar sangre Baos mara a 37C, 70C, y ebullicin Tubos de ensaye con 1 ml de pur de tomate, jugo de naranja y agua destilada CEPAS Escherichia coli Staphylococcus aureus Klebsiella Pneumoniae

INTRODUCCIN:
Diferentes especies microbianas varan ampliamente en sus fluctuaciones de temperatura ptima para su desarrollo: Las llamadas psicrfilas crecen mejor a temperaturas bajas (15 a 20C), las formas mesfilas lo hacen mejor de 30 a 37C, la mayor parte de la termfilas entre 50C y 60C. La mayor parte de los microorganismos son mesfilos, 30C es la temperatura ptima para muchas de las formas de vida libre y la temperatura del husped es ptima para los simbiontes de los animales de sangre caliente. El lmite superior de temperatura tolerada por cualquier especie se correlaciona bien con la estabilidad trmica general de las protenas de dicha especie. Los microorganismos comparten con los vegetales y los animales la respuesta al choque por calor, una sntesis de protenas por el calor cuando son expuestos a una elevacin sbdita en la temperatura por arriba de la ptima para el crecimiento. Al parecer estas protenas son resistentes al calor y estabilizan a las protenas de la clula sensible al calor. Las bacterias tambin exhiben fenmeno denominado choque por fro, sea la muerte de las clulas por un enfriamiento rpido, en oposicin a uno lento. Por ejemplo, el enfriamiento rpido de la escherichia coli desde 37C a 5C puede matar al 90% de las clulas EFECTO LETAL DEL CALOR. Al subir la temperatura por encima de la temperatura mxima de crecimiento, se dejan sentir los efectos sobre la viabilidad: la prdida de viabilidad significa que las bacterias dejan de ser capaces de crecer y dividirse. La muerte se debe a la destruccin o inactivacin irreversible de una molcula o estructura esencial (como p. ej. el ADN cromosmico o por creacin de un dao irreparable en la membrana). Cmo podemos caracterizar o medir en la prctica la inactivacin por calor de una suspensin bacteriana? He aqu algunos parmetros utilizados: tiempo trmico mortal: es el tiempo mnimo requerido para que mueran todas las bacterias de una determinada suspensin a una determinada temperatura;

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66 tiempo de reduccin decimal: es el tiempo requerido para reducir al 10% la densidad de la suspensin, a una determinada temperatura (tambin llamado valor D); punto trmico mortal: es la temperatura mnima que mata a todas las bacterias en un tiempo determinado (normalmente el tiempo de referencia empleado es de 10 min).

PROCEDIMIENTO
A) PREPARACIN DE LAS SUSPENSIONES MICROBIANAS 1.- Adicionar agua destilada a cada cepa que se va a estudiar cuidado de que quede turbia a manera de suspensin. 2.- Colocar 1 ml de jugo de naranja en un tubo de 13 X 100, 1 ml de Agua destilada en otro tubo de 13X100 y 1 ml de pur de tomate en otro tubo de 13 X 100. Ser necesario rotularlos. 3.- transferir 1 ml de la suspensin bacteriana preparada a cada tubo B) DETERMINACIN DEL PUNTO TERMICO MORTAL (PTM) 1.- Colocar en una gradilla una serie de 4 tubos de 13 X 100 para cada tipo de bacteria a estudiar 3.- Marcar cada tubo con el nombre de la cepa que se va a estudiar. 4.- Anotar en cada tubo las temperaturas siguientes testigo, 37C, 70C, y ebullicin 5.- Colocar en cada tubo 0.5 ml de la suspensin bacteriana que preparaste con agua, jugo de naranja y pur de tomate a tratar 6.- Calentar la suspensin a la temperatura indicada en un bao mara durante 10 minutos ( el tubo testigo NO SERA CALENTADO) 7.- Vaciar el contenido de cada tubo en la superficie de una placa de Agar nutritivo y Homogeneizar por rotacin sobre la mesa o mediante extensin con varilla de vidrio doblada a 90 grados 8.- Incubar a 39:C durante 24- 48 horas 9.- Observar si hay crecimiento. C) DETERMINACIN DEL TIEMPO TRMICO LETAL(TTL) 1.- Colocar en una gradilla una serie de 4 tubos de 13 X 100 para cada tipo de bacteria a estudiar 2.- Marcar cada tubo con el nombre de la cepa que se va a estudiar 3.- Anotar en cada tubo los tiempos que se indican a continuacin: Testigo, 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos 4.- colocar en cada tubo 0.5 ml de la suspensin bacteriana que preparaste con agua, jugo de naranja y pur de tomate a estudiar 5.- Calentar en bao mara a 70C para todos los tubos y respetando los tiempos indicados ( el tubo testigo NO SE CALIENTA)

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67 6.- Vaciar el contenido de cada tubo sobre la superficie de una placa de Agar nutritivo y homogeneizar por rotacin sobre la mesa o extensin con varilla de vidrio doblado a 90 grados 7.- Incubar las placas a 37C durante 24- 48 horas 8.- Observar si presenta o no crecimiento

CUESTIONARIO:
1: Qu caractersticas presentan las bacterias llamadas psicrfilas? ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ 2.- A qu temperatura crecen las bacterias mesfilas? ________________________________________________________________________________ 3.- Qu sucede con las protenas en la clula bacteriana cuando se aplica un cambio brusco en la temperatura ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ 4.- En qu consiste el tiempo trmico letal? ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ 5.- En qu consiste el punto trmico mortal? ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ 6.- A qu temperatura se reporta el punto trmico mortal para las bacterias estudiadas en los distintos diluyentes? ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ 7.- Qu muestras despus de la incubacin reporta el tiempo ptimo para la destruccin de las bacterias en los distintos diluyentes? ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________________

RESULTADOS:
Completa las siguientes tablas despus del tiempo adecuado y temperatura de incubacin para los distintos medios. A) PUNTO TERMICO MORTAL (PTM)

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68 Cepas E. coli Agua Jugo de Naranja Pur de tomate S. aureus Agua Jugo de Naranja Pur de tomate K.pneumoniae Agua Jugo de Naranja Pur de tomate Testig 37 70C Ebulli o C c. Testig 37 70C Ebulli o C c. Diluyente Crecimiento despus de calentar Testig 37 70C Ebulli o C c.

B) TIEMPO TRMICO LETAL(TTL) Cepas E. coli Agua Jugo de Naranja Pur de tomate S. aureus Agua Jugo de Naranja Pur de tomate K.pneumoniae Agua Jugo de Naranja Pur de tomate Testig 37 70C Ebulli o C c. Testig 37 70C Ebulli o C c. Diluyente Crecimiento despus de calentar Testig 5 15mi 30 o min n min.

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OBSERVACIONES:
Dibuja los pasos que seguiste para la realizacin de la prctica

CONCLUSIONES: ____________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ ___________________________________________________________________

INHIBIDORES BACTERIANOS
Prctica No 15 Nombre Del Alumno:_________________________________Semestre______ Grupo_______ Nombre del titular_____________________________________Fecha____________________ Nombre del Profr. de Laboratorio_________________________________ Calif:___________

OBJETIVO: El alumno manejar algunas tcnicas para poner de manifiesto la actividad de los antibiticos sobre el crecimiento microbiano.

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70 MATERIAL: Cajas de petri con medios de cultivo Muller-Hinton, o Agar nutritivo Asa bacteriolgica Mechero Fisher Sensidiscos ( antibiogramas) Fenol al 5% SUSTANCIAS BIOLGICAS Cultivo de en caldo nutritivo de 24 horas de Bacillus subtilis ( lact bacilos) Cultivo de 24 horas Staphylococcus aureus en manitol sal Agar (msa) Cultivo de 24 horas de Escherichia Coli en medio Macconkey

INTRODUCCIN:
ANTIBITICOS Son sustancias capaces de destruir y eliminar los microorganismos causantes de una infeccin producida por bacterias (faringitis, bronquitis, otitis, neumona, amigdalitis, etc). No son eficaces cuando la infeccin es producida por virus (gripe). Cada tipo de antibitico ser efectivo para destruir una clase de microorganismos en funcin de su modo de actuacin..Se les llama antibiticos de amplio espectro a los que son efectivos frente a un gran nmero de agentes microbianos: los microorganismos causantes de la infeccin son capaces de desarrollar resistencias al antibitico de manera que este no ser eficaz para eliminarlos. Cada ao se investiga creando nuevos antibiticos eficaces para las formas microbianas resistentes a sus anteriores tratamientos. Se deben usar siempre bajo prescripcin mdica. Existen pruebas (antibiogramas) que determinan el antibitico ms eficaz para cada infeccin, pero normalmente se sigue un protocolo de actuacin de los antibiticos de eleccin para cada tipo de infeccin. Es el mdico el profesional que juzga la infeccin existente y el antibitico eficaz para su tratamiento. Los antibiticos siempre se deben tomar bajo prescripcin mdica y cumplir el tratamiento completo. El incumplimiento del tratamiento puede dar lugar a recadas que precisarn el tratamiento con otro tipo de antibitico por haber desarrollado resistencia al primero. MODO DE ACCION DE LOS ANTIBITICOS 1.- Inhibicin de la sntesis de la pared celular. 2.- Alteracin sobre la membrana citoplsmica. 3.- Inhibicin de la sntesis proteica.4.- Bloqueo de la sntesis de los cidos nucleicos.

ANTIBIOGRAMAS
Para estudiar la sensibilidad de un microorganismo por tcnicas de difusin se dispone de dos sistemas, el de discos de papel impregnados con el

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71 antibitico y las tabletas, consistentes en una suspensin del antibitico liofilizada y comprimida en material inerte. Los fabricantes recomiendan conservar los discos a 20 C para largos periodos o entre 2 y 8 C si se utilizan en el plazo de una semana. Por el contrario, las tabletas se han considerado ms estables, pudindose almacenar a temperatura ambiente y manteniendo su actividad ms tiempo que los discos .Por lo que respecta a la temperatura de conservacin, al comparar para cada antibitico los dimetros de los halos de inhibicin de los discos conservados entre 4 y 6 C con los conservados a temperatura ambiente no se encontraron diferencias significativas a lo largo de todo el estudio; tampoco se encontraron diferencias al comparar los halos de las pastillas conservadas entre 4 y 6 C con las conservadas a temperatura ambiente, de modo que tanto los antibiticos que permanecieron estables durante el tiempo del estudio como los que disminuyeron su actividad lo hicieron de modo paralelo a ambas temperaturas

PROCEDIMIENTO:
A) PREPARACIN DE LAS SUSPENSIONES MICROBIANAS Suspender la cepa bacteriana en agua destilada logrado obtener una turbiedad del No 10 del nefelmetro de Mac- Farland. En caso de no tener el nefelmetro solo cuidar la turbiedad a manera de suspensin. B) ACTIVIDAD DE LOS ANTIBITICOS EN DISCO 1.- Marcar 2 placas Muller-Hinton, o Agar nutritivo con el nombre de la cepa S.aureus y otra con el nombre de K.pneumoniae. 2.- Tomar con un hisopo diferente las muestras que fueron preparadas en el inciso A de este procedimiento y sembrar las placas rotuladas 3.- Quemar el hisopo y desecharlo. 4. Colocar un multidisco o discos individuales sobre las placas y presionar ligeramente los discos contra la gelosa 5.-Incubar las placas a 37C durante 24 horas 6.- Medir el dimetro de los halos de inhibicin del crecimiento producidos por cada antibitico y notar los resultaos C) DETERMINACIN DE INHIBIDORES EN LA LECHE 1.- Preparar el medio de cultivo de la siguiente forma: -Preparar medio de cultivo Muller-Hinton, o Agar nutritivo, esterilizarlo y enfriarlo a 40C - Aadir 0.5 ml de B. Subtilis obtenido de un cultivo de 24 horas en caldo nutritivo en una caja de petri esterilizada - Vaciar 15 ml del medio de cultivo ya enfriado a 40C. Distribuir en forma homognea - Dejarlo que solidifique. 2.- Tomar una muestra de leche y calentar a bao Mara a 80C durante 3 minutos exactamente, enfriar bruscamente la leche en un bao con hielo

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72 3.- Impregnar un disco de papel filtro con la leche fra, secarlo ligeramente y con unas pinzas esterilizadas depositarlos en el centro de una caja de petri preparada anteriormente 4.- Incubar la placa de 18 a 20 horas a 37C y observar las zonas de inhibicin causadas por los antibiticos sobre el B. Subtilis. 5.- Si la muestra de leche contiene antibiticos, alrededor del disco se formar un halo, el cual indica la inhibicin de microorganismos y presencia de antibiticos en concentraciones superiores a las permitidas

CUESTIONARIO
1.- Qu funcin tiene lo antibiticos? ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ 2.-Qu son los antibiogramas y cul es su funcin? ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ 3.-Menciona dos causas del porque los microorganismos pueden llegar a hacerse resistentes a los antibiticos? ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ 4.-En caso de no tener Sensidiscos en el laboratorio: cmo puedes fabricarlos? ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ 5.-Escribe dos Fuentes naturales de donde se puedan obtener los antibiticos ________________________________________________________________________________ 6.-Segn los resultados de tu prctica . Qu medicamentos puedes utilizar para destruir y eliminar a los microorganismos como: Staphylococcus y Escherichia Coli? ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ 7.- Investiga qu tipo de enfermedades pueden ocasionar los microorganismos estudiados en la prctica ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ 8.-Existi inhibicin de microorganismos y presencia de antibiticos superiores a las permitidas en la leche que estudiaste?________por qu? ________________________________________________________________________________

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OBSERVACIONES
Realiza los dibujos de incubacin los resultados obtenidos a las 24 horas de

CONCLUSIONES
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