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Practicas Nº 2 y 3

“Precipitación isoeléctrica de la leche” “Cuantificación de proteínas”

Existen procedimientos de separación basados en diferencias de solubilidad. Las proteínas son moléculas que se forman por la unión de un número variado de aminoácidos. En base a esta característica se realiza uno de estos métodos se separación y purificación de proteínas. fuerza iónica. Los métodos corrientes para la separación de proteínas poseen un poder de resolución excepcionalmente elevado. propiedades dieléctricas del disolvente y la temperatura. actúan rebajando la energía de activación y. ya que para cada proteína estas propiedades son específicas. y esto explica el elevado número de funciones que realizan. La combinación de estas pequeñas moléculas origina una extraordinaria variación de proteínas. para conocer con mayor precisión su papel bioquímico. estos se basan en el hecho de que las proteínas en disolución muestran cambios profundos de solubilidad en función de distintas variables como: pH. la cual determina su comportamiento como electrolito.PRECIPITACION ISOELÉCTRICA DE LA CASEÍNA Y CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS Práctica 2 y 3 Práctica 2 Introducción Existen distintos métodos para la obtención de proteínas puras. por tanto aceleran la velocidad de reacción. definido como aquel valor de pH al que la molécula no posee carga . y puede utilizarse esta propiedad para la separación de mezclas de proteínas. uno de los más utilizados es la precipitación. Las enzimas son biocatalizadores. como su punto isoeléctrico y su pH para separarlas. solubles en agua. Muchas de estás funciones las realizan las enzimas. que es la precipitación isoeléctrica en la cual se utilizan las propiedades de solubilidad de las proteínas y su pH característico. En esta técnica de separación se busca conservar las actividades biológicas. y que pueden actuar en el nivel intracelular o extracelular. ya que cada proteína posee una composición de aminoácidos característica. las enzimas son proteínas globulares. que se difunden bien en los líquidos orgánicos. Estas variables son reflejo del hecho de que las proteínas son electrolitos de peso molecular muy grande. que constituyen un gran número de proteínas. Se utilizan distintas propiedades de las proteínas. El pH al que una proteína muestra un mínimo de solubilidad es su punto isoeléctrico. Es una técnica utilizada para concentrar proteínas.

y centrifugaciones. Puesto que las diferentes proteínas poseen valores de pH isoeléctrico diferentes. traspasados estos valores. Esta proteína tiene una gran importancia industrial. ya que al contenerse en un 77% al 82% en los productos lácteos. la subsecuente purificación mediante enjuagues con agua y etanol como medios. El pH óptimo está condicionado por el tipo de enzima y de sustrato. debido a que difieren en el contenido de aminoácidos con grupos R ionizables. La Caseína se le conoce a un grupo de proteínas presentes mayoritariamente en la leche. Las proteínas son moléculas relativamente frágiles que conservan su actividad biológica solamente en un intervalo relativamente limitado de pH. En estas condiciones no existe repulsión electrostática entre moléculas de proteínas vecinas y tienden a precipitar. Objetivos . con frecuencia pueden separarse unas de otras mediante la precipitación isoeléctrica. que puede ser observada en la leche desnatada. es la materia prima para de fabricación de diversos productos. Hipótesis A partir de la manipulación de pH de su medio. Existen varios tipos de Caseína como: Otros tipos 9 – 11% k caseína 14 – 16% (beta) caseína 34 – 36% (alfa) caseína 38 – 42% La Caseína alfa se encarga de los sabores característicos del suero. Se pueden apreciar a simple vista. Entre los dos límites existe un pH óptimo en el que la enzima presenta su máxima eficacia. ya que dan la apariencia coloidal. las enzimas se desnaturalizan y dejan de actuar. como los del queso y la caseína beta al dividirse da sabores amargos. Tienen en común que los grupos hidroxilo están esterificados con el acido fosfórico. Las proteínas presentan dos valores límite de pH entre los cuales son eficaces. debido a que el pH influye en el grado de ionización de los radicales del centro activo de la enzima y también y también de los radicales del sustrato. es posible aislar la caseína.PRECIPITACION ISOELÉCTRICA DE LA CASEÍNA Y CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS Práctica 2 y 3 eléctrica y es capaz de desplazarse en un campo eléctrico. El acido Fosfórico se une con el calcio y magnesio formando uniones entre moléculas. Esto de la propiedad de precipitarse en presencia de ácidos.

medimos constantemente en el potenciómetro y anotamos los resultados en la tabla 1. m.8 con HCl al 2%. titulamos hasta alcanzar el pH isoeléctrico de 4. . Filtramos la suspensión de éter en papel filtro. para permitir que todas las partículas de la caseína se pongan en contacto con el solvente. •--‐ Repetimos el paso anterior. De ahí tomamos 5 ml y lo almacenamos en un frasco Gerber a 4º C. • --‐ Secamos en la estufa a 40º C de 10 a 15 minutos. • --‐ Dejamos reposar a temperatura ambiente 5--‐10 minutos hasta que se formó un precipitado blanco. p. •--‐ Lavamos el precipitado con 20 ml de agua destilada. • --‐ Cortamos el papel filtro a la medida del embudo de Büchner y pesamos antes de colocarlo en el embudo. Con ayuda de una pipeta tiramos el sobrenadante hasta donde fue posible. • --‐ Diluimos 50 ml de la leche descremada anterior con agua destilada 1:4 y la pusimos en un vaso de precipitados de 500 ml y pasamos a la parrilla de agitación con mosca. agitando perfectamente con una varilla de vidrio. al cabo de los cuales decantamos rápidamente el tubo de centrifuga para eliminar el sobrenadante. extendiendo y pulverizando con ayuda de un agitador. m. m. durante 5 minutos y eliminar el sobrenadante con ayuda de una pipeta. • El alumno entenderá el principio químico y eléctrico del procedimiento. pesándolo en una balanza granataria (Figura Nº 2) para posteriormente pasarlos a centrifugar a 3000 r. • --‐ Pasamos a 2 tubos de centrifuga nuestro precipitado.PRECIPITACION ISOELÉCTRICA DE LA CASEÍNA Y CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS Práctica 2 y 3 • Aislar la caseína de la leche por el método de precipitación por punto isoeléctrico. Tomamos nota del peso. Tomamos 5 ml de este y almacenamos en un frasco Gerber a 4º C. •--‐ Centrifugamos nuevamente a 3000 r. teniendo cuidado de que no se queme (que se ponga amarillo). durante 5 minutos. Método Experimental • --‐ Se prepararon 300 ml de leche descremada en polvo (Svelty MR) a una concentración de 65 g/L con agua destilada (cantidad necesaria para todo el grupo). • --‐ Tomamos todas las pastillas y las colocamos en un vaso de precipitados de 100 ml. p. • --‐ En la campana de extracción añadimos al precipitado 20 ml de éter etílico y agitamos. • --‐ Guardamos la caseína aislada en un frasco Gerber a 4º C para su utilización posterior. p. Resuspendimos con la varilla de vidrio y volvimos a centrifugar a 3000 r. • --‐ Precipitamos la caseína a partir de los 195 ml de la leche diluida del paso anterior. •--‐ Lavamos el precipitado una vez con 10 ml de etanol al 75%.

luego. pero.8 (punto isoeléctrico y menos soluble de la caseína) al añadir 52 gotas de HCl al 2%.8. sin embargo.5 6 6. justamente debido a que le prestamos más atención a que l a t i tul a c ión s e hi c i e r a correctamente. no observamos ningún cambio en el sistema. con lo que se separó de otras proteínas al precipitarse. debido a que.5 5 5. a pesar de ese detalle. de manera general. excepto la acidificación del mismo.5 2 2. En lo que concierne el momento en el que vertimos gota a gota la solución de leche con el ácido.5 3 3. es importante decir que debimos de haber observado como el sistema se va tornando de un color blanco cada vez más fuere. Me faltaron datos. se precipitó en ese pH (ya que en ese estado es muy poco soluble. como se puede apreciar en la tabla Nº1.5 4 4. vale?? HCl 2% (mL) pH Cambios observados 1 1. se separó de partículas más ligeras que estuvieran disueltas en agua mediante enjuagues y centrifugación. Se realizó una relación de cantidad de gotas empleadas contra las variaciones en el pH registradas.5 Tabla Nº 1. a cada gota de ácido que se agregaba.PRECIPITACION ISOELÉCTRICA DE LA CASEÍNA Y CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS Práctica 2 y 3 Resultados Se obtuvo el pH 4. Titulación de la caseína. Titulación de caseína Discusión Y Análisis La caseína. no hay interacciones iónicas). se los terminan de poner. pudimos . lo cual permitió quitar un sobrenadante que tendría partículas hidrofílicas. por tener un punto isoeléctrico de 4. para poder separar de partículas hidrofóbicas se hizo un último enjuague y centrifugación con etanol.5 7 7.

pudo no haber sido el compuesto total que debimos haber obtenido. esto se consiguió utilizando el método de precipitación por punto isoeléctrico y así comprendimos los principios químicos y eléctricos del procedimiento utilizado. con su mera presencia. esto debido a que no se precipitara todo el compuesto cada una de las veces que lo lavamos. podemos purificarla y aislar a una de las proteínas presentes (es este caso caseína de la leche) pero sólo llegando a su pH o punto isoeléctrico (4. El saber los métodos y las bases teóricas para poder extraer una proteína de una mezcla de manera pura y en gran cantidad (o. Además que no logramos sacar el producto total del tubo de ensayo ya que una parte quedo impregnada al fondo del tubo y nos fue imposible sacarlo. en la Gráfica Nº 1. Con esta práctica comprobamos que. Sin embargo. de tener otra proteína con el mismo punto isoeléctrico en la solución se tendrían que recurrir a más técnicas para obtener sólo a la caseína.8 para la caseína) y mediante un proceso de centrifugación y un filtrado final obtener una sustancia totalmente pura y el resto de las proteínas e impurezas quedarán disueltas en el medio. la cuál mostramos a continuación. Cambio del pH de solución según número de gotas de HCl al 2%.PRECIPITACION ISOELÉCTRICA DE LA CASEÍNA Y CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS Práctica 2 y 3 cuantificar una relación entre cambio de pH y cantidad de gotas. dos con agua y una con etanol. Conclusiones Los objetivos planteados fueron logrados gracias a que se obtuvo la purificación de la caseína. lo más posible) nos permite tener un mayor control sobre experimentos posteriores. así como así como volver más simple la interpretación de los fenómenos consecuentes. puedan dificultar y hasta entorpecer el análisis de posibles observaciones. sino que. y no sólo eso. al sólo involucrar en la investigación las moléculas que interesan y dejar de manera casi nula otras moléculas que. . Es evidente que se tiene la certeza de que sólo se trabaja con dicha proteína globular y no con otras debido a un previo conocimiento de que la leche sólo posee un tipo de proteína con punto isoeléctrico 4. otras proteínas que tuviesen puntos isoeléctricos superiores se verían desnaturalizadas antes un pH así de extremo. por lo menos. ya que. mediante la acidificación de un medio en el cual encontramos una proteína. el peso final de la proteína caseína obtenida de la leche.8.

de la actividad de una enzima o el contenido proteico de un alimento. la espectrofotometría visible solamente usa el rango del campo electromagnético de la luz visible.PRECIPITACION ISOELÉCTRICA DE LA CASEÍNA Y CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS Práctica 2 y 3 Práctica 3 Introducción Para el estudio de la estructura de una proteína. cambia a violeta en presencia de proteínas. El biuret esta compuesto de Hidróxido potásico (KOH) y Sulfato cúprico ( . Tartrato de Sodio y potasio ). Al campo de luz uv de 200 a 400 nm se le conoce también como rango de uv cercano. En el método de Biuret también se utiliza un método colorimétrico que permite determinar la concentración de proteínas de una muestra mediante espectroscopia ultravioleta-visible a una longitud de onda de 540 nm (para detectar el ion Cu2+). El reactivo. principalmente de 200 a 400 nm y en el de la luz visible de 400 a 800 nm . de color azul. su color se vuelve rosa. El Hidróxido de Potasio no participa en la reacción. de 400 a 800 nm. pero proporciona el medio alcalino para que tenga lugar la reacción. proteínas y otros compuestos de enlace peptídico. Método de Biuret Con este tipo de método se detecta la prescencia de péptidos. en el rango UV de 80 a 400 nm. y si el reactivo esta en presencia de polipéptidos. es necesario conocer cuantitativamente la concentración de las proteínas. por lo que es de gran utilidad para caracterizar los materiales en la región ultravioleta y visible del espectro. . Método Espectrofotométrico Con este método se puede comparar la radiación absorbida o transmitida por una solución de soluto desconocida y una que contiene una cantidad conocida de la misma sustancia. La espectrofotometría ultravioletavisible usa haces de radiación del espectro electromagnético. Se han desarrollado diferentes técnicas que se basan en la formación de complejos coloridos entre las proteínas y reactivos específicos. La absorción y trasmitancia de luz depende tanto de la cantidad de la concentración como de la distancia recorrida.

de color amarillo. existe una relación directa entre el desarrollo del color y la concentración de proteínas. por los grupos fenólicos de los residuos de tirosina.PRECIPITACION ISOELÉCTRICA DE LA CASEÍNA Y CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS Práctica 2 y 3 Método de Lowry Método colorimétrico de valoración cuantitativa de las proteínas. Hipótesis . se unen a las proteínas formando complejos con los átomos de nitrógeno de los enlaces peptídicos.  Determinar el rendimiento y pureza de una proteína purificada: la caseína. Estos complejos de la proteína tienen un color azul claro. 1) Los iones en medio alcalino. Estos provocan el desdoblamiento de la estructura tridimensional de la proteína. A la muestra se añade un reactivo que forma un complejo coloreado con las proteínas. El principal constituyente del reactivo de FolinCiocalteau es el ácido fosfomolibdotúngstico. El Cu2+ se mantiene en solución alcalina en forma de su complejo con tartrato. actuando el cobre como catalizador. del reactivo de Folin-Ciocalteau. Este es el principio básico del azul de Coomasie para la determinación de proteínas por Bradford.  Apreciar el uso de las técnicas espectrofotométricas para cuantificar productos biológicos. 2) La reducción. también en medio básico. exponiéndose los residuos fenólicos de tirosina que van a participar en la segunda etapa de la reacción. Con este método las proteínas tienen una capacidad de absorción máxima de 465 eso cambia a 595 nm cuando el colorante esta unido a las proteínas. Método de Bradford Este método se basa en el acoplamiento del colorante con la proteína y se determina colorimetricamente. Objetivos  Conocer la técnica de Biuret para la determinación de la cantidad de proteína en una muestra biológica. siendo la intensidad de color proporcional a la concentración de proteínas. presentes en la mayoría de las proteínas. que al ser reducido por los grupos fenolicos da lugar a un complejo de color azul intenso.

.  Todos los métodos para cuantificar proteínas son buenos.  Cuando se sigue el método adecuado para cuantificar proteínas.. 2. se determinara la cantidad de la proteína.. disponibilidad y más fácil de entender.Se puso en un matraz volumétrico y se aforo a 50 mL .Se pesaron 200g de caseína obtenida en la práctica anterior y se clocó en un vaso de 100 mL. es posible obtener un mejor rendimiento y pureza. pero el método de Biuret es el más viable debido al tiempo que tarda en realizarse. obteniendo el complejo color azul púrpura de los enlaces peptídicos de las proteínas.PRECIPITACION ISOELÉCTRICA DE LA CASEÍNA Y CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS Práctica 2 y 3  Si se conoce detalladamente el Método de Biuret .Se añadieron 30 mL de solución Na Cl al 1 % 3. Materiales             1 gradilla 10tubos de ensaye 2 vasos de precipitados de 100 mL Micropipeta 1 agitador metálico (mosca) 2 pipetas serológicas de 10 mL 2 pipetas serológicas de 5 mL 2 pipetas serológicas de 1 mL 2 matraz volumétricos de 50 mL 1 probeta de 50 mL 1 espátula 2 vidrio de reloj Reactivos  Reactivo de Biuret  NaCl 1%  Agua destilada  Espectrofotómetro y celdas  Parrilla para agitación magnética  Balanza analítica  Albúmina sérica bovina (BSA) 10 mg/ mL (preparar 30 mL en el momento y disolvercon NaCl 1%)  NaOH 1N (Diluir de la solución 10 N preparada en la práctica 1) Procedimiento 1.Se puso gota a gota NaOH 1 N hasta q se diolvió toda la caseína en la parrilla de agitación. 4. bajo costo.. esto es.

Se leyó el espectrofotómetro 540 nm.. Nº de tubo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Reactivo Solución patrón de Albúmina (10 mg/mL) 0 6.00 1. problema de caseína obtenida (mL) Solución Sobrenadante (mL) Leche diluida 1:4 (mL) Reactivo de Biuret (mL) Tabla 3.Estas muestras se volvieron a guardar a 4ºC para utilizarlas en la práctica de electroforesis. 9.00 4 5.00 4 5.00 1. 8.50 5.00 4 0.50 0.00 5.Se agitaron tubos vortex. Leche diluida 1:4 Sobrenadante (SN) Caseína aislada y que se disolvió en paso 3 con NaCl al 1% y Na OH 1 N 6.25 4 1..50 4 0. 7.75 4 5. Resultados .00 4 NaCl 1% (mL) Sol...PRECIPITACION ISOELÉCTRICA DE LA CASEÍNA Y CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS Práctica 2 y 3 5.Se incubó 15 minutos a temperatura ambiente.25 5..1 Nota: Las muestras son obtenidas en la práctica 2 que fueron guardadas a 4º C. 10.00 1..75 4 0.25 4.75 5.Anotamos los datos obtenidos en nuestro manual.00 4 1.Se etiquetaron los tubos del 1-10 y se agregaron estas soluciones indicadas.50 4 5.

00 0.283 - 0.Calcular los gramos de albúmina tomando en cuenta que la concentración inicial es de 10 mg/mL. 11.. etc. 9. dando los valores en miligramos de proteína tomando en cuenta las alícuotas..50 1.064 0.Calcular los resultados de cada una de las muestras (incluir en el reporte la forma detallada de los cálculos realizados). anotar los resultados en la tabla..430 8. 8. .083 0.Linealizar la curva utilizando el método de regresión lineal 4.227 0.PRECIPITACION ISOELÉCTRICA DE LA CASEÍNA Y CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS Número de tubo Solución estándar de albúmina (BSA) mL Albúmina (mg/tubo) Absorbencia (540 nm) Muestras Problema (mL) Absorbencia de muestras problema (540 nm) Práctica 2 y 3 Caseína Obtenida (mg/tubo) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Cálculos 0 0.143 4.Elaborar las conclusiones.176 0.00 1.119 0. 7.Calcular la cantidad total de caseína obtenida en los gramos totales de materia seca aislada.....717 - 0 0..75 1.Calcular la cantidad total de proteína restante en el sobrenadante.00 1.25 - 0 2..287 6. en este caso.En función de los resultados. 5.Analizar y discutir los resultados de manera grupal y confrontar los resultados con lo que indica la literatura.Graficar la curva estándar con la concentración de la carga conocida.159 - 1. disoluciones.574 10.25 0.Calcular el porcentaje de proteína en materia seca.. la albúmina (mg) como variable independiente (en el eje de las x) y la absorbencia (540 nm) como variable dependiente (en el eje de las y) 3.112 0.50 0. Proteína mg/mL Factor de dilución 1:4 (mg) Proteína total de materia seca aislada (mg) Proteína total de materia seca aislada (mg) Proteína restante en el sobrenadante (mg) Porcentaje de proteína en la materia seca Rendimiento de la extracción de caseína 10. 2.. calcular el rendimiento de la reacción.221 0.00 1.

Facultad de Química.pquim. S. (1981).A. Obtenido de: http://depa.mx/amyd/ archivero/grasayproteina_1796.unam. Bioquímica: las bases moleculares de la estructura y función celular (segunda edición). Grasa y Proteína. . San Francisco. Albert L. Biochemistry (tercera edición).pdf • Lehninger. Ediciones Omega.PRECIPITACION ISOELÉCTRICA DE LA CASEÍNA Y CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS Práctica 2 y 3 Referencias: • Administración de manuales y documentos (Amyd. UNAM (07 de septiembre del 2007). (1999).. Christopher k. Barcelona. • Mathews.Editorial Benjamin Cummings.

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