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Biotecnologia Vegetal

Instituto Superior de Agronomia 2011-2012

Relatório da aula prática: Obtenção e análise de marcadores RAPD

Objectivos
Esta aula prática teve como principal objectivo realizar um procedimento experimental com marcadores biomoleculares, tendo como exemplo a técnica RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA). No qual se incluem objectivos mais específicos, entre os quais, compreender o fundamento e executar uma PCR (polymerase chain reaction), preparar um gel de agarose e realizar uma electroforese, entender a definição de marcador biomolecular e polimorfismo, contactar com aplicações práticas de marcadores moleculares: identificação varietal e similaridade fenética, compreender outros marcadores moleculares, por analogia com a técnica RAPD.

Introdução
Um marcador genético é qualquer característica morfológica ou molecular, herdada de maneira simples que diferencia indivíduos. O uso de marcadores genéticos baseia-se na detecção de polimorfismos. Os polimorfismos são variedades que podem ocorrer simultaneamente dentro ou entre populações de múltiplas formas fénotipicas de um carácter, atribuíveis aos alelos de um único gene. Os marcadores genéticos podem ser morfológicos ou moleculares. Os marcadores morfológicos são raros porque a variação genética tem uma base molecular complexa não sendo fácil de determinar. Os marcadores moleculares podem ser bioquímicos devido a proteínas ou de DNA.

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sendo realizados três passos em cada ciclo:  No primeiro passo são usadas temperaturas elevadas de forma a separar as molecular de DNA em duas cadeias simples (desnaturação de DNA). para permitir a ligação a temperatura de reacção é reduzida para 50 e 65˚C.Os marcadores moleculares apresentam diversas vantagens como independência de factores ambientais e do estado de desenvolvimento da planta. a ligação dos primers é feita através de ligações de hidrogénio. catalisada pelo DNA polimerase. Para a obtenção e análise de marcadores RAPD utilizámos o PCR para amplificar segmentos de DNA e posteriormente separar os fragmentos em gel de agarose através da electroforese. No segundo passo.   O processo pode ser repetido várias vezes sendo assim possível aumentar em cada ciclo duas vezes a concentração de DNA. simples com custo reduzido e elevada sensibilidade. A PCR é uma técnica rápida. A técnica da PCR baseia-se no processo de replicação de DNA que ocorre in vivo. a ligação entre Adenina e Timina exige menores valores do que a ligação entre Guanina e Citosina. A desnaturação de DNA permite a ligação dos primers. A técnica consiste na realização de vários ciclos. 2 . (geralmente os primers são constituídos por 15 a 30 nucleótidos). independência do estado fisiológico e sanitário e tem número virtualmente ilimitado. a ligação é feita em cadeias simples. ( a temperatura de emparelhamento vai depender da sequencia a amplificar. O terceiro passo do PCR consiste na síntese da cadeia complementar de cada cadeia molde. Os marcadores moleculares baseiam-se na detecção de sequencias especificas de DNA do organismo podendo ser por hibridação ou por PCR.

Pode-se definir a mobilidade electroforética (u) como a velocidade de migração por unidade de campo eléctrico. Numa mesma solução partículas com a mesma carga podem ter mobilidade electroforética distinta pois podem ter pesos moleculares diferentes. Equipamento           Máquina de gelo Centrífuga de bancada Termociclador Tina de electroforese horizontal Fonte de alimentação para electroforese Equipamento fotográfico tipo Polaroid Transiluminador Agitadores magnéticos com e sem aquecimento Arca congeladora –20ºC Computador Pessoal (PC) Material       Micropipetas Pontas para micropipeta Frascos erlenmeyer Tubos eppendorf 0. Coeficiente de Dice: 2Nab /(Na+Nb). A electroforese consiste no transporte de partículas num campo eléctrico.5 ml e 1.5 ml Parafilme Filmes Polaroid 667 3 . produzindo quando se igualam uma velocidade constante das partículas. A similaridade fenética pode ser calculada através do coeficiente de Dice. Através da separação das partículas de DNA conseguimos identificar uma variedade desconhecida.A separação dos fragmentos em gel de agarose é feita através de uma outra técnica: a electroforese. A identificação é feita por comparação de bandas: bandas iguais indivíduos iguais. No transporte electroforético a força do campo opõe-se a resistência viscosa do meio.

2.5mM MgCl2. 50mM KCl) 0. 30% glicerol em dH2O miliQ)  dNTPs – Gibco BRL (solução equimolar (10mM) de cada dNTP)  Primer OPA18 –  Marcador de DNA de peso molecular – ‘100bp ladder’ – MBI Fermentas Métodos O trabalho de laboratório decorreu em quatro passos A).70ul de dH2O miliQ.05=5. vamos descrever o trabalho pela ordem do protocolo.13ul de tampão de reação PCR 10X – Pharmacia (10mM Tris-HCl pH 9.0. utilizámos 3 amostras de DNA de 3 variedades de cerejeira e de 1 variedade desconhecida: C1. Num tubo eppendorf de 1. C) e D).05=13. por motivos de exequibilidade no tempo da aula.04 M Tris acetato.25ul de Primer OPA18 – Operon Technologies (sol.5ul x 5 x 1. 50mM KCl)  50X Tampão TAE – Tris-Acetato-EDTA (1 x 0. não tenha sido igual ao do protocolo.05=1. C2-Saco Cova da Beira.05ul de Taq DNA polimerase 5U/ul – Pharmacia Total da Solução 120.5ul x 5 x 1. por ser essa a correta. 1.001 M EDTA)  GreenSafe (corante de visualização de DNA)  – Pharmacia  Corante ‘azul de bromofenol’ (0. 1.25% (p/v) de azul de bromofenol.2ul x 5 x 1.Reagentes  Agarose ultra pure – electrophoresis grade  Tampão de reacção PCR 10X – Pharmacia (10mM Tris-HCl pH 9.0. C3-Vilar e C4-Desconhecida.63ul de dNTPs – Gibco BRL (solução equimolar (10mM) de cada dNTP) 1. B). de trabalho a 10pmol/ul) 0.05=2.76ul 4 .0ul x 5 x 1.5 ml colocou-se: 18.05=98. 0.Saco do Douro. A) PREPARAÇÃO DE UMA REACÇÃO RAPD (PCR com primer único de sequência arbitrária) Para preparar esta reação RAPD. Embora a sequencia dos passos em laboratório.8ul x 5 x 1.5mM MgCl2.

5 ml. agitando com cuidado para não danificarmos os primer.10 min 5 .Para evitar erros. Adotou-se o seguinte perfil: 94ºC ----------------. Temos assim completos os tubos que iremos colocar no termociclador para amplificarmos os respectivos ADNs . para evitar que se degrade. as contas anteriores foram reconfirmadas dando no final 23ul/cada amostra. por anterior conhecimento do mesmo.2mM de cada dNTP.90 seg. cerca de 400 bandas diferentes. Regulou-se a pipeta para os diferentes volumes (um de cada vez). |>35 ciclos 72ºC ----------------. que vai servir para o controle negativo coloca se 2ul de dH2O miliQ. para que não exista contaminação de ADN entre os tubos.4uM de primer em 1 x tampão de reação.30 seg. A ordem de colocação deve ser a descrita anteriormente. com o intuito de recolher o conteúdo que possa estar no fundo. para estas variedades de Cerejeira. ficando assim com 4 tubos com idêntica quantidade da reação onde se vai misturar 2ul de amostra de DNA (15ng/ul). Levámos a centrífugar durante 7 segundos. Com a ajuda de uma pipeta regulada para 23ul. A água será sempre a primeira a ser colocada no tubo para evitar que a solução precipite. tendo o cuidado de usar uma ponta nova sempre que se colocava um produto diferente no tubo. Caso não tivéssemos conhecimento anterior. De cada vez que se mistura um tipo de ADN retira-se a ponta da pipeta e coloca se uma nova. num tubo eppendorf de 0. sabendo de antemão que iriamos ter várias bandas possíveis. já devidamente misturados. De seguida. 1 unidade de Taq DNA polimerase. CONDIÇÕES FINAIS: Volume total de 25ul contendo 30ng de DNA genómico.60 seg. A colocação dos diversos produtos fez se com a ajuda de uma pipeta. O Tampão tem de ser colocado obrigatoriamente antes da Taq DNA Polimerase para regular o meio onde a mesma ser introduzida posteriormente. colocámos os produtos. | 36ºC ----------------. Segue-se a fase da programação dos tempos e temperaturas do termociclador onde irá ocorrer o PCR. No quinto e ultimo tubo. | 72ºC ----------------. 0. 0. 94ºC ----------------. teríamos de experimentar diversos até que um desses primer desse resultados aceitáveis. misturámos ligeiramente por inversão o mix da PCR (para as 4 amostras mais uma parte para o controlo negativo). na centrifugadora de bancada.30 seg. A Taq deverá ser a ultima a ser introduzida no tubo e só nessa altura poderá ser retirada do frio (Condições de -20 C) onde está armazenada. Escolheu-se o primer OPA-18. também com a ajuda de uma pipeta.

Os pentes deverão ficar bem encaixados para que os poços tenham todos a mesma profundidade.Os primeiros 90s a 94 C servem para a desnaturação inicial do ADN e essa temperatura é calculada de acordo com a seguinte formula Tm = 4(G + C) + 2(A + T) ºC .001 M EDTA) e despeja-se para o anterior frasco erlenmeyer. e homogeneiza-se a mistura. Esta preocupação deriva da necessidade do gel ficar uniforme e sem bolhas para que a condutividade seja constante. uma para fazer o controlo negativo da experiência e a última para o marcador molecular. As amostras de ADN teriam cerca de 280 a 300 bp o que deu cerca de 94ºC para a temperatura de desnaturação. Mede. 0. Mede se 196ml de dH2O e despeja se por cima da agarose (lavando o alumínio) ao mesmo tempo que esta vai escorrendo para o frasco erlenmeyer. Agita-se a mistura e coloca-se num agitador magnético por forma a dissolver a agarose. neste caso vamos usar 72ºC. no lado oposto aos pentes. 6 .5% AGAROSE EM 1 x TAE (esta operação pode ser feita enquanto o termociclador estiver a cumprir o seu programa) Pesam-se 3g de Agarose ultra pure – electrophoresis grade ( em pó) e colocam-se numa folha de alumínio. A nossa amplificação deverá ficar pronta 82 min depois. Deita-se a solução já a 50ºC no molde do gel. Entretanto colocamos o molde que irá receber a mistura por forma a que fique nivelado. quatro das amostras das nossas variedades de Cerejeira (três conhecidas e uma desconhecida). A temperatura de polimerização ronda os 70ºC que é a temperatura ótima para o funcionamento da enzima Taq DNA polimerase. que distinguem. Como se trata de um primer relativamente pequeno AGGTGACCGT utilizou-se a temperatura de emparelhamento ou annealing de 36ºC. C) ELECTROFORESE EM GEL DE AGAROSE Com as amostras do passo A) e com o Gel preparado como descrito no passo B) vamos agora fazer uma eletroforese em gel de agarose para determinar as bandas de cada uma.04 M Tris acetato. De seguida colocam se os tubos (4+1) no termociclador e inicia-se o programa. B) PREPARAÇÃO DE UM GEL DE 1. Desliga-se o agitador e deixa-se arrefecer a mistura até aproximadamente 50ºC. O processo de dissolução leva entre 5 a 6 minutos.se com uma pipeta 4ml de 50X Tampão TAE – Tris-AcetatoEDTA (1 x 0. Caso tenha bolhas de ar. Colocou-se um pedaço de parafilme com seis marcas. Juntase 5ul de corante Greensafee quando a solução já estiver a fazer bolhas e translúcida. Caso não se possa estar perto do mesmo quando a programação terminar deve se programar uma última temperatura cerca de 4ºC para que o termociclador faça de frigorífico e a amostra não se degrade. furam-se as bolhas com uma ponta de micropipeta e colocam-se os pentes.

o que significa que os reagentes não estavam contaminados com ADN. previamente colocado na tina de eletroforese horizontal. 7 . Depois de se colocarem as amostras nos poços do gel de agarose. Adicionou-se 1ul de marcador de DNA de peso molecular – ‘100bp ladder’ – MBI Fermentas a 9ul de dH2O. No final da hora e meia retirou-se o gel e levou-se para a câmara escura onde se fotografou com a ajuda de uma máquina tipo Polaroid. Saco do Douro ---------------------------------------Saco Cova da Beira ---------------------------------------- Vilar Desconhecida -------------------------------------------------------------------------------------------- Ou numa Matriz de zeros e uns: Saco do Douro 0 1 1 1 0 Saco Cova da Beira 0 1 0 1 1 Vilar 1 1 0 1 1 Desconhecida 0 1 1 1 0 Verificou-se na fotografia que não apareceu qualquer banda na amostra destinada ao controlo negativo. De seguida preparou-se o marcador molecular. regula-se a alimentação 120 V durante uma hora e meia. Esta colocação faz-se com a ajuda de uma pipeta adequada ao volume e devem-se trocar as pontas sempre que se manipular uma amostra diferente. aproximadamente.Pipetaram-se 10ul da reacção de amplificação de cada amostra com 2ul de corante ‘azul de bromofenol’ (0. Como não temos a mesma reproduzimos esquematicamente de seguida. Se quiséssemos que a experiência decorresse com maior rapidez poderíamos colocar uma voltagem na ordem dos 140 V durante meia hora. para não existir contaminação das mesmas. Podemos constatar desde o início que as amostras começaram a difusão passado pouco tempo.25% (p/v) de azul de bromofenol. Também foi visualizada o gel com as bandas num transiluminador de luz UV. Os preparados devem ser rapidamente colocados no gel de agarose e iniciar a eletroforese para não se degradarem. e o corante. já descrito anteriormente para as amostras. De notar que a proporção de qualquer um dos seis preparados tem uma proporção volumétrica de 1X de corante para 5X de solução de marcador/produtos da reacção de amplificação. Ficámos assim com uma fotografia com as bandas detectadas. 30% glicerol em dH2O miliQ).

86 1 0.86 0. 8 .67 Vilar 0.Pela análise dos quadros acima a amostra Desconhecida deverá ser similar à amostra do Saco do Douro. Dice a.67 0.67 1 0.Numero de bandas da variedade b Matriz de Similaridade Fenética de Dice Saco do Saco Cova da Douro Beira Vilar Desconhecida Saco do Douro 1 0. que abaixo se reproduz através de uma fotografia tirada ao ecrã do pc após introdução dos dados.67 0.57 1 Saco Cova da Beira 0.b=2Nab/(Na+Nb) sendo: Nab-Numero de bandas comuns entre a variedade a e a variedade b Na-Numero de bandas da variedade a Nb.57 1 2) Utilizando a matriz de zeros e uns anterior e o sofware NTSYS previamente intalado num PC foi-se calcular o Dendrograma para estas variedades.57 0. D) ANÁLISE DOS RESULTADOS 1) Vamos calcular agora a matriz de similaridade fenética utilizando o coeficiente de Dice.57 Desconhecida 1 0.

esta técnica estar ultrapassada devido ao aumento das tecnologias de DNA de baixo custo de sequenciamento. podem ser detectadas se ocorrerem nos locais de corte das enzimas de restrição. Os RFLPs têm muitas aplicações no melhoramento de plantas. Os AFLPs (Amplified Fragment Length Polymorphism) são polimorfismos de comprimento de fragmentos amplificados. não sendo necessário sequenciar DNA. deleção. portanto polimórficos (RFLPs). altamente saturados com marcadores. As variações que ocorrem nos nucleótidos do DNA. Apesar de. a amostra de DNA é quebrada em pedaços (digerida) pelos enzimas de restrição e os fragmentos de restrição resultantes são separados de acordo com seus comprimentos por eletroforese em gel. Estes mapas servem de base para o mapeamento de outras características de importância agronómica. ou não. são loci no DNA que podem ser identificados e mapeados. o monitoramento nos retrocruzamentos e auxílio na identificação e clonagem de genes. Os polimorfismos de comprimento de fragmentos de restrição. ou polimorfismo de tamanho de fragmento.3) Através da matriz de similaridade calculada na alínea 1) e do Dendrograma da alínea 2) pode-se concluir que existe 100% de similaridade fenética entre as amostras de DNA utilizadas da variedade Saco do Douro e da variedade Desconhecida. Caso o DNA de plantas. O polimorfismo pode ser definido como a ocorrência simultânea. tais como no desenvolvimento de mapas de ligação. principalmente as de natureza quantitativa e governada por muitos genes. a identificação de variedades. Os RFLPs ainda têm outras utilidades como a identificação de germoplasma. dentro ou entre populações. Desta forma é possível verificar as associações (ligações genéticas) entre os marcadores moleculares e os genes que afectam um carácter quantitativo. que podem ser identificados e clonados. do genoma). atribuíveis aos alelos de um único gene. Na análise de RFLP. seja por mutação. que resultam do uso combinado 9 . a caracterização genética de populações. for exposto a essas enzimas. No entanto para que se pudesse melhor aferir a similaridade deveríamos ter cerca de 400 bandas em cada variedade. a análise RFLP foi o primeiro perfil de DNA. são polimorfismos no comprimento de fragmentos de restrição. Os RFLPs (Restriction Fragment Length Polymorphism). de um segmento específico de ADN (correspondendo a regiões expressas. de múltiplas formas fenotípicas de um caracter. 4) Um marcador molecular é todo e qualquer fenótipo molecular proveniente de um gene expresso (isoenzimas) ou. diferindo num ou vários desses nucleótidos. originam-se fragmentos de diferentes tamanhos. entre outras. inserção e inversão. na actualidade. o controle de qualidade na produção de sementes híbridas.

nº20078 Augusto Ezequiel. nº20087 Nuno Fonseca. nº20019 Turma 1A Grupo 2 Lisboa. Os marcadores microssatélites são utilizados no mapeamento genético e na caracterização varietal para fins de protecção e de germoplasma para fins de conservação de várias espécies. para o uso dos microssatélites. No entanto. existe um custo elevado e trabalho no início. formadas por um ou poucos nucleótidos. nº20033 Pedro Fazenda. sequenciá-la e. sintetizar os iniciadores específicos para cada locus. Uma vez feito isto. Têm como principais características uma alta especificidade e resolução e poder de amostragem. posteriormente. Os Microssatélites (SSR . simples. os microssatélites proporcionam 3 a 4 vezes mais polimorfismo ou informação.de enzimas de restrição e da reacção em cadeia da polimerase (PCR). Desta forma. 15 de Novembro de 2011 10 . em terceiro lugar. nº20050 Maria Correia.Simple Sequence Repeats) são sequências curtas em tandem. Comparativamente aos RFLPs. Trabalho realizado por: Ana Cristina Gonçalves. mas o custo subsequente é baixo e torna-se uma técnica bastante simples. tem de se amplificar primeiro uma região. o locus marcador pode ser utilizado indefinidamente naquela espécie.

8 .7 07748  .8 .43172.!.9.3/4 34 13.7.:. 0.439.8 /.2 70.39074708 147./.

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