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第一章 概論

澱粉的新陳代謝 (Metabolism)
在高等植物中,澱粉 (starch) 是一種是由葡萄糖殘基 (glucose residue) 在質體
(plastid) 內組合成的不溶於水的聚合物 (insoluble polymer) ,不僅是植物儲藏能量
重要的方式之一,在食品工業上也扮演相當重要的角色。澱粉依據儲存型態以及位
置,又可分為暫時性澱粉 (transient starch) 以及儲藏性澱粉 (reserve starch) ,暫時性
澱粉產生於光合作用 (photosynthesis) 旺盛的葉綠體 (chloroplasts) 內,在日間光照
時合成,夜間黑暗時分解以提供植物體所需的碳源。而儲藏在造粉體 (amyloplast)
內的澱粉則提供植物在不利生長的環境下維持基本代謝所需的碳源。種子 (seed) 中
儲藏的澱粉則是作為下一個世代 (generation) 發芽生長所需的碳源。

澱粉合成 (Anabolism)
澱粉粒 (starch granule) 中包括兩種葡萄糖聚合物:(1) 直鏈澱粉 (amylose),藉由
-1,4 linkage 組成不分支的葡聚糖 (glucan);(2) 支鏈澱粉 (amylopectin) ,在直鏈
澱粉上藉由 -1,6 linkage 組成高度分支的葡聚糖,一般而言佔澱粉粒中 75% 的含
量 。 一 般 情 況 下 , 參 與 澱 粉 合 成 的 酵 素 包 括 澱 粉 合 成 酶 (starch synthase , EC
2.4.1.21) 、分支酵素 (branching enzyme,EC 2.4.1.18) 以及去分支酵素 (debranching
enzyme,EC 3.2.1.41) 。澱粉合成酶是以 ADPGlc 或是 UDPGlc 作為葡萄糖單元體來
源,在已存在的糖類分子非還原端 (non-reducing end) 延長醣鏈,再由分支酵素或
去分支酵素,對多醣分子來進行協同修飾,產生各種不同分支度的葡聚醣。由上述
說明可知,澱粉合成酶必須在含有糖引子 (sugar primer) 的情況下才能進行延伸糖
鏈的酵素功能 (primer dependent elongation) ,因此,最初糖引子的存在,是澱粉合
成不可或缺的物質,而具有生合成最初糖引子活性的酵素,應該參與澱粉合成的
最初步驟。

澱粉分解 (Catabolism)
植物細胞內澱粉代謝的目的主要是提供碳源以供給生長所需的葡萄糖或是維持
細胞內的恆定性所需的能量來源。在大多數植物中可以分解澱粉的酵素都含有以下
這幾種: (1) 內切性澱粉酶 (endo-amylase, α-amylase) , (2) 外切性澱粉酶 (exo-
amylase, b-amylase) , (3) 葡萄糖甘酶 (glucosidase) , (4) 去分支酵素 (debranching
enzyme) , (5) 澱粉磷解酶 (starch phosphorylase) 及 (6) disproportionating enzyme 。
其中某些酵素位在質體外,而這些酵素在質體外所扮演的的功能至今仍然尚未完
全明瞭。目前植物澱粉代謝途徑的研究多以阿拉伯芥 (Arabidopsis) 作為生物材料
(Bio-model) ,因為其基因體 (genome) 只有 5 對染色體共 120,000,000 鹼基,並在
西元 2000 年底已於美國與歐盟合作下完成定序,所以非常適合作為研究的材料。但
是因為植物細胞在生長過程的不同時期對於澱粉的新陳代謝扮演不同角色 ,像胚

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乳 (endosperm) 在萌芽時扮演分解澱粉的角色,在植株生長的時候又扮演合成儲存
澱粉的角色,其他又如葉肉細胞,白天進行光合作用時扮演合成澱粉的角色,夜
晚則是進行分解澱粉的角色,在這些細胞內關於澱粉新陳代謝的酵素彼此之間的
調控至今能尚未完全了解,所以了解這些調控有助於未來農業經濟的發展。圖一表
示澱粉在葉片細胞的質體 (plastid) 內分解澱粉的可能路徑。

圖一 澱粉在植物細胞質體 (plastid) 內分解的可能路徑


此 圖 只 標 示 主 要 的 分 解 與 合 成 路 徑 。 1. α-amylase ; 2. debranching enzyme
(isoamylase and limit-dextrinase) ; 3. starch phosphorylase ; 4. β-amylase ; 5.
disproportionating enzyme ; 6. α-glucosidase ; 7. triose-phosphate translocator ; 8.
hypothetical maltose translocator;9. glucose translocator。

澱粉磷解脢
澱粉磷解酶的發現與分類
澱 粉 磷 解 酶 (Starch phosphorylase, α-glucan phosphorylase, α-1,4-
glucan:orthophosphate α-D-glucosyltransferase, EC 2.4.1.1,以下簡稱 SP) 早於 1940
年由 Hans 在馬鈴薯及豌豆中發現。澱粉磷解酶是高等植物中參與澱粉代謝的酵素之
一,其催化反應如下: -glucose 1-phosphate + Glucan (n) ←→ Pi + Glucan (n+1) 。在植
物體中,葡聚糖以多種型態存在,以分子量來區分大致可以分為大分子的 polyglucan
與小分子 maltodextrin,而若以葡聚糖 -1,6 鍵結分支程度不同來分類,可以分為分
支度較高的 amylopectin 與分支度較低的 amylose,而植物的 SP 對上述不同的醣基有
著不同的親和力。 Steup 和 Fukui 分別對 SP 同功酶做出不同的分類:
1. Steup (1988) 根據次單元體的分子量及專一性不同,將 SP 分為兩種:

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Type I Type II
次單元體 分子量 90 kDa 左右 110 kDa 左右
對 支 鏈 聚 醣 (branched 強 弱
glucan) 的親和力
對 maltodextrin 的親和力 弱 強
儲存位置 Cytosol Chloroplast, Amyloplast
本論文之命名 H-SP L-SP

2. Fukui (1983) 根據其分子量、對醣類專一性及來源不同將 SP 分為三類:


Type I Type II Type III
次 單 元 體 分 子 110 kDa 90 kDa 藉於上述兩者之間

對 醣 類 的 親 和 對直鏈澱粉、支鏈澱 對直鏈、支鏈葡聚醣 對 高 度 分 支 的 葡 聚
力 粉 以 及 maltodextrin 親 和 力 強 , 對 醣比直鏈醣具有更
親和力強,對肝醣 maltodextrin 親 和 力 高的親和力
親和力低 低
物種分佈 菠菜葉綠體、馬鈴薯 菠菜非葉綠體組織、 動物型磷解酶 (GP)
塊莖及甜玉米中, 馬鈴薯塊莖及豆類中,
為 胞 器 型 (plastidic) 為 細 胞 質 型
磷解酶 (cytosolic) 磷解酶
環狀糊精之抑 佳 佳 無

本論文之命名 L-SP H-SP GP

L-SP 多在高澱粉含量的組織中大量表現,而 H-SP 存在的組織中澱粉含量很低,


加上這兩種磷解酶分布於細胞內的位置不同,L-SP 位於質體內,而 H-SP 位於細胞
質 (cytosol) 中,顯然 L-SP 與位於造粉體內澱粉的相關性較高 。在過去的澱粉代謝
研究中主要是以 L-SP 為主。

澱粉磷解酶的分子結構
Mori (1991) 在比對馬鈴薯塊莖中 H-SP 與 L-SP 次單元體的胺基酸序列後,發現
兩者的同源性相當高,但是 L-SP 分子中央多出了一段 78 個胺基酸 (以下簡稱 L78)
組成的環狀構造 (圖二) ,這一段序列造成 L-SP 與 H-SP 分子量差約 10 kDa 。將這
段序列與兔肌的肝醣磷解酶 (glycogen phosphorylase, GP) 作序列對比後,發現 L78
在 GP 的相對位置,正好與醣類結合區 (glucan binding site) 重疊,因此 L78 的插入
可能把 SP 的醣類結合區破壞 。而在甘藷 L-SP 次單元體的 L78 的結構中,發現其
有含有一個 PEST site,當中有一個 Ser 經分析後發現是一個很強的磷酸化位置,

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這個 Ser 被磷酸化後,是一個強烈的降解訊息,導致 L-SP 在 L78 上斷裂,而出現
約 50 kDa 的片段 (Fragment 50s, F50s) ,L-SP 降解後原本阻礙 L-SP 醣類結合區的
障礙就被移除,進而改變活性 。
L78

圖 二 甘藷中 L-SP 與 H-SP 結構比較示意圖 (台灣大學微生物與生化學研究所


莊榮輝, )

澱粉磷解酶的生理功能
在 1960 年以前,SP 是唯一在植物中發現可以合成澱粉的酵素,早期認為 SP 是
負責合成植物澱粉的主要酵素。但是在 de Fekete 等發現了結合性澱粉合成酶
(starch granule bound starch synthase, EC 2.4.1.11) 以及 Frydman 與 Cardini 發現的可
溶性澱粉合成酶 (soluble starch synthase, EC 2.4.1.21) 之後,加上在化學能量的觀點
上 SP 比較可能參與澱粉的磷解,所以現在將 SP 定位在磷解澱粉方向的磷酸化作
用上 。但是在 2004 年由 Zeeman 等人發現,將阿拉伯芥葉片中的 L-SP 基因抑制之
後,對於葉片中澱粉的分解並沒有多大的影響 ,推測 L-SP 在澱粉降解途徑中並
非一個必要的酵素。除此之外,在玉米粒中,Yu 等人也推測 SP 可能和澱粉生合成
相關基因的調控有關,因此 SP 的真正生理功能仍有待釐清 。

RNA 干擾術 (RNA interference)


一般為人所知的 gene silencing 技術為 anti-sense RNA 法。然而,至目前為止,
anti-sense RNA 對於 target gene 的抑制實驗,一直無法得到令人滿意的結果,其主
要原因,在於 (1) 單股 RNA 送入生物體內後極不穩定,很容易被 RNase 所水解;
(2) anti-sense RNA 無法完全抑制標的基因 (target gene) 的表現。在 1995 年時,以轉
錄後基因抑制 (post-transcriptional gene silencing) 為理論核心的 RNA 干擾 (RNA
interference, RNAi) 提出後,利用 RNAi 技術已成功抑制了多種生物體內基因的表
現。其極佳的專一性與長效性,使得 RNAi 獲選為 Science 2002 的 break through of
the year。
轉錄後基因抑制 (post-transcriptional gene silencing, 以下簡稱 PTGS) 最早是在植
物中發現的一種調節機制,在 2002 年後,其應用已成為現今最受重視的一項生物
技術。在最近數年的研究結果發現,自然界中, PTGS 可能是植物與動物用來抵禦
病毒入侵,或抑制與跳躍子基因表現 (transposon silencing) 有關的一種機制。目前
最令人感興趣的是以 PTGS 為理論基礎的 RNA 干擾術 (RNA interference, RNAi) :
一種藉由導入雙股 RNA (dsRNA) 而引發生物體中特定基因產生 PTGS 的現象。應用

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這種技術,已經在多種的生物體中,有效且專一的抑制標的基因的表現。以下,將
簡單介紹 RNAi 發現的歷程,及其作用機制。

生物體內基因抑制 (gene silence) 的現象


大約在十年前,Rich Jorgensen 嘗試引入某種製造紫色素的基因進入 petunias,試
圖藉此增加此牽牛花朵的紫色時發現,即使該基因接在一個極強的啟動子後端,
經轉殖後的植株,非但沒有產生更鮮豔的紫色花朵,反而出現了大量的班狀圖案 ,
甚至是白花。Jorgensen 將這種現象命名為 co-suppression,因為導入的基因與同質基
因 (homologous gene) 的表現同時受到抑制 。自此之後,在許多的植物中,也發現
了類似的現象。而在麵包黴 (Neurosporacrassa) 中所發現同樣的現象,使用的名稱為
quelling 。事實上,這兩者與 PTGS 皆為同一機制,只是使用名稱不同。究竟造成
co-supression 與 quelling 中 gene silencing 的原因為何?在某些基因轉殖植物中,已
發現核酸分子的甲基化可對基因的表現進行調控,這是屬於 transcriptional gene
silencing (TGS) 。在 TGS 中,受到調控的基因完全不表現,從 mRNA 的層次來看,
轉錄 (transcription) 受到了抑制,因此沒有相對的 mRNA 產生。而從 nuclear run-on
的實驗中發現,PTGS 所抑制的標的基因仍然會轉錄出 mRNA,但 mRNA 在細胞
質中卻被快速的降解,使得完整的 mRNA 無法累積 。
在 petunias 與 neurospora 中藉由人為的基因轉殖,發現可以產生 PTGS 的現象,
在這些受病毒感染的植物中,若病毒攜帶植物的內生性基因,則也有相同的反應 。
研究結果亦顯示,若植物細胞內有引發 PTGS 的反應,則 PTGS 可藉由某種小分子
的物質,在不同的細胞間傳輸 PTGS 的反應。這個現象,最早也在 Neurospora 中發
現 。之後的研究中, Palaugui 以經轉殖的植株,架接到未經轉殖的植株,發現
PTGS 的反應也會在非轉殖的植株產生 。究竟這種可以在細胞間傳送的小分子物質
為何?在以線蟲與果蠅為材料的實驗結果發現,這些小分子為雙股 RNA (dsRNA)

在線蟲中發現的 RNA 干擾現象


在 1995 年時,Guo 與 Kempheus 利用 antisense RNA,試圖抑制線蟲中的 par-1 基
因,實驗發現 antisense RNA 雖然可抑制 par-1 的表現,但 sense RNA 也有同樣的抑
制效果 。這個現象當時還無法得到合理的解釋,但在三年後, Fire 與 Mello 將某個
標的基因的 dsRNA (sense RNA 與 antisense RNA 的混合物) 注入線蟲體內後發現,
dsRNA 對標的基因的抑制能力,較單獨利用 sense RNA 或 antisense RNA 效果好 。
更在之後的研究證實,細胞中只要注入標的基因相對的 dsRNA 分子,就可以完全
抑制該細胞中標的基因的表現。而在線蟲的腸道中注入 dsRNA,不但可以抑制整個
個體中所有相對基因的表現,甚至在其所產生的第一子代 (F1 世代) 中,該基因的
表現也完全受到抑制 。而這種藉由 dsRNA 所引發的 gene silencing,隨後即被稱為
RNA interference。Fire 與 Timmons 建構可表現線蟲 unc-22 基因之 dsRNA 的細菌,
並用來餵食線蟲,發現這些線蟲的 unc-22 基因表現會受到抑制 。更進一步,直接
將線蟲浸泡在含有 dsRNA 的溶液中,也可以抑制相對的基因表現 。利用這些方法,

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許多線蟲中的基因,藉由使用 dsRNA 來進行各式各樣的功能性基因體實驗 。

果蠅中的 RNA 干擾現象


在果蠅中以 micro-infection 的方式,可成功的將 dsRNA 導入果蠅胚胎中,並引
發特定基因的 silencing 。在過去數年中,RNAi 技術已成功的成為 reverse genetics
工具。在果蠅的成體、胚胎或細胞株中,藉由 gene silencing 的方式,已經鑑定出多
種基因與其表現型 (phenotype) 之間的關係 。至於導入細胞中的 dsRNA 如何造成
gene silencing , 許 多 的 研 究 團 對 都 針 對 這 一 個 現 象 做 了 很 多 的 研 究 。 其 中 ,
Balulcomb 與 Hamilton 在植物中發現了一種長度約 25nt 的 dsRNA,若植株中可以
檢測到這種短鏈的 dsRNA,則可發現 PTGS 的現象,而在植株中不含有這種短鏈
dsRNA,則不具有 PTGS 。隨後,在其他的生物材料也發現,這種短鏈的 dsRNA 伴
隨 RNAi 存在 。
以果蠅為材料的各研究團隊發現了更多的 RNAi 相關機制 。Zamore 更將長鏈
dsRNA 加入果蠅胚胎的萃取物中,發現這些 dsRNA 會被降解成 21-23nt 長度的短
鏈 dsRNA 。他們同時也發現在導入 dsRNA 的細胞中,只有相對於這些短鏈 21-23
nt dsRNA 序列的 mRNA 會被降解,這說明了 PTGS 或 RNAi 專一性的原因。經由這
些發現, RNAi 的機制越來越清楚。

目前所認定的 RNAi 機制
藉由生物化學與遺傳學的方法,目前對於 RNAi 的機制已經有相當程度的瞭解。
而很多與 RNAi 相關的基因或酵素,也已在各種生物體中被鑑定出來。簡單來說,
RNAi 可以分為 initiation 與 effector 兩個主要步驟 (圖三) 。
在 initiation 步驟中,導入細胞的長鏈 dsRNA 會被降解成 21-23 nt 長度的短鏈
small interfering RNA (siRNA) ,也稱為 guide RNA 。細胞中水解 dsRNA 的酵素已證
實為一種 RNaseIII family 的雙股 RNA 水解酵素,稱為 Dicer 。Dicer 在不耗費 ATP
能量的情況下,可水解導入的長鏈 dsRNA,以及來自於轉殖基因 (transgene) 或病
毒 所 產 生 的 dsRNA 。 水 解 後 將 產 生 長 度 約 19-21nt 長 的 RNA duplex : 也 是
dsRNA,與一般 dsRNA 不同的之處,在於 siRNA 在 位置有兩個 nucleotides 的突出
(overhang) 。
而在 effector 步驟中,水解所產生的 siRNA 會與細胞中的一種 RNA-induced
silencing complex (RISC) 結合,藉由 ATP 做為能量的來源,將雙股的 siRNA 解旋
並活化 RISC。活化的 RISC 藉由其分子上的 antisense siRNA strand 與標的 mRNA 結
合,再由 RISC 分子上的 endonuclease 酵素的活性水解 mRNA。mRNA 降解的過程
還會進一步由其他未知的 nuclease 水解成小分子片斷 。

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圖三 RNAi 可能的作用機制

由於在許多生物體中,特別是植物中,極少量的 siRNA 即可產生有效的 gene


silencing,因此 RNAi 具有訊號放大的現象。一般認為,導入細胞的 dsRNA 除了可
被 Dicer 水解而生成更多小分子 siRNAs 外,siRNA 本身也可由生物複製,與上述
相關的酵素可能是細胞中的 RNA-dependent RNA polymerase (RdRP) ,與其他酵素
協同作用而產生 。

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圖四 RdRP 可能的作用機制

PTGS 與 RNAi 在生物體中所扮演的角色


從遺傳學與生物化學學的角度來看,PTGS 或RNAi 的存在具有演化意義。一般認
為,PTGS 可能是生物對於 transposons 或 RNA viruses 的一種防禦機制。而這種機
制可能在動植物尚未演化分離前就已經存在。許多研究結果都發現,將生物體內與
RNAi 有關的基因破壞,都會導致個體產生嚴重的發育缺陷 (developmental defects)
。這也顯示了RNAi 似乎參與了生物體的發育的途徑。生物體中,有兩種與 siRNA 非
常類似的小分子核酸。第一種是在C. elegans 中與發育相關的 small temporal RNAs
(stRNAs) ,其功能在阻礙轉譯進而達到調節基因的表現。研究中發現 C. elegans 中
lin-4 與 let-7 基因的 stRNA,是由 Dicer 將形成 stem-loop 的 RNA (約 70 nt) 水解而
來的。這些 stRNA 亦為 dsRNA,長度約為 22 nt,因此,Dicer 不但與 siRNA 的生成
有關,在生物體中,亦負責製造 stRNA。這也顯示了 RNAi 作用機制與 stRNA 的調
節途徑應有某種程度的相關 。第二種是在 Drosophila、C.elegans 與 HeLa cell 中發現
的數百種 22 nt 的 dsRNAs,稱為 microRNAs (miRNA) 。這些 miRNA 與 lin-4 與 let-
7 stRNA 產生的途徑非常類似,都是藉由 Dicer 水解 stem-loop 結構的 precursor
RNA 。miRNA 已證實與調節細胞中特定的基因表現有關。因此在演化上,stRNA 與
miRNA 和 siRNA 應有類似的功能,可藉由小分子 dsRNA 來調節基因的表現。

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長鏈 dsRNA 會引發非專一性的基因表現抑制
RNAi 的現象早在許多生物體中發現,如植物、原生動物、昆蟲與線蟲,但在哺
乳動物的細胞中,RNAi 卻很晚才被證實。其原因主要在於哺乳動物細胞中,若將
大於 30 nt 的 dsRNA 導入細胞中,則會引發細胞的非專一性 (nonspecific) 基因表現
抑制,全然不同於 RNAi 專一性的基因表現抑制。這種非專一性的基因表現抑制是
來自於哺乳動物細胞的抗病毒機制 (antiviral mechanism) ,其中相關的途徑有兩種。
(1) 當 哺 乳 動 物 細 胞 注 入 較 長 的 dsRNA 時 , 會 活 化 一 種 蛋 白 質 激 酶 (protein
kinase):PKR。被活化的 PKR 會對 translation initiation factor eIF2a 進行磷酸化,使
eIF2a 失去功能 (inactivation) ,進而無法行轉譯作用,使得細胞產生整體性非專一
的基因表現抑制現象。(2) 長鏈的 dsRNA 也會活化 2’-5’-oligo adenylate synthetase
(以下簡稱2’-5’-AS),2’-5’-AS 會進一步活化 RNaseL 以水解細胞內所有的單股
RNA,而導致非專一性的 mRNA 降解 (圖五)。

圖五 長鏈 dsRNA 可能引發非專一性的基因表現的機制

許多研究團發現在老鼠胚胎幹細胞 (mouse embryonic stem ES cell) 中,並不具備


這種抗病毒的反應 。因此,在這些細胞株中,長鏈的 dsRNA 或許能為 RNAi 所用。
然而,在大部分的哺乳動物細胞中,長鏈 dsRNA 都無法產生專一性的 RNAi 結果,
因此短鏈的 siRNA 是較佳的選擇。

使用 siRNA 可以 避免 PKR 非專 一性的 抑制


長度小於 30 nt 的 dsRNA 並不會引起 PKR kinase 的反應,因此當 RNAi 應用在
哺乳動物細胞株時,多使用 siRNA 當做基因抑制的導入物。當 siRNA 導入哺乳動
物細胞株時, 可引發相當專一的抑制,但其抑制能力則由於樣品差異而有不同的
結果。在細胞中,最高可以達到 90 % 的基因表現抑制 。經研究後發現,最有效的
siRNA 長度為 21 nt,且在其 3’ 端有兩個 U 或是 T nucleotides。而 siRNA 抑制的專
一性很高,就算在 siRNA 序列上只有一個鹼基的差異,就可以使得抑制效果大不

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相同 。然而,並非符合上述條件的 siRNA 就能有效抑制基因的表現,siRNA 序列的
設計將影響到 RNAi 的結果 。

RNAi 的應用
自從 Elbashir 在 2001 發表以 siRNA 對哺乳動物細胞株的基因抑制實驗後 ,在兩
年內,已有無數發表的實驗結果是以 siRNA 為技術核心。siRNA 之所以能在短時間
被廣泛應用,主要是它專一性的抑制基因表現能力,可提供研究者瞭解其基因的
身份 (identity) 與功能 (function) 。目前,以 siRNA 為主的 RNAi 技術主要有以下的
應用:

1. 測 試 未 知 基 因 功 能 假 說 的 正 確 性 (Testing Hypotheses of Gene


Function)
藉由microarray 的方式,科學家已經在無數的實驗中,得到大量的資訊。而實
驗結果中發生表現差異的基因 (differential expressed gene) ,時常是未知的 EST-
tag。目前,未知的 EST 基因通常是以序列間的同質性做比對,來預測此基因的
功能並提出假說。siRNA 則提供了測試這些未知基因功能假說正確性的一個方法
曾發現血清處理的 myotubes 會使 glucose 攝取量增加,並伴隨細胞表面 glucose
transporter (GLUT1) 表現量增加 。為了確定 GLUT1 與 glucose 攝取量之間的關
係,他們將細胞以 GLUT-1 siRNA 處理後發現,缺乏 GLUT-1 表現的 myotube
即 使在 血清 處理 後, 其 glucose 攝 取量 仍然 不變 ,證 實了 GLUT-1 可 促進
myotubes 對 glucose 的攝取。

2. 標的 確認 (Target Validation)
在 新 藥 開 發 上 , 有 標 的 鑑 定 (target identification) → 標 的 確 認 (target
validation) → 藥物開發 (drug development) → 藥物測試 (drug test) → 臨床試驗
(clinical trial) 的標準流程。由於 siRNA 的高專一性,因此非常適合作為 target
validation 步驟使用。將可能的治療標的 (therapeutic target) 基因表現抑制,其結
果可作為相對抑制性藥物 (inhibitory drug) 實驗的正對照組 (positive control) 。因
此,siRNA 目前逐漸用於新藥開發過程的標的基因抑制實驗。舉例來說,Cyclin
E 在許多腫瘤細胞中皆大量表現,為了確定這個蛋白質可以作為治療的標的物,
Li 等人使用了cyclin E 的 siRNA 來抑制肝細胞腫瘤 (hepatocellular carcinoma,
HCC) 中的 cyclin E 基因表現 。實驗發現,cyclin E 的 siRNA 可以促進腫瘤細胞
產生細胞凋亡 (apoptosis) 的現象。此外,siRNA 更可以抑制裸鼠 (nick mouse) 中
HCC 的生長。因此,能抑制 cyclin E 表現的藥物,應可作為抑制 HCC 生長所用。

3. 途徑 分析 (Pathway Analysis)
另一個 siRNA 的應用為途徑分析 (pathway analysis) 。舉例來說,抑制 p53 基
因表現,勢必也將抑制 p53 所調控的所有下游 (down stream) 基因的表現。因此,

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當細胞以 p53 siRNA 處理後,再以 microarray 比較與對照組的基因表現差異,
所有 mRNA 表現降低的基因,可能都會受到 p53 的調控。藉由這個方法,可以
發現某蛋白質所調控的下游基因。

4. 基因 的重複 性 (Gene Redundancy)


將真核細胞中,與生長相關的重要基因被抑制後,並不一定會使這個細胞死
亡,因為,在細胞中能有其他相關的基因,可以用來彌補這些因失去某些重要
基因表現所造成的傷害。siRNA 的技術可以用來研究這些功能重複 (redundant)
基因間的關係。藉由兩種或兩種以上基因的 siRNA 共同導入細胞,可以瞭解
redundant gene 的關係。舉例來說,Akt serine/threonine kinase 已被認為與細胞中
glucose 的濃度調節有關。Katome 曾使用 Akt2 的 siRNA 對細胞進行基因抑制實
驗時,卻發現細胞中 glucose 的濃度變化並不明顯,但當他將 Akt1 與 Akt2 兩
種基因的 siRNAs 導入細胞後,卻發現細胞中 glucose 的濃度有很大的變化 。由
此推論 Akt1 與 Akt2 共同參與了細胞 glucose 濃度的調節。

5. 功能 搜尋 (Functional Screening)
科學家可以大規模地對某一種生物體中所有的基因表現進行分析藉由建構龐
大 siRNA library,也就是所謂功能性基因體 (functional genomics) 的研究。目前,
科學家在線蟲中 (C. elegans) ,已利用 RNAi 的方式,分析 10000 個以上不同的
基因,並發現了與調節脂肪合成 、生長 與突變控制 有關的基因。而以果蠅為材
料的實驗也有類似的計畫進行 。而功能性基因體研究成功的重要依據,則是表
現型的分析方式與高品質的 siRNA library。

系統生物學 (Systems Biology)


在西元 2000 年初期,一個新的學門,系統生物學 (systems biology) 開始蓬勃發
展,而瞭解生物系統各分子間的交互作用 (molecular interaction),則是系統生物學
的基礎。把一個細胞當作一台電腦,裡面有許多的小單位 (small parts) 零件,一如
細胞內有許多的蛋白質、核酸、糖類、脂質與小分子代謝物。這些小單位各司其職,
並且一起指揮一台電腦的功能或是細胞的生老病死。因此,無論利用核酸微晶片之
轉錄體學 (transcriptomics) 技術,或者是二維膠體電泳等的蛋白質體學 (proteomics)
技術來分析細胞中之 mRNA 分子或蛋白質分子的含量變化,僅能瞭解各基因受到
環境影響或藥物刺激時,是否會有表現量上的變化,有如分析系統中個別元件數
量之多寡。但對於系統中各元件 (分子) 間的交互作用,卻無法解釋。而在生命科學
的研究上,若忽視分子與分子間相互的影響,單單研究個別分子的變化,很難有
機會瞭解生理現象的全貌。
系統生物學的研究,需要總合基因體學、轉錄體學、蛋白質體學等大規模 (large
scale) 實驗技術所產生的數據,並歸納整合出整體之路徑圖 (route map) 因此在研究
上,需要集合生物學家、統計學家、電腦學家甚至數學家。目前,研究系統生物學多

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使用模式生物 (model organism) ,而這些模式生物,如人類細胞株、酵母菌,多已
具備完整之基因體資料庫。科學家運用這些基因體資料庫,以傳統之免疫染色、酵
素活性分析、核酸微晶片、蛋白質二維膠體電泳和質譜儀鑑定等技術,逐漸建構出
各生物體中之系統生物學路徑圖。舉例來說,由著名期刊 Nature 所主導的 AFCS
(Alliance for Cellular Signaling) 聯盟,即是一個系統生物學研究的權威,目前已建
構出人類六個訊息傳導 (signal transduction) 的路徑,包括所有細胞皆具備的 PIP3
訊 息 傳 導 途 徑 、 巨 噬 細 胞 之 chemotaxis 與 interleukin 4 訊 息 傳 導 途 徑 , 以 及
astrocytes、epithelial cells and platelets 等相關之 UDP 訊息途徑,以及與 Ca5 有關之
途徑以及與抗體分子 Fc 接受器有關之訊息傳導途徑。在應用上,以 PIP3 訊息傳導
途徑為例 (圖六) ,全球科學家在進行相關 PIP3 訊息傳導研究時,可直接利用此路
徑來預測個人研究之結果。而實際上,系統生物學所產生的結果,不僅可運用於基
礎研究,在藥物作用與副作用的預測上,可以省去大量的經費與時間。因此,運用
系統生物學實驗方法所得到的實驗結果,對未來將有廣泛而深遠的影響。
目前,全球已有許多獨立機構以系統生物學方式進行研究,除了 ASCF 外,其
中最著名的,包括在西雅圖的私人研究單位 ISB (Institute of Systems Biology) ,以
及由美國政府之能源部 (Department of Energy, DOE) 與國家衛生研究所 (National
Institutes of Health, NIH) 所資助的 PNNL (Pacific Northwest National Laboratory)。ISB
著重在人類細胞的訊息傳導途徑的建構,用以輔助未來藥物的開發與疾病的治療 ,
是屬於私人之營利單位。而 PNNL 為政府補助機構,其利用系統生物學方式來鑑定
微生物 (microorganism) 對人類的影響。至 2005 年為止,上述兩個單位已有許多重
要 的 發 表 。 (ISB 共 發 表 59 篇 ,
http://www.systemsbiology.org/Resources_and_Development/Current_Publications ; PNNL 共 發 表 5191 篇 ,

http://www.pnl.gov/main/publications/externalRpt.asp 。)

12
圖六 AFCS 所建構的 PIP3 訊息傳導路徑圖
在 ACFS 的網頁上,各種訊息傳導途徑之相關分子與作用機制,皆可藉由滑鼠游
標點取,而獲得充分詳細的說明與連結。網址 : (http://www.signaling-gateway.org/)
(Adapted from ACSF website)

植物之系統生物學研究
植物的系統生物學研究成果遠不及人類或其他系統生物之進展,其主要原因在
於植物領域的基礎研究較少,且經費十分缺乏。在研究上,有兩個主要原因造成研
究進度的落後。第一個原因是植物品系間的差異,一種植物具有各種不同的品系,
不同品系樣品是否會造成研究之影響仍不得而知,因此多採用模式生物進行研究。
而植物題材之唯一的模式生物為阿拉伯芥,全球各地使用阿拉伯芥作為研究題材
的實驗室雖不少,但系統生物學需要龐大的基礎資訊作為分析藍本,目前所產生
的數據顯然較人類或酵母菌不足。第二個原因是實驗設計的困難,由於人類或酵母
菌等模式生物可以利用細胞株進行實驗,因此外加藥物或基因轉殖的實驗比較容
易進行。創造出多種不同的外界誘導條件 (external inducing condition) 來探討分子表
現上的變化。但由於植物細胞具細胞壁,因此要獲得穩定細胞株為實驗材料不易,
所以大多需使用完整植株進行實驗,加上全球農業生技市場對於基因改造作物
(genetically modified organism, GMO) 的嚴格把關,使得基因轉殖方法在植物的研究

13
上,受到諸多限制。在未掌握確切的誘導條件前,就無法產生一明確的研究主題。
因此,受到上述的限制,植物之系統生物學在研究上,進度遠落後於動物與微生
物之研究。
在植物的系統生物學研究中,主要是以阿拉伯芥作為題材。阿拉伯芥為植物樣品
唯一的模式生物材料,其 5 對染色體共有 120,000,000 鹼基已在西元 2000 年底時由
美國與歐盟合作下完成定序。關於阿拉伯芥的基因體計畫目前仍持續進行,由美國
NSF (National Science Fundation) 或歐盟 (European Union) 所資助的植物系統生物學
研 究 計 畫 , 包 括 Dr. Beynon 所 領 導 的 Complete Arabidopsis Transcriptome
MicroArray (CATMA) program (http://www.catma.org) 。其主要的工作,是以現有的
阿拉伯芥基因體資料庫為藍本,藉由國際合作之方式,取得各基因的 GSTs (Gene-
specific Sequence Tags),即基因註解 (gene annotation) ,目的在確定核酸微晶片實
驗中所有基因的身份。而另一個由 Dr. Shinozaki 所領導的 RIKEN Genome Sciences
Center ,則是建立阿拉伯芥的 GPS (Genome-Phenome Super-high-way),藉由簡單
易懂的圖形化使用者介面 (GUI, graphic user interface),來查詢阿拉伯芥各基因在染
色體上之相對位置。
在系統生物學中使用阿拉伯芥為題材的研究單位很多,其中最著名的為比利時
Ghent 大學的植物系統生物學系 (PSB department, Plant Systems Biology department,
http://www.psb.rug.ac.be/)。目前,該單位由多名科學家分工從事阿拉伯芥系統生物
學 研 究 的 各 領 域 , 包 括 Molecular Genetics Division 、 Functional Genomics
Division 、Computational Biology Division、Bioinformatics and Evolutionary Genomics
Division 、 Plant-Microbe Division 與 Genome Dynamics and Gene Regulation
Division,至目前為止,已有眾多發表。而國際上,還有數個以阿拉伯芥為材料,進
行系統生物相關研究的單位 (圖七) 。然而,至目前為止,阿拉伯芥或其他植物材料
的系統生物學研究,尚未產生類似 ASCF 之訊息傳導或代謝的路徑圖 (圖六) 。

圖七 全球其他以阿拉伯芥為材料,進行系統生物學研究之計畫

14
以植物澱粉代謝途徑為系統生物學研究之題材
澱粉是植物中含量最高的生物聚合物,也是人類所攝取的最主要多醣來源,因
此釐清澱粉代謝的機制,將有助於作物改良與栽培,其長遠目標是解決糧食問題。
然而,植物澱粉代謝的機制非常複雜 (圖八) ,參與的酵素種類很多,其中研究較
多的包括 (1) 直接參與澱粉合成之澱粉合成酶 (starch synthase) 與 UDPGlc / ADPGlc
焦磷解酶 (UDPGlc / ADPGlc pyrophosphorylase) ; (2) 參與澱粉分解之各種澱粉酶
(amylase) ; (3) 參與修飾澱粉結構之分支酵素 (branch enzyme) 或去分支酵素
(debranching enzyme) ; (4) 其他糖類分子代謝之酵素如六碳糖激酶 (hexose kinase)
或 (5) 磷酸糖轉化酶 (phosphoglucomutase) ;以及研究多年,功能尚未確定的澱粉
磷解酶 (starch phosphorylase) 。澱粉代謝個別酵素的催化反應機制雖已明瞭,但由
於代謝路徑上遍佈分支點 (branched point),因此,在不同的外界環境刺激下,植物
澱粉之合成與分解確切路徑仍充滿疑問。

15
16
圖 八 目 前 所 認 定 植 物 澱 粉 代 謝 的 途 徑 (Adapted from KEGG: Kyoto Encyclopedia of

Genes and Genomes)

17
實驗動機
澱粉是植物中含量最高的生物聚合物,也是人類所攝取的最主要多醣來源,為
了因應未來世界人口的快數成長,糧食作物可能供不應求的情況,釐清澱粉代謝
的機制將會有助於作物改良與栽培,其長遠目標是解決糧食問題。
植物澱粉代謝的機制非常複雜 (圖八),過去在探討這些代謝相關酵素的功能,主
要是利用篩選植物的突變株,利用功能消失 (function disability) 與表現型變化
(phenotype change) 來推論這些酵素在植物代謝上可能扮演之角色。但是由於突變株
的篩選不易,許多植物澱粉代謝相關酵素的生理功能仍不清楚。
1962 年時 Hassi 比較澱粉合成酶 (starch synthase, SS) 與 L-SP 在合成澱粉所需的
化學能量。比較 UDPGlc (SS 的基質) 與 Glc-1-P (L-SP 的基質) 的化學鍵能量時發現,
UDPGlc 的 glycosidic bond 水解所放出的熱量 (△F = -7.6 kcal),要比 Glc-1-P 的
phosphoester bond 水解 (△F= -4.8 kcal) 大得多,而葡聚醣的  -1,4 鍵結水解能量為
△F = -4.3 kcal,所以以 UDPGlc 為基質的 -1,4 葡萄糖鍵結反應要比以 Glc-1-P 為
基質的容易進行 。而在 pH 7.5 時,澱粉合成酶所催化的澱粉合成反應平衡常數為
250,也遠大於 L-SP 合成反應的平衡常數,因此單就能量的觀點而言,傾向澱粉
合成酶才是造成大量澱粉累積的酵素。但是由於澱粉合成酶不具有合成糖引子
(sugar primer) 的能力,無法自行生成糖引子來延伸碳鏈,而 L-SP 在試管中 (in
vitro) 的實驗上卻擁有這樣的功能,不僅可以合成澱粉也可以磷解澱粉 ,加上認為
L-SP 參與澱粉合成之論文亦時而有見,所以 L-SP 在植物體內真正扮演的角色依舊
不清楚 。
本實驗室雖獲得眾多生化實驗之證據 ,支持 L-SP 可能參與植物澱粉合成系列反
應最初所需之糖引子,然而在缺乏其他生理實驗或突變株支持下,這個新的理論
一時還無法廣為接受。所以本論文希望以一套利用 RNAi 抑制植物原生質體內基因
表現的的平台,來觀察當原生質體內的 L-SP 基因被抑制之後,是否會影響因蔗糖
刺激而導致細胞內澱粉累積現象的消失。除此之外,亦利用系統生物學的觀念來尋
找因蔗糖誘導所產生的澱粉累積現象,其中澱粉累積的過程是由哪些基因交互作
用所造成的結果,不僅欲利用 RT-PCR 技術來探討目前所認定澱粉代謝途徑中的特
定基因,也藉由二維膠體電泳分析來尋找表現量有變化的蛋白質,進而建立馬鈴
薯葉片中因蔗糖誘導所造成澱粉累積的系統生物學。圖九為本論文實驗設計與期望
的結果假想圖。

18
第一部分:L-SP功能探討
方法一 方法二
L-SP siRNA GFP siRNA
4 sequences
L-SP siRNA GFP siRNA UU
UU
UU
UU UU
UU

4 sequences UU
UU
UU
UU

UU UU UU

Transfection
UU UU UU
UU UU
Potato leaf UU UU

Transfection Potato leaf Potato leaf

Protoplasts
isolation Sucrose Sucrose
induction induction
1 2 3 4 GFP 1 2 3 4 GFP

RT-PCR RT-PCR

Western Western

Starch Starch

第二部分:系統生物學探討經蔗糖誘導後澱粉代謝相關基因變化

0 6 12 18 24 Hr 0 6 12 18 24 Hr
Intensity
Intensity

Gene A Gene C
0 6 12 18 24 Hr 0 6 12 18 24 Hr
Gene B Gene D Time (Hr) Time (Hr)
Gene A Gene C

RT-PCR RT-PCR RT-PCR

Sucrose induction time course To know the pathway

Wild type Sucrose Osmotic


induction control

2-DE Using MS analysis


to identify the up-
regulated and down-
regulated proteins

圖九 實驗設計與期望結果

19
第二章 材料與方法
實驗材料為馬鈴薯 (Solanum tuberosum) 葉片與塊莖 (tuber)。馬鈴薯塊莖購於台
北縣新莊市附近的傳統市場。買回後的薯球,也是馬鈴薯塊莖的部份,清洗後放
置於 25 ℃ 環境下等待發芽,發芽後種植在光週期為白晝 16 小時溫度 25℃,黑
夜 8 小時溫度 23℃ 的溫室中。馬鈴薯 (Solanum tuberosum) 屬於茄科 (Solanaceae)
、茄屬 (Solanum) ,為一年生草本植物。

馬鈴薯塊莖的 L-SP 純化法


馬鈴 薯塊莖 蛋白粗 抽法
酵素純化的第一要件就是要將實驗環境的溫度控制在低溫下。所以在冰浴的情
況下,將材料均質化後去除殘渣。將製成簽的馬鈴薯在冰箱中利用果機機均質,
接著利用硫酸銨與蛋白質產生水合,使得蛋白質之間得以非極性基團互相結合,
因而鹽析出蛋白質。由於細胞內的蛋白質表面的疏水區並不全然相同,所以可以
利用不同濃度的硫酸銨做初步分化。

儀器設備:
製簽用具
果汁機或均質機
紗布
高速冷凍離心機 (Hermle Z323K)
透析袋 (Viskase Companies, Inc., 311313)
攬拌器 (stir plate)

藥品試劑:
粗抽緩衝液 A:
Tris (50 mM) (BDH 103157P) 6.6 g

加水 800 mL 溶解,以 6 N HCl 調整 pH 成 7.4 後,加水至 1 L。使用時加水


稀釋 5 倍,並加入 2-mercaptoethanol (Merck, S3117833) 使其最終濃度為 1
mM。
(Tris = Tris [hydroxymethyl] methylamine,其 pH 受溫度影響很大)
粗抽緩衝液 B:
緩衝液 A 再加入 1 % (w/v) polyvinylpolypyrrolidone, PVPP (Sigma P-6755)
粗抽緩衝液 C:
緩衝液 A 再加入 NaCl 成為 0.15 M 濃度。
硫酸銨 (ammonium sulfate) :

20
硫酸銨 (Merck 101211) 於烘乾去除水份後,直接使用於蛋白質粗抽液中。
Protease inhibitor cocktail (Sigma, P 8340)
Phenylmethylsulphonyl fluoride, PMSF (Sigma, P 7626)
利用 Isopropanol 先配置成 200 mM 保存液,使用時再稀釋至最終濃度 0.1-
1.0 mM。本實驗使用 PMSF 濃度為 1 mM。

方法步驟:
1. 取重約 100 g 的新鮮馬鈴薯塊莖製簽,加入 100 mL 冰冷緩衝液 B,加入適
量 PMSF 保存液後在 4 ℃ 下使用果汁機使之均質,高速攪拌 1 分鐘,停止
攪拌冷卻 1 分鐘,重複 5 次。
2. 均質液以四層紗布過濾,取濾液在低溫離心機下以 12000 rpm 離心 20 分鐘;
收集上清液即得粗抽取液,測量其體積。
3. 取上清液於冰浴下,根據表一緩緩加入適當的硫酸銨粉末並不時攬拌,達到
所要的飽和濃度 (20%),,持續攬拌平衡 10 分鐘後,使用低溫離心機進行
12000 rpm 離心 20 分鐘。
4. 收集上清液 (0-20%分劃之沈澱不含 SP 可丟棄) ,重新測量體積,繼續以硫
酸銨沈澱,加到下一個飽和濃度 (60%)。
5. 同上收集沈澱後,溶在最少體積之緩衝液 C,並測量其最終體積若干後,再
加入適量之 protease inhibitor cocktail。
6. 置於透析袋中對 5 L 的緩衝液 C 透析過夜,次日以 12000 rpm 離心 20 分鐘
後取上清液,得到粗抽蛋白質。

表一 硫酸銨分劃表
0℃ 最終硫酸銨百分飽和濃度
20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 90 100
加入 1 L 溶液中之固態硫酸銨克數
硫 0 106 134 164 194 226 258 291 326 361 398 436 476 516 603 697
酸 20 0 27 55 83 113 143 175 207 241 276 312 349 387 469 557
銨 25 0 27 56 84 115 146 179 211 245 280 317 355 436 522
起 30 0 28 56 86 117 148 181 214 249 285 323 402 488
始 35 0 28 57 87 118 151 184 218 254 291 369 453
百 40 0 29 58 89 120 153 187 222 258 335 418
分 45 0 29 59 90 123 156 190 226 302 383
50 0 30 60 92 125 159 194 268 348

55 0 30 61 93 127 161 235 313

60 0 31 62 95 129 201 279
濃 65 0 31 63 97 168 244
度 70 0 32 65 134 209
75 0 32 101 174
80 0 34 139
90 0 70

21
本表數據來自 Methods in Enzymeology (1990) Vol. 182, p. 291,而該表原始資料又來自 Data for
Biochemical Research (1969) Dawson, R.M.C et al (ed), 2nd edition, Oxford Univ. Press.

離子 交換法
本 實 驗 所 使 用 的 層 析 介 質 為 DEAE Sephacel , 其 交 換 基 DEAE
(diethylaminlethyl) 是一種陰離子交換基,其 counter ion 為氯離子。

儀器設備:
鐵架以及固定環
層析管柱
Amicon YM-30

藥品試劑:
DEAD Sephacel
粗抽緩衝液 C (含 0.15 M NaCl 的粗抽緩衝液 A)
粗抽緩衝液 C2 (含 0.2 M NaCl 的粗抽緩衝液 A)
粗抽緩衝液 C3 (含 0.3 M NaCl 的粗抽緩衝液 A)
粗抽緩衝液 C4 (含 0.4 M NaCl 的粗抽緩衝液 A)
粗抽緩衝液 C5 (含 0.5 M NaCl 的粗抽緩衝液 A)
經過透析後的的馬鈴薯塊莖粗抽蛋白質樣品
200 mM Phenylmethylsulphonyl fluoride, PMSF

方法步驟:
1. 取 10 mL DEAD Sephacel 裝填於管柱中,並以粗抽緩衝液 C 流洗 10 倍膠體
體積。
2. 將樣品注入管柱後,以 30 mL 緩衝液 C 流洗管柱並開始搜集流洗液 (每 5 mL
蒐集成一管)。
3. 依序再各以 30 mL 緩衝液 C2、C3、C4、C5 流洗管柱並搜集流洗液。
4. 測試分劃液中的 SP 活性後,蒐集具有 SP 活性的各分劃液,以 Amicon YM-
30 濃縮至 3 mL 左右,以便進行 7.5 % Native-PAGE 之製備式電泳。

電泳 檢定法
電泳的高解析力使其成為生化技術中最有力的一門分析利器,以下簡略說明各
種電泳的形式及其應用: (1) 不連續膠體電泳 (disc-PAGE, native-PAGE) 是以原態
蛋白質進行電泳,一般用作純度檢定或活性分析; (2) SDS-膠體電泳 (SDS-
PAGE) 則用於蛋白質次單元體分子量的檢定; (3) 梯度 (gradient) 電泳則是在鑄膠
過程中,製造聚丙烯醣胺的連續梯度,可以使電泳解析力大為提高; (4) 親和性

22
層析法,則是在電泳膠體 (通常為不連續膠體電泳) 內加入與酵素具有親和性的物
質,通常為其基質,則該酵素在電泳過程中會因與基質的結合而產生泳動率的延
遲 (retardation) ,可為檢定此酵素存在與否的一種依據。本實驗室主要以迷你式平
板直立電泳器材,進行電泳分析,而用於酵素純化時,則採用製備式的電泳套組。

不連續膠體電泳 (Native-PAGE)
不連續膠體電泳是最基本的聚丙烯醯胺電泳形式,在分離膠體 pH 8.8 的電泳條
件下,大部分 pI 小於 8.8 的蛋白質分子均能往正極移動,因此分子的泳動率則與
電荷密度 (負電荷/分子量) 成正比。由於膠體中不含介面活性劑 (SDS 等) ,因此在
電泳完畢後其活性多能保持,可以在膠體上做酵素活性染色,也可用於大量樣品
的純化,即製備式電泳。 (Andrews, 1986; Dunn, 1993)

儀器設備:
電泳玻片及鋁片
間隔條 (Spacer, 0.5 mm, 0.75 mm, 1.5 mm)
齒狀條 (Comb, 10 well)
鑄膠套件 (五片裝及單片裝)
電泳槽 (Hoefer SE-250,平板式垂直迷你電泳槽)
電源供應器

藥品試劑:
通用電泳緩衝液:
Tris (25 mM) 15.1 g
Glycine (192 mM) 72.1 g

調 pH 值至 8.3,加水至 5 L,儲存於室溫
A 液 (丙烯醯胺溶液) (T 30%, C2.6%) :
Acrylamide (40%, Amersham-17-1303-01) 36.5 mL
Bis (Amersham-17-1304-02) 0.4 g

加水至 50 mL,儲存於 4℃
B 液 (分離膠體緩衝液) :
Tris 18.2 g
TEMED (Sigma, T-8133) 0.36 mL

以 HCl 調 pH 值至 8.8,加水至 100 mL,儲存於 4℃


C 液 (焦集膠體緩衝液) :
Tris 0.6 g

23
TEMED (Sigma, T-8133) 40 μL

以 HCl 調 pH 值至 6.8,加水至 10 mL,儲存於 4℃。


Native tracking dye:
Bromophenol blue 1 mg

溶於 5 mL 通用電泳緩衝液,加 5 mL 甘油 (glycerol) 混勻。


APS 溶液 (Ammonium persulfate 10%) :
Ammonium persulphate (Amersham-17-1311-01) 0.1 g

溶於 1 mL 二次水中,使用前新鮮配製。
異丙醇 (Isopropanol)

方法步驟:
鑄膠:
1. 將電泳玻片以及鋁板清洗後擦乾,以異丙醇擦拭乾淨,選擇所需厚度的間隔
條將其組裝於鑄膠套件中。
2. 依照下表所列的各溶液比例,選擇所需的分離膠體濃度,配置膠體溶液,其
中 APS 溶液必須最後加入,小心混勻,避免氣泡產生,慢慢倒入裝置好的
鑄膠套件中。
3. 注入分離膠體容易後留下 2 cm 高度,之後在各膠片組合中加入 100 µL 異丙
醇,壓平膠體液面。
4. 約 30 分鐘後 (天冷須更久時間),完成凝膠後將異丙醇倒出。
5. 配置焦集膠體溶液,並先準備齒狀條 (comb) ,加入集焦溶液後立刻插入,
約 15 分鐘後完成凝膠。
6. 拆卸鑄膠套件,將多餘的凝膠去除,膠片以擦手紙包好置於封口袋中,並加
入少量蒸餾水防止膠片乾裂,放在 4℃ 保存,使用期限為一週。

表二 一般常用的 Native-PAGE 的分離膠體與焦集膠體的參考濃度配方


膠體溶液 分離膠體溶液 焦集膠體
5% 7.5% 10% 12.5% 15% 20% 4%
A 1.65 2.5 3.3 4.15 5 6.7 0.66
B 2.5 -
C - 1.24
H2O 5.8 4.95 4.15 3.3 2.45 0.75 3.0
APS 0.05 0.1
總體積 10 5

24
(單位:mL)

電泳:
1. 先取出膠片回溫,將稀釋成一倍的通用電泳緩衝液倒入電泳槽底部。在避免
氣泡產生的情況下,將電泳夾夾妥後,在電泳玻片的上方,加入電泳緩衝液。
2. 取適量的樣品 (約 10-15 µL) ,加入 1/4 樣品體積之 Native tracking dye,混合
均勻後以微量吸管小心的注入膠體中的樣品槽,途中應避免氣泡的產生。
3. 將電泳槽上部的蓋子蓋上,確認正負極裝置正確,接上電源供應器,定電壓
以 150 V 進行電泳,若膠片需做活性染色,則必須在 4℃ 冰箱中進行電泳。
4. 待 Native tracking dye 跑出膠片外,關掉電源,取出膠片中的膠體,以解剖
刀截角以做記號,準備進行染色。

SDS 膠體電泳
SDS 膠體電泳是在不連續膠體電泳系統中,利用 SDS (sodium dodecyl sulfate)
這種清潔劑 (detergent) 附著在蛋白質疏水區的表面,由於 SDS 本身所帶之負電荷,
會引導蛋白質分子在電泳過程中移動。由於蛋白質本身所帶之電荷遠小於其表面
所附著之 SDS 分子,蛋白質本身所帶電荷對泳動率沒有影響,泳動率高低的決
定因素只在於蛋白質的分子量,因此 SDS 電泳非常適合測定蛋白質分子量。在樣
品處理過程中,常利用加熱破壞蛋白質的三級結構及四級結構,使其分子內部的
疏水區暴露而易與 SDS 結合;而還原劑加入的主要目的是破壞蛋白質原有的分
子內雙硫鏈 (intramolecular disulfate bond) ,並防止分子間 (intermolecular) 雙硫鏈
產 生 而 造 成 不 規 則 的 聚 合 物 (aggregation) 產 生 , 常 使 用 的 藥 品 為 2-
mercaptoethanol 及 dithiothreitol。因此 SDS 膠體電泳以廣泛地被用於蛋白質次單元
體分子量的決定及蛋白質純度判斷。 (Andrews, 1986; Dunn, 1993)

儀器設備:
同不連續膠體電泳

藥品試劑:
除了不連續膠體電泳所使用的藥品外,還需配置以下的藥品:
SDS 電泳緩衝液:
Tris base (最終使用濃度 25 mM) 15.1 g
SDS (Amersham-US75819, 0.1%) 5.0 g
Glycine (192 mM) 72.1 g

先以 4 L 水溶解,將 pH 值調至 8.3,再加水至 5 L,儲存於室溫


10﹪SDS:

25
SDS 5.0 g

加水至 50 mL,儲存於室溫。SDS 粉抹易隨風揚起,配置時應戴口罩避免吸


入。
SDS-PAGE sample buffer (2×) :
Tris (125 mM x 2) 0.3 g
EDTA•2 Na (2 mM x 2) 14.9 g
SDS (2% x 2) 0.4 g
ß-mercaptoethanol (5% x 2) 1.0 mL
Glycerol (10% x 2) 2.0 g
Bromophenol blue 少許

調 pH 值至 6.8,加水至 50 mL,儲存於 4℃。


低分子量標準蛋白質組合
Low molecular weight marker kit (Amersham-17-0446-01):

Protein M.W. (Da)

Phosphorylase B 94,000

Bovine serum albumin 67,000

Ovabumin 43,000

Carbonic anhydrase 30,000

Trypsin inhibitor 20,000

α-Lactalbumin 14,000

方法步驟:
方法同上節不連續膠體電泳。

表三 一般常用的 SDS-PAGE 的分離膠體與焦集膠體的參考濃度配方


膠體溶液 分離膠體溶液 焦集膠體
5% 7.5% 10% 12.5% 15% 20% 4%
A 1.65 2.5 3.3 4.15 5 6.7 0.66
B 2.5 -

26
C - 1.24
10%SDS 0.1 1.05
H2O 5.7 4.85 4.05 3.2 2.35 0.65 2.95
APS 0.05 0.1
總體積 10 5

(單位:mL)

製備 式電泳 與電泳 溶離
製備式電泳是利用平板式聚丙烯醣胺膠體電泳,進行蛋白質樣品的分離,以電
泳溶離回收而達到純化的目的。其解析力高的特性,雖可快速的純化我們所需的
蛋白質,然而其使用上仍有一些限制: (1) 必須能夠確認欲純化的蛋白質在膠體
上的位置,通常使用 CBR 染色及活性染色; (2) 蛋白質濃度過低的樣本不宜使用,
因 電 泳 溶 離 的 回 收 過 程 會 造 成 大 量 的 損 失 ; (3) 電 泳 膠 體 上 會 發 生 拖 尾
(smearing) 的蛋白質,由於其分佈範圍太過寬廣,不易定位回收,所以不適用,
如醣蛋白有這種現象。

儀器設備:
平板式垂直電泳槽 (Hoefer SE-600)
電泳玻璃片 (18 x l6 cm)
間隔條 (Spacer, 3 mm)
電泳溶離設備 (ISCO Model 1750 electrophoretic concentrator,電泳濃縮器)
解剖刀 (Feather No. 23)
電源供應器 (ISCOmodel453)
透析膜

藥品試劑:
所有電泳膠體溶液的配製及鑄膠方法詳見電泳一節所述
電泳溶離緩衝液:10 mM Tris-acetate, pH 8.6

方法步驟:
電泳及切割膠片:
1. 使用 SE-600 的鑄膠器,以 3 mm 間隔條鑄造 7.5 % 及 4% Native-PAGE (30
mL 分離膠體,10 mL 焦集膠體) ,置於 4℃ 冰箱中預冰。
2. 樣品加入 1/4 倍體積的 Native tracking dye 混合,緩慢而小心的注入樣品槽,
樣品槽約可容納 5 mL 。

27
3. 於冰箱中將電泳以定電流 40 mA 進行,約 5 小時。檢視染料位置,待染料跑
出膠片外即停止電泳,拆卸電泳裝置。
4. 拆卸膠片組合,以解剖刀垂直切割下中央膠體約寬 0.5 cm,並以活性染色法
確定 L-SP 活性位置。
5. 根據染色結果切下膠體上相對位置,以進行下一步電泳溶離。
電泳溶離:
1. 配製電泳溶離液,放於 4 ℃預冷。
2. 按照溶離器的使用說明,將透析膜及溶離槽裝置妥當,檢查有無漏水現象。
在溶離槽中倒入溶離緩衝液。
3. 將切割下的 L-SP 活性帶切成 0.2 cm × 0.2 cm 左右大小的膠體,放入溶離槽
的大槽中,開始溶離。需注意放置膠體的大槽朝向負極,而收集槽朝向正極。
4. 溶離採定電流方式使用 15 mA,取樣時先中止電流,每 2 小時蒐集一次。
5. 將 Tycon tube 套上塑膠吸管前端 (可避免刺破溶離槽內的透析膜) ,伸入溶離
槽的小槽中,小心吸取最底部 100-200 μL 的溶液。
6. 蒐集的溶離液可以利用輕輕拍打管壁的方式,觀察是否有不易消退的小水泡
產生來得知是否含有蛋白質。搜集三次後將樣品繼續溶離,隔天在蒐集最後
一次,如此即可得到純化的 L-SP 樣品。

一般 分析法 (蛋白 質定量 )

BC A 定量法
BCA (bicinchoninic acid) 法是利用蛋白質對兩價銅離子 (Cu2+) 進行還原,所生成
的 Cu2+可以 BCA 專一性地呈色而定量。本論文利用此方法來定量所有馬鈴薯粗抽
液樣品,因為粗抽液含有大量色素 (phenolic compound) 和鹽類,用此方法會減低
色素及硫酸銨鹽類對定量的干擾。

儀器設備:
ELISA 光度計 (Dynatech, MR 5000)
37℃ 恆溫箱

藥品試劑:
BCA (bicinchoninc acid assay) reagent kit (Pierce 23225)
使用前再將 Reagent A 和 Reagent B 以 50:1 比例混合。
5× PBS:
氯化鈉 (sodium chloride, NaCl, Merck K31745104) 38 g
磷酸二氫鈉 (sodium dihydrogen phosphate, NaH2PO4, Merck A239846)
7.8 g

28
補水至體積 1 L,稀釋五倍體積後即為 1× PBS。
Bovine serum albumin standard (BSA, Sigma-A4503)

方法步驟:
1. 以 BSA (2 mg/mL) 作 為 標 準 品 , 以 1× PBS 作 連 續 稀 釋 :
1×、1/2×、1/3×、1/4×、1/8×、1/16×、1/32×、0×。
2. 蛋白質樣品稀釋至濃度可以落在標準曲線差範圍內 (1/10×、1/20×) 。
3. 取 25 µL 之標準品與待測樣品,分別加入 ELISA plate 中。標準品與待測樣品
均做二重覆。
4. 之後加入 200 µL 的 BCA 試劑。
5. 在 37℃ 下反應 30 分鐘後,以 ELISA 光度計 測量 562 nm 吸光值。
6. 計算回歸係數,計算未知蛋白質濃度。

Bradford 定量 法
Bradford 法是利用蛋白質與染劑 Coomassie Brilliant Blue G-250 (CBG) 結合後,
溶液在 595 nm 吸光值變化來定量 (藍色) 。CBG 在試劑中所含的過氯酸溶液中,
呈紅棕色,但與蛋白質結合後 (因疏水性作用力及蛋白質所帶之正電荷而結合) ,
則變成藍色,蛋白質的濃度與藍色成正比,可以測量 595 nm 波長的吸光來定量
蛋白質。此法方便靈敏且再現性高,若使用微量滴定盤 (ELISA plate) 進行分析,
則可降低試劑用量,適合大量樣本的操作 (Bradford, 1976) 。本實驗當中以此方法
來偵測離子交換法後各管中的蛋白質濃度。

儀器設備:
ELISA 光度計
96 wells 微量滴定盤 (ELISA plate)

藥品試劑:
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate 5×
一般蛋白質定量時所使用的 Dye reagent 為 1×,所以先將 5× 濃縮液以二次水
稀釋成 1×,而微量蛋白質定量法則以原液進行 (5×) 。
Bovine serum albumin standard (BSA, Sigma-A4503) 。

方法步驟:
1. 以 BSA (1 mg/mL) 作為標準品,利用 1× PBS 作連續稀釋:1×、1/2×、1/3×、1/4×、
1/8×、1/16×、1/32×、0×
2. 將蛋白質樣品稀釋至濃度可以落在標準曲線差範圍內。
3. 取 20 µL 之標準品與待測樣品,分別加入 ELISA plate 中。標準品與待測樣品

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均做二重覆。
4. 後加入 200 µL 的 1× Bradford 試劑。
5. 在室溫下避光作用 15 分鐘後,以 ELISA 光度計測量 595 nm 吸光值。
6. 扣去吸光值大於 1.0 的數據,計算回歸係數,計算未知蛋白質濃度。

澱粉 定量 (Starch quantization)
此澱粉定量法修改自 Gerrits 。植物體內的澱粉不易溶於水,所以利用 DMSO 來
增加澱粉的溶解度,除此之外,因為澱粉與碘液會形成紫黑色錯合物,在 650
nm 時有很強的吸光值,利用這些特性來設計澱粉定量法,不僅靈敏度高,誤差
值也小。

儀器設備:
研缽
離心機 (Hsiangtai, CN-3400A)
水浴槽 (Kansin, WB201-B1)
ELISA 光度計 (Tekon, SPECTRA max 340PC)
15 mL 離心管
96 wells 微量滴定盤 (ELISA plate)

藥品試劑:
Iodine solution:
Iodine (Riedel-de Haen, 30305) 0.45 g
Potassium iodide (Nakalai, 286-25) 2.83 g

體積利用二次水補至 200mL
0.1M citrate buffer pH 4.6:
Citric acid (Sigma, C0759) 19.21 g

體積利用二次水補至 1L
9.25% HCl:
HCl (J.T.Baker, 9535) 50 mL

體積利用二次水補至 200 mL
10N NaOH:
NaOH (Mallinckrodt, UN1823) 40 g

體積利用二次水補至 100 mL
Dimethyl sulfoxide (DMSO, Sigma, D5879)

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Starch 標準液 1× (0.1mg / mL) :
Starch (Sigma, S2630) 1g

體積利用二次水補至 10 mL
液態氮 (liquid nitrogen)

方法步驟:
1. 配合液態氮將馬鈴薯葉片磨碎後蒐集至 15 mL 離心管中。
2. 加入 1 mL DMSO 和 0.25 mL 9.25% (v/v) HCl 並混合均勻。
3. 置入 60℃ 水浴槽中培養 1 小時。
4. 加入 20 µL 10 N NaOH 中和樣品。
5. 利用 0.1 M citrate buffer (pH 4.6) 將體積補至 5 mL。
6. 4000 rpm 離心 10 分鐘。
7. 將 starch 標準液做以下連續稀釋:1×、1/2×、1/3×、1/4×、1/8×、1/16×、1/32× 等;
樣品也做適當的稀釋:1×、1/2×、1/3×。
8. 取 10 µL 稀釋好的標準液和樣品加入 96 孔 ELISA 盤中。
9. 每孔 (well) 加入 200 µL 碘液。
10. 利用 ELISA 光度計讀取 650 nm 吸光值。
11. 計算回歸係數,計算未知澱粉樣品濃度。

膠體染色法

L-SP 酵素活 性染色 法 (添加醣 引子 )

L-SP 以 glucose-1-phosphate (G-1-P) 做 為 基 質 , 在 添 加 醣 引 子 (sugar


primer) 的情況下可合成葡聚醣。活性染色法是在原態電泳後,將膠體浸在含有目
標酵素基質的反應液中反應,藉由偵測其產物的量與位置,達到比較酵素活性強
弱及泳動率的雙重目的。酵素對基質作用後的產物必須是不可溶的,才不至於在
反應液中擴散而流失。L-SP 在含有 G-1-P 的環境下,可以進行葡聚醣的延長反應,
產生不可溶的澱粉,反應後酵素在電泳膠體上的位置與多寡,可藉由碘液使產生
的多醣呈現紅棕至紫黑色。在反應過程中若添加可溶性澱粉為醣類引子,則產生
暗棕色色帶;若不添加醣類則產生紫黑色帶。此法在偵測磷解酶上極為靈敏,且
不易受干擾。 (Chang et al, 1987)

儀器設備:

31
塑膠染盒
平台震盪器
37℃ 恆溫箱

藥品試劑:
MES 緩衝液 (0.04 M, pH 5.9) :
MES (2[N-morpholino] ethanesulfonic acid) (Sigma M-8250) 1.56 g

以 KOH 調整 pH 至 5.9 後,加水至 200 mL 置於 4℃ 保存。


可溶性澱粉 (1.2%) :
可溶性澱粉 (Sigma, S-2630 或 Nakalai, 321-22) 1.20 g

先以少量熱水溶解,再加水至 100 mL,置於室溫保存。使用前若有不溶物


則再加熱溶解之。
32 mM Glucose-1-phosphate 溶液:
Glucose-1-phosphate (Sigma, G-6895) 0.98 g

加水至 100 mL,置於 4℃ 保存,G-1-P 會因儲存過久而解裂出磷酸根,使


用期限為一星期左右。
碘液呈色劑:
Iodine (Wako) 0.15 g
KI (Nakalai, 296-25) 2.8 g

加水至 1000 mL。

方法步驟:
1. 將原態電泳完畢的膠體浸於反應基質液中,其中 MES : G-1-P : Soluble
Starch = 2 : 1 : 1 (v/v)。
2. 在 37℃ 下反應三小時或隔夜,1-2 µg 的 SP 在含有醣引子下反應 2 小時可
染出清晰色帶,不含醣引子約需 18-24 小時。
3. 反應結束後倒去基質液,以蒸餾水清洗膠片兩次,每次 10 分鐘。之後倒入碘
液呈色劑,於平台震盪器上搖晃使呈色均勻。
4. 此時可以看見紫黑色色帶,在含有可溶性澱粉為引子的呈色膠片,其背景顏
色較深,可在蒸餾水中清洗掉多餘的可溶性澱粉基質。若是酵素色帶因碘昇
華而消失,可再加入碘液重新染色。
5. 一般馬鈴薯塊莖粗抽液中含有澱粉酶 (β-amylase),在此染色結果中會出現
反白色帶。

32
Coomassie Brilliant Blue R-250 (CBR) 蛋白質 染色法
Coomassie Brilliant Blue R-250 (CBR) 蛋白質染色為最常用的染色法,靈敏
度中等。利用 CBR 染劑上的: (1) 芳香族苯環與蛋白質上的疏水性區及 (2) 亞硫
酸根 (SO32-) 與蛋白質上的正電荷結合。 (Sasse and Gallagher, 1991)

儀器設備:
塑膠染盒
平台式震盪機 (rotator)

藥品試劑:
CBR 染色液:
Coomassie Brilliant Blue R-250 (CBR) 0.75 g
Methanol 250 mL
Acetic acid 50 mL

先以 methanol 完全溶解 CBR 藥錠,再加入 acetic acid 與水至 550 mL。


脫色液:
Acetic acid (10%) 100 mL
Methanol (20%) 200 mL

補水至體積 1 L。

方法步驟:
1. 將電泳完畢的膠體浸泡在 CBR 染劑中,置於平台震盪器上搖盪,至少 20 分
鐘後回收染色液,並倒入脫色液脫色。
2. 脫色過程中可放入擦手紙增加脫色效果。
3. 若蛋白質濃度較低,則可以加長染色時間以增加色帶深度。
4. 若膠體尚有不溶的 CBR 染料沈積,可利用甲醇 (Methanol) 洗去。

鋅染 色法 (Zinc stain)
鋅染色早在 1900 年即被發表,於 2004 年由 Hardy 等人對鋅染色做了修改而
使其發揚光大。此染色法最大的優點在於染色過程時間短、靈敏度高 (等同硝酸銀
染色) ,且經過染色的蛋白質點對於後續的質譜儀分析不會造成影響。鋅染色原理
利用 pH 値的改變,使得 imidazole 與鋅離子形成乳白色錯合物堆積在蛋白質周
圍而呈色,是一種負染色法。 (Hardy et al, 2004)

儀器設備:

33
黑底塑膠染盒
平台式震盪機 (rotator)

藥品試劑:
鋅染染色液:
Imidazole-HCl 8.36 g
10% SDS 4 mL

加水至 400 mL
鋅染呈色液:
ZnCl2 10.9 g

加水至 400 mL
鋅染退染液:
Citric acid 1g

溶於 100 mL 的水中。
SDS 電泳緩衝液亦可當作脫色液,但無固定蛋白質之作用。
(PS:若膠體曾先用 CBR 染色,則需要以 50% 甲醇完全脫
色,再用鋅染退染液用作用至 pH 8.3,因為膠體過酸則無法進行鋅染色。)

方法步驟:
1. 將電泳完畢的膠體先以 SDS 緩衝液在平台震盪器上搖盪 10 分鐘。
2. 倒出 SDS 緩衝液以二次水清洗後加入鋅染染色液,並置於平台震盪器上搖
盪 10 分鐘。
3. 倒出鋅染染色液後以二次水清洗後,加入鋅染呈色液並快速搖晃使其呈色。
4. 若膠體有需要可用鋅染退染液進行退染 1 小時後再改用其他染色方法進行染
色。

銀染 色法 (Silver stain)
蛋白質分子上的酸基 (COO-) 或其他基團會與銀氨錯離子結合,而銀離子在酸性
環境下被還原為銀原子,可使蛋白質色帶成呈現深棕色至黑色。

儀器設備:
玻璃缸
平台式震盪機 (rotator)

藥品試劑: (一片 10 cm × 10 cm 膠體所需)

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還原液甲:
Glutaraldehyde (25%) 4 mL
Sodium thiosulfate = Na2S2O3 0.8 g

用二次水定量至 100 mL
還原液乙:
Citric acid (0.5/% 水溶液) 1 mL
甲醛 (Formaldehye) 0.1 mL
甲醇 (Methanol) 15 mL

用二次水定量至 100 mL
硝酸銀液:
ddH2O 4 mL
硝酸銀 0.8 g
NaOH (0.36%) 21 mL
氨水 1.4 mL

用二次水定量至 100 mL
將硝酸銀液溶於二次水,緩慢滴入 NaOH、氨水與二次水的混合液中,邊滴
入邊搖晃,確定沒有混濁生成,,全量滴入完成後應呈現澄清,若有混濁現
象則再以氨水滴定至澄清。
反應終止液:
Citric acid (0.5%) 10 mL
Ethylenediamine 0.1 mL

用二次水定量至 100 mL

方法步驟:
1. 將電泳膠片小心拆下,放在染色多孔鐵盤中。
2. 將膠體浸置於固定液中至少 1 小時。
3. 二次水清洗三次,每次 10 分鐘。
4. 還原液甲反應 1 小時。
5. 二次水清洗三次,每次 10 分鐘。
6. 硝酸銀液反應 10 分鐘。
7. 二次水清洗三次,每次 10 分鐘。
8. 加入還原液乙 開始呈色 (呈色時間應拿捏得宜,勿染過深造成膠片背景過
深) 。
9. 加入終止液 (至少 1 小時) ,停止呈色反應。

35
10. 描膠體影像。

洋菜 膠體染 色法
核 酸 樣 品 在 電 泳 分 析 後 無 法 直 接 利 用 肉 眼 觀 察 , 所 以 利 用 EtBr (Ethidium
broamide) 螯合上洋菜膠體中的核酸樣品,再利用 UV 光激發 EtBr 後便可觀察。由
於 UV 光對人體有一定程度的傷害性,所以可以藉由 Electrophoresis detect system
觀察。

儀器設備:
Electrophoresis detect system (UVP, BioDoc-It system LM-26E)
電泳槽 (Toyobo, GelMate 2000)

藥品試劑:
Ethidium bromide (BDH, 44392)

方法步驟:
1. 電泳分析後的洋菜交直接浸泡在含有 EtBr 的水溶液中,作用時間依照 EtBr
濃度而不同。
2. 浸泡後以清水稍加清洗後,至於 Electrophoresis detect system 並開啟電源便
觀察到清晰的色帶,如果對比不夠強可能是浸泡 EtBr 的時間不夠久所致。

西方墨點法 (Western Blotting)


蛋白質電泳膠片經過轉印到轉印膜 (PVDF membrane) 後,可以用於免疫染色、
蛋白質 N 端序列定序。PVDF 全名為 Polyvinylidene difluoride,是一種非常疏水
性的材質,蛋白質可以藉由其本身的疏水區與其結合。與傳統使用的硝化纖維紙
(nitrocellulose) 比較,PVDF 對於甲醇的耐受性較佳不易破碎或毀損且對蛋白質
吸附力極佳十分適合作為轉印膜的材料。

蛋白 質轉印

儀器設備:
半乾式電泳轉印槽 (Hoefer TE 22)
電源供應器 (Amersham Biosciences Biosciences EPS 301)
PVDF 轉印膜 (Amersham Biosciences Biosciences RPN303F)
濾紙 (10 × 10 cm)

藥品試劑:
轉印緩衝液 (Blotting buffer,10×)

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Tris (USB-77-86-1) 90.86 g
Glycine (Bio-Rad, 161-0718) 288 g

加水 1500 mL 溶解,以 HCl 調 pH 值為 8.3 後再定量至 2000 mL,使用時


稀釋 10 倍。若膠片為 SDS-PAGE 的膠片時,則轉印緩衝液在稀釋後需再加
入甲醇至最後濃度為 10 % (v/v) 。
Full Range Rainbow™ Molecular Weight Markers (10 000-250 000)
(Amersham RPN800)

方法步驟:
1. 將轉印膜 PVDF 切成比膠片稍大 (一般約 9 cm × 9 cm) 。PVDF 為疏水性材
質,必須先以 10 mL 100%甲醇充分濕潤後,再加入 90 mL 轉印緩衝液 (1×)
中才可使用。
2. 將六張稍大的濾紙 (一般約 10 cm × 10 cm) 置於含 10 %甲醇的轉印緩衝液
中濕潤。
3. 先墊三張濾紙於轉印槽上,再小心鋪上轉印膜,膠片再覆蓋於轉印膜上,最
後再蓋上三張濾紙。須特別留意不得有氣泡殘留在中間,否則會影響整個轉
印的效果。可用試管小心桿過以去除氣泡。
4. 在定電流 (電流設定成 PVDF 的面積乘以 0.8) 的情況下進行轉印, 2 小時後
取出轉印膜可進一步進行免疫染色。
5. 電泳過程中以 Full Range Rainbow Markers 作為標準轉印的參考。

酵素 免疫染 色
電泳後把蛋白質轉印至 PVDF 轉印膜上,利用專一性抗體對膜上的蛋白質抗原
做專一性結合,再用二極抗體對上述抗體進行專一性的結合。因二極抗體上接有
呈 色 用 的 標 誌 酵 素 ( 多 用 horse radish peroxidase) , HRP 或 alkaline
phosphate,AP),可在加入酵素基質後呈色得以偵測。

儀器設備:
平台震盪器
塑膠染色盤
高感光底片
壓片夾
洗片機

藥品試劑:
明膠-NET
Gelatin (0.25%) (Merck 4070) 2.5 g

37
NaCl (0.15 M) (Merck 6404) 8.75 g
EDTA‧2Na (5 mM) (Merck 8418) 1.8 g
Tween 20 (0.05%) (Merck 822184) 0.5 mL
Tris (50 mM) (Sigma T-1530) 6.05 g

加水 800 mL 並加熱至 gelatin 溶解,調 pH 8.0,再加水至 1 L。


5× PBS:
氯化鈉 (sodium chloride, NaCl, Merck K31745104) 38 g
磷酸二氫鈉 (sodium dihydrogen phosphate, NaH2PO4, Merck A239846) 7.8 g

補水至體積 1 L,稀釋五倍體積後即為 1× PBS。


PBST (phosphate buffer saline & Tween 20) :
將 5× PBS 稀釋至 1× 後每 1 L PBS 加入 1 mL Tween 20,即成為 PBST。
一極抗體
HRP (Horse radish peroxidase) 呈色系統
二極抗體:
Horse radish peroxidase conjugated,goat anti mouse IgA、IgG、IgM
H+L,使用前以 NET 稀釋 20000 倍。
呈色機制
DAB 呈色液:
Diaminobenzidine (Sigma D-5637) 5 mg
H2O2 (30%, Merck 7210) 10 mL

以 PBS (1×) 溶解後定量至 100 mL 使用


(PS:DAB 使用前新鮮配製,避光保存,為致癌物質勿吸入其粉末
或與皮膚直接接觸。)
ECL (Enhanced chemiluminescence) 呈色液 (需在暗房進行顯影)
Western LightningTM Chemiluminescence Reagent Plus
(PerkinElmer Life Sciences, Inc. NEL 104)
AP (Alkaline phosphatase) 呈色系統
二級抗體:
Alkaline phosphatase congugated , goat anti mouse IgA 、 IgG 、 IgM
H+L,使用前以 NET 稀釋 20000 倍。
AP 緩衝液 (alkaline phosphate buffer) 5×:
Tris (100 mM X 5) (Sigma T-1530) 6.05 g
NaCl (100 mM X 5) (Merck 6404) 2.92 g
MgCl2 (100 mM X 5) (Sigma M-8266) 0.475 g

38
加入水至 80 mL 後,利用 NaOH 將 pH 值調至 9.5 後,加水至 100 mL。
實驗前再稀釋成 1× 使用。
NBT 試劑
Nitro blue tetrazolium (Sigma N-6876) 50 mg

溶於 1 mL 的 70 % Dimethylforamide (DMF, Merck 3053) 。


BCIP 試劑
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (Sigma B-6149) 50 mg

溶於 1 mL 的 100 % Dimethylforamide (DMF, Merck 3053) 。


AP 呈色劑
BCIP 試劑 33 μL
NBT 試劑 66 mL

呈色前溶於 10 mL AP 緩衝液 (1x) 中。

方法步驟:
HRP 呈色系統
1. 轉印膜以 NET 做填塞反應至少 1 小時,可停在此步驟隔夜。
2. 加入以 NET 稀釋之ㄧ極抗體,於室溫下反應 1 小時。
3. PBST 洗三次,每次 10 分鐘。
4. 加入以 NET 稀釋之適當倍數的二極抗體,於室溫下反應 1 小時。
5. PBST 洗三次,每次 10 分鐘。
6. 加入 DAB 呈色液或 ECL 呈色液。
7. 如加入 DAB 呈色液則在背景未過深前倒去呈色液,以二次水清洗數次即
可。如加入 ECL 呈色液則在暗房間以底片進行壓片。
AP 呈色系統
1. 與 HRP 呈色系統步驟大致相同,唯所加之二極抗體不同,而由於二極
抗體的不同,因此,所使用的呈色基質也不同。
2. 轉印膜以 NET 做填塞反應至少 1 小時,可停在此步驟隔夜。
3. 加入以 NET 稀釋之ㄧ極抗體,於室溫下反應 1 小時。
4. PBST 洗三次,每次 10 分鐘。
5. 加入以 NET 稀釋之適當倍數的二次抗體,於室溫下反應 1 小時。
6. PBST 洗三次,每次 10 分鐘。
7. 加入 AP 呈色液。
8. 在背景未過深前倒去呈色液,以二次水清洗數次即可。

多株抗體製備 (polyclonal antibody)

39
多株性抗體為一群抗體之混合物,對一個具有多個抗原決定基的大分子蛋白質而
言,每個決定基都有一種或數種抗體可與之結合。而每種抗體均由單一的脾細胞
株 (B 細胞) 所分泌,即一個脾細胞株只產生一種抗體。若可分離出此細胞株加以
培養,使之分泌抗體,即可獲得只含一種抗體的均質品,即為單株抗體。本論文
使用多株抗體來代替單株抗體,不僅因為取得較單株抗體容易,也無須在多花額
外的金錢與人力在培養單株化後的融合瘤細胞 (hybridoma) 。

動物 免疫
將欲得到的抗體之抗原加入佐劑 (adjuvant) 製成乳劑之後,注射到動物腹腔內
使其誘發免疫反應而產生所需之抗體。本論文使用 BALB/c 實驗鼠進行免疫注射。

儀器設備:
BALB/c 小白鼠 (台大醫學院實驗動物中心)
三向轉接頭 (Nipro)
注射器 (1 mL, Terumo)
Parafilm (American National Can)

藥品試劑
PBS (Phosphate buffer saline)
Freund`s complete adjuvant (10 mL , Sigma,9007-81-2 )
Freund`s incomplete adjuvant (10 mL, Sigma, F-5506)
TiterMax Gold (1 mL, CytRx Corporation, 800-345-2987)
NS-1 細胞
純化的馬鈴薯 L-SP 抗原

方法步驟
1. 購買四週大的 BALB/c 小白鼠,待飼養至六週大時,開始進行抗體誘導。每
隻 小 鼠 第 一 次 免 疫 使 用 50 ug 抗 原 與 乳 化 劑 (Freund`s complete
adjuvant,TiterMax Gold) 1:1 混合。使用三向轉接頭與兩支注射器並以
parafilm 將注射器與三向轉接頭連接處包裹好,反覆的吸放注射器使其充分
乳化。
2. 第二次以後均使用 Freund`s incomplete adjuvant 來與 50 µg 抗原混合,總
共免疫 4~6 次,視效價產生情況決定。
3. 每隔兩周注射一次,每次注射前均採小白鼠尾巴血,用以抗體效價分析。
4. 免疫 4~6 次後,在犧牲實驗鼠的前一週以腹腔注射的方法注射 2 × 106 NS-1
細胞

多株 抗體純 化

40
經過外來抗原免疫過的實驗鼠,在施打 NS-1 細胞後的一至兩週內腹腔會因為腹
水堆積而開始腫大。因為進入實驗鼠體內的 NS-1 細胞不斷增生,且被實驗鼠當做
外來物進而啟動免疫機制來抵禦,其中包含大量抗體的釋出。而本論文就是藉由
這種情況下,讓實驗鼠將大量抗體釋放到腹腔中,待腹腔腫大至實驗鼠不便行走
時,犧牲實驗鼠並抽取純化實驗鼠的腹水。

儀器設備:
免疫過的 BALB/c 小白鼠 (台大醫學院實驗動物中心)
注射器針頭 (1 mL, Terumo)
15 mL 離心管
低速離心機 (Hsiangtai, CN-3400A)
低溫離心機 (Hermle, Z323K)

藥品試劑
PBS (Phosphate buffer saline)
硫酸銨 (Merck 101211)
甘油 (Glycerol) (Sigma G5516)

方法步驟
1. 將實驗鼠利用頸椎脫臼法犧牲。
2. 將針頭小心插入實驗鼠腹腔中,旋轉針頭後腹水便會流出,儘可能回收所
有腹水到 15 mL 離心管中。
3. 將腹水靜置 30 分鐘使凝血反應作用完全。
4. 4000 rpm 離心 10 分鐘後留下上清液並測量其體積。
5. 進行 0 % ~ 45 % 硫酸銨分劃,並且平衡 10 分鐘。
6. 於 4℃下 12000 rpm 離心 20 分鐘後去除上清液。
7. 將沉澱物 (pellet) 利用原來腹水一半的體積回溶後,再加入等體積的甘油混
合均勻,保存於 -20℃ 以便之後使用。

馬鈴薯基因表現測定

馬鈴 薯葉片 RNA 分離
為了了解馬鈴薯葉片細胞中糖類相關基因是否因為蔗糖 (sucrose) 刺激而活化,
且根據 Centro dogma,基因的活化會先轉錄成 mRNA 再轉譯成蛋白質,所以必須
先萃取馬鈴薯葉片細胞中的 RNA 才能偵測 mRNA 量。因為自然界中存在許多的
RNase 且 RNase 的活性不容易抑制,所以必須先將所有的容器都泡在 DEPC 水中
進行滅菌作用後烘乾再使用。

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儀器設備:
低溫離心機 (Hermle, Z323K)
乾式加熱板 (Genius, MC-01-220)

藥品試劑:
RareRNA reagent (真興股份實業股份有限公司, GPR02)
DNase I, RNase-Free (Roche, 10776785001)
DEPC 水
將 1 mL Diethyl pyrocarbonate (DEPC, Sigma D5758) 加入 1 L 一次水,劇烈混合
均勻後靜置一晚,再利用高溫高壓滅菌法 (溫度為 121℃,壓力為 15 磅/平方
英吋,時間為 15 分鐘) 去除多餘 DEPC 後才使用
50 mM EDTA 溶液 (先配製 0.5 M EDTA stock 溶液後再稀釋成 50 mM 使用)
Ethylenedinitrilo teraacetic acid (EDTA, J.T.Baker 6381-92-6) 9.306g

加入 DEPC 水定量至 50 mL 成 stock 溶液,再取 100 mL 0.5 M stock 溶液至 900


mL DEPC 水中成 50 mM EDTA 溶液
Chloroform (Merck, 102444)

方法步驟:
1. 取新鮮葉片組織約 100 mg。
2. 在研缽中加入約 40 mL 液態氮後磨碎葉片組織。
3. 將磨成粉末狀的組織碎片蒐集到 RNase-Free 的 eppendrof 中
4. 加入 1 mL RareRNA 並且混合均勻,室溫靜置 5 分鐘。
5. 加入 300 mL chloroform (此步驟在 Hood 內操作) 後劇烈震盪均勻後放置冰上
靜置 5 分鐘。
6. 利用低溫離心機在 4℃ 下 12000 rpm 離心 10 分鐘。
7. 小心吸取上層水層 (約 400 mL) 到另外一個新的 RNase-Free 的微量離心管中。
8. 加入兩倍體積 (約 800 mL) 冰冷的無水酒精。
9. 小心混合均勻後放在 -20℃ 冰箱靜置隔夜。
10. 利用低溫離心機在 4℃ 下,12000 rpm 離心 10 分鐘。
11. 將上清液去除後加入冰冷的 70 %酒精以洗去多餘鹽類。
12. 利用低溫離心機在 4℃ 下,12000 rpm 離心 10 分鐘。
13. 將 70% 酒精去除並待酒精完全揮發 (Air dry 或 Speed Vac) 。
14. 加入 20 mL DEPC 水回溶 RNA 並於 65℃ 培養 20 分鐘後放置冰上降溫。
15. 加入 1 mL DNase 後置於 37℃ 培養 15 分鐘。
16. 加入 2 mL 50 mM EDTA 溶液,混合均勻後放在乾式加熱板上 75℃培養 15 分
鐘以去除 DNase 活性。

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17. RNA 可保存於 -80℃ 冰箱約一星期左右。

RNA 定量
為了了解糖類代謝相關基因經過蔗糖 (sucrose) 刺激後活化的程度,可以利用反轉
錄聚合酶連鎖反應 (Reverse transcription-Polymerase Chain Reaction, RT-PCR) 來偵
測。而從馬鈴薯片葉片細胞中分離出來的 RNA 會因批次不同而濃度不同,且進行
反轉錄聚合脢連鎖反應時只需要 1 mg RNA 當作模板 (template) ,所以必須了解
每一次分離出來的 RNA 樣品濃度。

儀器設備:
分光光度計 (Photo-spectrometer, ThermoSpectronic, Helios beta)
石英管 (Cuvtte, Hellma, 104.002F-QS)

藥品試劑:
50 mM EDTA 溶液

方法步驟:
1. 取 2 mL RNA 溶液加入 500 mL 50 mM EDTA 溶液後混合均勻。
2. 將稀釋的 RNA 溶液置入石英管中。
3. 利用分光光度計計算 OD260 與 OD280 的值 ,RNA 樣品本身的完整性取決於
OD260 對 OD280 的比值。當比值小於 1.8 時代表 RNA 樣品中有 DNA 污染,會
影響接下來反轉錄聚合脢連鎖反應結果的誤判。當比值大於 2.0 時代表 RNA
樣品已經斷裂,會導致反轉錄聚合脢連鎖反應時沒有完整的模板來進行反
應。
4. 當 OD260 等於 1 時代表單股 RNA 的濃度約等於 40 ug/ mL,所以 RNA 樣品濃
度 (mg/mL) = OD260 × 250 × 0.04。

反 轉 錄 - 聚 合 酶 連 鎖 反 應 (R T-P CR , Reve rse Transc ri pt ion -P ol yme rase

Ch ai n R eact io n)
反轉錄-聚合酶連鎖反應 (以下簡稱 RT-PCR) 是先利用 M-MLV 反轉錄脢 (M-
MLV reverse transcriptase) 將特定 RNA 反轉錄成單股 cDNA 後再利用 DNA 聚合脢
(DNA polymerase) 放大此特定片段。在本論文中利用 RT-PCR 來測定特定澱粉代謝
相關基因的 mRNA 表現是否受到蔗糖刺激而改變,進而了解澱粉代謝相關基因之
間的調控。

儀器設備:
PCR machine (Biometra, T-1 Thermoblock)

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Electrophoresis detect system (UVP, BioDoc-It system LM-26E)
電泳槽 (Toyobo, GelMate 2000)

藥品試劑:
One-step RT-PCR Kit (GeneMark, RP01-50)
100 bp marker (GeneMark, GM100)
Ethidium bromide (EtBr, BDH, 44392)
DEPC 水
引子 (primers)
引子名稱 序列 (5’  3’) 連鎖反應 連鎖反應循
溫度 環數
L-SP forword primer CTTCCCAGTTCTGTTGCAGA 60℃ 26
L-SP reverse primer GTGGTATAACAGCTGGTTCC 60℃ 26
Potato PoAc97 ATGGCAGACGGAGAGGATATTCA 55℃ 24
Actin forword
primer
Potato PoAc97 GACGGCCAACAATACTAGGAAAT 55℃ 24
Actin reversed
primer

方法步驟:
1. 先配置 One-step RT-PCR Kit 中的 Master solution:
Nuclease-free water 37-X µL
Upstream primer (25 uM) 1 µL
Downstream primer (25 uM) 1 µL
5 × ReactionMix 10 µL
Enzyme Mix 1 µL
RNA template (1 µg) X µL

50 µL
每次實驗時上述藥劑 (除 RNA template 之外) 依比例乘上實驗樣品數 +1 配置
成 Master solution,將 Master solution 分管後再加入等質量的不同 RNA 樣品。
2. 反轉錄反應條件:
1. 50℃ 作用 30 分鐘進行反轉錄作用。
2. 94℃ 作用 4 分鐘來終止 MMLV 反轉錄脢的作用。
聚合酶連鎖反應條件 (步驟 3~5 的循環數從 20~30 不同) :
3. 94℃ 作用 30 秒。
4. 50-60℃ 作用 30 秒~1 分鐘不等 (不同組引子條件不同,固依據目標基因

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做分類) 。
5. 72℃ 作用 1 分鐘。
6. 72℃ 作用 8 分鐘。
7. 保存於 4℃ 環境中。

馬鈴薯葉片蛋白質粗抽

馬鈴 薯葉片 粗抽蛋 白質製 備

儀器設備:
低溫離心機 (Hermle, Z323K)

藥品試劑:
Protease inhibitor cocktail (Sigma, P 8340)
100 mM Tris buffer pH 7.0:
Tris 粉末 12.141 g
二次水 800 mL

待混合均勻後先將 pH 直調至 7.0,在補體積至 1000 mL,室溫保存。

方法步驟:
1. 將刺激完後的馬鈴薯葉片浸泡在液態氮 (Liquid Nitrogen) 中,並利用研缽將
其搗碎至粉末狀後收集到微量離心管 (Eppendrof) 中。
2. 加入 1 mL 100 mM Tris buffer pH 7.0 與 1.5 µL protease inhibitor cocktail 並混
合均勻。
3. 利用低溫離心機在 4℃ 下 12000 rpm 離心 10 分鐘。
4. 取上清液至新微量離心管中。
5. 重覆步驟 3 與 4 直至離心後沒有葉片組織碎片及為粗抽液。
6. 粗抽液保存於 -80℃。

馬鈴 薯葉片 蛋白質 濃縮 (活性 染色用 )


因為在馬鈴薯葉片中的目標蛋白質所佔比例不高,在不使蛋白質活性喪失的前題
下進行蛋白質濃縮來提高樣品濃度,以便提高目標蛋白質在進行 Native-PAGE 的
含量。利用鹽析法來沉澱粗抽樣品的蛋白質,可以使沉澱下來的蛋白質在回溶後
還具有活性,在本論文中使用的是硫酸銨 (Ammoniun sulfate) 沉澱法。

儀器設備:
低溫離心機 (Hermle, Z323K)

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Suspension rotator (Digisystem Laboratory instruments INC., SR100)

藥品試劑:
100 mM Tris buffer pH 7.0
100 %硫酸銨 100 mM Tris pH7.0 溶液:
硫酸銨 (Ammoniun sulfate, Riedel-de Haen, 31119) 69.7 g
100 mM Tris buffer pH 7.0 100 mL

混合均勻後置於 4℃保存。

方法步驟:
1. 取 200 µL 蛋白質粗抽液加入 800 µL100 %硫酸銨溶液。
2. 混合均勻之後將樣品放置冷房中的 Suspension rotator。
3. 平衡 20 分鐘後利用低溫離心機在 4℃ 與 12000 rpm 下進行 20 分鐘離心。
4. 去除上清液後加入 50 µL 冰冷的 100 mM Tris buffer pH 7.0 來回溶蛋白質。
5. 將蛋白質定量後即可以用,濃縮液可保存在 -20℃。

二維膠體電泳 (Two-Dimensional Electrophoresis)

馬鈴 薯葉片 蛋白質 濃縮 (二維 膠體電 泳用 )


一般適用於蛋白質沉澱的方法有以下幾種: (1) 硫酸銨沈澱法 (Ammonium
sulfate precipitation) ; (2) 三氯醋酸沈澱法 (TCA precipitation) ; (3) 丙酮沈澱法
(Acetone precipitation) ; (4) 三氯醋酸-丙酮沈澱法 (TCA-Acetone precipitation) ;
(5) 異丙醇沈澱法 (Isopropanol precipitation) 。其中硫酸銨沉澱法並不適合運用在二
維膠體電泳上,因為二維膠體電泳是一種觀察蛋白質次單元體泳動的技術,原態
蛋白質不僅僅影響第一維也會影響第二維膠體電泳,更會增加電泳後結果觀察的
困難度與複雜性。在本論文中,若單用三氯醋酸沈澱法會使得細胞色素殘留過多
影響結果的觀察,而單用丙酮沈澱法雖然可以減少大部分色素的殘留,卻使得蛋
白質沉澱不易回溶。故以三氯醋酸-丙酮沈澱法作為馬鈴薯葉片蛋白質濃縮的方法

儀器設備:
低溫離心機 (Hermle, Z323K)
超音波震盪器
小冰枕

藥品試劑:
Rehydration buffer:
CHAPS (2%) 0.5 mg

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IPG Buffer (0.5%) 125 µL
Urea (8 M) 12.0 mg

加水至 25 mL 後分裝成 1mL 後保存於-20℃


Acetone (RDH, 32201)
50 % TCA / Acetone:
50﹪TCA (J.T Baker, 0414-01) 50 g

將 TCA 粉末溶於 Acetone 中,體積補至 100 mL

方法步驟:
1. 取 400 µL 的蛋白質粗抽液加入 100 µL 50 % TCA / Acetone。
2. 混合均勻後靜置在 -20℃ 1 小時以上。
3. 以 12000 rpm 離心 10 分鐘後去除上清液。
4. 利用 Acetone 仔細清洗沉澱物 (pellet) 以去除殘餘 TCA,以 12000 rpm 離心
10 分鐘後去除上清液。
5. 重覆上述步驟共 3 次後,將沉澱物自然風乾。
6. 利用 100 µL Rehydration buffrt 回溶沉澱物。
7. 將樣品置於含小冰枕的超音波震盪器中震盪 30~60 分鐘,時間依溶解效果而
定。
8. 以 12000 rmp 離心 10 分鐘後去除不溶物後即得濃縮液。

第一 次元電 泳 (I soe lect ri c fo cu si ng , IEF )


Isoelectric focusing (IEF) 是根據蛋白質的的等電點 (isoelectric point, pI) 來分離蛋
白質的技術。由於蛋白質是雙電性分子 (amphoretic molecule) ,會依所在溶液環境
的 pH 值,其淨電荷 (net charge) 可能是帶正電、帶負電或不帶電 (電中性) 。而蛋白
質的電性決定於其胺基酸支鏈 (amino acid side chain) 、胺基 (amino terminal) 與酸基
(carboxy terminal) 的帶電量總和。在某特定的 pH 下,蛋白質的淨電荷為零,則稱
此 pH 值為其等電點 (Isoelectric point, pI) 。當 pH 值高於其 pI 則此蛋白質帶負電荷,
而當 pH 值低於其 pI 則此蛋白質帶正電荷。
IEF 的關鍵技術是在膠體中製造 pH 梯度。在電場的影響下,帶正電 (負電) 的蛋白
質將會往負極 (正電) 方向移動,直到膠體環境中的 pH 值與其 pI 相同,其電荷變
為零而停止移動,產生焦集 (focusing) 的現象。目前最廣為使用的 IEF 膠體為
immobilized pH gradient poly-acrylamide gel (IPG strip) ,其原理是將酸性或鹼性的緩
衝官能基 (buffering functional group) 以共價鍵結合於膠體骨架 (poly-acrylamide) 上。
而在 IEF 的實驗中,樣品必須完全溶解於第一次元電泳緩衝液 (rehydration buffer)
,其主要成分及功能如下:
1. Urea : urea 用 於 破 壞 分 子 內 與 分 子 間 的 作 用 力 , 使 得 蛋 白 質 分 子 失 活

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(denaturation) 。
2. CHAPS:為非離子性介面活性劑 (non-ionic detergent) ,防止蛋白質因疏水性
作用力 (hydrophobic interaction) 而產生的分子間的集結。
3. DTT or β-macaptoethanol:為還原劑,用來打斷分子間或分子內的雙硫鍵,避
免分子間產生巨大的集結體 (aggregation)。
4. IPG Buffer (ampholyte buffer) :可以幫助蛋白質聚焦在其等電點時,不因溶解
度過低而沈澱,其中微量離子濃度也是電流來源之一。
5. Bromophenol blue:作為指示劑,可以判斷電泳是否焦集良好。

儀器設備:
IPGphor Isoelectric Focusing System (Amersham Biosciences)
Strip holder:13 cm strip holder (最大容量體積 250 µL)
IPG strip:pH 3-10 NL
注射針筒

藥品試劑:
Cover fluid (Amersham Biosciences, 17-1335-01)
Rehydration buffer
Bromophenol blue solution:
Bromophenol blue 少許

利用適量二次水回溶
100× DTT solution

方法步驟:
1. 馬鈴薯葉片樣品取 350 µg,以 rehydration buffer 補體積至 250 µL。
2. 加入 2.5 µL 100× DTT solution 和 2 µL Bromophenol blue solution。
3. 將全部的樣品均勻加入至 strip holder 中。
4. 將 IPG strip 由 -20℃ 冰 箱 中 取 出 , 由 負 極 往 正 極 撕 去 薄 膜 , 膠 體 面 朝 向
holder,在不產生氣泡的情況下置於 strip holder 中。
5. 將 1 mL 的 cover fluid 蓋過 IPG strip,此液體應浮於水溶液樣品之上,可避免
strip 上的膠體乾掉。最後蓋上蓋子。
6. 開啟電腦,點選 IPGphor 軟體連線監控。
7. 第一次元 IEF 膠體 (13 cm strip) 電泳電壓參數如下:
Rehydration: 20℃,100 µA / strip,12 小時。

pH 3-10 NL 伏特 (Volt) 時間 (小時) 方式

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  500 1 Step- and hold
  1000 1 Step- and hold
  35000 Step- and hold

IP G 膠體 平衡反 應 (I PG s tr ip eq ui libra tio n)


IPG 膠體平衡反應主要目的是使 IPG strip 充分浸泡於 equilibration buffer 中,讓
蛋白質分子能完全被 SDS 包覆,利於第二次元電泳 (SDS-PAGE) 的進行。平衡反
應可分為兩階段,第一次的平衡為 reduction reaction:在 equilibration buffer 中加入
的 DTT,可以打開蛋白質分子間 (intermolecular) 或分子內 (intramolecular) 雙硫鍵。
第二次平衡為 alkylation reaction:在 equilibration buffer 中加入 Iodoacetamide (IAA)
,可將還原後的蛋白質硫氫基 ( SH group) 共價接上 acetamide 基團,避免蛋白質
因氧化再度形成雙硫鍵。

儀器設備:
Parafilm 膠膜
鑷子
裁切過的塑膠吸管 (約 15 cm 長)

藥品試劑:
SDS equilibration buffer:
Tris-HCl buffer , pH 8.8 (1.5 M, 最終使用濃度 50 mM) 6.7 mL
SDS (2%) 4.0 mg
Glycerol (30%) 69 mL
Urea (6 M) 72.07 mg
Bromophenol blue (0.01%) 少許

加水至 200 mL 後每 10 mL 分裝後保存於-20℃


Reduction buffer:100 mg DTT / 10 mL SDS equilibration buffer
Alkylation buffer:250 mg iodoacetamide / 10 mL SDS equilibration buffer

方法步驟:
1. 第一次平衡 (reduction) :將進行完第一次元電泳的 strip 置於 reduction buffer
中反應 15 分鐘。
2. 移去上述溶液,進行第二次平衡反應。
3. 第二次平衡 (alkylation) :於 alkylation buffer 中反應 15 分鐘。

第二 維 SDS -PA GE 電泳
二維膠體電泳的第二次元電泳的原理與 SDS 電泳的原理一樣。

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儀器設備:
平板式垂直電泳槽 (Hoefer SE-600)
電泳玻璃片 (18 x l6 cm)
間隔條 (Spacer, 1 mm)
電源供應器 (ISCOmodel453)
攪拌子
濾紙片 (作為 comb 使用)

藥品試劑:
同 SDS-PAGE 電泳
以及含 0.5 % Agarose SDS 電泳緩衝液

方法步驟:
1. 預鑄 12.5﹪SDS-PAGE 的膠體,預留約 1 cm 高的空間,將放置平衡後的 IPG
strip。膠片鑄造後可置於 4℃ 保存。
2. 將平衡後之 IPG strip 放於 SDS 膠體上 (先加入少量 SDS 電泳緩衝液以利操作)
,正極 (+) 在左,負極 (-) 在右,正極膠條頂至膠片最左端,避免任何氣泡
存在於 IPG strip 與 SDS 膠體之間。
3. 完全去除 SDS 電泳緩衝液。
4. 加入溫度約為 45℃ 之 0.5 % Agarose SDS 電泳緩衝液,同時迅速插入濾紙片
於整組膠片右邊。
5. 待 agarose 凝固後,組裝 SE-600 電泳槽,開始進行 SDS-PAGE。 (可於室溫或
4℃ 進行) 。
6. 使用 SE 600 電泳系統時,第二次元 SDS-PAGE 膠體電泳電流參數前 15 分鐘
每片 10 mA,之後以每片 20 mA 進行電泳約 5 小時。
影像擷取
本實驗之電泳膠體均以使用穿透式掃描器來擷取膠體影像。影像掃瞄裝置有很
多種,依據其掃瞄方式可略分為 CCD scanner、CCD camera 與 Laser scanner 等。CCD
camera 與 Laser scanner 可接收螢光訊號,對已用螢光標定的樣品,可做準確度極
高的表現差異量 (differential expression) 掃瞄。然而由於儀器與周邊價格昂貴,且螢
光染色並非所有實驗室所能負擔,因此一般而言,實驗室多使用 CCD scanner,
配合傳統染色法。這種方式已經可得到符合要求的膠體影像。決定 CCD scanner 品
質的因素包括其光學解析度 (optical resolution, DPI) 、光密度範圍 (optical density
range, OD) 與影像掃瞄輸出模式 (data output, bits/pixle) 。

儀器及軟體:
Image scanner (穿透式膠體掃描器)

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Magic scan V4.6

方法步驟:
1. 小心將染色後之膠片置於穿透式膠體掃描器上迅速,小心不要有任何氣泡
或灰塵沾附其上。
2. 迅速將多餘液體擦乾,避免損害掃描器。
3. 開啟 Magic scan V4.6,按下預視 (preview) 預掃膠體影像。
4. 選擇 “穿透式掃瞄”。
5. 選擇影像 “自動調整”。
6. 設定掃瞄路徑與存檔名稱 (需為 Tiff 格式) ,開始掃瞄並存檔完成。
7. 取下膠體,以拭鏡紙擦拭掃描器玻璃,並以 75% 酒精再清潔一次。
8. 所得影像可由影像分析軟體 (如 Photoshop) 標示重點。

質譜儀樣品處理與分析
在質譜儀分析前,含有蛋白質點的膠體必須經過適當蛋白酶 (protease) 水解,
並純化其中的 peptide 片段,再由質譜儀對這些片段作分析比對。

蛋白 酶水解
質譜儀所使用的蛋白酶,對蛋白質 peptide 的水解必須具有專一性。以胰蛋白酶
為例,其基質結合區 (substrate binding site) 富含負電荷,會專一性 (specific) 的與蛋
白質上的 Lysine 或 Arginine 結合。因此經由胰蛋白酶水解產生的 peptide 片段,其 C
端必為 Lysine 或 Arginine,這些具有特定切點的片斷將可以被分析。本實驗將以胰
蛋白酶 (Trypsin) 對目標蛋白質樣品水解。

儀器設備:
水浴或乾浴槽 (water bath or dry bath)
超音波震盪器 (Sonicator)
震盪混合器 (vortex)
真空乾燥濃縮機 (SpeedVac)

藥品試劑:
欲水解之蛋白質樣本膠點
Acetonitrile (HPLC grade)
25 mM Ammonium bicarbonate / 50% Acetonitrile (v/v) :
Ammonium bicarbonate 19.8 mg
Acetonitrile 5 mL

加水至 10 mL

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50 mM Ammonium bicarbonate:
取 39.6 mg 之 Ammonium bicarbonate 溶於 10 mL 之二次水中。
10 mM DTT:
取 1.54 mg 之 DTT 溶於 1 mL 之 25 mM Ammonium bicarbonate 中。
55 mM Iodoacetamide:
取 10.2 mg 之 Iodoacetamide 溶於 1mL 之 25 mM Ammonium bicarbonate 中。
50% Acetoneitrile , 1﹪Trifluoroacetic acid (TFA) (v/v) :
Acetoneitrile 0.5 mL
Trifluoroacetic acid 10 µL

加水至 1 mL
Trypsin (Promega, V5111)
Trypsin 20 µg
25mM Ammonium bicarbonate 1 mL

以 HCl 調 pH 直至 8 後-20℃保存
MALDI-TOF matrix solution (10 mg CHCA in 50% Acetonitrile / 0.1%TFA) :
CHCA (α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid,Sigma, C-2020) 10 mg
Acetonitrile 500 µL
TFA 1 µL

加水至 1 mL

方法步驟:
1. 取點
1.1. 將 1 mL 微量吸管尖端以手術刀切下約 1 mm。
1.2. 利用此吸管尖端,將膠體上欲鑑定的蛋白質點取下 (直徑約 1-2 mm) ,
裝入 1.5 mL 離心管 (離心管品質要佳,建議使用 eppendrof) 。
1.3. 加入 1 mL ddH2O 後直接移入 20℃ 保存。
2. 清洗
2.1. 以 1 mL 的 ddH2O,震盪清洗膠體三次,每次 10 分鐘。
2.2. 加入 0.5 mL 25 mM Ammonium bicarbonate / 50% Acetonitrile (v/v) ,震盪清
洗膠體 15 分鐘後移去上清液。
2.3. 加入 0.5 mL Acetonitrile,待膠體皺縮後移除 Acetonitrile。
2.4. 加入 0.5 mL 50 mM Ammonium bicarbonate 震盪 5 分鐘後,再加入相同體
積 Acetonitrile 震盪 15 分鐘後移除上清液。
2.5. 再次加入 0.5 mL Acetonitrile,待膠體皺縮成白色狀後移除上清液。
2.6. 室溫下乾燥數分鐘,輕拍管壁可見膠體在管內跳動。

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3. Reduction and alkylation
3.1. 加入 50 µL 10 mM DTT 於上述離心管中,於 56℃ 反應 45 分鐘後移除
上清液。
3.2. 加入 50 µL 55 mM Iodoacetamide 室溫下避光反應 30 分鐘後移除上清液。
3.3. 加入 0.5 mL 25mM Ammonium bicarbonate / 50% Acetonitrile (v/v) ,震盪清
洗膠體 15 分鐘兩次後移除上清液。
3.4. 加入 0.5 mL Acetonitrile,待膠體皺縮成白色狀後移除上清液。
3.5. 室溫下乾燥數分鐘,輕拍管壁可見膠體在管內跳動。
4. 胰白酶水解
4.1. 加入 1 µL Trypsin (20 ng) 於 37℃ 反應 30 分鐘。
4.2. 再加入 3 µL 25 mM Ammonium bicarbonate,於 37℃ 反應隔夜。
5. 萃取
5..1 確定樣品在至少有 3 µL 的情形下,若無則加入少量 ddH2O,以超音波
震盪 10 分鐘。
5..2 再加入 3 µL 50% Acetonitrile / 1﹪TFA sonication,以超音波震盪 10 分鐘。
5..3 重複此一步驟後,離心取上清液。
5..4 以真空乾燥濃縮機濃縮樣品 (若欲進行 LC/MS/MS 分析則到此為止) 。
5..5 將樣品沉澱物溶於 2 µL 的 50% Acetonitrile / 1﹪TFA。
5..6 取出 1 µL 樣品和 1 µL MALDI-TOF matrix solution 在 parafilm 上,以微量
吸管混勻。
5..7 取 1 µL 混合物,點在 MALDI-TOF 樣品盤上 (Target plate) ,待其風乾成
結晶狀後即可操作 MALDI-TOF 進行分析。

馬鈴薯葉片原生質體

原生 質體的 分離與 純化
得到馬鈴薯葉片原生質體以便進行往後的基因轉植實驗。每一種植物樣品適合
的條件都不一樣,甚至品系的不同和年齡也會影響純化的效果。感謝輔大 楊美桂
老師實驗室提供無菌操作平台供本論文實驗使用。

儀器設備:
馬鈴薯葉片數片 (fresh weight 約 5 g)
無菌用品:
剪刀
10 cm × 10 cm 細紗布數張
夾子
培養皿
15 mL 和 50 mL 離心管

53
玻璃離心管
滴管
0.22 um filter
低速離心機 (Hsiangtai, CN-3400A)
平台式震盪機 (rotator)

藥品試劑:
漂白水
70 % 酒精
Digestion solution (50 mL / 次) :
500 mM D-Sorbitol (Sigma, S1876) 4.56 g
1 mM CaCl2 (Merck, F719783 034) 5.55 mg
5 mM MES-KOH (Amresco, E169) 53.3 mg

利用二次水將體積補至 50 mL 並將 pH 值調至 5.5 後,


2 % Cellulose Onozuka R-10 (Yakult Honsha Co., 9012-54-8) 1g
0.3 % Macerozyme R-10 (Yakult Honsha Co., 9032-75-1) 0.15 g

使用前才將酵素加入並且利用 0.22 µm filter 過濾液體


Washing solution (100 mL 配方) :
500 mM D-Sorbitol 9.11 g
1 mM CaCl2 11.1 mg
5 mM MES-KOH pH 6.0 106.6 mg

利用二次水將體積補至 100 mL 並將 pH 值調至 6.0 後利用 0.22 um filter 過濾


液體
High-density solution (100 mL 配方) :
25 % Sucrose (Usb, US21938) 25 g
1 mM CaCl2 11.1 mg
5 mM MES-KOH pH 6.0 106.6 mg

利用二次水將體積補至 100 mL 並將 pH 值調至 6.0 後利用 0.22 um filter 過濾


液體
Low-density solution (100 mL 配方) :
13 % D-Mannitol (Sigma, M1902) 13 g
1 mM CaCl2 11.1 mg
5 mM MES-KOH pH 6.0 106.6 mg

54
利用二次水將體積補至 100 mL 並將 pH 值調至 6.0 後利用 0.22 µm filter 過濾
液體

方法步驟:
1. 先將馬鈴薯葉片進行消毒作用:
1.1. 利用二次水洗去樣品上灰塵。
1.2. 70 % 酒精浸泡樣品 5 分鐘後以二次水洗去多餘酒精。
1.3. 5 % 漂白水浸泡樣品 5 分鐘後以二次水洗去多餘漂白水。
2. 將葉片切成大小約 0.5 – 1 mm 的碎片。
3. 將葉片碎片放在培養皿並加入 25 mL Digestion solution。
4. 於 25 ℃ 黑暗環境下培養 3 小時。
5. 去 除 Digestion solution 後 將 組 織 碎 片 放 置 50 mL 離 心 管 中 , 加 入 20 mL
Washing solution 後置於平台式震盪機上低速搖晃 10 分鐘。
6. 蒐集 Washing solution,重覆一次。
7. 將 Washing solution 透過細紗布以去除大塊組織碎片。
8. 100 g 離心 10 分鐘後去除上清液,並利用 4 mL High-density solution 打散細胞。
9. 將含有細胞的 High-density solution 轉至玻璃離心管中,並小心加入 1 mL
Low-density solution。
10. 100 g 離心 5 分鐘後,細胞將存在於兩層液面之間。
11. 小心取出細胞並培養在植物培養液中。

細胞染色法

Ethidium Bromide / Acridine orange 活細 胞染色 法


在純化分離原生質體時難保全部的細胞都會存活,過低的存活率會影響之後轉
殖基因實驗的困難,判斷死活細胞數也有助於了解分離步驟是否適當。感謝輔大
周秀慧老師提供本論文所使用之 Et/Ao 染劑。

儀器設備:
血球計數器
螢光顯微鏡系統
照相系統:

藥品試劑:
100× EtBr / AO 試劑:
Acridine orange 15 mg
Ethidium bromide 50 mg

55
先溶解於 1 mL 95 % 酒精中,加入二次水將體積補至 50 mL,利用 PBS 稀釋
100 被後使用。

方法步驟:
1. 取 10 µL 待測細胞液與 10 µL EtBr / AO 試劑混合均勻後加入血球計數器中。
2. 利用螢光顯微鏡在藍光激發下觀察細胞,綠色為活細胞,紅色為死細胞。

原生 質體澱 粉粒染 色法 (碘液 染色 )


由於馬鈴薯葉片細胞可以生成澱粉,除了澱粉定量之外,也可以利用顯微鏡下
觀察與碘液行成錯合物的澱粉粒 (amyloplast)。先利用火烤 (或是甲醛) 將細胞固定
在載玻片後再以碘液染色細胞,於一般光學顯微鏡下即可觀察。

儀器設備:
載玻片與蓋玻片
光學顯微鏡
擦手紙

藥品試劑:
碘液

方法步驟:
1. 將細胞滴在載玻片上,利用火烤 2 – 3 分鐘來固定細胞。
2. 將碘液滴滿整各玻片,靜置一段時間後用擦水紙吸去多餘碘液,於光學顯微
鏡下觀察。

56
第三章 結果
由於每個基因的表現都是從 DNA 轉錄 (transcription) 出 mRNA 後再轉譯
(translation) 出蛋白質來執行基因的功能。因此欲建立 L-SP 基因表現的偵測方法,
在 mRNA 表現上使用 L-SP 專一性引子來進行 RT-PCR 進而得知基因的表現量;
在偵測 L-SP 蛋白質量上則是利用西方墨點法來測定含量。除此之外也利用 SP
活性染色法來偵測樣品中蛋白質的活性。藉由這些測定方法可以得知馬鈴薯葉
片受到蔗糖刺激後,其細胞內 L-SP 基因表現量的改變,除此之外,轉殖 L-SP
的專一性 siRNA 後,也是就由這些方來得知法原生質體內 L-SP 基因表現的變
化。

馬鈴薯 L-SP 抗體製備


為了利用西方墨點法的技術來探討馬鈴薯葉片中 L-SP 蛋白質受到蔗糖刺激
後的變化,所以必須取得一高專一性的抗體來偵測葉片 L-SP 蛋白質。在製備專
一性抗體的部份,首先先進行馬鈴薯 L-SP 蛋白質的純化,根據文獻的報導,
馬鈴薯塊莖中擁有高含量的 L-SP,所以在純化 LSP 蛋白質的部份,就是從塊莖
中純化出高含量的 L-SP 蛋白質,並且利用這些蛋白質來進行免疫小鼠的動作,
藉此以獲得抗 L-SP 蛋白質的抗體。由於實驗室先前的研究是探討甘藷 (sweet
potato) 中 L-SP 蛋白質的生理功能,所以擁有許多測試 L-SP 蛋白質的生化技術,
以下將以純化甘藷塊根中 L-SP 蛋白質的方法做為基礎,參考並修改其中某些
步驟來進行實驗。

馬鈴薯塊莖 L-SP 純化
馬鈴薯塊莖中 L-SP 蛋白之純化是根據實驗室現有純化甘藷塊根 L-SP 方法加
以修改。將從市場買回的馬鈴薯洗淨後削皮製成簽,在冰箱內以果汁機配合緩
衝液 B 研磨組織,以取得馬鈴薯塊莖粗抽液。利用 20 - 60 % 硫酸銨分劃沉澱蛋
白質,將蛋白質沉澱物回溶在少量緩衝液 C 之後,以緩衝液 C 進行一個晚上的
透析。透析後將樣品濃縮至體積 1 mL 以下後進行 DEAE 陰離子交換樹脂,蒐集
流洗液後利用 L-SP 活性染色法染色膠體後發現,L-SP 可在 NaCl 濃度 0.3 M 時
被流洗出來 (圖十 A) ,代表 L-SP 在陰離子交換樹脂時的 NaCl 流洗液濃度應介
於 0.2 - 0.3 M 之間。之後將每管流洗液利用 Bradfold 溶液進行大略的蛋白質定
量 (相對值) (圖十 B) ,發現在 0.3 M NaCl 流洗過程中,多數蛋白質 (包括 L-
SP) 多留在前三管中,故取第 14 – 16 管利用 YM-30 進行蛋白質濃縮,將體積
濃縮至小於 4 mL 為止。濃縮後的蛋白質樣品在低溫下進行製備式電泳,電泳分
析後截取膠體中間部份進行 L-SP 活性膠體染色 (圖十一 A) ,決定 L-SP 存在膠
體的區域後,切下含有 L-SP 的膠體置於冰箱中進行電泳溶離。溶離後則可以得
到純度很高的 L-SP 蛋白質 (圖十一 B) 。純化好的蛋白質經質譜儀鑑定其身分確
實 為 L-SP 之 後 , 不 僅 可 以 在 膠 體 活 性 染 色 和 西 方 墨 點 法 上 當 作 positive

57
control,也可以用在誘導小鼠產生抗體的抗原使用。

抗馬鈴薯 L-SP 蛋白質抗體與抗甘藷 L-SP 蛋白質抗體之比較


抗甘藷 L-SP 的單株抗體由台大微生物與生化所 莊榮輝老師實驗室所提供。一
開始在西方墨點實驗上,本想利用抗體之間的 cross-link 的現象來測定馬鈴薯葉
片中 L-SP 蛋白質的表現量,但是實驗結果卻發現專一性都不高 (圖十二 A 與 B)
。故利用由馬鈴薯塊莖所純化出來的 L-SP 蛋白進行免疫小鼠的實驗,每次免疫
小鼠使用總體積 125 µL 含 50 µg L-SP 蛋白質的 PBS 緩衝液與 125 µL 佐劑
(adjuvant) 的混合液,每隔兩週免疫一次小鼠,共免疫五次。免疫第五次後的隔
周用 2 × 106 NS-1 細胞誘導小鼠產生腹水。待腹腔腫大至影響小鼠行動後 (約需
一周時間) ,以斷頸法犧牲小鼠並蒐集腹水,利用 PBS 緩衝液將腹水體積放大
三倍,爾後使用硫酸銨 (0 – 40 %) 沉澱腹水中的 IgG 蛋白質,回溶至原本一半
體積的 PBS 緩衝液中並透析隔夜,透析後濃縮至原本腹水體積的一半,最後加
入等體積的甘油 (glycerol) ,混合均勻及得到抗馬鈴薯 L-SP 之多株抗體。製備出
來的多株抗體在進行西方墨點法之後 (圖十二 C) 發現的確能專一的指出馬鈴薯
葉片中 L-SP 蛋白質的位置。
除了多株抗體的專一性之外,在圖十二 C 中也初步發現,經過 10 % 蔗糖誘
導的馬鈴薯葉片比沒有誘導過的葉片中 L-SP 含量有著顯著的增加,確定蔗糖
的確可以增加 L-SP 蛋白質的表現量。但在 SDS-PAGE 電泳分析後轉印過後的實
驗結果中發現,L-SP 在葉片中表現量不算高,需要經過較長的時間呈色才能觀
察到,所以會有些微非專一性的色帶出現,而在使用 Native-PAGE 電泳分析後
轉印過後的實驗結果中非專一性影響比較小,除此之外,由於 SDS-PAGE 上大
部分的 L-SP 蛋白質會被另一分子量差不多的蛋白質 (經質譜儀鑑定身分為
Rubisco 蛋白質,data not shown) 所遮蔽到,而利用 Native-PAGE 電泳分析可以
將兩者分,所以之後的西方墨點法實驗都是以 Native-PAGE 進行電泳分析後再
轉印至 PVDF 膜上。

58
A

B
protein conc.

1.8 0.6

1.6
0.5
1.4

NaCl (M)
OD595

1.2
0.4

1.0

0.3
0.8

0.6
0.2
0.4

0.2 0.1
5 10 15 20 25 30

Fraction (tube)

20~60% AS
NaCl

圖十 馬鈴薯薯球粗抽液經 DEAE 陰離子交換樹脂後各管進行 L-SP 活性染色結果


硫酸銨分劃 (20~60 %) 後的馬鈴薯塊莖粗抽液,經過透析隔夜後進行 DEAE 陰離子交換樹
脂。(A) 蛋白質粗抽樣品在滴入後陰離子交換數之後開始蒐集。先以 0.15 M NaCl 緩衝液 A
流洗 (編號 1~6) ,接著用 0.2 M NaCl 緩衝液 A (編號 7~13) 、0.3 M NaCl 緩衝液 A (編號
14~19) 、0.4 M NaCl 緩衝液 A (編號 20~25) 和 0.5 M NaCl 緩衝液 A (編號 26~30) 流洗。搜
集完後的樣品依序進行 7.5 % Native-PAGE 電泳分析後以 SP 活性染色法染色。結果說明 L-
SP 在 0.3 M NaCl 緩衝液 A 的情況下離開 DEAE 樹脂。 (B) 從蒐集的 30 管中各取 10 µL 進
行 Bradfold 蛋白質定量法,左縱軸代表各管的蛋白質相對含量,右縱軸代表各管流洗使
用的 NaCl 濃度。

59
A B

L-SP

L-SP

圖十一 馬鈴薯塊莖中 L-SP 蛋白質純化之過程


(A) 將經過陰離子交換樹脂後的馬鈴薯 L-SP 蛋白質粗抽液進行製備式電泳,使用 SP 活性
染色法染色膠體,染色後發現有許多條色帶,將圖中選取的部份 (顏色最深的區域) 切下
其他未染色之相對位置的膠體,切成小塊膠體後進行電泳溶離。; (B) 溶離後 L-SP 蛋白質
進行 12.5 % SDS-PAGE 電泳分析,利用 CBR 膠體染色法觀察純化出來的蛋白質分佈的情
形。

60
L-SP

圖十二 馬鈴薯葉片經 10 % 蔗糖刺激後的西方墨點法圖


(1) 不經過蔗糖刺激; (2) 以 10 % 蔗糖溶液刺激葉片 24 小時。粗抽葉片蛋白質後,使用
12.5 % SDS-PAGE 進行電泳分析後轉印至 PVDF 膜上,利用不同的一級抗體進行西方墨
點法。(A) 利用抗甘藷 L-SP 的單株抗體 H7c 做為一級抗體,二級抗體使用 Goat anti-mouse
conjugated HRP; (B) 利用抗甘藷 L-SP 的單株抗體 J3b 做為一級抗體,二級抗體使用 Goat
anti-mouse conjugated HRP; (C) 利用抗馬鈴薯 L-SP 的多株抗體做為一級抗體,二級抗體
使用 Goat anti-mouse conjugated AP。HRP 呈色劑為 DAB;AP 呈色劑為 NBT + BCIP。

61
利 用 蔗 糖 溶 液 誘 導 馬 鈴 薯 葉 片 中 L-SP 蛋 白 質 表 現 增


由於馬鈴薯葉片中 L-SP 含量不高,所以希望建立誘導 L-SP 增加的條件,不
僅方便實驗觀察,也為增加日後觀察使用 L-SP 專一 siRNA 轉殖葉片的效果。根
據 Tandecarz 等人在 1996 年發現馬鈴薯原生質體中 L-SP 蛋白質表現在 3 % 蔗
糖溶液培養的條件下比在 2 % 蔗糖溶液表現量高 ,由於 Tandecarz 實驗中使用
的一級抗體效價很高,故能觀察到 L-SP 蛋白質表現量微小的差異。但在考慮未
來 siRNA 轉殖原生質體效率 (efficiency) 可能不高的情況下 (一般而言,除了使
用病毒來進行轉殖實驗,其餘轉殖方法的效率都不超過 50 %),轉殖後的原生
質體族群基因受到抑制的效果在整各族群中也不會太顯著,如何拉大轉殖後基
因抑制的效果變成為影響實驗結果判讀的重要步驟。於是為了方便實驗結果的
觀察,希望在轉殖 L-SP 專一 siRNA 之後,可以誘導 L-SP 基因表現量增加,而
沒有轉殖 siRNA 的葉片中 L-SP 含量會因為刺激而增加,有轉殖 siRNA 的葉片
則會因為 RNAi 的抑制,使得 L-SP 無法因為刺激而增加,故可以觀察到轉殖與
沒轉殖 L-SP 表現量上的差異。因此,找出利用蔗糖誘導 L-SP 表現量增加的最
佳條件,則是本論文的第一要件。

馬鈴薯葉片中澱粉含量會因蔗糖刺激而累積
利用不同濃度的蔗糖溶液來刺激馬鈴薯葉片,搭配光照與否的條件,發現當
蔗糖溶液濃度越高時可以造成葉片中的澱粉生成越多,同樣的條件下也發現光
照有利於澱粉的累積 (圖十三) 。除此之外,在蔗糖溶液濃度低於 2 % 的情況下,
對於澱粉的累積並不會因為是否有經過光照而受到影響。在可誘導澱粉累積的
同樣的蔗糖濃度下,經過光照的葉片會比沒有經過光照的葉片產生更多的澱粉,
但是相對於無法誘導澱粉累積的蔗糖濃度條件下,卻不會因為光照的關係影響
細胞內澱粉的累積。因此推論,蔗糖的誘導在光照的輔助下可以加強澱粉累積
的程度,而在一般的生理條件情況下 (蔗糖濃度低於或等於 2 %) ,光照影響澱
粉累積的程度差異並不大。
在光照條件下,利用 10% 蔗糖溶液刺激 24 小時後的葉片,利用碘液進行澱
粉染色發現,明顯比沒有受到 10% 蔗糖溶液刺激的葉片顏色還深 (圖十四 A)
,代表在葉片中澱粉生成量的確和蔗糖刺激有關。在相同的實驗條件下,純化
出來的馬鈴薯葉片原生質體,同樣利用碘液染色也可以在顯微鏡下觀察到較多
的澱粉顆粒生成 (圖十四 B) ,而從沒有蔗糖刺激的葉片純化出來的原生質體,
可能因為沒有多餘澱粉的累積,導致澱粉粒無法因為澱粉累積而增大,導致在
光學顯微鏡下無法以肉眼觀察到。
以上結果皆顯示蔗糖溶液的確可以誘導馬鈴薯葉片中澱粉的累積,不僅如此,
隨著誘導時間的增加,澱粉的累積也跟著增加,而所使用的蔗糖溶液濃度也會

62
影響澱粉累積的程度。

馬鈴薯葉片中 Leucine aminopeptidase 蛋白質含量增加


經過光照和 10 %蔗糖溶液誘導馬鈴薯葉片 0 至 48 小時之候發現,隨著蔗糖
誘導的時間增加,有一種原態分子量約 300 kD 而次單元體分子量約 50 kDa 大
小的蛋白質也隨之增加 (圖十五 A 與 B) ,經 LC / MS / MS 質譜儀分析鑑定身分
後發現為 Lecine aminopeptidase 蛋白質 (圖十五 C) ,說明在 10 % 蔗糖溶液的誘
導下,並不是只有 L-SP 蛋白質會隨著誘導時間的增加而增加。而增加的含不僅
在 SDS-PAGE (圖十五 B) 和 Native-PAGE (圖十五 A) 可以發現。所以一旦使用
10 % 蔗糖溶液當作爾後刺激的條件,雖然可以使細胞內 L-SP 蛋白質表現量與
澱粉累積增加甚多,但卻也會引發其他非澱粉代謝相關基因表現量表現甚多,
因此,為了避免葉片因過高的滲透壓刺激而引發細胞內其他機制來抵抗過高的
滲透壓刺激,之後的實驗便將蔗糖溶液的刺激溶度改成 5 %,雖然 L-SP 基因表
現量減少了,相對的,其他非澱粉代謝相關基因因滲透壓誘導而表現的量的減
低了。這樣的條件取捨可以減少日後在系統生物學實驗上的繁雜度。

誘導馬鈴薯葉片中 L-SP 蛋白質表現量


將馬鈴薯葉片剪下後利用 70 % 酒精進行消毒,之後直接浸泡在 5 % 蔗糖溶
液中進行誘導 0 至 48 小時,誘導結束後抽取葉片蛋白質,經 80 % 硫酸銨沉澱
法濃縮樣品後,進行 Native-PAGE 電泳分析,電泳分析後將膠體中的蛋白質轉
印至 PVDF 轉印膜後,利用 8M Urea-PBST 浸泡兩小時後以 PBST 將多餘 Urea
洗淨,使用稀釋 5000 倍的一級抗體進行西方墨點法實驗。二級抗體則為稀釋
20000 倍 goat anti-mouse conjugated-HRP,呈色基質使用 ECL,利用底片壓片進
行感光以觀察結果。在光照與 5 %蔗糖溶液誘導的條件下發現,L-SP 蛋白質表
現量會隨著誘導時間的增加而增加 (圖十六) ,並利用 Image Master 2D Elite 軟體
定量。

誘導馬鈴薯葉片中 L-SP 蛋白質活性


取下馬鈴薯葉片進行消毒後,將馬鈴薯葉片置於光照環境與 5 % 蔗糖溶液中
誘導 0 至 48 小時後,誘導結束後抽取葉片蛋白質,經 80 % 硫酸銨沉澱法濃縮
樣品後,進行 Native-PAGE 電泳分析。電泳分析後則是利用 SP 活性染色法進行
膠體染色,圖中說明了馬鈴薯葉片中 L-SP 蛋白質的活性也會隨著蔗糖誘導時
間的增加而增加 (圖十七) 。不過因為 5 % 蔗糖溶液對於細胞來說是種高滲透壓
的環境,細胞內澱粉的累積究竟是因為蔗糖誘導還是因為高滲環境所造成。在
實驗過程中,藉由其他單醣 (mannitol 和 sorbitol) 製造與 5 %蔗糖溶液相同的滲
透壓,結果發現並不能誘導 L-SP 蛋白質含量和活性的增加 (圖十八) ,顯示 L-
SP 蛋白質表現量與活性的增加一定與蔗糖有關。

63
誘導馬鈴薯葉片中 L-SP mRNA 表現量
取下馬鈴薯葉片進行消毒後,將馬鈴薯葉片置於光照環境與 5 % 蔗糖溶液中
誘導 0 至 48 小時後,抽取葉片的 total RNA 後,先以變性膠體進行電泳分析,
分析後利用 EtBr 進行染色,確定 RNA 樣品沒有 smear 的現象後,再利用 L-SP
引子和 Actin 引子分別進行 RT-PCR 實驗。RT-PCR 的結果中發現 L-SP 蛋白質的
基因會因為光照環境與蔗糖的誘導,隨時間的增加而增加 (圖十九 A) 。經過
Image master 2D Elite 軟體定量發現,在 5% 蔗糖誘導 36 小時後,馬鈴薯葉片中
的 L-SP mRNA 表現量比沒有誘導的樣品表現量增加約 6 倍左右 (圖十九 B) 。

64
A
Sucrose induction (Light)
Starch (g) / leaf weight (g) 1400
0%
1200 1%
2%
5%
1000 10%

800

600

400

200

0
0 6 12 18 24
Incubation time (hr)

B
Sucrose induction (Dark)
1400
Starch (g) / leaf weight (g)

0%
1200 1%
2%
5%
1000 10%

800

600

400

200

0
0 6 12 18 24
Incubation time (hr)

圖十三 馬鈴薯葉片以不同蔗糖溶液濃度誘導澱粉累積之比較
馬鈴薯葉片摘下後,先以酒精消毒後,並以含有不同濃度蔗糖溶液中,分別在 (A) 光照以
及 (B) 黑暗下培養 0 至 24 小時,誘導結束後萃取葉片中的澱粉並加以定量。

65
A B
0 hr 24 hr

1 cm 1 cm
C D
0 hr 24 hr

cl

cl

cl
cl

50 µm 50 µm

圖 十四 馬 鈴薯葉片在 10 % 蔗糖誘導 0 與 24 小時後,以碘液染色呈現澱粉累積 的


現象
(A) 馬鈴薯葉片不經過蔗糖誘導; (B) 馬鈴薯葉片以 10 % 蔗糖溶液於光照環境下誘導 24
小時; (C) 從圖 A 葉片中純化出來的原生質體; (D) 從圖 B 葉片中純化出來的原生質體。
箭號所指為葉綠體 (chloroplast, cl) 。

66
67
圖 十五 10 % 蔗糖溶液誘導條件導 致馬鈴薯葉片 Leuci ne aminope ptidase 蛋白質的
增加
(A) 葉片蛋白質粗抽液利用 7.5% Native-PAGE 進行電泳分析; (B) 葉片蛋白質粗抽液利用
12.5 % SDS-PAGE 進行電泳分析; (C) LC / MS / MS 結果經由 Matrix Science 網站分析的結
果。

68
69
圖 十 六 馬 鈴 薯 葉 片 在 5 % 蔗 糖 誘 導 0 至 48 小 時 後 , 利 用 西 方 墨 點 法 探 討 L-SP
蛋白質表現量的差異
(A) 誘導結束後將葉片蛋白質粗抽液利用 7.5% Native-PAGE 進行電泳分析,藉由西方墨點
法來觀察不同誘導時間下 L-SP 蛋白質的表現量。 (B) 將圖 A 之色帶以 Image Master 2D
Elite 軟體加以定量。

70
A Induction time (hrs)
0 2 4 6 12 24 36 48
L-SP

B Induction time (hrs)


0 2 4 6 12 24 36 48

圖 十 七 馬 鈴 薯 葉 片 在 5 % 蔗 糖 誘 導 0 至 48 小 時 候 , 利 用 SP 活 性 染 色 法 探 討 L-
SP 蛋白質活性的差異
(A 誘導結束後將葉片蛋白質粗抽液利用 7.5% Native-PAGE 進行電泳分析後,藉由 SP 活性
染色法來觀察不同誘導時間下 L-SP 蛋白質活性的差異。 (B) 圖 A 色帶之 loading control。

71
A

圖十八 L-S P 蛋白質活性與含量無法利用高滲透壓條件誘導後增加


利用 Sorbotol 與 Mannitol 誘導馬鈴薯葉片中的 L-SP。圖中 1 代表誘導前;2 代表 sorbitol 誘導
12 小時;3 代表 sorbitol 誘導 24 小時;4 代表 mannitol 誘導 12 小時;5 代表 mannitol 誘導 24
小時。 (A) 利用西方墨點法觀察 L-SP 蛋白質表現量的差異; (B) 藉由 SP 活性染色法觀察
其 L-SP 活性的變化; (C) 為圖 A 與圖 B 的 loading control,利用 CBR 染色膠體。

72
5% sucrose induction

圖十九 馬鈴薯葉片在 5 % 蔗糖誘導 0 至 48 小時候, L-S P mRNA 的表現量


(A) 經過蔗糖刺激後的馬鈴薯葉片 mRMA,利用 RT-PCR 來探討基因表現量的差異。利用
2% agarose 進行電泳分析; (B) 將圖 A 之色帶以 Image Master 2D Elite 軟體加以定量,將 L-
SP 基因表現量除上 Actin 基因表現量。

73
馬鈴薯葉片原生質體轉殖 siRNA
根據上述誘導與測定 L-SP 基因表現方法,配合上植物原生質體 (protoplast)
純化的方法後,將 L-SP 專一 siRNA 轉殖進入馬鈴薯葉片原生質體中。根據先前
的研究指出,轉殖至細胞內的 siRNA 需要 36 – 72 小時候才能完全抑制細胞內
基因的表現 ,所以在本論文中不僅要建立馬鈴薯葉肉細胞原生質體的純化條件,
也要建立其培養條件。因為純化出來的原生質體在經過 siRNA 轉殖過後,先培
養 36 -72 小時以讓 siRNA 作用,之後再利用上述的蔗糖誘導條件誘導 L-SP 蛋
白質表現,誘導結束後再觀察 L-SP 蛋白質表現情形是否有受到 siRNA 的抑制,
若 L-SP 基因的表現可以受到抑制,之後才觀察澱粉生成是否受到影響。

L-SP 專一 siRNA 設計與製備


一般設計 siRNA 序列時常用遵循以下繼各步驟:第一,選擇標的 mRNA 序
列上具有 AA dinucleotide 起始的21nt長度 ;第二,挑選四段適合序列進行實驗。
由於 L-SP 中含有一段特定序列 (約 80 個胺基酸,稱為 L78) 而 H-SP 沒有,利
用 BLAST 搜尋比對各生物體中的基因序列後,發現 L78 或其他 L-SP 中的相對
序列,其序列與任何基因皆無序列同質性 ,因此非常適合作為siRNA 的標的序
列,可以避免產生非專一性的基因表現抑制。因此將這段胺基酸序列的基因片
段 (204 nt) ,以 Ambion Inc. 所提供的 siRNA target finder 分析後,共發現 19 段
適合序列 (表四) ,挑選其中四組進行 in vitro transcription。利用 SilencerTM siRNA
Construction Kit 將選定的四段序列進行細胞外轉錄作用,並得到大小約 20 nt 的
siRNA 四組 (圖二十) 。

馬鈴薯原生質體純化條件之建立
根據 Serva 網站 (http://www.serva.de/products/knowledge/081041.shtml) 所提供
的純化方法加以修改,並拿來作為純化馬鈴薯葉片原生質體的步驟。由於一開
始使用的馬鈴薯品種為農改場所提供的克尼伯,不僅可以使用三階段梯度純化
出大量原生質體,而且存活率相當的高 (圖二十一 A 與 C) 。但是由於此克尼伯
品種得來不易,故之後實驗所使用的品種皆為市場買來不明品種,不僅純化出
原生質體數量明顯降低 (圖二十一 B),而且存活率也不高 (圖二十一 D) 。因此,
在調整純化馬鈴薯葉片原生質體的條件,則是本論文中耗費最久的時間。最後,
參考由 Grosser 所建立的植物原生質體純化方法後 ,改以兩階段梯度來純化葉
片原生質體,雖然可以純化出較多的原生質體 (圖二十二 A) ,但是存活率 (圖
二十二 B) 卻不及之前使用克尼伯 (圖二十一 C) 品種當做實驗材料來的高。
在本論文實驗設計之初,欲利用蔗糖刺激後所純化出來的原生質體進行轉殖
實驗,但是結果發現,經過蔗糖誘導之後的葉片在三階段濃度梯度的純化步驟
時,大部分原分質體不會存在於溶液的中間介面上 (圖二十一 A) ,而是在離心
後降至管底。說明了在蔗糖的誘導之後,馬鈴薯葉片中的細胞本身密度有所改

74
變,導致純化的數量大幅降低,也使往後實驗設計改以純化未經蔗糖刺激的葉
片,純化出原生質體後再進行轉殖 siRNA 的步驟。

馬鈴薯原生質體培養條件
轉植實驗一次的需要約需要 106 原生質體,而經由蔗糖誘導之後所純化出來
的原生質體數量太低 (約 105 ) ,如此一來若要使用蔗糖誘導後的原生質體進行
轉植實驗,一次實驗將需要約 40 g 馬鈴薯葉片材料需足夠 (約可從 4 g 未經蔗
糖誘導之葉片中純化出 106 個原生質體) ,所以改以純化未經誘導之原生質體後
再 進 行 siRNA 的 轉 植 實 驗 。 在 純 化 出 葉 片 原 生 質 體 之 後 , 先 利 用 電 導 法
(electroporation) 轉殖 siRNA 進入細胞內,轉殖後經過 24 小時的培養後以 Et/Ao
細胞染色法觀察原生質體發現,大部分細胞皆已經死亡 (圖二十三) 。一開始認
為是轉殖技術上所造成原生質體的死亡,所以花了一段時間調整電導法的條件
設定,但是卻始終不見任何起色。加上電導法轉殖作用結束後以 Et/Ao 細胞染色
法觀察原生質體的存活率發現,存活率與轉殖前並無太大的差異,所以推測可
能是培養條件或環境不利原生質體生長。所以在原生質體純化後分別各以含 2 %
sucrose MS meduim 以及輔大 蘇睿智老師所以提供之 Conditon medium 培養 24
小時後,發現大部分細胞皆已經死亡 (圖二十四) ,因此認為在培養原生質體的
條件上並不如預期中來的簡單。

75


表四 L78 序列中適合做為 siRNA 的序列


根據 Ambion Inc. 所提供的 siRNA target finder 分析後,共發現 19 段適合序列,其中以星
號 (*) 註解的即為選定做為本論文實驗所用的四組 siRNA 序列。

76
1 2 3 4 5

圖 二 十 利 用 Silencer TM siRNA Co nstructio n Ki t 所 製 備 出 來 的 四 組 L-S P 專 一


siRN A 與 con trol 的 GF P 專一 siRNA
(1) 為 GFP 基因的 siRNA (序列為:5’-AAGGTGATGCAACATACGGAA-3’) ; (2) 序列為
編號 8 的 siRNA; (3) 序列為編號 12 的 siRNA; (4) 序列為編號 13 的 siRNA; (5) 序列為
編號 15 的 siRNA。

77
1 2
A B

C D
200 µm 200 µm

圖 二十 一 使用 Serva 網站提供之純化步驟來純化不同品系馬鈴薯葉片原生質 體
的結果
(A) 使用三階段濃度梯度純化克尼伯品種的原生質體,編號 1 為不經過蔗糖誘導之葉
片的純化結果,編號 2 為經過 10 % 蔗糖誘導之葉片的純化結果; (B) 使用三階段濃度
梯度純化市場買來品種的原生質體; (C) 克尼伯品種的葉片原生質體使用 Et/Ao 染色
觀察存活率的結果; (D) 市場買來的品種其葉片原生質體使用 Et/Ao 染色觀察存活率
的結果。圖 A 與 B 中,黑色箭頭所指位置為純化出來的原生質體所在位置,在存活率
染色部份;圖 C 與 D 中,綠色螢光表示活細胞,而紅色部分表示死細胞。

78
A

圖二十二 使用 Prof. Gloria 建議的純化步驟,從一般市場買來之馬鈴薯葉片所純


化出的原生質體結果
(A) 使用兩階段濃度梯度純化原生質體之結果,黑色箭頭所指位置為純化出來的原生
質體所在位置。 (B) 利用 Et/Ao 染色法觀察純化出來的原生質體之存活率,綠色螢光代
表活細胞,紅色螢光代表死細胞。

79
80
A

400µm
B

400µm

圖二十三 經由電導法 (electroporation) 轉殖 siRNA 前後細胞的存活情形


(A) 轉殖前利用 Et/Ao 觀察存活率; (B) 轉殖後經過 24 小時培養後,利用 Et/Ao 觀察
存活率。圖中可以明顯發現,轉殖後的原生質體經過 24 小時培養後皆已死亡。綠色螢
光代表活細胞,紅色螢光代表死細胞。

81
A

500 µm

圖二十四 培養馬鈴薯葉片原生質體的結果
(A) 從市場買的馬鈴薯葉片中剛純化出來的原生質體存活率; (B) 利用 2 % sucrose
MS medium 培養 24 小時候原生質體的存活率; (C) 利用 Condiotion medium 培養 24
小時候原生質體的存活率。綠色螢光代表活細胞,紅色螢光代表死細胞。

82
葉片的澱粉代謝相關基因之系統生物學研究
所謂系統生物學,就是探討一細胞 (或生物) 受到外來某一刺激後,誘導出來
的基因彼此之間的調控關係。在本論文中,將利用馬鈴薯葉片為實驗材料,以 5
% 蔗糖溶液當做外來刺激,探討馬鈴薯葉片細胞中澱粉代謝相關基因間彼此的
交互作用。由於目前已知與澱粉代謝相關的基因不下數十個,假如將每個基因
都進行 RT-PCR 的分析,所花費的成本將會過高,因此一開始根據 KEGG 所提
供的 “Sucrose and Starch Metabolism” 相關基因的路徑圖 (圖八) ,挑選 20 個有
興趣的基因先進行研究 (包括 L-SP 基因) 。由於植物體內合成澱粉的途徑相當複
雜,故在本論文中期望找出由外來蔗糖所誘導出的澱粉合成路徑中,相關代謝
基因彼此的交互作用。

利用二維膠體電泳探討系統生物學
蛋白質體學是以生物體全體蛋白質做為研究對象的一個新興學門,而在蛋白
質體學的各項技術中,又以二維膠體電泳 (two-dimensional electrophoresis) 結合
質譜儀 (mass spectrometry) 分析的研究方法最廣為使用。因此,藉由二維膠體電
泳與質譜儀,科學家可以同時分離並鑑定生物樣品中上千種蛋白質。因此,在
探討馬鈴薯葉片因蔗糖誘導造成澱粉累積的系統生物學研究上,預期可以利用
蛋白質體學的技術加以應用與討論在蛋白質間的關係。本論文使用 5 % 蔗糖溶
液誘導馬鈴薯葉片 0 至 24 小時後,輔以二維膠體電泳的方式進行分析。在第一
維膠體電泳的部分使用的條件為 pH 3 – 10 的 strip,在蛋白質總量為 350 mg 時
利用 36500 Vhr 來分離蛋白質,第二維膠體電泳則是使用 12.5% SDS-PAGE 來
分離蛋白質,電泳分析結束後以鋅染色法觀察樣品中蛋白質分佈的情形。
由於蔗糖誘導時間的不同,在誘導四個時間點下,觀察到許多蛋白質表現量
出現改變,其中選取 12 個蛋白質表現量差異較多的蛋白質 (圖二十五) 進行
trypsin preoteolysis,並送交中研院進行 LC / MS / MS 分析,將質譜儀分析結果
經由 Matrix Science 網站進行身分比對,發現其中四個蛋白質的可能身分。依照
分子量排序,分別為 Threonine deaminase、Rubisco large subunit、Rubisco 以及 R1
protein (表四)。

利用 RT-PCR 探討系統生物學
本論文所研究的系統生物學可分為兩各部份,一是利用蛋白質體學方式進行
探討,另一部份則是根據阿拉伯芥已知 “Sucrose and Starch metabolism” (圖八)
代謝途徑中選取 19 個基因 (表六) 進行 RT-PCR 反應,在蔗糖誘導的不同時間
點下,觀察這 19 個基因各自表現量上的變化,進而推測可能的調控途徑。由於
這些基因大部分都有同源基因 (homologus genes),所以實際上所測試的基因不
只 19 個。在本論文中目前只先探討三個基因 (包括其中所包含的同源基因),分
別是 cytosolic starch synthase、granule-bound starch synthase 以及 ADP–glucose

83
pyrophosphorylase。在 5 % 蔗糖誘導不同時間後,利用每個基因各自專一的引子
進行 RT-PCR 來得知這些基因表現量的變化。

84
圖二十五 馬鈴薯葉片在 5 % 蔗糖誘導 0 至 24 小時候整體蛋白質含量的改變
(A) 蔗糖誘導 0 小時之葉片蛋白質 2-DE 圖譜。 I-VI 區域放大圖示顯示於 (B) 。藍色箭號代
表受到蔗糖誘導而表現增加之蛋白質。紅色箭號代表受到蔗糖誘導而表現減少之蛋白質樣
品。1st dimension:13 cm,pH 3- 10,total protein 350 µg,36500 Vhr;2nd dimension:12.5 %
SDS-PAGE;膠體進行鋅染色法。

85
Number Up Down Protein ID Theoretical MW and pI
regulated regulated
1 ▲ Threonine deaminase 39235 Da and 4,73
4 ▲ Rubisco large subunit -
6 ▲ Rubisco -
12 ▲ R1 protein 57472 Da and 5.66

表五 在蔗糖誘導澱粉累積的過程中,表現量改變以及已經由 LC / MS / MS 鑑定出
身分的蛋白質
圖中以三角形標示為蛋白質受到蔗糖誘導後,表現亮增加或是減少。

86
Accession or EC number Enzyme ID Reaction catalyzsd
TC number
Z21486 3.2.1.26 Beta-fructofuranosidase Hydrolysis of terminal non-reducing beta-D-
fructofuranoside residues in beta-D-fructofuranosides

AJ001374 3.2.1.20 Alpha-glucosidase Hydrolysis of terminal, non-reducing 1,4-linked alpha-D-


glucose residues with release of alpha-D-glucose

Z12823 2.7.1.4 Fructokinase ATP + D-fructose <=> ADP + D-fructose 6-phosphate

AY205302 2.4.1.13 Sucrose synthase NDP-glucose + D-fructose <=> NDP + sucrose

TC112034 2.7.7.27 AGPase ( ADP-glucose ATP + alpha-D-glucose 1-phosphate <=> diphosphate +


pyrophosphorylase ) ADP-glucose

AJ240054 5.4.2.2 Phosphoglucomutase Alpha-D-glucose 1-phosphate <=> alpha-D-glucose 6-


phosphate

X52385 2.4.1.1 Phosphorylase (1,4-alpha-D-glucosyl)(n) + phosphate <=> (1,4-alpha-


D-glucosyl)(n-1) + alpha-D-glucose 1-phosphate

X58453 2.4.1.11 granule-bound starch UDP-glucose + (1,4-alpha-D-glucosyl)(n) <=> UDP +


synthase (1,4-alpha-D-glucosyl)(n+1)

Y10416 2.4.1.21 Soluble starch synthase ADP-glucose + (1,4-alpha-D-glucosyl)(n) <=> ADP +


(1,4-alpha-D-glucosyl)(n+1)

2.4.1.7 Sucrose phosphorylase Sucrose + phosphate <=> D-fructose + alpha-D-glucose


1-phosphate
TC123217 2.7.1.69 Protein-N(pi)- Protein EIIB N(pi)-phospho-L-histidine/cysteine + sugar
phosphohistidine--sugar <=> protein EIIB + sugar phosphate
phosphotransferase
TC119709 2.4.1.14 Sucrose-phosphate UDP-glucose + D-fructose 6-phosphate <=> UDP +
synthase sucrose 6-phosphate

TC115698 3.1.3.24 Sucrose-phosphatase Sucrose 6-phosphate + <=> sucrose + phosphate

TC127514 5.3.1.9 Glucose-6-phosphate D-glucose 6-phosphate <=> D-fructose 6-phosphate


isomerase
TC112854 2.7.7.9 UTP--glucose-1- UTP + alpha-D-glucose 1-phosphate <=> diphosphate +
phosphate UDP-glucose
uridylyltransferase
3.6.1.21 ADP-sugar ADP-sugar + H2O <=> AMP + alpha-D-aldose 1-
diphosphatase phosphate

3.6.1.9 Nucleotide A dinucleotide + H2O <=> 2 mononucleotides


diphosphatase

2.7.7.34 Glucose-1-phosphate GTP + alpha-D-glucose 1-phosphate <=> diphosphate +


guanylyltransferase GDP-glucose

2.7.7.33 Glucose-1-phosphate CTP + alpha-D-glucose 1-phosphate <=> diphosphate +


cytidylyltransferase CDP-glucose

表六 圖八中選定的 19 個有興趣基因的蛋白質名稱、 EC number 以及催化的反應


其中藍底表示的部份為目前 (2006 年 4 月) 尚未有任何文獻報導過其基因序列的基因。

87
第四章 討論
本論文研究的目的有以下幾點: (1) 希望建立快速篩選植物基因功能的平台,
利用 RNAi 的方法轉殖進入植物原生體後,觀察有興趣基因被抑制後,其原生
質體表現型 (phenotype) 的改變,藉此表現型的改變來推測基因可能的生理功能。
(2) 希望了解因為蔗糖誘導澱粉累積的過程中,哪些基因的表現量改變,進而
探討這些基因間彼此的調控關係。 (3) 探討植物體內備受爭議的酵素 L-SP 真正
的生理功能。

蔗糖誘導馬鈴薯葉片細胞可造成澱粉累積與 L-SP 基因大

量表現
Tandecarz 在 1996 年觀察到,馬鈴薯葉片原生質體培養在不同蔗糖濃度的 MS
培養液中,L-SP 蛋白質表現量有所差異。培養環境中蔗糖含量較高 (3%) 的細胞
內 L-SP 表現量較高,而培養環境中蔗糖含量較低 (2%) 的細胞內 L-SP 表現量較
低 。在本論文中則是先將這個發現研究的更加深入,不僅利用蔗糖有效誘導 L-
SP 基因表現 (圖十九) ,也觀察到 L-SP 蛋白質表現量增加 (圖十六) 以及蛋白質
活性增加 (圖十七) 。是否只是單純因為 LSP 含量故使得活性跟著增加?在比活
性 (活性強度與蛋白質量的比值) 上來看,蔗糖誘導 48 小時後的單位活性遠大
於誘導 36 小時,是否有著其他機制使得 LSP 活性增高而不需要藉由蛋白質含
量提高來達到生理所需,則需要更進一步的探討。為了了解本論文中 L-SP 基因
表現的誘導與蔗糖有直接或間接的相關性,而不是因為外環境滲透的刺激所產
生 , 在 控 制 組 上 做 了 與 5 % 蔗 糖 溶 液 相 同 滲 透 壓 的 兩 組 刺 激 (mannitol 與
sorbitol),觀察後發現並不會造成 L-SP 基因表現的增加 (圖十八) ,此這些結果
可以很確定知道 L-SP 基因的表現確實和蔗糖有一定的關連性。而在澱粉生成的
過程中發現誘導超過 18 小時候會有漸漸趨緩的傾向 (圖十三),不僅代表澱粉含
量的增加到後來會有一種趨近飽和的現象,也可能因為澱粉的增加導致細胞內
滲 透 壓 的 增 加 , 至 少 誘 導 出 一 種 逆 境 蛋 白 (stress protein) --- Leucine
aminopeptidase,細胞可能是利用這個蛋白質來降低細胞內滲透壓的增強。由於
在 一 維 電 泳 上 可 以 很 明 顯 的 發 現 5 % 蔗 糖 溶 液 誘 導 24 小 時 後 Leucine
aminopeptidase 的增加 (圖十五) ,為了避免滲透壓造成實驗上太大的複雜度,
本論文選擇利用 5% 蔗糖溶液當作誘導條件,並且在 24 小時內觀察 L-SP 變化
與澱粉的生成。
在本論文中尚發現,蔗糖誘導的澱粉累積現象約可在誘導後 12 小時觀察到
(圖十三) ,而蔗糖誘導 L-SP 基因的表現約在 4 – 6 小時左右可以觀察到 (圖十
九) ,加上原生質體的碘液染色實驗中發現,大部分與碘液形成紫黑色錯合物
的位置都在質體器內 (圖十四 D) ,這種現象說明了蔗糖誘導 L-SP 基因大量表
現的速度比澱粉合成的速度快。由於 L-SP 屬於質體內的蛋白質 ,也就是說在蔗

88
糖誘導的過程中,先刺激植物細胞大量表現 L-SP,L-SP 再根據胺基酸序列上
的 leader sequence 進入質體,之後澱粉才開始累積。究竟 L-SP 在質體內累積與
澱粉的生成是否有直接關係,還是 L-SP 就如同現階段科學家所認定的磷解澱
粉角色,先累積在澱粉儲存的質體內 (也就是 amyloplast) 以方便植物細胞未來
用來降解澱粉所需,仍然需要更進一步的探討才能明瞭。

建立快速基因功能檢定平台所遇到的困難與可能解決方


由於本論文中純化之原生質體不易進行培養 (圖二十四) ,加上純化的效率也
不高 (圖二十二) ,經文獻查詢後發現 ,原生質體的純化與培養會依照品種的不
同而有大不相同的結果。某些物種的某些特定品種,可以從 1 g 的材料中純化出
大約 107 個原生質體,其他相同物種但不同品種可能連 105 不到,不僅如此,
在培養原生質體的時候也有完全不同的結果。也許是因為本論文所使用的馬鈴
薯品種剛好不適合做為純化與培養原生質體的材料,所以造成純化後得到的原
生質體數量不高以及培養 24 小時近全部死亡的結果 (圖二十四) 。在未來,實驗
室不排除改以某一特定品種 (例如克尼伯品種) 來進行實驗,希望獲得更大量原
生質體;而在培養原生質體的方面也可考慮使用 feeder layer 來幫助生長,如此
一來方能獲得轉殖 siRNA 後的結果。除此之外,若考慮不以原生質體做為轉殖
siRNA 的材料,可以使用基因槍 (Gene gun) 來進行轉殖組織的動作,利用這種
方法不僅可以省去純化原生質體的煩瑣步驟,也可以減少培養原生質體所需要
的硬體空間和培養基,唯一比較值得注意的是基因槍的單價不斐以及必須利用
金粉包裹核酸顆粒方能進行轉殖,金粉的消耗也是必須評估的。

系統生物學研究上更進一步的探討可以幫助了解澱粉代

謝中相關基因的交互作用
利用二維膠體電泳來觀察 5% 蔗糖誘導馬鈴薯葉片中蛋白質表現量的差異 (圖
二十五) ,希望藉由二維膠體電泳的高產出 (high throughput) 優點來觀察植物細
胞在蔗糖誘導後,澱粉生成途徑與哪些酵素有關。不過礙於馬鈴薯的基因庫仍
在建構中,所以只能依照現有的瑣碎資料來得知其中一些蛋白質的身分。其中
第 12 號蛋白質的身份經 LC / MS / MS 分析後發現可能為 R1 蛋白質 (R1 protein)
。目前科學家推測這個蛋白質的生理功能可能與馬鈴薯塊莖 (tuber) 以及葉片中
支鏈澱粉的代謝有關 (執行水解澱粉的功能) (Ritte et al., 2002) (圖二十六) 。R1
protein 在本論文中所發現的增加現象是否與蔗糖誘導相關仍有待釐清。除此之
外,由於實驗中發現 5 % 蔗糖濃度誘導葉片 24 小時之後,會造成一 stress
protein 的表現量增加 (Leucine aminopeptidase,圖 ),代表著在 5 % 蔗糖濃度的
誘導下會造成細胞面對高滲透壓的環境,進而處使某些 stress proteins 表現量增

89
加。為了釐清哪些蛋白質與蔗糖誘導的澱粉累積現象有關,哪些蛋白質則是因
為高濃度蔗糖溶液造成的高滲透壓環境而表現,未來實驗室將以 sorbitol 或是
manitol 模擬與 5 % 蔗糖溶液相當的滲透壓來探討因高滲透壓誘導出來的基因。
將 5 % 蔗糖誘導後的蛋白質二維膠體電泳圖譜中,表現與高滲透壓的二維膠體
電泳圖譜 (sorbitol 或是 manitol) 相同者去除後,剩下其他表現量有變化的蛋白
質即很有可能與蔗糖誘導所產生的澱粉合成的代謝途徑有關。

圖二十六 目前認定 R1 protein 所催化的反應

除此之外,由於許多細胞在蛋白質活性的調控上除了藉由蛋白質含量的改變
來 調 控 蛋 白 質 活 性 , 往 往 也 常 利 用 轉 譯 後 修 飾 作 用 (post-translation
modification) 來調控著蛋白質的活性,例如磷酸化 (phosphorylation) 的現象。在
未來,實驗室也可利用 ProQ 磷酸化蛋白質染色法來觀察經過蔗糖誘導後馬鈴
薯葉片中哪些蛋白質磷酸化的現象有所改變。在澱粉代謝的研究上,由於相關
基因植物突變株的篩選不易,所以造成現今研究上的困難,所以本實驗室未來
更希望進一步建立 siRNA 轉殖原生質體的系統或是基因槍的轉殖方式,觀察轉
殖某特定基因的 siRNA 後造成的細胞表現型改變,藉此方法來推論某基因在細
胞內可能扮演的生理角色。而在 L-SP 研究的部分,建立原生質體的培養條件以
及轉殖 siRNA 的部分仍在進行中,預計讓馬鈴薯葉片原生質體轉殖一段 L-SP
的 siRNA 片段後,觀察由蔗糖所誘導的澱粉累積現象是否一樣會發生。如果細
胞在失去 L-SP 的情況下無法大量合成澱粉,則很清楚的明白 L-SP 在生物體內
確實扮演合成澱粉的角色。但是由於本論文中澱粉的定量是利用與碘液形成錯
合物的方式定量,在澱粉合成酶 (starch synthase) 功能正常的情況下可能會延伸
澱粉碳鏈長度,使得轉殖細胞的澱粉含量與沒轉殖的細胞沒有差異,此時就需
配合測定細胞內糖引子的含量來確認細胞內 L-SP 的真正生理功能。

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參考資料

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