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REPASO EXAMEN FINAL CAP 8: CLONACION DNA, BIBLIOTECA DE DNA, SECUENCIACION Y PCR A.

Clonación i) Se refiere al acto de hacer muchas de una molecula o secuencia de DNA . ii) Aislamiento de un gene o segmento de DNA del resto de la molecula (se facilita haciendo muchas copias de un gene). iii) Se realiza de muchas formas. iv) La más sencilla es insertar un fragmento de DNA en un plasmidio o virus. (1) El DNA se recombina y se introduce en la bacteria. (2) El plasmidio se corta con enzimas de restriccion al igual que el fragmento de DNA a clonar. (3) Los dos pedazos de DNA se unen para formar una molecula de DNA circular ( contiene el DNA del plasmidio y del que se va a clonar y vana ser unidos por DNA ligasa). (4) El DNA recombinante es introducido a la bacteria . v) En el caso de la insulina humana se añade el plasmidio a celulas eucariotas de levaduras.( En procariotas no prrocesan el transcrito primario y no tienen capacidad para dar dobleces de la proteina eucariota). vi) Plasmidio = molecula de DNA circular. B. Bilioteca del DNA i) Biblioteca del DNA genómico = se produce al cortar genoma entero de una celula con enzimas de restrincción e insertaar los fragmentos en p-lasmidios para luego ser clonados. (1) Desventajas: (a) El genoma es cortado al azar, solo algunos fragmentos van a contener genes (b) La mayoría de los fragmentos va a contener secuencias de DNA que no codifican. ii) Biblioteca de DNA de copia ( cDNA) = Se seleccionan secuencias de DNA que se transcriben en mRNA para utilizarlas en clonación: (1) Extraer DNA de las células y hacer copia complementaria. (2) El DNA cadena sencilla sintetizado por la enzima se convierte en DNA doble helice por la enzima DNA polimerasa. (3) Cada clono obtenido por este metodo se conoce como cDNA iii) La biblioteca de cDNA a diferencia de la genómica contiene solo aquellas regiones del genoma que son transcritos a m RNA, ya que las celulas de diferentes tejidos producen diferentes m RNAen un organismo, existe una biblioteca de c DNA para cada tipo de celula C. Secuencia del DNA i) Permite determinar la secuencia de nucleotidos del DNA puro rapidamente. ii) Metodo de Dideoxy = Se basa en la sintesis in vitro llevada a cabo con dideoxinucleosidos trifosfatados y deoxinucleosidos trifosfatados.

iii) Los dideoxy no contienen OH en el terminal 3’; asis e detiene la sintesis y se forman multiples fragmentos de DNA ; Luego son analizados en electroforerir pra determinar la secuencia. D. Polymerase Chain Reaction (PCR) i) La tecnica de PCR permite hacer la clonación mas rapido; este amplifica una secuencia del DNA en grandes cantidades, sin necesidad de contruir bibliotecas de DNA. ii) Permite amplificar mas d eun millon de DNA obtenido a partir de una region seleccionada de genoima, siempre y cuando se conosca una parte de su secuencia de nucleotidos. (1) Dos sets de oligonucleotidos de DNA se utilizan como primers para pegarse a las cadenas de DNA y promover el comienzo de la sintesis de DNA.( catalizada por polimerasa). (2) Requiere cambios de Temperatura para los distintos proceso en la sintesis de DNA. CAP. 10: ESTUCTURA DE LA MEMBRANA CELULAR 1) La membrana permite el transporte de materiales a la celula. i) Define los limites de la celula y mantiene las diferencias entre el citoplasma y el ambiente extracelular ii) Es una capa fina de lipidos y proteinas unidas por enlaces no covalentes. (1) Las moleculas de lipidos están organizados en una doble capa para evitar la entrada de moleculas solubles en agua. (2) Las proteinas en la membran tienen función de: (a) Transporte (b) Catalizar reacciones (c) Receptores comunicación celular 2) La doble capa de lipidos i) Las moleculas de lipidos en la membrana son anfipáticas ( tienen terminación hidrofilica o polar y otra hidrofóbica o no polar). ii) Lipidos mas abundantes son los fosfolipidos ( tienen una cabeza polar y dos colas hidrofobicas – son usualmente acidos grasos, una insaturada y otra saturada). iii) Lipidos froman agregados para exponer sus cabezas hidrofilicas y encerrar las colas hidrofobicas( pueden formar micelios, colas hacia adentro, o bicapa en forma de sandwich). iv) La bicapa es fluida y atraves de ella pueden pasar moleculas de lipidos por difusión; depende de la composicion y temperatura. v) Normalmente no está compuesta solo de fosfolipidos, tambien contiene colesterol y glucolipidos vi) Membranas en eucariotas poseen grandes cantidades de colesterol. vii) Colesterol = su funcion es promover las propiedades permeables de la membrana:

(1) Se une a los fosfolipidos para que la membrana no pierda su forma y hacerla menos permeable a moleculas solubles al agua (2) Son responsables de hacer membranas menos fluída