LUIS FELIPE GUTIÉRREZ ALVAREZ

EXTRACTION ET CARACTÉRISTIQUES DES HUILES DE L’ARGOUSIER (Hippophaë rhamnoides L.)
Une étude des effets de la méthode de déshydratation des fruits sur le rendement d’extraction et la qualité des huiles

Mémoire présenté à la Faculté des études supérieures de l’Université Laval dans le cadre du programme de maîtrise en Génie Agroalimentaire pour l’obtention du grade de Maître ès sciences (M.Sc.)

DÉPARTEMENT DES SOLS ET DE GÉNIE AGROALIMENTAIRE FACULTÉ DES SCIENCES DE L’AGRICULTURE ET DE L’ALIMENTATION UNIVERSITÉ LAVAL QUÉBEC

2007

© Luis Felipe Gutiérrez Alvarez, 2007

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Résumé
Les huiles d’argousier (Hippophaë rhamnoides L.) ont été reconnues depuis longtemps pour leurs propriétés nutraceutiques. Les effets du séchage à l’air et de la lyophilisation sur les rendements d’extraction et la qualité des huiles de graines et de la pulpe d’argousier (cv. Indian-Summer) ont été étudiés. Les extractions ont été effectuées en utilisant l’hexane. Les graines séchées à l’air et celles lyophilisées ont donné des rendements d’extraction semblables (∼12%p/p), tandis que des différences significatives ont été trouvées entre les rendements d’extraction des pulpes séchées à l’air et lyophilisées (35.9±0.8 contre 17.1±0.6%p/p). Les acides α-linolénique (37.2-39.6%), linoléique (32.4-34.2%) et oléique (13.1%) furent les principaux acides gras trouvés dans les extraits des graines, alors que les extraits des pulpes furent riches en acides palmitoléique (39.9%), palmitique (35.4%) et linoléique (10.6%). Le fractionnement des huiles brutes, fait par extraction en phase solide, a donné principalement des lipides neutres (93.9-95.8%). Les indices de peroxyde des huiles des graines et des pulpes furent d’environ 1.8 et entre 3.0 et 5.4 meq/kg, respectivement. Les profiles de fusion des huiles ont été caractérisé par calorimétrie différentielle à balayage.

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Abstract
Sea buckthorn (Hippophaë rhamnoides L.) seeds and pulp oils have been recognized for their nutraceutical properties. The effects of air-drying and freeze-drying on extraction yields and quality of oils from sea buckthorn (cv. Indian-Summer) seeds and pulp were studied. Oil extractions were carried out using hexane. Air-dried (ADS) and freeze-dried (FDS) seeds, gave a similar extraction yields (∼12%w/w), whereas those of air-dried (ADP) and freeze-dried (FDP) pulps were significantly different (35.9±0.8 vs. 17.1±0.6%w/w). Fatty acid analysis revealed that α-linolenic (37.2-39.6%), linoleic (32.4-34.2%) and oleic (13.1%) acids were the main fatty acids in seed oils, while pulp oils were rich in palmitoleic (39.9%), palmitic (35.4%) and linoleic (10.6%) acids. Lipid fractionation of crude oils, obtained by solid phase extraction, yielded mainly neutral lipids (93.9-95.8%). The peroxide values of seed and pulp oils were circa 1.8 and between 3.0-5.4 meq/kg respectively. The melting behavior of oils was characterized by differential scanning calorimetry.

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Avant-propos
De plus en plus la population s’intéresse à la consommation « d’aliments santé » et d’aliments traditionnels enrichis en substances (vitamines, minéraux, acides gras essentiels, etc.). Cet intérêt plutôt récent, et les fortes campagnes publicitaires axées sur les effets bénéfiques de ces aliments sur la santé, constituent une des habitudes alimentaires du 21ème siècle. Face à ce changement dans les habitudes alimentaires, les entreprises agroalimentaires et pharmaceutiques sont appelées à satisfaire cette demande. C’est ainsi qu’aujourd’hui, l’on trouve dans le marché principalement trois gammes de produits ayant des effets bénéfiques pour l’organisme : les produits censés contribuer au bon fonctionnement du système cardiovasculaire, les probiotiques et les produits allégés. L’argousier (Hippophaë rhamnoides L.), une plante presque inconnue pour la population québécoise et inexploitée commercialement au Québec, a été importé en 1938 de la Russie vers le Canada. Sa production au pays, atteint déjà plus de 1.6 million de kilogrammes (Agriculture and Agri-Food Canada, 2003). Il représente un candidat de choix pour le marché des aliments fonctionnels et nutraceutiques, à cause de ses effets bénéfiques pour la santé, prouvés scientifiquement depuis le 20ème siècle. Dans le cadre d’un programme de mise en valeur de l’argousier au Québec, ce projet de recherche, sous la direction de M. Khaled Belkacemi (Ph.D), professeur agrégé du Département de sols et de génie agroalimentaire de l’Université Laval, et la codirection de Mme. Cristina Ratti, (Ph.D), professeure titulaire du Département de sols et de génie agroalimentaire de l’Université Laval, a visé un des composants les plus importants du fruit d’argousier : ses huiles. Le présent mémoire se compose de trois chapitres, dont le premier comporte une revue de littérature sur la composition nutritionnelle des fruits de l’argousier, et les méthodes utilisées pour extraire leurs huiles, et le deuxième présente les hypothèses et objectifs de recherche. Le troisième chapitre, décrivant la méthodologie des travaux réalisés et les

v résultats obtenus, a été rédigé en anglais sous forme d’article scientifique. Il sera soumis à publication dans la revue « Food Chemistry », sous le titre « Effect of drying method on the extraction yields and quality of oils from Sea Buckthorn (Hippophaë rhamnoides L.) seeds and pulp ». M. Luis Felipe Gutiérrez est le premier auteur, et Mme. Cristina Ratti et M. Khaled Belkacemi sont les coauteurs. Ils ont apporté leur soutien scientifique et leurs conseils selon leurs expertises. Une conclusion générale est présentée à la fin, donnant une vision globale de l’ensemble des résultats obtenus, ainsi que les perspectives de recherche pour des travaux futurs.

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Remerciements
J’aimerais exprimer mes plus sincères remerciements à mes directeurs de recherche, M. Khaled Belkacemi et Mme. Cristina Ratti, pour la confiance qu’ils m’ont accordé dès l’admission au programme, ainsi que pour le temps consacré et les conseils prodigués tout au long de ce projet. Je remercie très chaleureusement Mélanie Plourde et François-Olivier Marquis-Duval pour leur aide technique dans les analyses GC. Également, à Gilles Ayotte pour sa collaboration dans les analyses statistiques des données. Je tiens à remercier aussi l’équipe du laboratoire pilote, Jocelyne Giasson, Mélanie Martineau, Pascal Cliché et Gaétan Desnoyers. Merci également à ceux stagiaires d’été, qui ont travaillé avec moi, Mélanie Peng et Mirabelle Prudencio. Un remerciement spécial à mes collègues et amis, Mónica Araya, Mirela Vlad-Cristea, Nassima Kemache, Huu Thuan Bui, Rabih Saad et Narindra Raharitsifa. Vos rires et paroles de soutien tout au long de la réalisation de mes travaux, ont rendu cette expérience plus agréable. J’aimerais bien remercier mon épouse, Sandra Dalila. Sa compréhension, son appui inconditionnel, ses sacrifices, et surtout son amour, ont joué un rôle incontestable, sans lesquels la réalisation de ce rêve n’aurait pas été possible. Je remercie infiniment mes parents, pour la vie, les principes et l’éducation qu’ils m’ont procuré tout au long de ma vie. Maman, merci beaucoup pour ton immense amour et pour m’encourager toujours. Je voudrais finalement remercier avec gratitude le Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada (CRSNG), l’Association des Producteurs d’Argousier du Québec (APAQ), et l’Institut des nutraceutiques et des aliments fonctionnels (INAF), qui ont appuyé financièrement la réalisation de ce projet.

A mi esposa Sandra Dalila. Gracias a tu comprensión, tu acompañamiento incondicional, tus esfuerzos y sacrificios, se ha hecho posible la realización de otro de mis sueños.

Table des matières
Résumé................................................................................................................................... ii Abstract................................................................................................................................. iii Avant-propos .........................................................................................................................iv Remerciements.......................................................................................................................vi Chapitre 1................................................................................................................................3 Revue de littérature.................................................................................................................3 1.1 L’argousier..................................................................................................................3 1.1.1. Brève description et distribution géographique ..............................................3 1.1.2. Composition nutritionnelle .............................................................................4 1.1.2.1. Vitamines ................................................................................................5 1.1.2.2. Sucres......................................................................................................6 1.1.2.3. Acides organiques...................................................................................6 1.1.2.4. Minéraux.................................................................................................6 1.1.2.5. Flavonoïdes.............................................................................................7 1.1.2.6. Lipides ....................................................................................................7 1.1.2.7. Acides gras..............................................................................................9 1.1.2.8. Caroténoïdes .........................................................................................14 1.1.2.9. Stérols ...................................................................................................15 1.1.2.10. D’autres composants des lipides...........................................................15 1.1.3. Effets physiologiques des huiles de l’argousier............................................20 1.1.4. Industrie et produits à base d’argousier ........................................................21 1.2 L’extraction d’huiles.................................................................................................22 1.2.1. Préparation des matières premières ..............................................................24 1.2.1.1. Le séchage....................................................................................................24 1.2.2. Influence de la méthode de déshydratation sur l’extraction d’huiles .................29 1.3 Extraction des huiles de l’argousier..........................................................................30 1.3.1. Extraction des huiles de l’argousier par pressage...............................................30 1.3.2. Extraction des huiles de l’argousier par solvants................................................31 1.3.3. Extraction des huiles de l’argousier avec des fluides supercritiques..................34 1.3.4. Extraction enzymatique des huiles de l’argousier ..............................................40 1.3.5. Extraction aqueuse des huiles de l’argousier......................................................40 Chapitre 2..............................................................................................................................50 Hypothèses et objectifs de recherche....................................................................................50 2.1. Hypothèses.....................................................................................................................50 2.2. Objectif général..............................................................................................................50 2.3. Objectifs spécifiques......................................................................................................50 Chapitre 3..............................................................................................................................52 Effects of Drying Method on the Extraction Yields and Quality of Oils from Sea Buckthorn (Hippophaë rhamnoides L.) Seeds and Pulp ........................................................................52 3.1 Résumé............................................................................................................................52 3.2 Abstract...........................................................................................................................54 3.3 Introduction.....................................................................................................................54 3.4 Materials and methods ....................................................................................................56 3.4.1 Berries..................................................................................................................56

ix 3.4.2 Air-drying experiments........................................................................................56 3.4.3 Freeze-drying experiments ..................................................................................56 3.4.4 Total lipid content of starting materials...............................................................57 3.4.5 Oil extraction with solvent...................................................................................57 3.4.6 Analytical methods ..............................................................................................58 3.4.6.1 Melting profiles.............................................................................................58 3.4.6.2 Lipid fractionation ........................................................................................58 3.4.6.3 Fatty acid composition..................................................................................59 3.4.6.4 Triglyceride composition..............................................................................59 3.4.6.5 Peroxide value...............................................................................................60 3.4.6.6 Scanning electron micrographs.....................................................................60 3.4.7 Statistical analysis................................................................................................60 3.5 Results and discussion ....................................................................................................60 3.5.1 Moisture content of the sea buckthorn materials. ................................................60 3.5.2 Total lipid of the sea buckthorn materials ...........................................................60 3.5.3 Oil extraction using solvents................................................................................62 3.5.4 Fatty acid composition.........................................................................................66 3.5.5 Triglyceride composition.....................................................................................67 3.5.6 Lipid fractions extracted by SPE .........................................................................70 3.5.7 Peroxide values of the oils ...................................................................................73 3.5.8 Melting profiles....................................................................................................74 3.6 Conclusions.....................................................................................................................78 3.6 References.......................................................................................................................79 Conclusions générales...........................................................................................................81 Perspectives de recherche .....................................................................................................84 Annexe 1 ...............................................................................................................................85 Matériaux et produits expérimentaux ...................................................................................85 Annexe 2 ...............................................................................................................................86 Divers espèces et sous-espèces de l’Hippophaë ...................................................................86 Annexe 3 ...............................................................................................................................87 Enzymatic Oil Extraction of Sea Buckthorn (Hippophaë rhamnoides L.) Pulp: A Preliminary Study .................................................................................................................87 Résumé..................................................................................................................................87 Abstract.................................................................................................................................88 Introduction...........................................................................................................................88 Materials and methods ..........................................................................................................89 Fatty acid composition..................................................................................................90 Lipid fractionation ........................................................................................................90 Melting profiles.............................................................................................................91 Experimental design and statistical analysis.................................................................91 Results and discussion ..........................................................................................................91 Fatty acid composition..................................................................................................93 Lipid fractions...............................................................................................................94 Melting profiles.............................................................................................................97 References.............................................................................................................................99

Liste des tableaux
Tableau 1.1.Teneur en acides organiques du jus du fruit de l’argousier cv. Indian-Summer (Adapté de Li & Beveridge, 2003 et Beveridge et al., 2002) .................................................6 Tableau 1.2. Teneur en lipides (%) des graines du fruit de l’argousier (H. rhamnoides) selon la sous-espèce et la méthode de détermination (Adapté de Beveridge et al., 1999; Yang & Kallio, 2005 et Yakimishen et al., 2005) ..................................................................8 Tableau 1.3. Teneur en lipides (%) des parties molles (pulpe et peau) du fruit de l’argousier (H. rhamnoides) selon la sous-espèce et la méthode de détermination (Adapté de Yang & Kallio, 2005 et Yakimishen et al., 2005) ................................................................................9 Tableau 1.4. Composition en acides gras de l’huile des graines du fruit de l’argousier (Hippophaë L.) de différentes espèces et sous-espèces (Adapté de Yang et Kallio, 2005; Rongsen, 2005; Cenkowski et al., 2006) ..............................................................................12 Tableau 1.5. Composition en acides gras de l’huile des parties molles du fruit de l’argousier (Hippophaë L.) de différentes espèces et sous-espèces (Adapté de Yang et Kallio, 2005; Rongsen, 2005; Cenkowski et al., 2006) ..............................................................................13 Tableau 1.6. Teneur en β-carotène des huiles de fruits de l’argousier de différentes espèces et sous-espèces d’Hippophaë L. (mg/100 g d’huile) (Tiré de Yang & Kallio, 2005) ..........14 Tableau 1.7. Composition en acides gras des TAGs de l’huile des graines du fruit de l’argousier (Hippophaë L.) de différentes espèces et sous-espèces (Adapté de Kallio et al., 2002a; Yang & Kallio, 2001;Ozerinina et al., 1987; Zhmyrko et al. 1984) .........................18 Tableau 1.8. Composition en acides grasdes TAGs de l’huile des parties molles du fruit de l’argousier (Hippophaë L.) de différentes espèces et sous-espèces (Adapté de Kallio et al., 2002a; Yang & Kallio, 2001; Ul’chenko et al., 1995; Zhmyrko et al. 1984) .......................18 Tableau 1.9. Composition en acides gras des PL de l’huile des graines du fruit de l’argousier (Hippophaë L.) de différentes espèces et sous-espèces (Adapté de Kallio et al., 2002a; Yang & Kallio, 2001; ) .............................................................................................19 Tableau 1.10. Composition en acides gras des PL de l’huile des parties molles du fruit de l’argousier (Hippophaë L.) de différentes espèces et sous-espèces (Adapté de Kallio et al., 2002a; Yang & Kallio, 2001) ...............................................................................................19 Tableau 1.11. Caractéristiques des extractions des fruits de l’argousier avec divers solvants. ..............................................................................................................................................35 Tableau 1.12. Caractéristiques des extractions des fruits de l’argousier avec chloroforme – méthanol................................................................................................................................36 Tableau 1.13. Caractéristiques des extractions des fruits de l’argousier avec le CO2 supercritique..........................................................................................................................37 Tableau 1.14. D’autres méthodes d’extraction des huiles du fruit de l’argousier (Adapté de Li & Beveridge, 2003) ..........................................................................................................41 Table 3.1. Lipid content in sea buckthorn dry pulp of different subspecies of Hippophaë rhamnoides............................................................................................................................61 Table 3.2. Oil recoveries from air- and freeze-dried sea buckthorn seeds and pulp using the Soxhlet extractor with hexane during 4 hours, over various solid to solvent ratios a ...........64 Table 3.3. Effects of variation of temperature (T) and solid to solvent ratio (R), on the extraction efficiency of oils from air- and freeze-dried sea buckthorn seeds and pulpsa. ....66 Table 3.4. Fatty acid composition (percent of total) of oils from air- and freeze-dried sea buckthorn seeds and pulps, extracted with hexane (30-68ºC). .............................................67

xi Table 3.5. Fatty acid composition (percent of total) in individual lipid fractions of oils from air- and freeze-dried sea buckthorn pulps, extracted with hexane using the Soxhlet extractor during 4 hours. ......................................................................................................................71 Table 3.6. Fatty acid composition (percent of total) in individual lipid fractions of oils from air- and freeze-dried sea buckthorn seeds, extracted with hexane using the Soxhlet extractor during 4 hours. ......................................................................................................................72 Table 3.7. Thermal characteristics of sea buckthorn pulp oils .............................................75 Table A.3.1. Fatty acid composition (percent of total) of oils from sea buckthorn pulp, extracted with three different commercial enzymes during 24 h at pH 5.0 and 50ºC ..........93 Table A.3.2. Fatty acid composition (percent of total) in individual lipid fractions of oils from sea buckthorn pulp, extracted with three different commercial enzymes during 24 h at pH 5.0 and 50ºC a..................................................................................................................96 Table A.3.3. Thermal characteristics of enzyme extracted sea buckthorn pulp oils a ..........97

Liste des figures
Figure 1.1. Fruits de l’argousier (Photo : Luis Felipe Gutiérrez) ...........................................3 Figure 1.2. Schéma de l’opération d’extraction d’huiles par solvants. ................................23 Figure 1.3. Étapes du procédé de lyophilisation (Adapté de Barbosa-Cánovas & VegaMercado, 1996).....................................................................................................................27 Figure 3.1. Méthodologie suivie pour extraire et caractériser les huiles de l’argousier. ......53 Figure 3.2. Scanning electron micrographs of: (a) air-dried (ADP) and (b) freeze-dried (FDP) sea buckthorn pulps. ..................................................................................................62 Figure 3.3. Oil extraction kinetics from air-dried and freeze-dried sea buckthorn seeds and pulps using the Soxhlet extractor with hexane (R=0.25 g/mL). ...........................................63 Figure 3.4. Extraction efficiency of oils from freeze-dried pulp, over various ratios of solid to solvent (g/mL), using hexane for 24 hours at three different temperatures......................65 Figure 3.5. Triglyceride composition of oils from: (a) air- and freeze-dried sea buckthorn pulps, and (b) air- and freeze-dried sea buckthorn seeds......................................................69 Figure 3.6. DSC melting curves of oils from: (a) air- and freeze-dried sea buckthorn seeds, and (b) air- and freeze-dried sea buckthorn pulps. ...............................................................76 Figure 3.7. SFI of oils from: (a) air- and freeze-dried sea buckthorn seeds, and (b) air- and freeze-dried sea buckthorn pulps. .........................................................................................77 Figure A.3.1. Oil extraction yields obtained from sea buckthorn pulp using three commercial enzymes at different concentrations..................................................................92 Figure A.3.2. Melting profiles of sea buckthorn pulp oils extracted with three different commercial enzymes during 24 h at pH 5.0 and 50ºC (4ºC/min scan rate)..........................98 Figure A.3.3. Solid fat content of sea buckthorn pulp oils extracted with three different commercial enzymes during 24 h at pH 5.0 and 50ºC..........................................................98

Introduction
L’argousier (Hippophaë rhamnoides L.) est un arbuste originaire d’Europe qui a été importé en 1938 de la Russie vers le Canada, principalement comme plante ornementale. Plus tard, cette plante est devenue une de celles qui convient le mieux à la conservation environnementale (AAC, 2003). Ses fruits sont actuellement d’un grand intérêt grâce à leurs propriétés nutraceutiques, déjà prouvées par les anciens médecins traditionnels de l’Eurasie, et abondamment étudiées surtout au début du 21ème siècle (Zeb, 2004; Yang et Kallio, 2002; Süleyman et al., 2001, Johansson et al., 2000; Yang et al., 2000). Les fruits d’argousier, de part leur richesse vitaminique, ont un contenu appréciable en huile contenant entre autres, deux acides gras essentiels, l’acide linolénique (ω-3) et l’acide linoléique (ω-6) (Kallio et al., 2002, 2002a; Yang et Kallio, 2001; Beveridge et al., 1999). La teneur élevée en tocophérols, en tocotriénols et en caroténoïdes de l’huile (Luhua et al., 2004; Zadernowski et al., 2003), lui confèrent des propriétés antioxydantes, démontrées dans de nombreuses études faites chez l’humain et in vitro (Gao et al., 2003; Eccleston et al., 2002). Ainsi, l’huile et autres produits dérivés de l’argousier entreraient dans la catégorie d’aliments nutraceutiques et fonctionnels. Un aliment nutraceutique est un produit extrait ou fabriqué à partir d’aliments, mais formulé sous forme de pilules ou de concentrés dont les bienfaits physiologiques ou de protection contre les maladies chroniques ont été démontrées. Selon Agriculture et Agroalimentaire Canada (AAC), « l’argousier offre au Canada d’intéressantes perspectives compte tenu de la présence d’un important approvisionnement en eau de haute qualité pour la transformation, d’une expertise technique en extraction d’huiles et d’un engagement de tous les paliers de gouvernement, envers la création de produits à valeur ajoutée nouveaux et diversifiés ». La région de Matane a été nommée région pilote pour la culture et la transformation de l’argousier au Québec, où il existe environ 36 producteurs qui cultivent l’argousier pour une production d’environ 78.000 plantes. Le cultivar Indian Summer est le plus utilisé par

2 les producteurs (96%) suivi de l’espèce Sinensis (MAPAQ, 2002). Cependant, les procédés de transformation ne se sont pas encore développés, et des travaux de recherche sont nécessaires pour trouver des conditions optimales d’opération et estimer les coûts de mise en marché et production. Parmi les produits à base d’argousier, ses huiles représentent une bonne alternative commerciale avec une demande potentielle élevée. En fait, à partir de l’argousier, il est possible d’obtenir trois types d’huile, selon qu’on la tire de la pulpe, de la graine ou de la peau (Li & Beveridge, 2003). Cependant, vu la difficulté de séparer la peau de la pulpe, normalement on ne fait pas de distinction entre ces deux huiles, et on les nomme indistinctement huile de la pulpe ou huile des parties molles. L’extraction des huiles de l’argousier a été réalisée depuis long temps. Plusieurs méthodes d’extraction ont été appliquées, mais l’extraction par solvants, incluant le CO2 supercritique, prédomine. Comme pour la plupart de fruits, l’argousier requiert diverses opérations préliminaires avant l’extraction de ses huiles. Ces opérations, normalement comportent le nettoyage, le broyage et le séchage. L’information concernant les effets de différents paramètres, tels que le type de solvant et la taille des particules, sur le rendement d’extraction et la qualité des huiles, est relativement bien connue. Cependant, l’information disponible concernant les effets de la méthode de déshydratation sur l’extraction des huiles, n’est pas largement répandue. L’objectif global de ce travail est donc de comparer les effets de la lyophilisation et du séchage à l’air, comme des opérations de déshydratation des fruits d’argousier (cv. Indian summer), sur le rendement d’extraction et la qualité des huiles obtenues, en utilisant l’hexane comme solvant.

Chapitre 1 Revue de littérature
1.1 L’argousier
1.1.1. Brève description et distribution géographique
L’argousier (Hippophaë rhamnoides L.) est une plante qui se présente sous la forme d’un arbuste ou d’un arbre, dont la taille rarement dépasse trois à quatre mètres de hauteur, quoique certaines variétés puissent atteindre jusqu’à 20 mètres. Ses feuilles, étroites et lancéolées, sont de couleur verte argentée à la face supérieure (Rousseau, 2002). Les fruits se classifient comme non climatériques, et à l’état mûr peuvent être jaunes, oranges ou rouges. Ils se présentent sous forme d’ovale légèrement arrondie, et sont réunis en grappes denses sur les rameaux (Figure 1.1.). Leur poids varie normalement entre 4 et 60 grammes/100 fruits, pouvant dépasser 60 g chez certains cultivars russes. Le poids moyen des fruits du cultivar canadien « Indian-Summer », oscille entre 20-40 g/100 fruits (Li & Beveridge, 2003). Chaque fruit contient une graine brune, qui pèse environ 16 mg (Harrison & Beveridge, 2002).

Figure 1.1. Fruits de l’argousier (Photo : Luis Felipe Gutiérrez)

4 Six espèces (H. rhamnoides, H. salicifolia, H. tibetana, H. neurocarpa, H. gyantsensis et H. goniocarpa) et 12 sous-espèces de l’argousier ont été identifiés (Li & Beveridge, 2003), dont deux (l’Hippophaë rhamnoides L. subsp. sinensis Rousi et l’Hippophaë rhamnoides L. subsp. Rhamnoides) sont les plus utilisées pour des fins commerciales (Yang & Kallio, 2001). L’argousier est naturellement distribué dans les régions froides de l’Asie et l’Europe. Les principales populations naturelles d’argousier ont été trouvées en Chine, Russie et l’Himalaya Indien (Singh, 2003). De nos jours, l’argousier pousse dans environ une trentaine de pays (incluant l’Afghanistan, l’Allemagne, le Belarus, le Bhoutan, le Danemark, la Finlande, la France, le Népal, la Norvège, le Pakistan, les Pays-Bas, la Pologne, la République Tchèque, la Roumanie, le Royaume-Uni, la Suède et l’Ukraine), et il a aussi été introduit en l’Amérique du Nord et du Sud, Canada et Bolivie, respectivement. Au Canada, l’argousier est cultivé en Colombie-Britannique, Alberta, Saskatchewan, Manitoba, Québec et Terre-Neuve (Harrison & Beveridge, 2002). Au Québec, la région de Matane a été nommée région pilote pour la culture et la transformation de l’argousier. Dans cette région, il existe environ 36 producteurs, possédant approximativement 78.000 plantes. Le cultivar Indian Summer est le plus utilisé, suivi de la sous-espèce sinensis (MAPAQ, 2002). Les plantes femelles commencent la production de fruits 4-6 ans après l’ensemencement (Li & Beveridge, 2003), et en milieu naturel, elles peuvent donner un rendement fruitier de 0.75–1.5 t/ha (Lu, 1992). Schroeder & Yao (1995) ont rapporté une production de fruits de 4-5 t/ha en Saskatchewan, tandis qu’en Colombie-Britannique on a rapporté des rendements entre 20-25 t/ha (Li & Beveridge, 2003).

1.1.2. Composition nutritionnelle
L’argousier, appelé souvent «plante miracle», présente une composition chimique et nutritionnelle unique, faisant d’elle une source de grand intérêt pour l’industrie des aliments fonctionnels et produits nutraceutiques (Oomah & Mazza, 1999).

5 Les baies d’argousier sont parmi les fruits les plus nutritifs et les plus riches en vitamines. Ils contiennent jusqu’à dix vitamines différentes, des acides gras essentiels, des sucres, des oligo-éléments, des flavonoïdes, des pigments, ainsi que de l’huile (Yang & Kallio, 2002a). Ils sont aussi riches en protéines et en éléments chimiques, y compris du fer, du calcium et du manganèse (AAC, 2003).

1.1.2.1. Vitamines Les fruits d’argousier sont très riches en vitamines (C, E, A, B1, B2, F, K et P) (Lu, 1992). Des études réalisées avec des fruits de la sous-espèce sinensis ont donné des concentrations en vitamines A, B2 et C beaucoup plus élevées que celles contenues dans d’autres fruits et légumes tels que la carotte, la tomate et l’orange (Zeb, 2004). La teneur en vitamine C peut varier de 30.4 mg/100 g, chez les fruits de la sous-espèce gyantsensis (Rongsen, 2005), à 2500 mg/100 mg chez les fruits de la sous-espèce chinoise sinensis (Schroeder & Yao, 1995). Pour le cultivar Indian-Summer, Beveridge et al (2002; 1999) ont rapporté une teneur en vitamine C oscillant entre 137-193 mg/100 g. Comme le contenu de vitamine C est influencé par plusieurs facteurs, tels que le degré de maturation, l’origine et le temps de la cueillette, les conditions et le temps de stockage, ainsi que par des facteurs génétiques et géographiques, il existe une grande variation de la teneur en vitamine C entre les différentes sous-espèces et variétés. Les tocophérols et tocotriénols (vitamine E) sont aussi trouvés dans des quantités appréciables dans les fruits d’argousier. La teneur totale de ces composants varie de 100 à 300 mg/kg et de 10 à 150 mg/kg dans les graines et les baies fraîches, respectivement (Yang & Kallio, 2002a). Récemment, Cenkowski et al. (2006) ont trouvé des concentrations de tocophérols et tocotriénols variant entre 273.6 et 430.3 mg/100 g et entre 127.4 et 173 mg/100 g, pour les huiles des graines et la pulpe d’argousier respectivement, chez le cultivar Indian-Summer.

6 1.1.2.2. Sucres La teneur en sucres des fruits d’argousier varie selon l’origine, la sous-espèce, le temps de la récolte et leur état de maturité. Elle oscille entre 2.0 et 3.3%, quoique certains fruits originaires de la Russie peuvent atteindre jusqu’à 7.0% (Singh, 2005). Le cultivar IndianSummer présente un contenu de sucres solubles qui varie entre 9.3 et 17.3 ºBrix (Li & Beveridge, 2003). Or, les principaux constituants des sucres du fruit de l’argousier sont le glucose et le fructose, avec des faibles quantités de xylose et d’alcools de sucre, tels que le mannitol, sorbitol et xylitol (Li & Beveridge, 2003).

1.1.2.3.Acides organiques Les fruits de l’argousier ont une teneur élevée en acides organiques, parmi lesquels il est possible de mentionner les acides malique, citrique, tartrique, succinique, quinique et oxalique. D’après Rongsen (2005), la teneur en acides organiques des baies d’Hippophaë varie entre 1.64-5.95%, étant beaucoup plus élevée que celle du fruit de citron. Le Tableau 1.1. présente la composition en acides organiques du fruit de l’argousier (cv. Indian Summer). On y observe, l’importance de l’acide quinique, dont la concentration est environ le double de la concentration en acide malique. Tableau 1.1.Teneur en acides organiques du jus du fruit de l’argousier cv. Indian-Summer (Adapté de Li & Beveridge, 2003 et Beveridge et al., 2002) Acide (mg/mL) Acide malique Acide citrique Acide tartrique Acide quinique Acide oxalique 1.1.2.4. Minéraux Les fruits de l’argousier contiennent des nombreux éléments minéraux et oligoéléments. Selon Solonenko & Privalov (2005) la composition minérale du jus est élevée, et il contient Étendue 11.4 – 15.5 1.58 – 2.21 0.67 – 3.29 19.6 – 26.5 0.13 – 0.50

7 tous les micro et macroéléments essentiels. Le potassium, le calcium, le phosphore, le magnésium, le sodium et le fer sont les éléments les plus représentatifs du fruit, bien que d’autres éléments tels que le cuivre, le manganèse, le zinc, le nickel, le strontium, le vanadium, le molybdène, le sélénium, le bore, le baryum, l’aluminium, le soufre, le chlore et le plomb aient été aussi rapportés.

1.1.2.5. Flavonoïdes Plusieurs études ont démontré la présence de flavonoïdes dans les fruits et les feuilles de l’argousier (Tolkachev & Sheichenko, 2005; Tsybikova et al., 2005; Guan et al., 2005; Häkkinen et al., 1999; 1999a). Les principaux flavonoïdes identifiés sont la leucocyanidine, la cathécine, les flavonols (isorhamnétine, quercétine, quassine et cameline) et des traces de flavanone. Les flavonols peuvent représenter environ 87% de tous les composés phénoliques, dont le principal est la quercétine (87.3%), suivie de faibles proportions des acides ellagique (4.4%), férulique (3.1%), p-coumarique (2.8%) et p- hydroxybenzoïque (2.8%) (Häkkinen et al., 1999a).

1.1.2.6. Lipides Une des caractéristiques principales des fruits de l’argousier est leur richesse en lipides. Contrairement à d’autres fruits, l’argousier synthétise et accumule des lipides dans toutes les parties du fruit, et par conséquent, il est possible d’obtenir trois types d’huile, selon qu’on la tire de la pulpe, de la graine ou de la peau (Li & Beveridge, 2003). Cependant, vu la difficulté de séparer la peau de la pulpe, normalement on ne distingue pas ces deux huiles, et on les nomme indistinctement huile de la pulpe ou huile des parties molles. Yang et Kallio (2002a; 2005; 2005a) ont réalisé une révision très complète de la teneur et des effets physiologiques des lipides du fruit de l’argousier. D’après ces auteurs, le contenu en huile des graines est généralement constant (environ 10%) et indépendant des caractéristiques morphologiques et origines, bien que des valeurs plus élevées (jusqu’à 1516%) aient été rapportées pour quelques cultivars (Kallio et al. 1999; Kallio et al. 2002a;

8 Yang & Kallio, 2002). Par contre, la teneur en lipides des parties molles (pulpe et peau) varie considérablement selon l’origine et d’autres facteurs tels que le temps de la cueillette, l’application de fertilisants inorganiques, l’état de maturité des fruits et le climat. Des valeurs variant entre 4% et 34% (en poids sec) ont été rapportées dans la littérature, dont les plus élevées (30-34%) correspondent aux sous-espèces caucasica et turkestanika, et les plus faibles (4-12%) à la sous-espèce sinensis (Yang et Kallio, 2005). Les travaux récents de Yakimishen et al. (2005) indiquèrent que la teneur en huile du cultivar Indian-Summer varie selon la méthode d’extraction, entre 10.3% et 19.7% et 3.4% à 11.7% pour les parties molles et les graines respectivement. Les Tableaux 1.2. et 1.3. montrent la teneur en lipides des graines et des parties molles du fruit de l’argousier respectivement, selon la sous-espèce ou variété, et la méthode de détermination. Tableau 1.2. Teneur en lipides (%) des graines du fruit de l’argousier (H. rhamnoides) selon la sous-espèce et la méthode de détermination (Adapté de Beveridge et al., 1999; Yang & Kallio, 2005 et Yakimishen et al., 2005) Sous-espèce ou variété Turkestanika Méthode de détermination Extraction Soxhlet avec éther diéthylique Hexane Extraction avec éther de pétrole Extraction avec chloroforme Non définie Chloroforme:Méthanol (2:1) Extraction Soxhlet avec éther de pétrole Extraction Soxhlet avec n-hexane Extraction avec éther de pétrole Non définie Chloroforme:Méthanol (2:1) Extraction Soxhlet avec éther de pétrole Chloroforme:Méthanol (2:1) Chloroforme:Méthanol (1:1) Extraction avec éther de pétrole Extraction avec CO2 supercritique Extraction par pression Non définie Teneur en lipides (%) 5.3-15.7 11.8 9.3-9.7 11.8-12.4 9.5-10.5 10.1-16.5 8.2-10.3 10.1-10.8 8.1-12.3 6.9-11.4 4.2-10.7 8.2-10.4 7.0-14.2 10.2-11.7 8.2 5.3 3.4 9.69-20.2

Mongolica Sinensis

Rhamnoides Indian-Summer

9 Tableau 1.3. Teneur en lipides (%) des parties molles (pulpe et peau) du fruit de l’argousier (H. rhamnoides) selon la sous-espèce et la méthode de détermination (Adapté de Yang & Kallio, 2005 et Yakimishen et al., 2005) Teneur en lipides (%) Extraction Soxhlet avec éther de pétrole 30.1-33.2a Caucasica Extraction Soxhlet avec éther de pétrole 23.2-34.0b Extraction Soxhlet avec hexane 17.8-26.7b Turkestanika Chloroforme:Méthanol (1:2) 7.4c Extraction avec éther de pétrole 29.5d Extraction avec chloroforme 31.2d Extraction avec éther diéthylique 34.4d Non définie 21.2-29.1e Non définie 16.0-28.0e Mongolica Chloroforme:Méthanol (2:1) 5.4f Extraction Soxhlet avec éther de pétrole 5.6-9.2b Sinensis Extraction Soxhlet avec éther de pétrole 0.6-1.1c Extraction Soxhlet avec hexane 7.1-8.9b Extraction Soxhlet avec éther de pétrole 20.0f Extraction Soxhlet avec éther de pétrole 11.4-27.6d Extraction avec éther de pétrole 4.1-12.3d Non définie 4.1-8.9 Chloroforme:Méthanol (2:1) 2.8f Chloroforme:Méthanol (2:1) 0.8-2.6g Extraction Soxhlet avec éther de pétrole 4.8-5.4f Rhamnoides Chloroforme:Méthanol (2:1) 3.2f Chloroforme:Méthanol (2:1) 1.7-4.1g Extraction avec éther de pétrole 11.9b Indian-Summer Chloroforme:Méthanol (1:1) 19.7b Chloroforme:Méthanol (1:1) 2.0c Extraction avec CO2 supercritique 10.3b Extraction aqueuse 0.7b a Fruit sans pépins, b Parties molles sèches, c Jus frais, d Pulpe sèche, e Peau, f Parties molles fraîches, g Baies surgelées Sous-espèce ou variété Méthode de détermination

1.1.2.7.Acides gras Les huiles issues des baies de l’argousier sont uniques parce que leur composition en acides gras varie selon qu’on les tire de la graine ou des parties molles (pulpe et peau). Plusieurs études sur la composition en acides gras des huiles du fruit de l’argousier de différentes

10 espèces, sous-espèces et origines ont été réalisées (Cenkowski et al., 2006; Ranjith et al., 2006; Yin et al., 2005; Yakimishen, 2004; Cakir, 2004; Yang & Kallio 2005; 2002; 2002a; 2001; Kallio et al., 1999; 2002a; Beveridge et al., 1999). L’huile des graines est caractérisée par sa teneur élevé en acides gras insaturés (85-90%), parmi lesquels deux acides gras essentiels, l’acide linoléique ou oméga-6 (18:2n-6) et l’acide α-linolénique ou oméga-3 (18:3n-3) peuvent représenter jusqu’à 70%. Les proportions de ces deux acides gras sont généralement 30-40% et 20-35%, respectivement (Yang & Kallio, 2002a). Cependant, des valeurs particulièrement faibles ont été rapportées pour des baies sauvages chinoises de la sous-espèce neurocarpa (19% d’acide linoléique et 8% d’acide α-linolénique) (Yang & Kallio, 2005). D’autres acides gras normalement trouvés dans les graines sont les acides oléique (18:1n-9, 13-30%), palmitique (16:0, 720%), stéarique (18:0, 2-9%) et vaccénique (18:1n-7, 2-4%) (Yang & Kallio, 2002a; 2005) (Tableau 1.4.). L’huile des parties molles est caractérisée par sa forte teneur en acides gras saturés. Elle comporte principalement les acides palmitoléique (16:1n-7, 16-54%), palmitique (16:0, 1747%), oléique (18:1n-9, 2-35%), et des faibles proportions en acides linoléique (18:2n-6, < 10%), α-linolénique (18:3n-3, < 3%) et stéarique (18:0, 0.2-3%) (Ranjith et al., 2006; Cenkowski et al., 2006; Ul’chenko et al., 1995; Kallio et al., 1999; 2002a; Yang et Kallio, 2001;2002a, 2005) (Tableau 1.5.). La teneur élevée en acide palmitoléique, un acide gras rare dans le royaume végétal, caractérise donc l’huile des parties molles du fruit de l’argousier comme la source principale d’acide palmitoléique, suivi de l’huile de noix de macadamia (Macadamia integrifolia) qui en contient environ 20%. Tenant compte de l’intérêt accru que l’on attribue au rôle physiologique des acides gras insaturés (Spitz et al., 1992; Katsouyanni et al., 1991), l’huile de la pulpe d’argousier attire beaucoup l’attention. Les travaux de Yamori et al. (1986) ont indiqué qu’un apport accru d’acide palmitoléique dans l’alimentation pourrait améliorer le métabolisme des cellules musculaires lisses vasculaires. De plus, une concentration élevée en acide palmitoléique, pourrait avoir des effets

11 hypocholestérolémiques et hypotriglycéridémiques, et réduire les risques d’accident vasculaire cérébral (Yang et Kallio, 2002a).

12

Tableau 1.4. Composition en acides gras de l’huile des graines du fruit de l’argousier (Hippophaë L.) de différentes espèces et sousespèces (Adapté de Yang et Kallio, 2005; Rongsen, 2005; Cenkowski et al., 2006)

Espèce / Sous-espèce / Cultivar 16:0 7.5-9.0 7.9 7.7-9.6 13.6 8.6-11.1 6.7-13.2 10.3 13.9 13.1 12.9 14.3 14.2 9.3 7.6 6.7-7.5 14.8 18.1 16:1n-7 0.3-1.2 0.9 0.4-1.9 3.8 2.5-8.4 0.3-1.1 3.2 0.7 4.2 3.3 1.6 1.4 3.5 0.4 2.4 2.1

H. rhamnoides ssp. mongolica H. rhamnoides ssp. caucasica H. rhamnoides ssp. sinensis H. rhamnoides ssp. yunannesis H. rhamnoides ssp. turkestanika H. rhamnoides ssp. rhamnoides H. rhamnoides ssp. luviatilis H. salicifolia H. goniocarpa ssp. litangensis H. goniocarpa ssp. goniocarpa H. gyantsensis H. neurocarpa ssp. stellatopilosa H. neurocarpa ssp. neurocarpa H. tibetana Cultivar Indian-Summer Cultivar Hergo Cultivar Leikora

Acides Gras (%) 18:0 18:1n-9 18:1n-7 2.0-4.5 14.1-22.0 2.0 3.7 16.3 2.1-3.3 12.9-29.7 1.9-2.5 2.0 14.9 3.4 2.1-2.8 12.9-24.0 3.1 1.8-7.7 13.7-21.1 1.8-3.8 2.5 21.7 2.7 18.9 3.0 2.6 18.0 3.4 2.4 12.8 4.1 4.4 21.9 3.4 2.8 20.6 2.9 2.0 17.0 2.8 2.1 15.1 2.5 2.4-2.8 13.0-13.6 1.9-2.3 6.6 29.9 7.0 31.6 -

18:2n-6 35.0-39.6 45.2 27.6-43.6 33.2 32.0-36.2 34.7-43.0 32.8 37.6 36.1 28.4 32.8 38.5 33.4 38.4 35.3-36.3 13.6 13.9

18:3n-3 29.0-36.9 25.7 20.2-36.3 26.6 13.7-27.3 25.4-38.5 28.7 21.1 20.4 32.0 16.9 17.5 28.7 32.1 35.9-38.5 3.5 5.7

13

Tableau 1.5. Composition en acides gras de l’huile des parties molles du fruit de l’argousier (Hippophaë L.) de différentes espèces et sous-espèces (Adapté de Yang et Kallio, 2005; Rongsen, 2005; Cenkowski et al., 2006)

Espèce / Sous-espèce / Cultivar 16:0 27.3-40.2 47.0 16.6-32.0 24.7 20.9-34.2 20.4-46.8 40.7 20.8 27.5 25.7 18.7 16.6 30.8 34.3-35.5 35.5-45.8 31.1-36.4 16:1n-7 32.2-53.8 16.4 12.1-35.0 34.3 15.8-54.8 27.1-42.4 26.8 36.0 38.3 17.6 5.6 2.9 35.4 34.4-38.5 16.6-18.2 20.2-21.4

H. rhamnoides ssp. mongolica H. rhamnoides ssp. caucasica H. rhamnoides ssp. sinensis H. rhamnoides ssp. yunannesis H. rhamnoides ssp. turkestanika H. rhamnoides ssp. rhamnoides H. rhamnoides ssp. luviatilis H. salicifolia H. goniocarpa ssp. litangensis H. goniocarpa ssp. goniocarpa H. gyantsensis H. neurocarpa ssp. stellatopilosa H. neurocarpa ssp. neurocarpa Cultivar Indian-Summer Cultivar Hergo Cultivar Leikora

Acides Gras (%) 18:0 18:1n-9 18:1n-7 0.6-3.3 1.6-13.7 35.0 0.8-1.9 12.5-28.1 6.2-9.9 0.6 16.3 8.3 2.1-2.3 11.0-33.9 0.2-1.1 13.3-20.8 8.3-10.7 0.6 26.4 1.0 22.0 11.9 0.7 6.8 8.2 2.3 12.1 9.9 10.0 14.1 6.8 4.5 22.0 6.2 1.6 19.9 9.1 1.1-1.2 3.2-3.5 6.9-7.3 1.2-1.6 22.9-26.8 0.7-2.4 24.3-34.1 -

18:2n-6 5.2-14.0 1.6 2.6-27 9.9 1.0-1.5 3.5-16.5 3.6 3.9 13.7 27.3 35.9 40.6 1.3 12.4-13.5 < 0.1-1.6 < 0.1-3.3

18:3n-3 0.4-14.4 1.2-13.7 2.1 0.3-0.4 0.7-6.8 1.2 1.8 1.6 1.8 2.1 3.2 0.5 1.1-2.0 0.3-1.7 < 0.1-2.5

14 1.1.2.8. Caroténoïdes Des 600 caroténoïdes connus dans la nature, 39 ont été identifiés dans les fruits d’argousier (Singh, 2005). La teneur en caroténoïdes peut varier grandement selon la source de l’huile (50 et 2139 mg/100 g) (Beveridge et al., 1999). Les huiles de la pulpe sont plus riches en caroténoïdes que les huiles des graines, lesquelles en contiennent habituellement des faibles quantités (20 à 85 mg/100 g d’huile) (Li & Beveridge, 2003). Le β-carotène constitue environ 15-55% des caroténoïdes totaux, variant ses teneurs typiques entre 100-500 et 20100 mg/100 g chez les huiles de la pulpe et des graines respectivement (Yang & Kallio, 2002a). La présence d’autres caroténoïdes dans les fruits d’argousier, tels que le αcarotène, le γ-carotène, le δ-carotène, le licopène, le β-zéacarotène, la cryptoxanthine, la sintexanthine, la lutéine et la zéaxanthine a été aussi rapportée (Li & Beveridge, 2003). Le Tableau 1.6. présente les valeurs de la teneur en β-carotène des huiles issues de la pulpe et des graines de fruits d’argousier de différentes espèces et sous-espèces rapportées récemment par Yang & Kallio (2005). On remarque que les valeurs les plus élevées, dans les huiles de graines et la pulpe, ont été trouvées chez l’espèce H. salicifolia (485.2 mg/100 g et 97.5 mg/100 g respectivement), tandis que les valeurs les plus faibles sont répertoriées chez les espèces H. neurocarpa et H. rhamnoides sous-espèces mongolica et turkestanika (13.0-18.4 mg/100 g et 122.7-169.2 mg/100 g respectivement). Tableau 1.6. Teneur en β-carotène des huiles de fruits de l’argousier de différentes espèces et sous-espèces d’Hippophaë L. (mg/100 g d’huile) (Tiré de Yang & Kallio, 2005) Espèce / Sous-espèce H. salicifolia H. gyantsensis H. neurocarpa H. tibetana H. rhamnoides ssp. sinensis H. rhamnoides ssp. yunannesis H. rhamnoides ssp. turkestanika H. rhamnoides ssp. mongolica Huile de la pulpe 485.2 271.6 148.6 394.3 363.9 364.8 169.2 122.7 Huile des graines 97.5 22.1 13.0 17.3 33.6 21.2 18.4 14.6

15 1.1.2.9. Stérols La teneur en stérols de l’huile du fruit de l’argousier oscille entre 2.2 et 8.8%, et varie selon l’origine, la sous-espèce, la méthode d’extraction des huiles et l’époque de la cueillette des fruits (Li & Beveridge, 2003; Yang et al., 2001). En termes de poids frais, elle oscille entre 0.1-0.2% chez les graines, et entre 0.02-0.04% dans les parties molles (Yang & Kallio, 2002a). D’après Mironov et al. (1989), environ 50% des stérols seraient contenus dans les lipides de la peau du fruit, alors que les lipides de la pulpe et des graines en contiendraient 20% et 30%, respectivement. Yang et al. (2001) ont trouvé des contenus de stérols variant entre 12 et 23 g/kg, 10 et 29 g/kg et 13 et 33 g/kg dans les huiles des graines, des parties molles (pulpe et peau) et des fruits entiers respectivement, chez les sous-espèces sinensis et rhamnoides. Le sitostérol a constitué entre 57 et 76% des stérols totaux des graines, et entre 61 et 83% des stérols totaux des parties molles. D’autres stérols trouvés dans cette étude furent l’isofucostérol (13-21%), le stigmastanol (1-5%), le citrostadienol (2-5%) et le campestérol (2-3%) dans les graines, tandis que l’isofucostérol, le stigmast-8-èn-3β-ol et l’obtusifoliol ont constitué ensemble entre 3-9% des stérols totaux des parties molles. Cenkowski et al. (2006) ont rapporté le β-sitostérol comme le principal stérol identifié dans les huiles de graines (environ 97% des stérols totaux) et de la pulpe (96-98% des stérols totaux), chez le cultivar Indian-Summer. D’autres stérols trouvés dans cette étude furent le campestérol (17.2 à 22.5 mg/100 g d’huile de graines, et 6.6 à 12.4 mg/100 g d’huile de la pulpe) et des faibles quantités de cholestérol et stigmastérol.

1.1.2.10.

D’autres composants des lipides

Outre les tocophérols, les tocotriénols, les caroténoïdes et les stérols, les triglycérides (TAGs), les phospholipides (PL), les acides gras libres, et les mono et diglycérides sont les principaux constituants des lipides du fruit de l’argousier. Leurs proportions et compositions varient selon l’origine, la méthode d’extraction, la sous-espèce et le degré de maturité des fruits, parmi d’autres facteurs (Yang & Kallio, 2005).

16 La teneur en TAGs totaux des fruits d’argousier oscille généralement entre 3 et 6%, malgré qu’ils peuvent atteindre jusqu’à 14% dans certains cultivars russes (Li & Beveridge, 2003). Chez les sous-espèces rhamnoides et sinensis, Yang et Kallio (2002) ont trouvé que la teneur en TAGs des graines et des fruits entiers varia entre 5.7% et 13.0%, et entre 1.3% et 3.7% respectivement, tandis que chez la sous-espèce mongolica, Kallio et al. (2002a) ont rapporté une teneur en TAGs d’environ 8.3% et 4.8% dans les graines et les fruits entiers respectivement. D’après Yang et Kallio (2001), les TAGs constituent 85 à 90% des huiles des graines et de la pulpe du fruit de l’argousier. Manninen et al. (1995) ont rapporté que l’huile des graines est constituée principalement de TAGs à indice d’acyle de 54 (environ 74% des TAGs totaux), tandis que l’huile de la pulpe est constituée principalement de TAGs à indice d’acyle de 48, 50 et 52 (environ 69% des TAGs totaux). La teneur en phospholipides (PL) des graines et des fruits de l’argousier (sous-espèces sinensis, rhamnoides et mongolica) oscille entre 0.4-1.0% et 0.1-0.4% respectivement (Kallio et al., 2002a; Yang & Kallio, 2001; 2002). La l’acide phosphatidique (PA), le lyso phosphatidylcholine (PC), la (LPI) et la lyso phosphatidyléthanolamine (PE), le phosphatidylinositol (PI), le phosphatidylglycérol (PG), phosphatidylinositol phosphatidylcholine (LPC) ont été identifiées dans les graines de l’argousier par Isamukhamedov & Akramov (1982), qui ont en trouvé un contenu de phospholipides de 0.6%. Le contenu de lipides polaires du fruit de l’argousier est de 8% dans les graines, 3.3% dans la pulpe, et 8.9% dans la peau selon Li & Beveridge (2003). Les travaux récents de Pintea et al. (2001), ont indiqué que les lipides polaires comprenaient des phospholipides (61%) et des galactolipides (39%). La composition en acides gras des classes des lipides des fruits d’argousier a été étudiée depuis longtemps (Ul’chenko et al., 1995; Ozerinina et al., 1987; Zhmyrko et al. 1984; Mamedov et al., 1981). Quelques données correspondant à la composition des TAGs et PL

17 des huiles des graines et de la pulpe d’argousier, sont présentées dans les Tableaux 1.7. à 1.10.

18

Tableau 1.7. Composition en acides gras des TAGs de l’huile des graines du fruit de l’argousier (Hippophaë L.) de différentes espèces et sous-espèces (Adapté de Kallio et al., 2002a; Yang & Kallio, 2001;Ozerinina et al., 1987; Zhmyrko et al. 1984)

Espèce / Sous-espèce / Cultivar 16:0 8.6 8.3 7.0 7.1 5.8 7.2 16.8 7.5 16:1n-7 0.6 0.9 19.7 2.5

H. rhamnoides ssp. mongolica H. rhamnoides ssp. sinensis H. rhamnoides ssp. rhamnoides Cultivar Dar Katuni Cultivar Maslichnaya Cultivar Shcherbinka-1 Argousier Ukrainien région Paltau Argousier Ukrainien région Zeravshan a : Exprimé comme 18:1.

Acides Gras (%) 18:0 18:1n-9 18:1n-7 3.3 17.9 2.1 2.3 19.3 2.1 2.8 17.3 2.6 a 2.7 16.6 2.7 12.5a a 2.5 15.1 1.4 18.6a 2.5 18.9a 18:2n-6 38.6 40.6 38.6 39.5 41.3 39.5 28.9 43.4

18:3n-3 29.1 27.5 31.7 33.5 37.7 34.6 14.6 25.2

Tableau 1.8. Composition en acides grasdes TAGs de l’huile des parties molles du fruit de l’argousier (Hippophaë L.) de différentes espèces et sous-espèces (Adapté de Kallio et al., 2002a; Yang & Kallio, 2001; Ul’chenko et al., 1995; Zhmyrko et al. 1984)

Espèce / Sous-espèce / Cultivar 16:0 33.9 23.7 22.3 34.5 36.9 39.6 38.1 40.2 37.2 16:1n-7 32.8 22.1 24.2 37.3 40.1 37.0 32.6 32.2 49.9

H. rhamnoides ssp. mongolica H. rhamnoides ssp. sinensis H. rhamnoides ssp. rhamnoides Cultivar Maslichnaya Cultivar Dar Katuni Cultivar Novost’ Altai Cultivar Nomernoi Cultivar Zolotoi pochatok Argousier Ukrainien région Paltau

Acides Gras (%) 18:0 18:1n-9 18:1n-7 1.2 4.6 6.4 1.5 17.7 6.6 1.3 17.9 7.4 a 2.2 11.0 1.3 10.8a a 2.0 11.4 3.3 10.8a a 2.9 13.6 12.1a

18:2n-6 15.5 18.0 16.5 12.4 10.2 8.1 11.4 10.0 0.6

18:3n-3 5.6 10.3 10.5 Tr. Tr. Tr. Tr. Tr. -

19

Tr. : Traces, a : Exprimé comme 18:1.

Tableau 1.9. Composition en acides gras des PL de l’huile des graines du fruit de l’argousier (Hippophaë L.) de différentes espèces et sous-espèces (Adapté de Kallio et al., 2002a; Yang & Kallio, 2001; ) Acides Gras (%) 16:0 17.0 13.6 11.5 5.2 14.3 3.8 20.0 4.9 4.7 6.0 10.0 4.3 16:1n-7 18:0 18:1n-9 18:1n-7 18:2n-6 47.7 45.9 45.6 18:3n-3 14.8 11.9 18.7

Espèce / Sous-espèce / Cultivar

H. rhamnoides ssp. mongolica

H. rhamnoides ssp. sinensis

H. rhamnoides ssp. rhamnoides

Tableau 1.10. Composition en acides gras des PL de l’huile des parties molles du fruit de l’argousier (Hippophaë L.) de différentes espèces et sous-espèces (Adapté de Kallio et al., 2002a; Yang & Kallio, 2001) Acides Gras (%) 16:0 21.1 15.9 17.0 21.5 15.1 18.6 16:1n-7 18:0 1.6 1.8 2.2 18:1n-9 18.5 16.6 16.5 18:1n-7 9.2 9.5 8.6 18:2n-6 22.2 25.7 24.2 18:3n-3 16.2 15.4 12.9

Espèce / Sous-espèce / Cultivar

H. rhamnoides ssp. mongolica

H. rhamnoides ssp. sinensis

H. rhamnoides ssp. rhamnoides

20

1.1.3. Effets physiologiques des huiles de l’argousier
L’argousier a été utilisé dans les médecines tibétaines et mongoles pendant plus de mille ans pour le traitement de l’expectoration et de la toux, ainsi que pour améliorer la circulation sanguine et le fonctionnement du système digestif (Yang & Kallio, 2002a). En 1977, le Département Chinois de Santé Publique a listé l’argousier dans le « Dictionnaire des médecines chinoises » (Mingyu, 1994), et récemment le Ministère Chinois de la Santé a classifié l’huile d’argousier dans la catégorie des aliments fonctionnels (Li & Beveridge, 2003). Les effets physiologiques des huiles du fruit de l’argousier sont nombreux et la recherche sur leurs utilisations médicinales est encore en développement. Yang & Kallio (2002a; 2005a), ayant fait une compilation exhaustive des effets physiologiques des lipides de l’argousier, affirment que les effets antioxydants, les effets sur la peau et la muqueuse, les effets sur des facteurs de risque des maladies cardiovasculaires, les effets sur les fonctions immunes et les applications anticancéreuses, sont les principaux bienfaits des huiles du fruit de l’argousier. Les huiles des graines et de la pulpe d’argousier ont montré des effets positifs dans le ralentissement du processus d’oxydation et dans la stabilisation de structures membranaires (Rui & Gao, 1989; Gao, 2005), ainsi que des effets protecteurs contre les dommages de tissu provoqués par intoxication chimique chez les modèles animaux (Wu & Meng, 2003). Süleyman et al. (2002) ont montré qu’un extrait huileux du fruit d’argousier, mélangé avec l’huile de maïs (1/1 v/v), pourrait être employé comme supplément diététique par les personnes qui fument, afin d’empêcher le stress oxydatif causé par la nicotine. Selon certaines études, l’huile et le jus d’argousier renferment des composés de nature anticancéreuse (Xu et al. 2001). L’huile de graines a été employée comme traitement auxiliaire à des patients avec différents cancers recevant la chimiothérapie (Li, 1993). Ce traitement a fait augmenter le taux de transformation des lymphocytes et le taux de

21 formation de rosette E, et il a allégé les effets hémotoxiques et les perturbations gastrointestinales provoquées par la chimiothérapie (Li, 1993). L’huile des graines d’argousier a aussi été utilisée avec succès comme traitement topique pour les brûlures de la peau de premier et deuxième degré (Zhao, 1994). Le traitement avec l’huile des baies d’argousier, extrait à l’hexane, a accéléré le processus curatif des blessures de la peau des lapins, par rapport au traitement fait avec l’huile de tournesol (Mironov et al., 1989). Chez les rats, l’huile des parties molles (pulpe et peau) d’argousier a montré des meilleurs effets curatifs sur des blessures de la peau, que l’huile des graines (Mironov et al., 1989). D’autres études rapportent les effets des extraits des feuilles et du fuit de l’argousier sur la guérison des blessures cutanées, ainsi que contre la toxicité à l’arsenic et contre les dommages oxydants induits par la radiation, chez les rats (Gupta & Flora, 2006; Goel et al., 2005; Gupta et al., 2005). Süleyman et al. (2001) ont rapporté les effets antiulcéreux d’un extrait à l’hexane des fruits d’argousier chez le rat. Ils ont trouvé que ce type d’extrait pourrait empêcher que des dommages gastriques se produisent. Chez l’humain, les études de Yang et al. (1999; 2000), traitent des effets d’une supplémentation diététique avec les huiles de la graine et de la pulpe de l’argousier sur la dermite atopique. Ce traitement a donné des résultats encourageants. Johansson et al. (2000) ont réalisé une étude afin d’évaluer les effets de l’huile de la pulpe de l’argousier sur des facteurs de risque des maladies cardiovasculaires. Ils ont trouvé qu’une supplémentation avec l’huile de la pulpe de l’argousier pourrait servir comme traitement à des personnes qui présentent des tendances de coagulation sanguine, et qu’elle pourrait aussi faire diminuer et empêcher l’agrégation plaquettaire, et par conséquent le risque de maladies cardiovasculaires.

1.1.4. Industrie et produits à base d’argousier
Malgré que l’utilisation de l’argousier en Europe et Asie soit connue depuis des siècles, l’activité industrielle de l’argousier n’a débuté en Russie que depuis les années 40 (Li &

22 Beveridge, 2003). Les premiers produits ont fait partie de la diète des astronautes, qui ont aussi utilisé des crèmes à base de l’argousier pour la protection de la radiation cosmique (Li & Beveridge, 2003). C’est dans les années 80 que la Chine établit les premières plantations, et à partir de 1982 près de 150 industries se sont établies, produisant environ 200 produits (Li & Beveridge, 2003). Plus récemment, des industries se sont établies en Allemagne et d’autres pays, incluant le Canada (Yakimishen, 2004). Les produits faits à base de l’argousier occupent une place importante principalement dans les industries pharmaceutique, cosmétique et alimentaire. En Chine et Russie, les fruits et les huiles de l’argousier sont utilisées comme matières premières pour l’élaboration d’aliments fonctionnels et d’ingrédients pour les médecines naturelles, ainsi que pour la fabrication des produits cosmétiques (Yang & Kallio, 2005a). Dans le cas des industries pharmaceutique et cosmétique, il est possible de trouver des médicaments sous diverses formes (pilules, capsules, comprimés, poudres, aérosols, liquides et liniments) lesquels peuvent servir au traitement de différentes maladies telles que l’inflammation des muqueuses buccale, rectale et vaginale, l’érosion cervicale, les lésions causées par les rayonnements, les brûlures, les ulcères duodénaux, gastriques et cutanés (Li & Beveridge, 2003), ainsi qu’une grande variété de crèmes, pommades, shampooings, savons, solutions topiques et protecteurs solaires. L’industrie alimentaire comprend une large gamme de produits d’argousier, tels que les jus, les liqueurs, la crème glacé, les bonbons, les confitures, les barres énergétiques, les vins et les thés.

1.2 L’extraction d’huiles
Les procédés d’extraction d’huiles varient largement selon la source d’où elles soient issues. Dans le cas de graines et pulpes de fruits, cette opération se réalise principalement par des méthodes mécaniques (extraction par pression), à l’aide de solvants (extraction par solvants), ou par une combinaison des deux.

23 L’extraction par solvants est la méthode la plus largement répandue pour l’obtention d’huiles issues de matériaux oléagineux. Il s’agit d’une opération de transfert de matière impliquant le contact entre un solide qui contient le soluté, et un solvant qui le solubilise. Elle comporte généralement une séquence de trois étapes: l’extraction de l’huile (faite par des contacts successives entre le solvant et le solide), la désolvantation du solide (faite généralement par chauffage à la vapeur), et finalement la récupération de l’huile de la miscella (faite par évaporation et/ou distillation) (Figure 1.2.).
Matériau solide (Graines ou Baies) Nettoyage Réduction du contenu en eau (Cuisson, Séchage) Réduction de la taille (broyage, écrasement) Extraction par solvants

Solide lixivié Élimination des traces du solvant pour utilisation postérieure

Miscella (Solvant + Huile) Distillation

Solvant

Huile

Figure 1.2. Schéma de l’opération d’extraction d’huiles par solvants. Compte tenu du fait que l’extraction d’huiles est une opération très ancienne, elle a été abondamment étudiée. Des nouvelles méthodes, telles que les extractions assistées par micro-ondes ou par ultrason, l’extraction accélérée par solvants, l’extraction avec des fluides supercritiques, et l’extraction assisté par des enzymes, ont été développées à petite et grande échelle, afin de maximiser les rendements, de diminuer la consommation de solvants, de réduire le temps d’extraction, de faire les opérations plus sélectives, et de

24 contribuer à la préservation de l’environnement. D’autre part, il est bien connu que les rendements d’extraction et la qualité finale de l’huile sont affectés principalement par la méthode d’extraction, le type et la quantité de solvant, la température, le temps d’opération, la taille des particules et la teneur en eau du solide.

1.2.1. Préparation des matières premières
Indépendamment de la méthode utilisée, l’extraction d’huiles comporte généralement diverses opérations préliminaires, telles que le nettoyage, le décorticage, le broyage, la floconnisation, la cuisson et/ou séchage, et dans certains cas la détoxication (Fils, 2000; Williams, 1997). De ces opérations, le séchage revête une grande importance, vu qu’il cause des changements physiques, chimiques et structuraux, qui affectent les propriétés de transport et la qualité des produits (Okos et al., 1992).

1.2.1.1. Le séchage Le séchage est un procédé de conservation des aliments dont le but et d’éliminer la majorité de l’eau qu’ils contiennent, afin que les microorganismes ne puissent plus se développer, et pour ralentir la plupart des réactions de dégradation. Comme étape préliminaire à l’extraction d’huiles, l’objectif du séchage est de réduire la teneur en eau jusqu’environ 23%, pour favoriser les rendements d’extraction (Williams, 1997; Bernardini, 1983). Le séchage est une opération complexe, dans laquelle les transferts de matière et chaleur se produisent simultanément. Malgré qu’il puisse être réalisé par diverses méthodes, en général tous les procédés de séchage peuvent être groupés dans trois catégories (Beaudry et al., 2004): le séchage au soleil, le séchage sous conditions atmosphériques (y compris les étuves, les tunnels de séchage, et les séchoirs à lit fluidifié, à micro-ondes, et par atomisation), et le séchage sous conditions sub-atmosphériques (y compris le séchage sous vide et la lyophilisation). D’après Flink & Knudsen (1987), le séchage à l’air et la lyophilisation sont les méthodes les plus utilisées pour réduire la teneur en eau des produits alimentaires solides.

25 1.2.1.1.1. Le séchage à l’air Dans une opération typique de séchage à l’air, le produit à déshydrater est placé dans un environnement fermé, et mis en contact avec une courant d’air chaud. La chaleur, transmise au produit principalement par convection, génère un gradient de température dans le solide, causant l’évaporation de l’eau libre du produit, laquelle migre constamment vers la surface (par diffusion et/ou écoulement capillaire, parmi d’autres mécanismes), pour être postérieurement entraînée par l’air circulant (Menon & Mujumdar, 1987). Dans cette première étape du processus, la vitesse de séchage, contrôlée principalement par les propriétés physiques de l’air (la température, l’humidité et le débit), est généralement constante (Chen & Johnson, 1969). À la fin de la période de séchage à vitesse constante, l’eau libre n’arrive plus à la surface du produit, et il commence une période à vitesse décroissante, toujours plus longue que celle à vitesse constante. Dans cette deuxième période, la vitesse de séchage est gouvernée par les propriétés physiques du solide, et les transferts de chaleur et de matière sont hautement dépendants de la microstructure du produit (Aguilera & Stanley, 1999). Le séchage à l’air est une méthode de déshydratation largement répandue à cause de sa simplicité et des coûts de production relativement bas. Néanmoins, l’obtention de produits secs non uniformes, les longues périodes de séchage, et les effets négatifs sur la qualité des produits finaux sont ses principaux désavantages.

1.2.1.1.2. La lyophilisation La lyophilisation est une méthode de déshydratation qui consiste à éliminer par sublimation, la majeure partie de l’eau contenue dans un produit. Cette opération se réalise habituellement à des faibles conditions de pression et de température (au-dessous du point tripe de l’eau), et comporte principalement deux étapes: la congélation et la déshydratation. La congélation, normalement réalisée dans un appareil différente au lyophilisateur, joue un rôle capital dans la lyophilisation, parce que la taille et distribution des cristaux de glace formés, influencent le procédé de lyophilisation et la qualité du produit final. L’objectif de

26 cette première étape est de congeler l’eau libre du produit, laquelle constitue dans la plupart des cas 70 à 90% de l’eau total. En général, une congélation rapide proportionne un produit final de meilleure qualité, vu que l’on favorise la formation de petits cristaux de glace, lesquels permettront de conserver mieux la structure du produit, prévenant son effondrement pendant ou après la lyophilisation (Mellor, 1978). L’étape de déshydratation recouvre deux principes physiques (Marin & René, 2000): la sublimation des cristaux de glace formés durant la congélation (appelée déshydratation primaire), et la désorption finale de l’eau non congelable (dénommée déshydratation secondaire). Le produit congelé est placé dans la chambre de séchage, d’où l’air est évacué postérieurement à l’aide d’une pompe à vide. La sublimation se produit en fournissant de l’énergie au produit congelé, et grâce à la différence de pression existant entre la pression de vapeur d’eau du front de sublimation (interphase entre la couche sèche et la couche congelée du produit) et la pression partielle de la vapeur d’eau dans la chambre de séchage. L’énergie nécessaire pour atteindre la sublimation (chaleur latente de sublimation) est fournie au produit congelé par conduction et/ou rayonnement, ou par l’irradiation des molécules d’eau avec des micro-ondes (Barbosa-Cánovas & Vega-Mercado, 1996). La désorption de l’eau contenue dans la surface interne du produit, commence quand il n’y a plus de glace à sublimer, et la teneur en eau du produit correspond à l’eau partiellement liée (entre 10 et 30%). Dans cette étape qui peut prendre plus d’un tiers de tout le cycle de séchage, il est important de maintenir la température au-dessous de 30 à 50ºC, afin d’éviter l’effondrement du produit (Barbosa-Cánovas & Vega-Mercado, 1996). En bref, les étapes comportant le procédé de lyophilisation, peuvent se représenter tel qu’illustré à la Figure 1.3. Les produits lyophilisés sont très légers et poreux, et présentent une haute hygroscopicité et une très faible teneur en eau. Ils peuvent être stockés presque indéfiniment à la température ambiante, en évitant le contact avec l’oxygène, la lumière et la vapeur d’eau (Marin & René, 2000; Mellor, 1978).

27

Figure 1.3. Étapes du procédé de lyophilisation (Adapté de Barbosa-Cánovas & VegaMercado, 1996) En raison de ses particularités, la lyophilisation occupe une place important parmi les méthodes de séchage. Elle permet d’obtenir des produits finaux de haute qualité, lesquels conservent leurs propriétés chimiques, physiques, biologiques et organoleptiques. La forme et texture originales sont aussi conservées, vu que la transition de l’état congelé à l’état déshydraté, en l’absence d’une forte proportion d’eau liquide, réduit les possibilités d’altération (Marin & René, 2000). En plus, l’absence d’air et les faibles températures d’opération, empêchent la croissance des micro-organismes et préviennent la dénaturation des protéines, les modifications chimiques et le rancissement dû à l’oxydation (Mellor, 1978). Or, les principaux désavantages de la lyophilisation sont reliés aux coûts énergétiques et au temps de séchage (Liapis & Marchello, 1984). Le mode de fonctionnement sous vide, et les faibles vitesses de déshydratation font de la lyophilisation une technique onéreuse, et en conséquence elle ne s’applique que pour des produits ayant une grande valeur ajoutée.

1.2.1.1.3. Effets du séchage sur les propriétés des produits Outre la diminution de la teneur en eau, le séchage cause divers changements physiques, chimiques et structuraux sur les produits. D’après King (1971) et Aguilera & Stanley

28 (1999), les principaux inconvénients qui peuvent altérer les produits au cours du séchage ou durant leur stockage sont: L’oxydation de lipides : La présence d’oxygène durant le séchage à l’air favorise plus les réactions d’oxydation des lipides, par rapport à la lyophilisation. Cependant, les produits lyophilisés possédant une grande surface spécifique et une très faible teneur en eau, sont très susceptibles à ce type de détérioration. Le stockage dans des emballages étanches à l’oxygène ou sous atmosphères contrôlées (absence d’oxygène), permet de prévenir ce problème. Le brunissement non enzymatique : Les réactions de brunissement non enzymatique, communément appelées réaction de Maillard, désignent un ensemble complexe de réactions impliquant des composés carbonylés ou des sucres réducteurs et des composés aminés libres (protéines, acides aminés). Elles sont influencées par la température, et entraînent généralement une modification de l’apparence, de la flaveur et de la qualité nutritionnelle des aliments. Contraire au séchage à l’air, les faibles températures d’opération et la transition relativement rapide d’un état complètement hydraté à un état de faible teneur en eau, permettent de minimiser la réaction de Maillard au cours de la lyophilisation. Les réactions enzymatiques : Les réactions enzymatiques peuvent occasionner de différentes manières la détérioration des produits alimentaires. Le brunissement enzymatique, la scission des molécules d’amidon entraînant la production de sucres simples, l’hydrolyse de pectines et de lipides sont quelques exemples. Ces réactions sont favorisées par des teneurs en eau élevées, malgré qu’elles puissent se présenter aussi à l’état congelé. Des traitements de blanchiment sont usuellement utilisés afin de prévenir ce type de réactions. Dénaturation de protéines : La dénaturation de protéines est un problème qui se présente durant le séchage. Cet inconvénient, causé par les températures élevées (40 à 80ºC, dépendant de la protéine et du pH) et par des concentrations de sel élevées, occasionne un faible taux de réhydratation, et des changements dans la texture du

29 produit. Par rapport à la lyophilisation, le séchage à l’air favorise plus la dénaturation de protéines. Changements microstructuraux : La perte de l’intégrité cellulaire et le rétrécissement («shrinkage») sont des problèmes associées aux changements microstructuraux des produits durant le séchage. Les effets du séchage sur la microstructure des solides varient d’une méthode à l’autre. Par exemple, il est bien connu que la qualité microstructurale des produits lyophilisés est nettement supérieure à celle des produits déshydratés par d’autres méthodes, et que le rétrécissement est habituellement beaucoup moins prononcé dans la lyophilisation par rapport aux autres méthodes de séchage (Mellor, 1978).

1.2.2. Influence de la méthode de déshydratation sur l’extraction d’huiles
Le séchage à l’air est la méthode de déshydratation la plus communément utilisé pour ajuster la teneur en eau de graines et pulpes de fruits avant l’extraction de leurs huiles. Malgré que d’autres méthodes de déshydratation ont été évaluées, l’information disponible à ce sujet est vraiment limitée, et la plupart des études sont des applications aux huiles essentielles. Oomah et al. (1998) ont étudié les effets des séchages à l’air et par micro ondes sur le rendement et la qualité de l’huile de pépins de raisins. Ils ont trouvé que le séchage par micro ondes a fait augmenter significativement le rendement d’extraction, par rapport au séchage à l’air (15.4% vs. 14.2%, p<0.05). L’indice de peroxyde et la viscosité des huiles ont été plus élevés quand les pépins furent séchés par micro ondes. Or, pour ce qui concerne les tocophérols et tocotriénols, les huiles dérivées des pépins séchés par micro ondes ont présenté des contenus en α- et γ-tocophérol et en δ-tocotriénol plus élevés que ceux trouvés dans les huiles issues des pépins séchés á l’air. Cependant, les contenus en βet δ-tocophérol, et en α- et γ-tocotriénol furent plus élevées chez les huiles issues des pépins séchés à l’air. L’indice de saponification a été moins élevé chez les huiles dérivées des pépins séchés par micro ondes (192.4 vs. 195.9).

30 Dans une étude récente, Díaz-Maroto et al. (2004) présentent les effets de trois méthodes de séchage (séchage au four à 45ºC, séchage à l’air à la température de la pièce et lyophilisation) sur les composants aromatiques et la structure des feuilles de basilic. Des pertes de composants volatiles de 28.6%, 27.4% et 13.6% ont été trouvées après le séchage au four, la lyophilisation et le séchage à l’air, respectivement. Le séchage a produit d’importants changements structuraux aux feuilles de basilic. La structure des feuilles a collapsée après les séchages au four et à l’air, tandis qu’après la lyophilisation ce phénomène n’a pas été observé. D’autres études ont aussi montré que la méthode de séchage exerce des effets significatifs sur le rendement et la composition des huiles issues plantes aromatiques (Sefidkon et al., 2006; Omidbaigi, et al., 2004; Raghavan et al., 1997; Deans & Svoboda, 1992).

1.3 Extraction des huiles de l’argousier
Malgré le fait que l’extraction et l’utilisation des huiles de l’argousier soient des pratiques très anciennes, l’information sur les méthodes d’extraction des huiles, et l’influence des paramètres opérationnels n’est pas couramment disponible. Quelques brevets ont été cités par Li & Beveridge (2003). Les extractions avec des fins analytiques utilisent principalement des méthodes traditionnelles. Quelques données rapportant des rendements typiques ont été présentées précédemment (Tableaux 1.2. et 1.3.). Cependant, très peu des détails concernant les conditions d’opération ont été rapportés, hormis quelques études récentes sur la modélisation d’extractions avec le CO2 supercritique.

1.3.1. Extraction des huiles de l’argousier par pressage
Très peu d’applications du pressage pour l’obtention des huiles de l’argousier sont disponibles dans la littérature. L’extraction par pression, d’après Yang & Kallio (2002a), n’est pas une méthode appropriée pour l’obtention de l’huile des graines, compte tenu de son faible rendement par rapport aux coûts élevés des fruits. Cependant, la centrifugation et

31 décantation du jus obtenu après le pressage des fruits, constituent des méthodes efficaces pour la séparation de l’huile de la pulpe. Arumughan et al. (2005) ont rapporté des rendements élevés d’huile de pulpe (2.6-3.0% par fruit frais), ainsi que du jus (75-80%), en utilisant le pressage suivi de centrifugation. En utilisant une presse à vis, la majorité de la pulpe, et 80% du jus et de l’huile, ont été récupérés dans la phase liquide. Le procédé ainsi développé pour ces auteurs, a permis la séparation d’environ 70% de l’huile de pulpe, sans l’emploi des solvants organiques, favorisant ainsi la conservation des molécules bioactives qu’y se trouvent. L’huile des graines d’argousier cv. Indian-Summer a été obtenue par pressage avec des rendements oscillant entre 3.3 et 3.8%w/w (Yakimishen, 2004). Des températures entre 63ºC et 70ºC, pour l’huile à la sortie de la presse, furent utilisées. Dans la même étude, l’extraction par pressage de flocons de pulpe (teneur en eau entre 6.2-7.5%) n’a pas permis la récupération d’huile. Malgré l’indisponibilité d’information sur l’extraction des huiles de l’argousier par pressage, quelques entreprises en Europe auraient produit des huiles issues de l’argousier par cette méthode. Par exemple, Vlase et al. (2006) rapportent l’utilisation d’huile d’argousier obtenue par pressage à froid, produit par la compagnie française Archimex. D’autre part, diverses compagnies annoncent sur leurs sites Web, les huiles d’argousier obtenues par pressage. C’est le cas par exemple de « Mountain Rose Herbs » (http://www.mountainroseherbs.com/learn/oilprofile/sea_buckthorn.php) « Shokaty International Ltée » (www.shokaty.com) dans le Canada. et « HR Laboratories LLC » (http://www.hrlaboratories.com) dans les États-Unis, ainsi que

1.3.2. Extraction des huiles de l’argousier par solvants
Les huiles des graines et de la pulpe de l’argousier ont été extraites il y a long temps, à l’aide de différents solvants. Néanmoins, étant donné que les publications couramment

32 accessibles sont principalement reliées à des études de caractérisation des huiles ou de différentes espèces et/ou cultivars, les effets des variables d’opération n’ont pas été étudiés. Dans ce contexte, les solvants les plus utilisés sont ceux employés normalement dans les méthodes standards, utilisant l’éther de pétrole, l’hexane et des mélanges de chloroforme et méthanol comme solvants. Mironov et al. (1980), ont réalisé des extractions selon la méthode de Soxhlet utilisant l’hexane, l’éther de pétrole, et le chlorure de méthylène. Après 4–5 heures d’extraction ils ont rapporté des rendements entre 22-23% et 32-34% en poids sec, pour les fruits et la pulpe de l’argousier respectivement. Une étude de l’activité biologique de ces huiles, a montré que celles-ci avaient une grande capacité pour la régénération intensive de lésions de la peau chez les lapins et les rats. L’éther de pétrole a été utilisé pour l’extraction des huiles des graines et de la pulpe de fruits d’argousier de différentes espèces (Hippophaë rhamnoides ssp. sinensis, Hippophaë goniocarpa, et Hippophaë neurocarpa) (Lu, 1999). La quantité d’huile obtenue oscillait entre 9.77–14.15% et 29.04–32.10% pour les graines et la pulpe respectivement. L’espèce neurocarpa est celle qui a présenté les valeurs les plus élevées en termes de rendement. Yakimishen (2004) a réalisé l’extraction de l’huile des graines et de la pulpe d’argousier (cultivar Indian-Summer), avec l’éther de pétrole, selon la méthode 02-01A de l’American Association of Cereal Chemists. Les rendements des matériaux préalablement séchées à l’air chaud (50ºC, 24 heures) furent de 8.2% et 11.9% (en poids frais) pour les huiles des graines et de la pulpe respectivement. L’éther diéthylique a été employé pour l’obtention de l’huile de fruits d’argousier séchés à 105ºC, durant 6–12 heures (Sabir et al., 2005). Dix grammes de fruits secs, furent soumis à des extractions Soxhlet durant six heures, à des températures entre (30–40ºC). Les teneur en huile, pour les graines et la pulpe, ont varié entre 7.7–13.7% et 17.8–29.1% (en poids sec) respectivement.

33 Dans une étude concernant la production d’un ester concentré en acide palmitoléique, Klaas & Meurer (2004) ont réalisé des extractions des fruits d’argousier du cultivar Leikora avec le cyclohexane. Un rendement en huile de 20.2% par rapport à la peau du fruit fut rapportée. L’hexane a aussi été utilisé dans plusieurs études. Cakir (2004) a extrait avec l’hexane, l’huile du mésocarpe et des graines de fruits d’argousier, par la méthode de Soxhlet durant huit heures. Les extractions ont été protégées contre la lumière et le solvant fut évaporé à pression et température réduites. Tsydendambaev & Vereshchagin (2003) ont utilisé l’hexane pour l’extraction des huiles des graines de l’argousier, lors d’une étude de la variation de la composition en triglycérides durant la maturation des fruits d’argousier (cv. Dar Katuni). Yin et al. (2005), ont rapporté une teneur en huile de 5.24% en poids sec, pour des graines d’argousier extraites avec l’hexane à 343 K pendant 16 heures avec un ratio soluté:solvant de 1:7 (m/v). Oomah et al. (2000) ont réalisé l’extraction de l’huile de la pulpe et des graines de l’argousier de différents cultivars avec l’hexane. La pulpe, a été obtenue à partir du jus par centrifugation à différentes vitesses (2500 et 12000 rpm) L’huile de la pulpe a été récupérée par homogénéisation avec l’hexane (1:1 w/v). Les graines ont été soumises à une extraction de trois heures (ratio 1:5 w/v). Ensuite, l’hexane a été évaporé et l’huile a été mesurée par gravimétrie. Les résultats ont montré qu’à une vitesse de centrifugation élevée, le rendement d’huile de la pulpe peut atteindre jusqu’à 49%, et que les caractéristiques et composition des huiles varient selon le cultivar et la méthode d’obtention. Un résumé des conditions et résultats d’opérations d’extraction des huiles de l’argousier avec divers solvants, ainsi que leurs compositions en acides gras est présenté dans le Tableau 1.11. Les méthodes de Folch et al. (1957) et Christie (1982), lesquelles utilisent des mélanges de chloroforme – méthanol comme solvant, ont été les plus utilisées dans les études portant sur la caractérisation des huiles de fruits de l’argousier et leurs variations selon les différentes espèces et origines (Ranjith et al., 2006; Tiitinen et al., 2005; Zadernowski et al., 2003;

34 Kallio et al., 2002; 2002a; Yang et Kallio, 2002; 2001; Pintea et al., 2005; 2001). Quelques résultats obtenus par cette méthode, sont présentés dans le Tableau 1.12.

1.3.3. Extraction des huiles de l’argousier avec des fluides supercritiques
L’extraction des huiles de l’argousier avec des fluides supercritiques (CO2), a déjà été étudiée au niveau de laboratoire, et elle est aussi une technologie utilisée pour leur production industrielle (Li & Beveridge, 2003) (Tableau 1.13.). D’après Li & Beveridge (2003), le rapport de Stastova et al. (1996) constitue la seule source de données des premières extractions des huiles de l’argousier avec le CO2 supercritique. Ces données indiquent que l’huile d’argousier a été extraite en Russie dès 1978 avec le CO2 en état liquide. L’extraction à contre courant à 20ºC et 5.7 MPa, durant 33.5 heures, d’un mélange de flocons de pulpe et des grains séchés à l’air (45:55 en poids), a eu un rendement variant entre 4–8% en poids. Les mêmes auteurs affirment, qu’en Allemagne, la compagnie FLAVEX a extrait l’huile de fruits d’argousier d’origine lituanien, à l’aide du CO2 à 40ºC et 35 MPa. Un rendement d’extraction de 16.5% en poids a été rapporté.

35

Tableau 1.11. Caractéristiques des extractions des fruits de l’argousier avec divers solvants.
Conditions d’opération Des graines
45.1 g/kg C16:0 (26.3%) C18:0 (3.2%) C14:0 (1.2%) C15:0 (0.7%) C16:0 (29.3%) C8:0 (1.3%) C10:0 (1.3%) C14:0 (1.4%) C18:0 (1.0%) C16:0 (8.26%) C8:0 (2.78%) C14:0 (0.15%)

Caractéristiques de la matière première Rendement
Saturés Insaturés

Composition des acides gras des huiles
C18:1n-9 (32.8%) C18:2n-6 (21.7%) C16:1n-7 (12.7%) C18:3n-3 (1.4%) C16:1n-7 (47.8%) C18:2n-6 (10.6%) C18:1n-9 (6.5%)

Référence
Cakir, (2004)

Les graines et les parties molles

Des fruits d’argousier de la Turquie.

Des parties molles
6.4 g/kg

Solvant : n-hexane Temps d’extraction : 8 heures. L'extraction : Soxhlet, protégée contre la lumière. Après de saponifier avec des solutions méthanoliques de NaOH 0.5 M, et d’acidifier avec HCl 2 M jusqu’à pH 4-5, les acides gras ont été extraits au moyen du chloroforme et le solvant évaporé postérieurement.

Les graines
52.4 g/kg

Des graines
C18:2n-6 (40.8%) C18:3n-3 (25.7%) C18:1n-9 (22.3%) Non disponibles Solvant : n-hexane Temps d’extraction : 16 heures. Température d’extraction : 343 K Ratio soluté/solvant : 1:7

Moulues et tamisées, avec un contenu en eau de 13.1% en poids.

Yin et al. (2005)

La pulpe
Solvant : n-hexane L’huile a été récupérée par homogénéisation avec hexane (1:1 w/v). L’huile des graines a été obtenue par extraction durant trois heures (relation 1:5 w/v). Solvant : éther de pétrole L’extraction a été faite selon la méthode 0201A de l American Association of Cereal Chemists. 8.2 %1

De la pulpe
Jusqu’à 49% en poids, obtenu à une vitesse de centrifugation élevée.

Obtenue à partir du jus par centrifugation (15 minutes à 4°C) à différentes vitesses (2500 et 12000 rpm)

Oomah et al. (2000)

Les graines

Des graines
C16:0 (7.00%) C18:0(2.6%) C18:1n-9 (13.6%) C18:1n-7 (2.1%) C18:2n-6 (35.5%) C18:3n-3 (37.4%)

Séparées mécaniquement du tourteau séché à l’air à 50ºC durant 24 heures, et postérieurement nettoyées avec de l’air comprimé.

Yakimishen (2004) De la pulpe
11.9%1 C16:0 (35.2%) C18:0 (1.2%) C16:1 (35.0%) C18:1n-9 (3.3%) C18:1n-7 (6.9%) C18:2n-6 (12.8%) C18:3n-3 (1.5%)

La pulpe

Obtenue par pressage des fruits et séchée à l’air à 50ºC durant 24 heures.

36

Tableau 1.12. Caractéristiques des extractions des fruits de l’argousier avec chloroforme – méthanol.
Conditions d’opération
Des graines 73 g/kg a Saturés C16:0 (8.7%) C18:0 (2.5%)

Caractéristiques de la matière première Rendement1 Composition des acides gras des huiles

Référence
(Yang et Kallio, 2001)

Les graines Séparées mécaniquement du tourteau obtenu par pressage des fruits, et séchées à l'air à la température ambiante. Temps d’extraction : 3 minutes. Des extractions successives avec chloroforme-méthanol (2:1 v/v) avec postérieure filtré et séparation de la fraction lipidique par décantation. 113 g/kg b C16:0 (7.4%) C18:0 (3.0%) Des parties molles 80 g/kg a C16:0(26.7%) C18:0 (1.3%)

Insaturés C18:2n-6 (40.9%) C18:3n-3 (26.6%) C18:1n-9 (19.4%) C18:1n-7 (2.2%) C18:2 n-6 (39.1%) C18:3 n-3 (30.6%) C18:1n-9 (17.1%) C18:1n-7 (2.8%)

(Yang et Kallio, 2001)

Les parties molles Obtenues par pressage des fruits, et séchées à l'air à la température ambiante. 189 g/kg b

(Yang et Kallio, 2001)

C16:0(27.8%) C18:0 (0.8%)

C16:1n-7(27.2%) C18:1n-9 (17.1%) C18:2n-6 (12.7%) C18:1n-7 (8.1%) C18:3n-3 (7.1%) C16:1(32.8%) C18:1n-9 (17.3%) C18:2n-6 (9.0%) C18:1n-7 (9.1%) C18:3n-3 (3.3%) C16:0(22.9%) C18:0 (0.8%)

(Yang et Kallio, 2001)

Des baies entières Lyophilisées jusqu’à 15-30% du poids original.

Des baies entières 79 g/kg a

(Yang et Kallio, 2001)

166 g/kg b

C16:0(23.6%) C18:0 (1.2%)

C16:1n-7 (21.5%) C18:2n-6 (18.6%) C18:1n-9 (17.6%) C18:3n-3 (11.2%) C18:1n-7 (6.7%) C16:1n-7 (26.0%) C18:2n-6 (15.3%) C18:1n-9 (17.2%) C18:3n-3 (8.8%) C18:1n-7 (7.8%)

(Yang et Kallio, 2001)

37

1

a

Défini comme la masse d’huile obtenue par rapport à la masse du matériau solide (basé en poids frais). ssp. sinensis, b ssp. rhamnoides.

Tableau 1.13. Caractéristiques des extractions des fruits de l’argousier avec le CO2 supercritique.
Conditions d’opération
Des graines 18-55 g/kg C14:0(0.17%) Des graines 50 g/kg Saturés C16:0(8.85%) C8:0(2.42%)

Caractéristiques de la matière première

Rendement

Composition des acides gras des huiles Insaturés C18:2 (n-6) (40.1%) C18:3 (n-3) (26.7%) C18:1 (n-9) (21.8%)
Non disponibles

Référence
Yin et al. (2004)

Les graines
Écart de pressions : 20-30 MPa Écart de températures : 35-40 ºC Débit de CO2 : 0.15-0.3 m3/h Temps d’extraction : 4-5 heures Écart de pressions : 9.6-27 MPa Écart de températures : 25-60ºC Débit de CO2 : 0.1-0.2 L/min Les conditions optimales ont été trouvées pour les particules les plus petites à 27 MPa et 40ºC.

Moulues jusqu’à une taille de 18-36 mailles. Teneur en huile initial: 18.5% en poids. Teneur en eau: 13.1%

Les graines

Séparées mécaniquement du tourteau séché à l’air, et moulues postérieurement à trois tailles différentes, dont la plus petite contient 50% en poids de particules de 0.1 mm. Teneur en eau: 8-9%.

Stastova et al. (1996)

La pulpe

Obtenue par pressage des fruits et séchée à l’air, et moulue postérieurement aux mêmes tailles des graines. Teneur en eau: 4-5% Écart de pressions : 8-60 MPa Écart de températures : 35-65ºC Débit de CO2 : 10.5-57 kgCO2/(kg solide*h) Les conditions optimales ont été trouvées à 27 MPa, 40ºC et 57 kg CO2/(kg solide*h). Pression d’opération : 35 MPa Température d’opération : 45ºC Temps d’extraction : 6 heures

De la pulpe 85 g/kg

Non disponibles

Les graines

Moulues à une taille entre 0.3-1.0 mm et séchées à l’air durant 2 heuresà 50ºC. Teneur en huile initial : 9.3% en poids.

Des graines 91.7 g/kg

Non disponibles

Derevich et Shindyapkin (2004) Des graines 53.4 g/kg (30 s) 30.3 g/kg (10 s)

Les graines

Séparées mécaniquement du tourteau séché à l’air à 50ºC durant 24 heures. Postérieurement nettoyées avec l’air comprimé, et moulues durant 10 et 30 secondes.

C16:0 (7.2%) C18:0(2.4%)

C18:1n-9 (13.0%) C18:1n-7 (1.9%) C18:2n-6 (35.9%) C18:3n-3 (37.9%) De la pulpe 111.3 g/kg C16:0 (35.5%) C16:1 (36.3%)

Yakimishen (2004)

La pulpe

Obtenue par pressage des fruits, et séchée à l’air à

38

50ºC durant 24 heures, en couches de 20 mm d’épaisseur.

C18:0 (1.1%)

C18:1n-9 (3.5%) C18:1n-7 (6.9%) C18:2n-6 (12.4%) C18:3n-3 (1.2%)

39 Stastova et al. (1996) ont étudié l’effet de différentes conditions d’opération sur le rendement des extractions des huiles des graines et de la pulpe d’argousier, utilisant le CO2 supercritique. Dans cette étude, les graines, séparées mécaniquement du tourteau séché à l’air, ont été moulues et extraites dans un appareil à extraction semi continu, en faisant varier les pressions entre 9.6 et 27 MPa, et les températures entre 25 et 60ºC. Des rendements d’extraction d’environ 50 g/kg et 85 g/kg ont été obtenus pour les graines et la pulpe respectivement, à des conditions de 27 MPa et 40ºC, et avec un débit de CO2 de 1 L/min. L’huile de la pulpe a eu une solubilité dans le solvant plus élevée que l’huile de graines, probablement dû à sa teneur en acides gras de chaînes plus courts. L’augmentation de la température et de la pression a fait augmenter le taux d’extraction de l’huile. Cependant, le paramètre qui a affecté le plus la quantité d’huile extraite, a été la taille des particules. Les particules plus fines ont fourni les plus grands rendements. Les principaux composants des huiles furent les triglycérides (76-92%), tandis que la teneur en acides gras libres a oscillé entre 1-4%. D’autres travaux d’extraction des huiles de l’argousier avec le CO2 supercritique, incluent ceux de Derevich & Shindyapkin (2004), qui ont rapporté une efficacité d’extraction d’environ 70% pour l’extraction des graines d’argousier à 35ºC et 48 MPa. Yin et al. (2005; 2003) utilisant des conditions optimales (pression d’opération entre 20 et 30 MPa, température d’extraction entre 35-40ºC, débit de CO2 entre 0.15-0.3 m3/h, et temps d’extraction entre 4-5 heures) rapportèrent un rendement d’extraction de l’huile de graines d’environ 90%. Une composition élevée en acides linoléique (40.1%), linolénique (26.7%) et oléique (21.8%), semblable à celle obtenue par Kallio et al. (2002; 2002a) et Yang et Kallio (2002; 2001) en utilisant un mélange de chloroforme – méthanol comme solvant, a été rapportée. Yakimishen (2004) a réalisé l’extraction des huiles de l’argousier, cultivar Indian summer, avec le CO2 supercritique à 45ºC et 35 MPa. Pour cette fin, les fruits ont été pressés, et le tourteau placé en couches de 20 mm d’épaisseur a été séché á l’air durant 24 heures à 50ºC. Après le séchage, les graines séparées de la pulpe à l’aide d’un vibrateur et nettoyées avec de l’air comprimé, étaient moulues durant 10 et 30 secondes avant l’extraction. Après six

40 heures d’opération, cette approche a permis l’extraction du 37%, 65.1% et 86.3% des huiles des graines moulues durant 10 et 30 secondes, et de la pulpe, respectivement. Pour des temps d’extraction plus courts (3 heures), l’efficacité de l’opération représentait 90% par rapport au rendement obtenu durant 6 heures. Cependant, une diminution de 50% du volume de CO2 fut observée.

1.3.4. Extraction enzymatique des huiles de l’argousier
Les travaux d’extractions enzymatiques des huiles de l’argousier sont quasiment inexistants. Le seule étude, partiellement disponible, est celui de Nikolov & Heilscher (2002). Dans ce travail, les fruits ont été soumis à des traitements de tamisage (0.6 mm) ou ultrafiltration (membrane de polysulfone de 100 kDa) et traités avec deux préparations enzymatiques (Novozyme AP ou Rohapect D5L) durant 24 h à 20 et 50°C. L’ultrafiltration et le traitement enzymatique à 50ºC ont donné les meilleurs résultats, indépendamment du type d'enzymes. Ainsi, ce procédé à permis récupérer 97-99% du jus et 1-3% d’huile.

1.3.5. Extraction aqueuse des huiles de l’argousier
Les études des extractions aqueuses des huiles d’argousier ne sont pas très nombreuses. Les travaux récents de Yakimishen (2004) constituent la seule référence disponible pour le cultivar Indian-Summer. Les graines moulues furent soumises à l’extraction à 70ºC avec l’éthanol au 40% (ratio 2.5:1 solvant/graines) durant deux heures. Cependant, après de centrifuger et séparer la phase liquide, aucune huile n’a été récupérée. L’huile de la pulpe fut récupérée après deux étapes. Dans la première, l’huile a été obtenue après la centrifugation des fruits macérés et chauffés à 45ºC durant une heure. Dans la deuxième, le jus obtenu après la centrifugation de la première étape, fut extrait avec l’éthanol (95-99%, 2/1 v/v) durant deux heures à 70-80ºC. Avec ce procédé, le rendement en huile de la pulpe a été 0.13%w/w. D’autres méthodes d’extraction des huiles du fruit de l’argousier utilisent le mélangeage et chauffage (60ºC durant 48 heures) de la pulpe ou des fruits avec l’huile de tournesol, suivi

41 d’une séparation par pressage (Mironov, 1980). Le Tableau 1.14. résume quelques méthodes d’extraction cités par Li & Beveridge (2003). Tableau 1.14. D’autres méthodes d’extraction des huiles du fruit de l’argousier (Adapté de Li & Beveridge, 2003)
Méthode
Extraction par solvants avec Dichlore– difluorméthane Extraction par composants floculants et solvants organiques

Caractéristiques
Séchage des fruits jusqu’à une teneur en eau de 1.2 - 1.5%. Taille des particules : 500 µm Pression d’opération : 0.6 MPa Durée de l’extraction : 2-2.5 heures Ajouter des composants floculants à l’huile extraite de la pulpe, et enlever le précipité. Déshydratation de l’huile avec sulfate de sodium anhydre. Réextraction de l’huile à l’aide de benzène. Filtration. Congélation des fruits entre -22 et 27ºC durant 3-4 jours. Décongélation et fermentation prolongée durant 2-3 jours à 60-65ºC, suivi de la séparation du jus. Séchage de la pulpe avec agitation permanente. Séparation de l’huile de la masse sèche par centrifugation. Mélange continu de la pulpe broyée avec des huiles végétales, et postérieure séparation de l’extrait huileuse. Mouture des fruits et séparation des graines intactes. Les fruits sont mélangés à l'huile végétale préchauffée à 50-60 ºC, et un traitement avec des ultrasons est appliqué, pour faciliter la séparation de l'huile dans les étapes postérieures.

Avantages Désavantages
Teneur en caroténoïdes de 500 mg %. Résidus de solvant inacceptables dans les aliments. Résidus de solvant inacceptables dans les aliments.

Référence
Arkhipova et al. (1995)

Horvarth et al. (1994)

Extraction méchanique

Coût élevé. Procédé très long. Rendement faible.

Nizhegorodtsev et Umanskii (1991)

Mélange avec huiles végétales Mélange avec des huiles végétales et traitement ultrason

Mélange d’huiles avec un contenu élevé en caroténoïdes. Mélange d’huiles sans résidus chimiques.

Bekaso (1992), Gavrishin et al. (1990) Gorunzhina et al. (1990). Kesariiski et al. (1990)

Bibliographie
Agriculture and Agri-Food Canada. (2003). Canada: Sea Buckthorn. Bi-weekly Bulletin. Volume 16, Number 13. Aguilera, J.M., & Stanley, D.W. (1999). Microstructural principles of food processing and engineering. Second Edition. Gaithersburg, MD: Aspen Publishers. Arkhipova, T.N., Pipunyrov, S.V., & Popov, V.A. (1995). Production of sea buckthorn oil by extraction of dried milled sea buckthorn fruit with dicloro-difluoro-methane, followed by distillation. Russian Patent 207239. Arumughan, C., Ranjith,A., Sarinkumar, K., & Venugopalan, V. V. (2005). Integrated processing of fresh indian seabuckthorn (Hippophae rhamnoides). In 2nd International Seabuckthorn Association Conference, August 26-29, 2005, Beijing, China. Barbosa-Cánovas, G., & Vega-Mercado, H. (1996). Dehydration of foods. Chapman & Hall, New York, USA. Beaudry, C., Raghavan, G.S.V., Ratti, C., & Rennie, T.J. (2004). Effect of four drying methods on the quality of osmotically dehydrated cranberries. Drying Technology, 22 (3), 521–539. Berk, Z. (1992). Technology of Production of Edible Flours and Protein Products from Soybeans. FAO Agricultural Services Bulletin No. 97. Bekaso, L.S. (1992). Production of oil from sea buckthorn berries by milling, extraction with vegetable oil and separation of juice after settling. Russian Patent 2032720. Bernardini, E. (1982-83). Raw materials and extraction techniques. v. 1. Publishing house B.E. Oil, Rome, Italy. Beveridge, T., Li, T.S.C., Oomah, D., & Smith, A. (1999). Sea buckthorn products: manufacture and composition. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 47 (9), 3480-3488. Beveridge, T., Harrison, J.E., & Drover, J. (2002). Processing effects on the composition of sea buckthorn juice from Hippophaë rhamnoides L. cv. Indian Summer. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 50 (1), 113-116. Cakir, A. (2004). Essential oil and fatty acid composition of the fruits of Hippophaë rhamnoides L. (Sea Buckthorn) and Myrtus communis L. from Turkey. Biochemical Systematics and Ecology, 32 (9), 809-816. Cenkowski, S., Yakimishen, R., Przybylski, R., & Muir, W.E. (2006). Quality of extracted sea buckthorn seed and pulp oil. Canadian Biosystems Engineering, 48, 3.9-3.16. Chen, C.S., & Johnson, W.H. (1969). Kinetics of moisture movement in hygroscopic materials. I. Theoretical consideration of drying phenomena. Transactions of the ASAE, 12, 109-113. Christie, W.W. (1982). Lipid analysis: isolation, separation, identification and structural analysis of lipids. Oxford; Toronto: Pergamon Press. Deans, S., & Svoboda, D. (1992). Effect of drying regime on volatile oil and microflora of aromatic plant. Acta Horticulture, 306, 450–452. Derevich, I.V., & Shindyapkin, A.A. (2004). Extraction of organic oil from Sea Buckthorn seeds with supercritical carbon dioxide. Theoretical Foundations of Chemical Engineering, 38 (3), 274-283.

43 Díaz-Maroto, M.C., Sánchez Palomo, E., Castro, L., González Viñas, M.A., & PérezCoello, M.S. (2004). Changes produced in the aroma compounds and structural integrity of basil (Ocimum basilicum L) during drying. Journal of the Science pf Food and Agriculture, 84, 2070-2076. Fils, J.M. (2000). The production of oils. In Edible Oil Processing, Edited by Wolf Hamm & Richard J. Hamilton, p. 47-78, CRC Press, , Boca Raton, FL, USA. Flink, J.M., & Knudsen, H. (1987). An introduction to freeze drying. Denmark. 95 p. Folch, J., Lees, M., Sloane-Stanley, G.H. (1957). A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues. Journal of Biological Chemistry, 226, 497-502. Gao, X. (2005). Antioxidants and antioxidative activity of sea buckthorn (Hippophaë L. In Sea buckthorn (Hippophaë L.): A Multipropose Wonder Plant, Vol. 2 (V. Singh, Editor –in-Chief, 2005), p. 390-401, Daya Publishing House, New Delhi, India. García-Ayuso, L.E., & Luque de Castro, M.D. (1999). A multivariate study of the performance of a microwave-assisted Soxhlet extractor for olive seeds. Analytica Chimica Acta, 382, 309-316. Gavrishin, N.S., Gavrishin, S.D., & Voronoskii, A.V. (1990). Production of sea buckthorn oil with increasing carotenoid content by milling sea buckthorn fruit, separating juice from solids, extracting juice with vegetable oil and extracting solids with obtained extract. Russian Patent 2053255. Goel, H.C., Gupta, D., Gupta, S., Garg, A.P., & Bala, M. (2005). Protection of mitochondrial system by Hippophae rhamnoides L. against radiation-induced oxidative damage in mice. Journal of Pharmacy and Pharmacology, 57 (1), 135143. Gorunzhina, S.I., Pavlov, S.S., & Sharygin, M.A. (1990). Production of sea buckthorn oil by mixing sea buckthorn fruit with preheated vegetable oil, milling in centrifugal field, separating intact seeds and extracting. Soviet Union Patent 1833409. Guan, T.T.Y., Cenkowski, S., & Hydamaca, A. (2005). Effects of drying on the nutraceutical quality of sea buckthorn (Hippophaë rhamnoides L. ssp. sinensis) leaves. Journal of Food Science, 70 (9), E514-E518. Gupta, A., Kumar, R., Pal, K., Banerjee, P.K., & Sawhney, R.C. (2005). A preclinical study of the effects of sea buckthorn (Hippophaë rhamnoides L.) leaf extract on cutaneous wound healing in albino rats. Lower Extremity Wounds, 4 (2), 88-92. Gupta, R.K., & Singh, V. (2003). Nitrogen fixation in sea buckthorn (Hippophaë rhamnoides L.). In Sea buckthorn (Hippophaë L.): A Multipropose Wonder Plant, Vol. I (V. Singh et al., Eds., 2003), p. 286-299, Indus Publishing Company, New Delhi 110027, India. Gupta, R., & Flora, S.J.S. (2006). Protective effects of fruit extracts of Hippophaë rhamnoides L. against arsenic toxicity in Swiss albino mice. Human & Experimental Toxicology, 25 (6), 285-295. Häkkinen, S.H., Kärenlampi, S.O., Heinonen, I.M., Mykkänen, H.M., & Törrönen, A.R. (1999). Content of the flavonols quercetin, myricetin, and kaempferol in 25 edible berries. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 47 (6), 2274-2279. Häkkinen, S.H., Heinonen, I.M., Kärenlampi, S.O., Mykkänen, H.M., Ruuskanen, J., & Törrönen, A.R. (1999a). Screening of selected flavonoids and phenolic acids in 19 berries. Food Research International, 32 (5), 345-353.

44 Harrison, J. E., & Beveridge, T. (2002). Fruit structure of Hippophae rhamnoides cv. Indian Summer (sea buckthorn). Canadian Journal of Botany, 80(4), 399–409. Horvarth, J., Kelemen, J., Lassu, I., Marko, G., Mozsik, G., & Sarudi, I. (1994). Oil extraction of sea buckthorn berries for human consumption and cosmetics. Hungarian Patent 72703. Isamukhamedov, A.Sh., & Akramov, S.T. (1982). Phospholipids of the seeds of Hippophaë rhamnoides. Khimiya Prirodnykh Soedinenii, 3, 395-396. Johansson, A.K.; Korte, H.; Yang, B.; Stanley, J.C.; Kallio, H.P. (2002). Sea buckthorn berry oil inhibits platelet aggregation. J. Nutr. Biochem. 11, 491–495. Kallio, H., Yang, B., Tahvonen, R., & Hakala, M. (1999). Composition of sea buckthorn berries of various origins. In Proceedings of International Workshop on Sea Buckthorn (pp. 13-19), 28 August-2 September, 1999, Beijing, China. Kallio, H., Yang, B., & Peippo, P. (2002). Effects of different origins and harvesting time on vitamin C, tocopherols, and tocotrienols in sea buckthorn (Hippophaë rhamnoides) berries. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 50 (21), 61366142. Kallio, H., Yang, B., Peippo, P., Tahvonen, R., & Pan, R. (2002a). Triacylglycerols, Glycerophospholipids, Tocopherols, and Tocotrienols in Berries and Seeds of Two Subspecies (ssp. sinensis and mongolica) of Sea Buckthorn (Hippophaë rhamnoides). Journal of Agricultural and Food Chemistry, 50(10), 3004-3009. Katsouyanni, K., Skalkidis, Y., Petridou, E., Polychronopouloutrichopoulou, A., Willet, W., & Trichopoulous. D. (1991). Diet and peripheral arterial occlusive disease – The role of polysaturated, monosaturated and saturated fatty acids. American Journal of Epidemiology, 133 (1), 24-31. Kesariiski, A.G., Nikolyuk, V.I., & Podgainyi, V.A. (1990). Sea buckthorn oil production by extracting mixtures of milled pressings and stones of buckthorn with vegetable oil, with simultaneous ultrasonic treatment. Soviet Union Patent 1750686. King, C.J. (1971). Freeze-drying of foods. CRC Press, Cleveland, USA. Klaas, M.R.G., & Meurer, P.U. (2004). A palmitoleic acid ester concentrate from sea buckthorn pomace. European Journal of Lipid Science and Technology, 106 (7), 412-416. Kuk, M.S., & Hron, R.J. (1998). Cottonseed extraction with a new solvent system: Isohexane and alcohol mixtures. Journal of the American Oil Chemists Society, 75 (8), 927-930. Li, T.S.C., & Schroeder, W.R. (1999). A grower’s guide to sea buckthorn. Agriculture and Agri-Food Canada. 75 p. Li, T.S.C., & Beveridge, T.H.J. (with contributions by B.D. Oomah, W.R. Schroeder, and E. Small) (2003). Sea Buckthorn (Hippophaë rhamnoides L.): Production and Utilization. NRC Research Press, Ottawa, Ontario. 133 p. Li, Z.R., & Tan, S.Z. (1993). A clinical observation on the effects of oral supplementation of sea buckthorn oil on patients with malignant tumor under chemotherapy. Hippophaë, 6 (4), 41-42. Liapis, A.I., & Marchello, J.M. (1984). Advances in the modeling and control of freeze drying. In Advances in Drying, Vol. 3, edited by A.S. Mujumdar. Hemisphere Publishing, New York.

45 Lóbrega, J.A., Trevizan, L.C., Araújo, G.C.L., Nogueira, A.R.A. (2002). Focusedmicrowave-assisted strategies for sample preparation. Spectrochimica Acta Part B, 57, 1855-1876. Lu, R. (1992). Sea Buckthorn: A multipurpose plant species for fragile mountains. Int. Centre for Integrated Mountain Development, Katmandu, Nepal. 62 p. Lu, R. (1999). A new sea buckthorn resource – Hippophae goniocarpa. In Proceedings of the International Workshop on Sea Buckthorn, Beijing, China. Mamedov, S.Sh., Gigienova, É.I., Umarov, A.U., & Aslanov, S.M. (1981). Lipids of the oils of the fruit and leaves of Hippophaë rhamnoides. Khimiya Prirodnykh Soedinenii, 6, 710-715. Manninen, P., Laakso, P., & Kallio, H. (1995). Method for characterization of triacylglycérols and fat soluble vitamins in edible oils and fats by supercritical fluid chromatography. Journal of the American Oil Chemists Society, 72 (9), 1001-1008. Marin, M., & René, F. (2000). Lyophilisation. Tech. ing., Agroaliment, vol. F2, n F3240, F3240.1-F3240.11. Mellor, J.D. (1978). Fundamentals of freeze-drying. Academic Press, New York. Menon, A.S., & Mujumdar, A.S. (1987). Drying of solids: Principles, classification, and selection of dryers. In Handbook of Industrial Drying, edited by Arun S. Mujumdar. Marcel Dekker, New York. Mingyu, X. (1994). Anticancer effects of and direction research on Hippophae. Hippophae, 7(4), 41-43. Mironov, V.A., Vasil’ev, G.S., Matrosov, V.S., Muzychenko, L.D., Usha, B.V., Kas’yanenko, I.I., & Fel’dshtein, M.A. (1980). Sea buckthorn oil obtained by the extraction method and its biological activity. Khimiko-Farmatsevticheskii Zhurnal, 14 (8), 74-80. Mironov, V.A., Guseva-Donskaya, T.N., Dubrovina, Y.Y., Osipov, G.A., Shabanova, E.A., Nikulin, A.A., Amirov, N.Sh., & Trubitsina, I.G. (1989). Chemical composition and biological activity of extracts from sea buckthorn fruit components. KhimikoFarmatsevticheskii Zhurnal, 23, 1357-1364. Mironov, V.A., Guseva-Donskaya, T.N., Amirov, N.Sh., & Nikulin, A.A. (1989). New technology and pharmacology of sea buckthorn oil production. In Proceedings of International Symposium on Sea Buckthorn (Hippophaë rhamnoides L.), p. 348349, Xian, China. Nikolov, L., & Heilscher, K. (2002). Enzyme-thermal treatment of sea buckthorn (Hippophae ramnoides L.) for producing of oil and juice. Khranitelno-vkusovaPromishlenost, (7), 10-11. Nizhegorodtsev, Y.M., & Umanskii, M.S. (1991). Production of concentrate of sea buckthorn oil involves freezing and thawing sea buckthorn berries, separating juice and flesh, drying and centrifuging. Russian Patent 2076899. Okos, M.R., Narsimhan, G., Singh, R.K., & Weitnauer, A.C. (1992). Food dehydration. In Handbook of Food Engineering, edited by D.R. Heldman and D.B. Lund. Marcel Dekker, New York. Omidbaigi, R., Sefidkon, F., & Kazemi, F. (2004). Influence of drying methods on the essential oil content and composition of Roman chamomile. Flavor and Fragrance Journal, 19, 196-198.

46 Oomah, B.D., Liang, J., Godfrey, D., & Mazza, G. (1998). Microwave heating of grapeseed: Effect on oil quality. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 46, 4017-4021. Oomah, B.D., & Mazza, G. (1999). Health benefits of phytochemicals from selected Canadian crops. Trends in Food Science and Technology, 10(6-7), 193-198. Oomah, D.; Ranatunga, J.; Li, T.S.C.; & Patel, R. (2000). Variations in Nutritional Quality of Sea Buckthorn (Hippophae rhamnoides L.). European Conf. Nutritional Enhancement Plant Foods. Norwichm, UK. Sept. 6-9, 2000. Ozerinina, O.V., Berezhnaya, G.A., Eliseev, I.P., & Vereshchagin, A.G. (1987). Composition and structure of the triacylglycérols of Hippophaë rhamnoides seeds. Khimiya Prirodnykh Soedinenii, 1, 52-57. Pintea, A.; Marpeau, A.; Faye, M.; Socaciu, C.; & Gleizes, M. (2001). Polar lipid and fatty acid distribution in carotenolipoprotein complexes extracted from sea buckthorn fruits. Phytochemical análisis, 12 (5), 293 – 298. Pintea, A., Varga, A., Stepnowski, P., Socaciu, C., Culea, M., & Diehl, H.A. (2005). Chromatographic análisis of carotenol fatty acid esters in Physalis alkekengi and Hippophae rhamnoides. Phytochemical Analysis, 16, 188-195. Raghavan, B., Rao, L., Singh, M., & Abraham, K. (1997). Effect of drying methods on the flavour quality of marjoram (Origanum majorana L.). Nahrung, 41(3), 159–161. Ranjith, A., Sarin Kumar, K., Venugopalan, V.V., Arumughan, C., Sawhney, R.C., & Singh, V. (2006). Fatty acids, tocols, and carotenoids in pulp oil of three sea buckthorn species (Hippophae rhamnoides, H. salicifolia, and H. tibetana) grown in the Indian Himalayas. Journal of the American Oil Chemists Society, 83 (4), 359364. Rongsen, L. (2005). Biochemical characteristics of sea buckthorn (Hippophaë L.). In Sea buckthorn (Hippophaë L.): A Multipropose Wonder Plant, Vol. 2 (V. Singh, Editor –in-Chief, 2005), p. 98-107, Daya Publishing House, New Delhi, India. Rousseau, H. (2002). Développement des techniques de reproduction végétative et essais de cultivars d’argousiers. Rapport projet #0121. Institut de Recherche et Développement en Agroenvironnement (IRDA). 35 p. Rui, L.X., & Gao, Y. (1989). Effects of sea buckthorn oil on lipid peroxidation of guinea pigs erythrocyte membranes. In Proceedings of International Symposium on Sea Buckthorn (Hippophaë rhamnoides L.). p. 358-364, Xian, China. Sabir, S.M., Maqsood, H., Ahmed, S.D., Shah, A.H., & Khan, M.Q. (2005). Chemical and nutritional constituents of sea buckthorn (Hippophae rhamnoides ssp. turkestanika) berries from Pakistan. Italian Journal of Food Science, 17 (4), 455-462. Schroeder, W.R., & Yao, Y. (1995). Sea buckthorn: a promising multipurpose crop for Saskatchewan. Praire Farm Rehabilitation Administration, Agriculture and AgriFood Canada. 10 p. Sefidkon, F., Abbasi, K., & Khaniki, G.B. (2006). Influence of drying and extraction methods on yield and chemical composition of the essential oil of Satureja hortensis. Food Chemistry, 99, 19-23. Singh, V. (2003). Geographical adaptation and distribution of sea buckthorn (Hippophaë L.) resources. In Sea buckthorn (Hippophaë L.): A Multipropose Wonder Plant, Vol. I (V. Singh et al., Eds., 2003), p. 21-34, Indus Publishing Company, New Delhi 110027, India.

47 Singh, V. (2005). Free radicals, diseases, anti-oxidants and anti-oxidant properties of sea buckthorn (Hippophaë rhamnoides L.). In Sea buckthorn (Hippophaë L.): A Multipropose Wonder Plant, Vol. 2 (V. Singh, Editor –in-Chief, 2005), p. 3-69, Daya Publishing House, New Delhi, India. Solonenko, L.P., & Privalov, G.F. (2005). Amino acids and other nutrients of Siberian sea buckthorn fruit. In Sea buckthorn (Hippophaë L.): A Multipropose Wonder Plant, Vol. 2 (V. Singh, Editor –in-Chief, 2005), p. 263-271, Daya Publishing House, New Delhi, India. Spitz, D.R., Kinter, M.T., Kehrer, J.P., & Roberts, R.J. (1992). The effects of monosaturated and polyunsaturated fatty acids on oxygen-toxicity in cultured-cell. Pediatric Research, 32 (3), 366-372. Stastova, J., Jez, J., Bartlova, M., & Sovova, H. (1996). Rate of the vegetable oil extraction with supercritical CO2 – III. Extraction from Sea Buckthorn. Chemical Engineering Science, 51 (18), 4347-4352. Süleyman, H., Demirezer, L.Ö., Büyükokuroglu, M.E., Akcay M.F., Gepdiremen, A., Banoglu, Z.N., & Göçer, F. (2001). Antiulcerogenic effect of Hippophaë rhamnoides L. Phytotherapy Research, 15 (7), 625-627. Süleyman, H., Gumustekin, K., Taysi, S., Keles, S., Oztasan, N., Aktas, O., Altinkaynak, K., Timur, H., Akcay, F., Akar, S., Dane, S., & Gul, M. (2002). Beneficial effects of Hippophaë rhamnoides L. on nivotine induced oxidative stress in rat blood compared with vitamin E. Biological & Pharmaceutical Bulletin, 25 (9), 11331136. Tiitinen, K.M., Hakala, M.A., & Kallio, H.P. (2005). Quality components of sea buckthorn (Hippophaë rhamnoides) varieties. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 53 (5), 1692-1699. Tolkachev, O.N., & Sheichenko, O.P. (2005). Flavonoids of sea buckthorn (Hippophaë rhamnoides L.): Chemistry and pharmacology. In Sea buckthorn (Hippophaë L.): A Multipropose Wonder Plant, Vol. 2 (V. Singh, Editor –in-Chief, 2005), p. 159-167, Daya Publishing House, New Delhi, India. Tsybikova, D.Ts., Rasputina, D.B., & Komissarenko, N.F. (2005). Flavonoids and other biologically active substances of sea buckthorn leaves. In Sea buckthorn (Hippophaë L.): A Multipropose Wonder Plant, Vol. 2 (V. Singh, Editor –in-Chief, 2005), p. 168-176, Daya Publishing House, New Delhi, India. Ul’chenko, N.T., Zhmyrko, T.G., Glushenkova, A.I., & Mudakhaev, Y.M. (1995). Lipids of Hippophaë rhamnoides pericarp. Chesmistry of Natural Compounds, 31 (5), 565567. Vlase, L., Olah, N., & Marculescu, A. (2006). The study of tocopherols from different sea buckthorn and wheat germ extracts. Revista de Chimie, 57 (3), 320-322. Willimas, M.A. (1997). Extraction of lipids from natural sources. In Lipid Technologies and Applications, edited by Frank D. Gunstone & Fred B. Padley, p. 113-135, Marcel Dekker, Inc., New York, USA. Wu, D., & Meng, Z. (2003). Effect of sulfur dioxide inhalation on the glutathione redox system in mice and protective role of sea buckthorn seed oil. Archives of Environmental Contamination and Toxicology, 45 (3), 423-428.

48 Xu, M., Xiaoxuan, S., & Jinhua, C. (2001). The medicinal research and development of sea buckthorn. In Proceedings of International Workshop on Sea Buckthorn (pp. 12-23), February 18-21, 2001, New Delhi, India. Yakimishen, R. (2004). An evaluation of oil extraction technologies for sea buckthorn seed and pulp oils. Unpublished M.Sc. thesis. Department of Biosystems Engineering, University of Manitoba, Winnipeg, MB. Yakimishen, R., Cenkowski, S., & Muir, W.E. (2005). Oil recoveries from sea buckthorn seeds and pulp. Applied Engineering in Agriculture, 21 (6), 1047−1055. Yamori, Y., Nara, Y., Tsubouchi, T., Sogawa, Y., Ijeda, K., & Horie, R. (1986). Dietary prevention of stroke and its mechanisms in stroke-prone spontaneously hypertensive rats – Preventive effect of dietary fiber and palmitoleic acid. Journal of Hypertension, 4, S449-S452, Suppl. 3. Yang, B., Kalimo, K.O., Mattila, L.M., Kallio, S.E., Katajisto, J.K., Peltola, O.J., & Kallio, H.P. (1999). Effects of dietary supplementation with sea buckthorn (Hippophaë rhamnoides) seed and pulp oils on atopic dermatitis. Journal of Nutritional Biochemistry, 10 (11), 622-630. Yang, B., Kalimo, K.O., Tahvonen, R.L., Mattila, L.M., Katajisto, J.K., & Kallio, H.P. (2000). Effects of dietary supplementation with sea buckthorn (Hippophaë rhamnoides) seed and pulp oils on the fatty acid composition of skin glycerophospholipids of patients with atopic dermatitis. Journal of Nutritional Biochemistry, 11 (6), 338-340. Yang, B., & Kallio, H. P. (2001). Fatty acid composition of lipids in sea buckthorn (Hippophaë rhamnoides L.) berries of different origins. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 49 (4), 1939-1947. Yang, B., Karlsson, R.M., Oksman, P.H., & Kallio, H.P. (2001). Phytosterols in sea buckthorn (Hippophaë rhamnoides L.) berries: Identification and effects of different origins and harvesting times. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 49 (11), 5620-5629. Yang, B., & Kallio, H. (2002). Effects of Harvesting Time on Triacylglycerols and Glycerophospholipids of Sea Buckthorn (Hippophaë rhamnoides L.) Berries of Different Origins. Journal of Food Composition and Analysis, 15 (2), 143-157. Yang, B., & Kallio, H. (2002a). Composition and physiological effects of Sea Buckthorn (Hippophaë) lipids. Trends in Food Science and Technology, 13 (5), 160-167. Yang, B., & Kallio, H. (2005). Lipophilic components of sea buckthorn (Hippophaë rhamnoides L.) seeds and berries. In Sea buckthorn (Hippophaë L.): A Multipropose Wonder Plant, Vol. 2 (V. Singh, Editor –in-Chief, 2005), p. 70-97, Daya Publishing House, New Delhi, India. Yang, B., & Kallio, H. (2005a). Physiological effects of sea buckthorn (Hippophaë rhamnoides) fruit pulp and seed oils. In Sea buckthorn (Hippophaë L.): A Multipropose Wonder Plant, Vol. 2 (V. Singh, Editor –in-Chief, 2005), p. 363-389, Daya Publishing House, New Delhi, India. Yin, J., Sun, X., Ding, X., & Liang, H. (2003). Modeling of supercritical fluid extraction from Hippophae rhamnoides L. seeds. Separation Science and Technology, 38 (16), 4041–4055.

49 Yin, J.Z., Wang, A.Q., Wei, W., Liu, Y., & Shi, W.H. (2005). Analysis of the operation conditions for supercritical fluid extraction of seed oil. Separation and Purification Technology, 43 (2), 163-167. Zadernowski R, Naczk M, & Amarowicz R. (2003). Tocopherols in sea buckthorn (Hippophaë rhamnoides L.) berry oil. Journal of the American Oil Chemists Society, 80 (1), 55-58. Zeb, A. (2004). Chemical and nutritional constituents of sea buckthorn juice. Pakistan Journal of Nutrition, 3 (2), 99–106. Zhao, Y. (1994). Clinical effects of Hippophaë seed oil in the treatment of 32 burn cases. Hippophaë, 7 (3), 36-37. Zhmyrko, T.G., Goncharova, N.P., Gigienova, É.I., & Glushenkova, A.I. (1984). Group composition of the neutral lipids in the oil of the fruit of Hippophaë rhamnoides. Chemistry of Natural Compounds, 20 (3), 279-284.

Chapitre 2 Hypothèses et objectifs de recherche
2.1. Hypothèses
L’application de différentes méthodes de déshydratation, comme étape de prétraitement des fruits d’argousier, aurait un effet sur le rendement de l’extraction de leurs huiles. L’absence d’oxygène durant la lyophilisation serait un facteur qui contribuerait à améliorer la qualité des extraits lipidiques des fruits d’argousier.

2.2. Objectif général
Comparer les effets de la lyophilisation et du séchage à l’air, comme des opérations de déshydratation des fruits d’argousier, sur le rendement d’extraction et la qualité de leurs huiles, en utilisant l’hexane comme solvant.

2.3. Objectifs spécifiques
• Déterminer les rendements d’extraction des huiles des graines et de la pulpe de l’argousier séchés à l’air chaud et lyophilisés, et analyser les différences causées par ces deux méthodes de déshydratation. • Étudier les effets de la température et du ratio soluté/solvant, sur les rendements des extractions, utilisant l’hexane comme solvant. Analyser les données et déterminer les conditions d’extraction optimales. • Analyser par chromatographie gazeuse les huiles issues des graines et de la pulpe de l’argousier séchés à l’air et lyophilisés, pour déterminer leur composition en acides gras et leur contenu en triglycérides, et établir les différences par rapport à la méthode de déshydratation.

51 • Fractionner les lipides à l’aide de l’extraction en phase solide, et déterminer la composition en acides gras de chacune des fractions obtenues. • Déterminer les profils de fusion des huiles et leurs teneurs en gras solide (SFC) en fonction de la température, en utilisant la calorimétrie différentielle à balayage (DSC). • • Estimer l’état d’oxydation des huiles, à l’aide de l’indice de peroxyde. Comparer les données obtenues avec ceux rapportées pour d’autres espèces et sousespèces.

Chapitre 3 Effects of Drying Method on the Extraction Yields and Quality of Oils from Sea Buckthorn (Hippophaë rhamnoides L.) Seeds and Pulp
Luis-Felipe Gutiérrez, Cristina Ratti and Khaled Belkacemi* Soils and Agri-Food Engineering Department, Nutraceuticals and Functional Foods Institute (INAF), Université Laval, Québec, G1K 7P4, Canada *Corresponding author. Phone: 418-656-2131, ext. 6511. Fax: 418-656-3327. E-mail: khaled.belkacemi@sga.ulaval.ca Submitted to Food Chemistry Ce chapitre, rédigé sous forme d’article décrit les travaux réalisés et les résultats obtenus, concernant les effets de deux méthodes de séchage (lyophilisation et séchage à l’air chaud) sur les rendements d’extraction et la qualité des huiles obtenues des fruits de l’argousier, utilisant l’hexane comme solvant.

3.1 Résumé
Les huiles d’argousier (Hippophaë rhamnoides L.) ont été reconnues pour leurs propriétés nutraceutiques. Les effets du séchage à l’air et de la lyophilisation sur les rendements d’extraction et la qualité des huiles des graines et de la pulpe d’argousier (cv. IndianSummer) ont été étudiés. Les extractions ont été effectuées en utilisant l’hexane. Les graines séchées à l’air et celles lyophilisées ont donné des rendements d’extraction semblables (∼12% p/p), tandis que des différences significatives ont été trouvées entre les rendements d’extraction des pulpes séchées à l’air et lyophilisées (35.9±0.8 contre 17.1±0.6% p/p). L’analyse des acides gras a révélé que les acides α-linolénique (37.239.6%), linoléique (32.4-34.2%) et oléique (13.1%) furent les principaux acides gras trouvés dans les extraits des graines, alors que les extraits des pulpes furent riches principalement en acides palmitoléique (39.9%), palmitique (35.4%) et linoléique (10.6%). Le fractionnement des huiles brutes, fait par extraction en phase solide, a donné

53 principalement des lipides neutres (93.9-95.8%). Les indices de peroxyde des huiles des graines et des pulpes furent d’environ 1.8 et entre 3.0 et 5.4 meq/kg, respectivement. Les profiles de fusion des huiles ont été caractérisé par calorimétrie différentielle à balayage. Le protocole expérimental de ce projet s’est divisé en trois étapes, comme le montre la Figure 3.1.: Le prétraitement des fruits, l’extraction des huiles, et finalement, leur caractérisation.
Conditionnement des échantillons avant l'extraction
Fruits d'argousier congelés Broyage

Lyophilisation

Séchage à l'air chaud

Broyage

Broyage

Tamisage

Tamisage

Pulpe Broyage

Graines Broyage

Pulpe Broyage

Graines

Broyage

Extraction avec l'hexane

Extraction avec l'hexane

Extraction avec l'hexane

Extraction avec nl'hexane

Extraction des huiles

Pulpe lyophilisée lixiviée

Miscella de la pulpe lyophilisée

Graines lyophilisée s lixiviées

Miscella des graines lyophilisées

Pulpe séchée à l'air lixiviée

Miscella de la pulpe séchée à l'air

Graines séchées à l'air lixiviées

Miscella des graines séchées à l'air Opération de séparation du solvant Huile des graines séchées à l'air

Opération de séparation du solvant Huile de la pulpe lyophilisée

Opération de séparation du solvant Huile des graines lyophilisées

Opération de séparation du solvant Huile de la pulpe séchée à l'air

Solvant

Solvant

Solvant

Solvant

Caractérisation des huiles

Analyse des huiles

Indice de peroxyde

Fractionnement des lipides

Composition en acides gras

Composition en triglycérides

Propriétés de fusion et SFC

Figure 3.1. Méthodologie suivie pour extraire et caractériser les huiles de l’argousier.

54

3.2 Abstract
The effects of air-drying and freeze-drying on extraction yields and quality of oils from sea buckthorn (cv. Indian-Summer) seeds and pulp were studied. Oil extractions were carried out using hexane. Air-dried (ADS) and freeze-dried (FDS) seeds, gave a similar extraction yields (∼12%w/w), whereas those of air-dried (ADP) and freeze-dried (FDP) pulps were significantly different (35.9±0.8 vs. 17.1±0.6%w/w). Fatty acid analysis revealed that αlinolenic (37.2-39.6%), linoleic (32.4-34.2%) and oleic (13.1%) acids were the main fatty acids in seed oils, while pulp oils were rich in palmitoleic (39.9%), palmitic (35.4%) and linoleic (10.6%) acids. Lipid fractionation of crude oils, obtained by solid phase extraction (SPE), yielded mainly neutral lipids (93.9-95.8%). The peroxide values of seed and pulp oils were circa 1.8 meq/kg and between 3.0-5.4 meq/kg respectively. The melting behavior of oils was characterized by differential scanning calorimetry (DSC). Keywords: Sea buckthorn, Hippophaë rhamnoides, oil extraction, freeze-drying, airdrying, melting profiles, fatty acids, triglycerides, solid phase extraction.

3.3 Introduction
Sea buckthorn berries are rich in vitamins, carotenoids, flavonoids, proteins, antioxidants, amino acids, essential fatty acids, and phytosterols (Beveridge, Li, Oomah & Smith, 1999). The most valuable components of the berries are their oils. Both seeds and berry pulp have high total lipid content, including tocopherols, tocotrienols, carotenoids and two essential fatty acids: ω-3 and omega-6 (Yang & Kallio, 2002). The composition of the sea buckthorn seed and pulp oils vary according to the subspecies, origins, cultivation activities, harvesting time of the berries, and the extraction method (Yang & Kallio, 2002a). The seed oil is highly unsaturated, with proportions of linoleic (C18:2n-6) and α-linolenic (C18:3n3) acids between 30-40% and 20-35% respectively, whereas the pulp oil is more saturated containing high amounts of palmitoleic (C16:1n-7, 16-54%) and palmitic acids (C16:0, 1747%) (Yang & Kallio, 2002).

55 Solvent extraction using hexane and supercritical CO2 extraction are among the main methods used for sea buckthorn oil extraction, although aqueous extraction and pressing are also used. Recently, Yakimishen, Cenkowski, & Muir (2005) reported for sea buckthorn berries cv. Indian-summer, seed oil recoveries of 7.2% and 4.5% using supercritical CO2 extraction and screw pressing respectively, and a pulp-flake oil recovery of 17% for supercritical CO2 extraction. Moreover, low recovery of pulp oil (1.2%) was obtained by aqueous extraction. Oil extraction involves various preliminary operations, such as cleaning, dehulling, drying and grinding. However, the total amount of extracted oil depends mainly on the extraction time and temperature, moisture content and particle size of the oil-bearing materials. The greatest amount of oil is extracted during the first 20 minutes of extraction, and as moisture content decreases, oil recovery increases (Bernardini, 1982). Drying methods have different effects on microstructure and quality of dehydrated products. Freeze-dried food materials remain a benchmark quality because of the structure preservation during removing water (Aguilera, Chiralt & Fito, 2003), contrary to the significant structural changes caused by air-drying. Oomah, Liang, Godfrey, & Mazza (1998) studied the effects of microwave-drying and air-drying on the physical and chemical properties of oil from grape seeds. They found that microwave drying increased oil yield, viscosity, peroxide value and conjugated dienes, whereas p-anisidine and saponification values were reduced. Other studies have showed that drying methods have significant effects on oil extraction efficiency, physical properties and chemical compositions of aromatic plants (Raghavan, Rao, Singh & Abraham, 1997; Omidbaigi, Sefidkon & Kazemi, 2004; Hsu, Chen, Weng, & Tseng, 2003). The effects of dehydration method, as a pretreatment operation to oil extraction, on extraction yields and quality from sea buckthorn berries have hardly been investigated. Therefore, this research aimed to evaluate these effects for two drying methods: air-drying and freeze-drying.

56

3.4 Materials and methods
3.4.1 Berries
Sea buckthorn berries (Hippophaë rhamnoides L. cv. Indian-Summer) from Sainte-Annede-Beaupré (Québec, Canada) were hand-cleaned and stored at -30ºC in sealed plastic bags until the beginning of the experiments. Before drying, batches of 400 g of frozen berries were ground only for 60 s to avoid possible seed damage, using a blender (model PR200B, General Electric, USA).

3.4.2 Air-drying experiments
Frozen ground berries were placed in a perforated drying tray. Starting with approximately 900 g berries, air-drying experiments were conducted at 50ºC and 1.0 m/s air velocity for 24 h, using a laboratory tray drier (Model UOP8-G, Armfield, Hampshire England). The dried product was crushed in a mortar to facilitate the separation of seeds from the pulp. Special caution was kept to avoid seeds damage. A 10 mesh (2 mm) sieve (Canadian Standard Sieve Series, W.S. Tyler, St Catharines, ON, Canada) was used to separate most seeds from dried pulp. Pulp residues adhered to seeds, were hand-separated and crushed in a mortar. Air-dried seeds were cleaned and subsequently milled using a disc-grinder (Type C/11/1, GlenMills Inc., Clifton, New Jersey, USA). Particle size distribution was measured using a sieve shaker (model 41314, Retsch Inc., Newtown, PA, United States). Both airdried pulp (ADP) and seeds (ADS) were stored at -20ºC in plastic containers until oil extraction.

3.4.3 Freeze-drying experiments
Frozen ground berries were laid in layers of approximately 2-cm thickness in aluminum trays covered with perforated aluminium paper. Freeze-drying experiments were carried out in a freeze-drier (model Ultra 25 LE, Virtis, Gardiner, NY, USA) at constant temperature of 50ºC for 24 h, under vacuum pressure of 0.0145 kPa and a condenser temperature of -48ºC.

57 After freeze-drying, the samples were immediately stored under vacuum in plastic bags, using a vacuum apparatus (Model 350, SIPROMAC Inc., St-Germain, QC, Canada), until sieving under an anhydrous atmosphere in an Atmos-bag (model Z106089-1EA, Aldrich Atmosbag, Sigma-Aldrich, Oakville, ON, Canada). Freeze-dried samples were sieved using a 10 mesh screen allowing the separation of seeds from the pulp and obtaining uniform size pulp particles. Freeze-dried seeds were cleaned manually and subsequently milled, sieved and stored as described above for air-dried seeds.

3.4.4 Total lipid content of starting materials
Total lipids were extracted from ground materials using the chloroform-methanol extraction procedure adapted from Christie (1982). Dried samples were homogenized for 5 min with chloroform/methanol (1:1 v/v) in proportion 1/10 m/v. The mixture was filtered, and the obtained solid residue homogenized with chloroform in proportion 1/5 m/v for 5 min. The filtrate was transfered into a separatory funnel and the solid was extracted once again under the same conditions and filtered. Distilled water was added to the combined filtrates and the resulted mixture was thoroughly shaken and settled overnight. The lower layer containing the lipids was removed from the funnel, and subsequently, the solvent was evaporated on a rotary film evaporator (Büchi R-205, Cole-Parmer, Vernon Hills, Illinois USA). The obtained crude lipid extracts were collected, evaporated under nitrogen, weighed, and stored in sealed amber glass vials at -20ºC until lipid analysis.

3.4.5 Oil extraction with solvent
Oil extraction was conducted at 30, 40, 50 and 68ºC using hexane as solvent and three solid to solvent ratios (R): 1/4, 1/7 and 1/14 m/v. A Soxhlet extractor was used for the extractions carried out at 68ºC, whereas extractions at 30, 40 and 50ºC were achieved in sealed erlenmeyer flasks under continuous agitation (400 rpm) for 24 h, using a thermoregulated bath. After the extraction process, the flask contents were filtered under vacuum, and the liquid fraction containing lipid extract and solvent was poured into a 500mL flask of a rotary film evaporator to remove the solvent. The extracts were treated as

58 described above for total lipid content. For each dried product, the oil extraction yield (%w/w) and the extraction efficiency were calculated using Eq. 1 and 2 respectively. Oil extraction yield (% ) = Mass of extracted oil ( g ) × 100 Mass of oil − bearing material ( g ) Oil extraction yield Total lipid content (Eq. 1)

Extraction efficiency =

(Eq. 2)

3.4.6 Analytical methods
3.4.6.1 Melting profiles Melting profiles of the seed and pulp oils were determined using a differential scanning calorimeter (Pyris 1 DSC, Perkin Elmer, Norwalk, CT, USA) equipped with an intracooler II (Perkin Elmer, Norwalk, CT, USA). The system was purged during analysis with nitrogen at 30 mL/min. DSC melting curves were performed within the temperature ranges of -60 to 30ºC and -50 to 50ºC for seed and pulp oils respectively. Samples (10-20 mg) were cooled and held at the lowest temperatures for 5 min and then heated at 4ºC/min. An empty pan was used as inert reference to balance the heat capacity of the sample pan. Calibration of DSC was carried out using indium (mp=156.6ºC, ∆Hf =28.71 J/g). Data were analyzed using thermal analysis software (Pyris 1 Version 3.5, Perkin Elmer). The solid fat index (SFI) was determined from the DSC melting curves by sequential integration of peak areas (Deroanne, 1977; Lambelet, 1983).

3.4.6.2 Lipid fractionation Separation of individual lipid fractions was achieved using solid-phase extraction (SPE) cartridges (Bakerbond SPE amino [NH2] disposable extraction columns,J.T. Baker Inc., Phillipsburg, NJ, USA) as described by Oomah, Ladet, Godfrey, Liang, & Girard (2000). The cartridges were preconditioned with 2-mL methanol, 2-mL chloroform, and 4-mL hexane before use. Lipid fractions were recovered by sequential elution under vacuum with

59 4-mL each of chloroform/isopropanol (2/1, v/v), diethyl ether/acetic acid (95/5, v/v), and methanol, to separate neutral lipids, free fatty acids and phospholipids, respectively. The collected eluted fractions were evaporated under nitrogen, weighed, and stored at -20ºC for subsequent fatty acid analysis.

3.4.6.3 Fatty acid composition The fatty acid composition of the oil extracts was determined by GC. Seed and pulp oils were converted into their methyl esters (FAME) and analyzed on a 5890 series II gas chromatograph (Hewlett-Packard, Palo Alto, CA). The oven temperature was programmed as follows: from 60ºC (isothermal for 1 min) to 190ºC at 20ºC/min, and isothermal period of 30 min at 190ºC. The injector and detector temperatures were set at 250°C. Hydrogen was used as carrier gas. GC separation peaks was performed on a BPX-70 capillary column (60 m×0.25 mm i.d.×0.25 µm film thickness; SGE, Melbourne, Australia). Fatty acids were identified by comparing their retention times with those of the FAME standards purchased from Nu Chek Prep (Elysian, MN, USA) under the same conditions. Peaks were integrated using Hewlett-Packard ChemStation software.

3.4.6.4 Triglyceride composition A gas chromatography (GC) method was used for the determination of the triglyceride composition (TAG) of the oil extracts. Seed and pulp oils were dissolved in octane and analyzed on a 5890 gas chromatograph (Hewlett-Packard, Palo Alto, CA). The oven temperature was programmed as follows: from 250ºC to 350ºC at 1.5ºC/min, from 350ºC to 360ºC at 0.5ºC/min, and isothermal period of 90 min at 360ºC. Injector and detector temperatures were set at 400°C. Hydrogen was used as carrier gas. The GC separation method was performed on a RTX-65TG capillary column (30 m×0.25 mm i.d.×0.1 µm film thickness; Resteck, Bellefonte, PA, USA). The identification of the peaks was achieved by comparing their retention times with those of the standards purchased from Nu Chek Prep (Elysian, MN, USA) and Sigma-Aldrich (Sigma, St. Louis, MO, USA) under the same conditions. Peaks were integrated using Hewlett-Packard ChemStation software.

60 3.4.6.5 Peroxide value Peroxide values of the extracted oils were determined according to Official methods of the AOCS (1993) (AOCS Recommended Practice Cd 8b-90).

3.4.6.6 Scanning electron micrographs Microstructure observations of ADP and FDP were carried out using scanning electron microscopy (JEOL, Model JSM-6360LV, Tokyo, Japan) operated under vacuum at an accelerating voltage of 30 kV.

3.4.7 Statistical analysis
All assays were carried out at least in duplicate. Analysis of variance by the general linear models (GLM) procedure and mean comparisons by the least significant difference (LSD) test were performed using the Statistical Analysis System (SAS Institute, 2000).

3.5 Results and discussion
3.5.1 Moisture content of the sea buckthorn materials.
Moisture content of fresh pulp and seeds were 87.6±0.0% and 5.5±0.2% respectively. After drying operations the average values of moisture content were 2.6±0.2% and 1.5±0.3% for ADP and FDP respectively, while no significant effects were found on the moisture content of seeds, in comparison to their initial value.

3.5.2 Total lipid of the sea buckthorn materials
Chloroform-methanol extraction was used to determine the total lipid content of the starting materials. Significant differences were found between the total lipid content of ADP and FDP (35.8±0.8 vs. 16.4±0.5%w/w, p<0.001), whereas no significant differences were

61 observed for ADS and FDS (11.1±0.0 vs. 13.1±0.8%w/w). Results of lipid content of seeds are in agreement with those reported by Yakimishen (2004) for the cultivar Indian-summer, and by Kallio, Yang, Peippo, Tahvonen, & Pan (2002) and Yang & Kallio (2001) for the subspecies mongolica and rhamnoides. The lipid content of FDP was at the lower end of the expected range reported previously by Yang & Kallio (2002) for different subspecies of Hippophaë rhamnoides, whereas lipid yields from ADP were at the higher up of these reported values (Table 3.1). Table 3.1. Lipid content in sea buckthorn dry pulp of different subspecies of Hippophaë rhamnoides Subspecies Indian-summer Caucasica Turkestanica Mongolica Sinensis Rhamnoides
a

Lipid content (%) 16.4±0.5a, 35.8±0.8b 19.7±2.3 23-34 18-34 16-28 4-20 16.6-18.9

Ref. This work
(Yakimishen, Cenkowski, & Muir, 2005) (Yang & Kallio, 2002) (Yang & Kallio, 2002) (Yang & Kallio, 2002) (Yang & Kallio, 2002) (Yang & Kallio, 2001)

FDP, b ADP.

Differences in the lipid content of sea buckthorn berries may be attributed to the different subspecies, geographical and climate conditions, harvesting time of the berries, as well as the extraction method (Yang & Kallio 2002a). Nevertheless, the marked difference between oil recovery from ADP and FDP found in this work could be due to the drying effects on pulp cellular microstructure. Figures 3.2a and 3.2b show the scanning electron micrographs of air- and freeze-dried sea buckthorn pulps, respectively. As evidenced, air-drying (Figure 3.2a) caused significant structural changes on pulp cells, contrary to freeze-drying (Figure 3.2b). It can be observed that the size and shape of air-dried pulp cells were irregular while freeze-dried pulp cells exhibited a regular shape and size. Moreover, the diameter and perimeter of ADP cells were larger than FDP cells. Air-drying caused breakage and

62 destruction of cell walls, and consequently large cavities and intercellular spaces were formed. On the other hand, no broken cell walls were observed in freeze-dried pulp. Since mass-transfer through the solid matrix is usually the rate-controlling step in food extractions (Aguilera & Stanley, 1999), and because of the almost negligible cellular damage of FDP, the resistance to oil diffusion is bigger than in ADP. This behavior could explain the differences found in oil recoveries from ADP and FDP.

(a)

(a)

(b)

(b)

Figure 3.2. Scanning electron micrographs of: (a) air-dried (ADP) and (b) freeze-dried (FDP) sea buckthorn pulps.

3.5.3 Oil extraction using solvents
Sea buckthorn seed and pulp oils were bright yellow and dark red respectively. Both oils were liquid at room temperature. The pulp oil was more viscous than seed oil. This could be ascribed to its more saturated nature, as it will be shown later. Extraction yields of oils

63 from ground seeds and pulps were primarily monitored over time at 68ºC, using the Soxhlet extractor with a solid to solvent ratio R of 1/4. The Figure 3.3 depicts the oil extraction kinetics from air- and freeze-dried sea buckthorn seeds and pulps. Once again, the oil recovery from ADS and FDS was similar, whereas the oil extraction yield obtained from air-dried pulp was more than two folds of that attained from freeze-dried pulp. The airdrying process introduced some structural changes in the shape of cells, and even destroyed them, allowing to the cellular substances, including lipids to be easily extracted. In contrast, the regular structure of FDP cells exerted a transfer resistance to an adequate diffusion of the solvent through the cell membrane.

40 35

Extraction yield (% w/w)

30 25 20 15 10 5 0 0 50 100 150 200

FDP ADP ADS FDS

250

Extraction time (min)
Figure 3.3. Oil extraction kinetics from air-dried and freeze-dried sea buckthorn seeds and pulps using the Soxhlet extractor with hexane (R=0.25 g/mL).

64 As depicted in Figure 3.3, extractions reached equilibrium at about 4 hours. This extraction time was then chosen to evaluate the effect of solid to solvent ratio on oil extraction yields from air- and freeze-dried materials using the Soxhlet extractor (Table 3.2). There was a slight increase in the extraction yield from ADS as the R ratio decreased from 1/4 to 1/14 g/mL (11.2±0.1 vs. 12.4±0.1 %w/w, p<0.05), whereas this ratio did not show significant differences on oil extraction yields from FDS, FDP and ADP, where their average values were 13.1±0.9, 17.1±0.6 and 35.9±0.8 %w/w, respectively. These results did not differ significantly from those obtained with chloroform-methanol, indicating a low content of polar lipids, such as phospholipids, in the investigated sea buckthorn materials. Table 3.2. Oil recoveries from air- and freeze-dried sea buckthorn seeds and pulp using the Soxhlet extractor with hexane during 4 hours, over various solid to solvent ratios a R (g/ml) 1/4 1/7 1/14
a

Oil recovery (% w/w) FDS 12.1±0.6a 13.7±0.2a 13.5±0.4a ADS 11.2±0.1a 11.9±0.3b 12.4±0.1b FDP 16.4±0.7a 17.2±0.1a 17.6±0.0a ADP 35.9±3.9a 35.2±1.7a 36.7±2.9a

Means in a column followed by the same letter are not significantly different by LSD test at the 5% level.

To investigate the temperature effect on the extraction efficiency of oils, equilibrium data were obtained at 30, 40 and 50ºC, after extraction times of c.a. 24 h. For each temperature, the dried sea buckthorn materials were mixed continuously with hexane in sealed erlenmeyer flasks, using 3 levels of R (1/4, 1/7 and 1/14 g/mL). The results indicated that extraction efficiency of oils increased with the increase of temperature and with the decrease of R, as illustrated in Figure 3.4 for FDP. However, the effect of R was more marked than the effect of temperature. When R values decreased, the effect of temperature became less important. Table 3.3 presents the effects of variation of temperature and solidto-solvent ratio on the extraction efficiency of oils from air- and freeze-dried sea buckthorn seeds and pulps. As seen in this Table, there was only an average 4%-increase in the oil

65 extraction efficiency from ADP when the temperature increased from 30 to 50ºC, while this increase was about 15% (p<0.05) when R decreased from 1/4 to 1/14 g/mL. Thus, contrary to Soxhlet extraction, where the oil recoveries were practically not affected by R ratio because of the occurrence of better mass transfer features during the extraction process, extractions carried out in erlenmeyer flasks were more dependent on R ratio than the temperature. Thus, to obtain high yields (greater than 90% of extraction efficiency), and prevent the negative effects of high temperatures on lipids and other valuable components, oil extractions from sea buckthorn seeds and pulp could be carried out at low temperatures, using low R ratios.

1,0 T = 30ºC T = 40ºC T = 50ºC

0,9

Extraction efficiency

0,8

0,7

0,6

0,5 0,0 0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

R (g/mL)
Figure 3.4. Extraction efficiency of oils from freeze-dried pulp, over various ratios of solid to solvent (g/mL), using hexane for 24 hours at three different temperatures.

66 Table 3.3. Effects of variation of temperature (T) and solid to solvent ratio (R), on the extraction efficiency of oils from air- and freeze-dried sea buckthorn seeds and pulpsa. T (ºC) 30 40 50
a

Extraction efficiency (%)b FDS 74.7a 87.9b 87.8b ADS 80.2a 80.4a 91.0b FDP 71.4a 76.3b 82.1c ADP 81.6a 84.1a 85.3a

R (g/mL) 1/4 1/7 1/14

Extraction efficiency (%)c FDS 73.1a 84.0b 93.4c ADS 74.5a 85.8b 91.4c FDP 65.2a 76.1b 88.5c ADP 76.6a 83.2b 91.2c

Means in the same column followed by the same letter are not significantly different by LSD test at the 5% level. b Data represent the average of the extraction efficiency values obtained using the three solid to solvent ratios (R): 1/4, 1/7 and 1/14 g/mL. c Data represent the average of the extraction efficiency values obtained at T=30, 40 and 50ºC.

3.5.4 Fatty acid composition
The fatty acid composition of oils from air- and freeze-dried sea buckthorn seeds and pulps is summarized in Table 3.4. No significant differences were found in the fatty acid composition of pulp oils when comparing the two drying methods, where their main components are palmitoleic (Po), palmitic (P) and linoleic (L) acids (∼40%, ∼35% and ∼10%, respectively). Similar values were recently reported for sea buckthorn (cv. Indiansummer) pulp oil (Cenkowski, Yakimishen, Przybylski & Muir, 2006), whereas Yang & Kallio (2001) reported lower concentrations of palmitic (∼27%) and palmitoleic acids (27.2-32.8%), and higher proportions of oleic acid (∼17%), in pulp oils from subspecies sinensis and rhamnoides. Linolenic and α-linolenic acids were the major fatty acids in the sea buckthorn seed oils. Except for stearic and oleic acids, oils from ADS and FDS exhibited quasi-similar composition of fatty acid profiles (See Table 3.4). Oils from FDS were richer in α-linolenic and linoleic acids (39.6% vs. 37.2%, p<0.05 and 34.2% vs. 32.4% p<0.05, respectively), and poorer in palmitic and palmitoleic acids (6.5% vs. 8.0%, p<0.05 and 0.7% vs. 2.8%, p<0.05, respectively) than oils from ADS. Oleic and stearic acids were 13% and 3%, respectively, in both oils from ADS and FDS. These values were corresponds to those reported by Cenkowski, Yakimishen, Przybylski & Muir (2006) with

67 slightly lower linoleic acid content for similar cultivar. However, compared to those of seed oils from subspecies sinensis and rhamnoides (Yang & Kallio, 2001), a lower content of oleic (O) and linoleic (L) acids (13% vs. 18% and ∼33% vs. ∼39% respectively) and a higher amount of α-linolenic (Ln) acid (∼38% vs. 29%) were obtained in our results. Table 3.4. Fatty acid composition (percent of total) of oils from air- and freeze-dried sea buckthorn seeds and pulps, extracted with hexane (30-68ºC). PULP ADP 35.3±1.6 40.1±1.2 1.8±0.2 0.8±0.04 3.2±0.2 6.5±0.5 10.6±0.6 0.9±0.1 FDP 35.5±0.5 39.7±1.2 2.0±0.3 0.9±0.1 3.0±0.4 6.3±0.1 10.6±0.7 1.1±0.2 ADS 8.0±0.5a 2.8±0.5a nd 3.1±0.5 13.1±0.6 2.2±0.1a 32.4±1.0a 37.2±1.4a SEEDS FDS 6.5±0.2 0.7±0.2 nd 2.9±0.03 13.1±0.2 1.9±0.04 34.2±0.3 39.6±0.4

Fatty acid C16:0 (Palmitic) C16:1 (Palmitoleic) C17:0 (Margaric) C18:0 (Stearic) C18:1n-9 (Oleic) C18:1n-7 (Vaccenic) C18:2n-6 (linoleic) C:18:3n-3 (α-linolenic)

nd: Not detected. a p<0.05 between the two drying methods.

Polyunsaturated fatty acids (PUFA) of the seed oils amounted between 70-75% of the total fatty acids, while the monounsaturated (MUFA) and saturated (SFA) fatty acids were about 18% and 11% respectively. These oils, characterized by high ratios of PUFA/MUFA and PUFA/SFA, are prone to the oxidation because of their high content in α-linolenic acid.

3.5.5 Triglyceride composition
Figure 3.5a shows the triglyceride (TAG) composition of oils from ADP and FDP. Significant differences were found in the TAG profiles of pulp oils when comparing the two drying methods. These differences were probably due to the more severe conditions of

68 air-drying introducing some changes in the TAG molecules of ADP. However, pulp oils contain mainly TAG with acyl carbon numbers of 48 and 50, with 1-3 double bonds (C48:2, C48:1, C50:3, C50:2 and C48:3), representing approximately 85% of the total TAGs. Taking into account the fatty acid composition of pulp oils (Table 3.4), C48 molecules (representing more than 50% of the total TAGs) should largely correspond to TAG of three 16-carbon fatty acids. Most of these TAG molecules could mainly be PoPoP, PPPo and PoPoPo. Similarly, C50 molecules (representing about 40% of the total TAGs) would correspond to TAGs with two 16-carbon fatty acids and one 18-carbon fatty acid. In view of these results, the majority of TAGs could correspond principally to PPoL and PPL. The TAG distribution of oils from ADS and FDS is showed in Figure 3.5b. As can be seen in this Figure, seed oils were mainly constituted by TAGs with acyl carbon numbers of 54 and 52, and minor amounts of C48 and C50 molecules, which comprise predominantly 18and 16-carbon fatty acids. As showed in Table 3.4, oils from ADS were richer in palmitic and palmitoleic acids, and poorer in linoleic and α-linolenic acids than oils from FDS. These differences made that the proportions of C54 and C52 TAGs were higher in oils from FDS than in oils from ADS (66% vs. 56%, p<0.01 and 30% vs. 28%, p<0.01 respectively), whereas concentrations of C48 and C50 molecules were higher in oils from ADS than in oils from FDS (8% vs. 1%, p<0.01 and 7% vs. 2%, p<0.01 respectively). Regarding the fatty acid composition of seed oils, C54 and C52 TAGs would be mainly, LLL, LnLnO, OLLn, LLLn, LLO, LLP and PLLn. In general, the TAG compositions of seed and pulp oils obtained in this work were in accordance with those reported by Yang & Kallio (2006) for seeds and berries of sea buckthorn of different subspecies and origins.

69
35 30 25
FDP ADP

(a)

Content (%)

20 15 10 5 0
1 2 3 1 2 3 2 4 3 4 8: 8: 8: 0: 0: 0: 0: 2: 2: 2: C4 C4 C4 C5 C5 C5 C5 C5 C5 C5

25
FDS ADS

20

(b)

Content (%)

15

10

5

0
1 2 3 1 2 3 2 3 4 5 6 3 4 5 6 7 8 8: 8: 8: 0: 0: 0: 2: 2: 2: 2: 2: 4: 4: 4: 4: 4: 4: C4 C4 C4 C5 C5 C5 C5 C5 C5 C5 C5 C5 C5 C5 C5 C5 C5

Figure 3.5. Triglyceride composition of oils from: (a) air- and freeze-dried sea buckthorn pulps, and (b) air- and freeze-dried sea buckthorn seeds.

70

3.5.6 Lipid fractions extracted by SPE
Sea buckthorn seed and pulp oils consisted mainly of neutral lipids (NL) (∼95%), with minor amounts of free fatty acids (FFA) (∼2-4%) and phospholipids (PL) (1-2%) (Tables 3.5 and 3.6). High levels of neutral lipids (92%) have been reported for sea buckthorn seed oil by Zadernowski, NowakPolakowska, Lossow, & Nesterowicz (1997), while similar values for FFA and PL fractions in oils from pumpkin seeds were recently reported (Yoshida, Shougaki, Hirakawa, Tomiyama & Mizushina, 2004). The fatty acid profiles of the NL fractions were very close to the corresponding crude seed and pulp oils, because of the quantitative primacy of this fraction in the oils. However, when comparing the two drying methods, slight differences were found between the fatty acid compositions of oils from ADP and FDP. On the other hand, similar differences observed in the fatty acid profiles of crude seed oils were found in the NL fractions of ADS and FDS. The PL fractions of pulp oils were poorer in palmitic and palmitoleic acids (∼11% and ∼4%, respectively), but much richer in linoleic and α-linolenic acids (∼8% and ∼5%, respectively) than in crude oils (Table 3.5). Significant differences, that could be attributed to the alterations of the cell membrane during air drying, were found in the proportions of linoleic (18.4% vs. 20.5%, p<0.05) and palmitic (25% vs. 22.7%, p<0.05) acids, when comparing the PL fractions of oils from ADP and FDP, respectively. The PL fractions of seed oils were in general richer in linoleic (∼13%), palmitic (∼4%) and stearic (∼3%) acids, and poorer in α-linolenic acid (∼20%), than in crude oils (Table 3.6). Except for linoleic acid, which amounted 45% of the total fatty acids in both oils from ADS and FDS, significant differences in the proportions of the other fatty acids were found in PL fractions when comparing air- and freeze drying methods.

71

Table 3.5. Fatty acid composition (percent of total) in individual lipid fractions of oils from air- and freezedried sea buckthorn pulps, extracted with hexane using the Soxhlet extractor during 4 hours. Oil from ADP NL 95.8±1.3 35.8±0.1a 28.7±1.0 38.2±0.5 2.9±0.0 nd 2.4±0.1 7.6±0.2 13.6±0.3 6.6±1.0 2.4±0.9 8.9±0.3 18.4±0.9a 5.8±0.2 1.6±0.3 3.2±0.3a 34.8±0.7 39.2±0.1 2.0±0.0a 0.9±0.0 3.0±0.0a 6.4±0.0 11.0±0.0a 0.9±0.0a
a

Oil from FDP PL 2.2±0.3 25.0±1.1a 35.2±0.1 39.9±0.1 2.2±0.0 0.9±0.0 2.7±0.0 6.3±0.0 10.8±0.0 1.0±0.0 94.3±0.1 NL FFA 4.0±0.5 27.6±2.2 39.4±0.8 3.1±0.3 nd 2.1±0.1 7.3±0.3 12.7±0.5 6.9±1.8 PL 1.5±0.4 22.7±0.4 35.2±0.7 3.9±0.1 1.2±0.0 1.4±0.1 8.9±0.3 20.5±1.0 5.3±0.2

FFA 1.7±0.8a

Composition (mass%)

C16:0 (Palmitic)

C16:1 (Palmitoleic)

C17:0 (Margaric)

C18:0 (Stearic)

C18:1n-9 (Oleic)

C18:1n-7 (Vaccenic)

C18:2n-6 (linoleic)

C:18:3n-3 (α-linolenic)

nd: Not detected. a p<0.05 between the two drying methods.

72

Table 3.6. Fatty acid composition (percent of total) in individual lipid fractions of oils from air- and freeze-dried sea buckthorn seeds, extracted with hexane using the Soxhlet extractor during 4 hours. Oil from ADS NL 94.3±1.1 8.2±0.06a 2.9±0.1a 2.9±0.0 12.7±0.2 2.2±0.0 31.9±0.4a 37.7±0.4 35.8±1.5a 30.9±0.9a
a

Oil from FDS PL 1.2±0.1 12.2±0.7b 1.9±0.6a 6.5±0.2a 12.6±0.2c 4.9±0.1
a

FFA 2.9±0.2 9.1±0.7b 3.1±0.1c 3.2±0.2a 12.2±0.4b 2.3±0.1
a

NL 93.9±0.6 6.9±0.1 1.4±0.2 3.0±0.1 13.0±0.2 2.0±0.0 33.1±0.5

FFA 2.7±1.9 6.8±0.0 1.4±0.0 3.0±0.0 13.0±0.1 2.0±0.0 32.9±0.3

PL 0.8±0.2 10.0±0.2 0.6±0.2 5.9±0.2 14.2±0.2 4.5±0.1 45.9±0.9

Composition (mass%)

C16:0 (Palmitic)

C16:1 (Palmitoleic)

C18:0 (Stearic)

C18:1n-9 (Oleic)

C18:1n-7 (Vaccenic)

C18:2n-3 (linoleic)

44.4±1.7 15.2±0.1a

C:18:3n-3 (α-linolenic)

38.7±0.7

38.5±0.4

17.4±1.4

a

p<0.05, b p<0.01, c p<0.001 between the two drying methods.

73 In general, for both seed and pulp oils, the fatty acid profiles of PL fractions obtained in this work, are within the range reported for others subspecies of sea buckthorn (Kallio, Yang, Peippo, Tahvonen & Pan 2002; Yang, & Kallio, 2001). Nevertheless, the sea buckthorn (cv. Indian-summer) pulp oils would have a higher content in palmitoleic and palmitic acids, but a lower content in linoleic and α-linolenic acids, compared with subspecies mongolica, sinensis and rhamnoides. Genetic differences among subspecies, as well as geographical conditions, cultivating activities and lipid extraction processes, could explain these differences (Yang & Kallio 2002a). The fatty acid profiles of the FFA fractions of seed and pulp oils were relatively similar to those of crude oils (Tables 3.5 and 3.6). However, lower proportions of palmitic acid (∼7%) and higher amounts of α-linolenic acid (∼6%), were observed in pulp oils. In the case of seed oils, once again the same differences found in the fatty acid compositions of crude oils were observed in the FFA fractions, when comparing the two investigated drying methods. As observed in Tables 3.5 and 3.6, the different conditions of the drying methods used in this work introduced some changes in the fatty acid profiles of individual lipid fractions of the oils. Consequently, their TAG compositions were also affected, as showed in Figures 3.5a and 3.5b.

3.5.7 Peroxide values of the oils
Fresh oils from air- and freeze-dried sea buckthorn seeds and pulps had a peroxide value (PV) of 1.8 and ∼4 meq/kg, respectively, which are lower than those generally found in commercial vegetable oils (≤10 meq/kg). However, the PV of oils from ADP was higher than those from FDP (5.4±0.3 vs. 3.0±1.9 meq/kg). The absence of oxygen during freezedrying of pulp and the effects of the more severe conditions of air-drying could explain these results.

74

3.5.8 Melting profiles
The melting curves of seed oils showed 4 overlapping peaks as depicted in Figure 3.6a. This figure shows one minor low-temperature endothermic transition below -40ºC, followed by one prominent endothermic transition, and two high-temperature endothermic minor peaks at about -24ºC and -15ºC respectively. The main endothermic transition, most likely corresponded to melting of the major TAG groups, C54 TAGs, such as LLL, LnLnO, OLLn, LLLn and LLO. As can be seen in Figure 3.6a, oils from ADS did not show the two higher-temperature peaks as exhibited by FDS oils. Only, a single peak at about -21ºC was depicted. Moreover, the lower-temperature endotherm was broader for oils from ADS than those from FDS. The slight differences between the melting curves could be attributed mainly to the difference in the TAG composition of the oils obtained from air- and freezedried seeds. The melting enthalpies found for oils from ADS and FDS (70.3±5.8 J/g and 64.7±4.7 J/g, respectively) are in agreement with those reported by Tan & Che Man (2002) for various vegetable oils. In Figure 3.6b, the DSC melting curves of oils from ADP and FDP indicate the presence of three major groups of triglycerides melting independently between -30ºC and 20ºC. The more saturated nature of sea buckthorn pulp oils is highlighted in these thermograms. The first low-temperature endotherm (LTE), between -30ºC and -6ºC, could mainly correspond to the melting of unsaturated TAGs such as PPoL, PPL and PoPoPo, whereas the other two middle- and high-temperature endotherms (MTE and HTE), would represent the melting of more saturated TAGs, such as PoPoP and PPPo, representing about 50% of the total TAG in sea buckthorn pulp oils. As depicted in Figure 5b, the main peak of the middletemperature endotherm was followed by two minor transitions prior to the melting of the third group of TAG. Nevertheless, the melting temperature selected for this endotherm corresponded to the main peak. A similar criterion was used for the temperature attribution for the first low-temperature endotherm. Therefore, the melting enthalpies and temperatures of each endotherm are given in Table 3.7. When comparing the two drying methods, there were no significant differences between the melting temperatures of endotherms, being their average values -22.5ºC, -4ºC and 10ºC for the low-, middle- and high-temperature

75 endotherms respectively. The melting enthalpy of the low-temperature endotherm was lower in oils from ADP than in those from FDP (19.4 J/g vs. 25.6 J/g, p<0.01), whereas melting enthalpies for the middle- and high-temperature endotherms were about 10 J/g and 40 J/g. The different TAG profiles observed in oils from ADP and FDP could explain the differences found between the melting enthalpies of the low-temperature endotherms. On the other hand, according to Timms (1980), the large area of the highest melting peak would partly due to the higher heat of melting of the TAG groups corresponding to this endotherm. Another reason which could explain this situation is connected to the presence of high melting triglycerides crystallizing together with lower melting triglycerides in a quasi-stable mixture. Table 3.7. Thermal characteristics of sea buckthorn pulp oils ADP LTE Tm (ºC) ∆Hm (J/g)
a

FDP HTE 9.9±1.5 40.4±8.9 LTE -22.4±0.6 25.6±2.4 MTE -3.4±0.4 10.2±1.7 HTE 10.9±0.4 40.6±1.9

MTE -4.4±0.9 9.5±2.9

-23.0±0.6 19.4±2.8a

p<0.01 between the two drying methods. Tm: Melting temperature. ∆Hm : Melting enthalpie.

The solid fat indices (SFI) of the sea buckthorn seeds and pulp oils, calculated from their corresponding thermograms by sequential peak integration areas, indicated that SFI decreased as temperature increased (Figures 3.7a and 3.7b). Once again, it can be noticed in these curves the differences found in the TAG profiles of both seed and pulp oils. Seed oils melted completely at temperatures around 0ºC, because of their high unsaturated nature, whereas complete melting of TAGs is achieved above 20ºC for pulp oils, confirming their more saturated nature.

76
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 -60 -50 -40 -30 -20 -10 0 10 20 30

FDS ADS

(a)

H t fl d d
H t fl d d

Temperature (°C)
0 1 2 3 4 5 6 -50 -40 -30 -20 -10 0 10 20 30 40 50

FDP ADP

(b)

Temperature (°C)

Figure 3.6. DSC melting curves of oils from: (a) air- and freeze-dried sea buckthorn seeds, and (b) air- and freeze-dried sea buckthorn pulps.

77

100

SFI oils from FDS SFI oils from ADS
80

60

(a)

40

SFI (%) SFI (%)

20

0 -60 -50 -40 -30 -20 -10 0 10 20 30

Temperature (ºC)
100

SFI oils from FDP SFI oils from ADP

80

60

(b)

40

20

0 -50 -40 -30 -20 -10 0 10 20 30 40 50

Temperature (ºC)

Figure 3.7. SFI of oils from: (a) air- and freeze-dried sea buckthorn seeds, and (b) air- and freeze-dried sea buckthorn pulps.

78

3.6 Conclusions
Air-dried (ADS) and freeze-dried (FDS) sea buckthorn seeds, gave a similar extraction yield around 12%w/w, whereas significant differences were found between extraction yields of air-dried (ADP) and freeze-dried (FDP) sea buckthorn pulps (35.9±0.8 vs 17.1±0.6%w/w). Fatty acid analysis revealed that α-linolenic (37.2-39.6%), linoleic (32.434.2%) and oleic (13.1%) acids were the main fatty acids in seed oil extracts, while pulp extracts were rich in palmitoleic (39.9%), palmitic (35.4%) and linoleic (10.6%) acids. Lipid fractionation of crude seed and pulp oils, obtained by SPE, yielded mainly neutral lipids (93.9-95.8%). Sea buckthorn seed oils exhibited four thermal structural transitions between -50ºC and 0ºC, whereas multiple transitions were observed in melting profiles of pulp extracts. The seed oils were characterized with peroxide values of 1.8 meq/kg, while those of pulp oils were between 3.0-5.4 meq/kg. Drying method did not have a marked effect on oil quality. However, it is worth mention that oils from freeze-dried pulps had a much lower peroxide value bearing out their enhanced quality.

3.6 References
Aguilera, J.M., Chiralt, A., & Fito, P. (2003). Food dehydration and product structure. Trends in Food Science & Technology, 14(10), 432-437. Aguilera, J.M., & Stanley, D.W. (1999). Microstructural principles of food processing and engineering. Second Edition. Gaithersburg, MD: Aspen Publishers. AOCS. (1993). Official methods and recommended practices of the American Oil Chemists' Society. Champaign, IL: American Oil Chemists' Society. Bernardini, E. (1982). Oil seeds, oils and fats. Volume 1. Raw materials and extraction techniques. Eds. Roma: B.E. Oil. Beveridge, T., Li, T.S.C., Oomah, D., & Smith, A. (1999). Sea buckthorn products: manufacture and composition. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 47(9), 3480-3488. Cenkowski, S., Yakimishen, R., Przybylski, R., & Muir, W.E. (2006). Quality of extracted sea buckthorn seed and pulp oil. Canadian Biosystems Engineering, 48, 3.9-3.16. Christie, W.W. (1982). Lipid analysis: isolation, separation, identification and structural analysis of lipids. Oxford; Toronto: Pergamon Press. 207 p. Deroanne, C. (1977). L’analyse calorimétrique différentielle, son intérêt pratique pour le fractionnement de l’huile de palme et la détermination de la teneur en phase solide. Lebensmittel-Wissenschaft & Technologie, 10(5), 251-255. Hsu, C.L., Chen W.L., Weng Y.M., & Tseng, C.Y. (2003). Chemical composition, physical properties and antioxidant activities of yam flours as affected by different drying methods. Food Chemistry, 83(1), 85–92. Kallio, H., Yang, B., Peippo, P., Tahvonen, R., & Pan, R. (2002). Triacylglycerols, glycerophospholipids, tocopherols, and tocotrienols in berries and seeds of two subspecies (ssp. sinensis and mongolica) of sea buckthorn (Hippophaë rhamnoides). Journal of Agricultural and Food Chemistry, 50(10), 3004-3009. Lambelet, P. (1983).Comparison of NMR and DSC methods for determining solid content of fats application to milk-fat and its fractions. Lebensmittel-Wissenschaft & Technologie, 16(2), 90-95. Omidbaigi, R., Sefidkon, F., & Kazemi, F. (2004). Influence of drying methods on the essential oil content and composition of Roman chamomile. Flavour and Fragrance Journal, 19(3), 196–198. Oomah, B.D., Ladet, S., Godfrey D.V., Liang, J., & Girard, B. (2000). Characteristics of raspberry (Rubus idaeus L.) seed oil. Food Chemistry, 69(2), 187-193. Oomah, B.D., Liang, J., Godfrey, D., & Mazza, G. (1998). Microwave heating of grapeseed: Effect on oil quality. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 46(10), 4017-4021. Raghavan, B., Rao, L., Singh, M., & Abraham, K. (1997). Effect of drying methods on the flavour quality of marjoram (Origanum majorana L.). Nahrung, 41(3), 159–161. SAS Institute. (2000). SAS/STAT User’s Guide, Version 8. SAS Institute Inc., Cary, NC. Tan, C.P., & Che Man, Y.B. (2002). Comparative differential scanning calorimetric analysis of vegetable oils: I. Effects of heating rate variation. Phytochemical Analysis, 13(3), 129-141. Timms, R.E. (1980). The phase behavior and polymorphism of milk-fat, milk-fat fractions and fully hardened milk-fat. Australian Journal of Dairy Technology, 35(2), 47-53.

80 Yakimishen, R. (2004). An evaluation of oil extraction technologies for sea buckthorn seed and pulp oils. Unpublished M.Sc. thesis. Department of Biosystems Engineering, University of Manitoba, Winnipeg, MB. 242 p. Yakimishen, R., Cenkowski, S., & Muir, W.E. (2005). Oil recoveries from sea buckthorn seeds and pulp. Applied Engineering in Agriculture, 21(6), 1047−1055. Yang, B., & Kallio, H.P. (2001). Fatty acid composition of lipids in sea buckthorn (Hippophaë rhamnoides L.) berries of different origins. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 49(4), 1939-1947. Yang, B., & Kallio, H. (2002). Composition and physiological effects of sea buckthorn (Hippophaë) lipids. Trends in Food Science & Technology, 13(5), 160-167. Yang, B., & Kallio, H. (2002a). Effects of harvesting time on triacylglycerols and glycerophospholipids of sea buckthorn (Hippophaë rhamnoides L.) berries of different origins. Journal of Food Composition and Analysis, 15(2), 143-157. Yang, B.R., & Kallio, H. (2006). Analysis of triacylglycerols of seeds and berries of sea buckthorn (Hippophae rhamnoides) of different origins by mass spectrometry and tandem mass spectrometry. Lipids, 41(4), 381-392. Yoshida, H., Shougaki, Y., Hirakawa, Y., Tomiyama, H., & Mizushina, Y. (2004). Lipid classes, fatty acid composition and triacylglycerol molecular species in the kernels of pumpkin (Cucurbita spp) seeds. Journal of the Science of Food and Agriculture, 84(2), 158-163. Zadernowski, R., NowakPolakowska, H., Lossow, B., & Nesterowicz, J. (1997). Seabuckthorn lipids. Journal of Food Lipids, 4(3), 165-172.

Conclusions générales
Afin de vérifier les hypothèses de ce projet, une évaluation des effets de deux méthodes de déshydratation (la lyophilisation et le séchage à l’air chaud) sur les rendements d’extraction et la qualité des huiles des graines et de la pulpe du fruit d’argousier (cv. Indian-Summer) a été réalisée. Les extractions ont été effectuées à différentes températures (30, 40, 50 et 68ºC) en utilisant l’hexane comme solvant. Trois ratios soluté - solvant (1/4, 1/7 et 1/14) furent étudiés. La quantité de lipides totaux des produits secs, déterminée en utilisant le chloroforme – méthanol comme solvant, a été semblable pour les graines séchées à l’air chaud et lyophilisées (∼12% w/w), contrairement à ce qui a été observé pour la pulpe (35.8% w/w pour la pulpe séchée à l’air chaud vs. 16.4% w/w pour la pulpe lyophilisée). La différence trouvée entre les quantités de lipides totaux issues des pulpes, a été attribuée principalement aux effets du séchage sur leurs structures cellulaires. Des micrographies obtenues par microscopie électronique à balayage ont montré que le séchage à l’air chaud a causé des grands changements et dommages à la structure cellulaire de la pulpe, permettant aux substances cellulaires, y compris les lipides, d’être facilement extraites. Par contre, la structure régulière des cellules de la pulpe lyophilisée aurait exercé une résistance plus élevée à la diffusion du solvant et des lipides, à travers de la membrane cellulaire. Les rendements d’extraction des huiles obtenus à 68ºC en utilisant la méthode Soxhlet avec l’hexane comme solvant, ont été similaires à ceux trouvés avec le chloroforme –méthanol, et ce pour les trois ratios soluté – solvant étudiés. Les rendements d’extraction des graines séchées à l’air chaud et lyophilisées furent semblables (∼12% w/w), tandis que la quantité d’huile obtenue de la pulpe séchée à l’air chaud a été plus du double de celle extraite de la pulpe lyophilisée (36%w/w vs. 17%w/w, respectivement). Après 4 heures, les extractions effectuées par la méthode Soxhlet ont atteint l’équilibre. Contrairement à ce qui a été observé pour les extractions réalisées dans des erlenmeyers à 30, 40 et 50ºC durant 24 heures, les rendements d’extraction n’ont pas été affectées par le ratio soluté – solvant en raison d’un meilleur transfert de masse pendant le processus d’extraction. D’ailleurs, les extractions effectuées dans des erlenmeyers furent plus dépendantes du ratio soluté –

82 solvant que de la température. Pour ces extractions, il a été trouvé une efficacité d’extraction des huiles des graines et de la pulpe de l’argousier située entre 64-99% et 5991%, respectivement, lorsqu’on a fait varier le ratio soluté – solvant entre 1/4 et 1/14, et la température entre 30 et 50ºC. L’huile des graines est caractérisée par une faible proportion d’acides gras saturés, et par une teneur élevée en acides gras insaturés. Les huiles issues des graines lyophilisées furent plus riches en acides α-linolénique (39.6% vs. 37.2%) et linoléique (34.2% vs. 32.4%), et moins riches dans les acides palmitoléique (0.7% vs. 2.8%) et palmitique (6.5% vs. 8.0%), par rapport aux huiles extraites des graines séchées à l’air chaud. Par contre, la méthode de déshydratation n’a pas causé des différences significatives dans la composition d’acides gras des huiles de la pulpe, lesquelles ont été caractérisées pour un haut degré de saturation. Elles contiennent environ 35% d’acide palmitique et une proportion d’acides gras insaturés constituée surtout par les acides palmitoléique (∼40%) et linoléique (∼10%). Des différences significatives ont été présentées dans les compositions des triglycérides des huiles des graines et de la pulpe d’argousier, par rapport à la méthode de déshydratation. Cependant, comme pour d’autres espèces et sous-espèces de l’argousier, les triglycérides des huiles des graines furent constitués principalement par des molécules comportant 54 et 52 atomes de carbone, tandis que ceux des huiles de la pulpe ont été composés surtout par des molécules comprenant 48 et 50 atomes de carbone. Or, les différences dans les compositions des triglycérides des huiles des graines et de la pulpe par rapport à la méthode de séchage, ont causé des légères dissimilitudes dans leurs profils de fusion et dans leurs indices de gras solide, tel qu’illustré dans les Figures 3.6 et 3.7. Le fractionnement des huiles brutes des graines et des pulpes, fait à l’aide de l’extraction en phase solide, a donné principalement des lipides neutres (∼95%), et des faibles quantités d’acides gras libres (2-4%) et de phospholipides (1-2%). La composition massique de ces fractions n’a pas été amplement influencée par la méthode de séchage. Cependant, des différences significatives dans leurs profils d’acides gras furent trouvées par rapport à la méthode de déshydratation.

83 L’état d’oxydation des huiles des graines, évalué à l’aide de l’indice de peroxyde, n’a pas été influencé par la méthode de déshydratation. Ceci pourrait être attribué au fait que les graines sont enrobées pour la paroi membranaire de la graine, ce qui, dans les conditions étudiées, empêcherait un peu l’oxydation des lipides durant la période de séchage. D’autre part, les huiles de la pulpe lyophilisée ont présenté un indice de peroxyde moins élevé que celui obtenu des huiles issues de la pulpe séchée à l’air chaud (3.0 vs 5.4 meq/kg), ce qui pourrait être dû à l’absence d’oxygène durant la lyophilisation. Ainsi, dans le contexte des paramètres étudiés dans ce projet, la lyophilisation ne serait pas une méthode indiquée comme opération préliminaire à l’extraction des huiles de l’argousier, compte tenu du rendement d’extraction plus faible qu’elle donne, et parce que les différences trouvées dans les paramètres de qualité ne justifient pas ses coûts plus élevés par rapport au séchage à l’air chaud. Cependant, vu l’énorme potentiel nutritionnel de l’argousier, et les caractéristiques excellentes des produits lyophilisés, cette technique pourrait être la méthode de choix pour la production d’une poudre d’argousier de haute valeur ajoutée.

Perspectives de recherche
Pour que la production et l’industrialisation de l’argousier au Québec soient rentables, il est fondamental de réduire les coûts de récolte (estimés entre $8-10/kg). Pour cela, la recherche concernant la cueillette mécanique des fruits devrait être faite. Grâce aux propriétés physico chimiques des huiles d’argousier, ces fruits deviennent une source importante de lipides pour l’industrie cosmétique et pharmaceutique. Néanmoins, il est possible que des résidus d’hexane ne soient pas acceptés. Par conséquent, d’autres solvants ou méthodes d’extraction devraient être étudiées. Commercialement, les huiles d’argousier sont extraites à l’aide du CO2 supercritique. Cependant, les coûts élevés de cette technologie sont un grand inconvénient, étant donné que les prix des huiles des graines et de la pulpe ont été estimés à $300/kg et $160/kg, respectivement. Malgré que l’utilisation d’enzymes a démontré une grande performance dans les procédés d’extraction d’huiles, elle est pratiquement non étudiée dans le cas du fruit de l’argousier. Ceci nous a amené à réaliser une étude préliminaire concernant l’extraction enzymatique de l’huile de la pulpe d’argousier, en utilisant trois enzymes commerciales. Les résultats de cette étude sont présentés dans l’Annexe 3. D’autre part, les récents intérêts et applications des acides gras monoinsaturés donnent à l’huile de la pulpe d’argousier une grande importance, compte tenu que ce fruit est la source naturelle la plus riche en acide palmitoléique, suivi de la noix de macadamia. L’application d’une technologie qui permette la production de fractions riches en acide palmitoléique à partir de l’argousier valoriserait encore plus ce fruit, et lui donnerait d’autres opportunités commerciales.

Annexe 1 Matériaux et produits expérimentaux

1

2

3

4

5

6

1. Fruits d’argousier entiers. 2. Graines entières de fruits d’argousier. 3. Graines moulues de fruits d’argousier. 4. Pulpe d’argousier séchée à l’air chaud. 5. Pulpe d’argousier lyophilisée. 6. Huiles de la pulpe (à gauche) et des graines (à droite).

Annexe 2 Divers espèces et sous-espèces de l’Hippophaë

subsp. turkestanica Rousi

H.tibetana Schlechtend

H. salicifolia D. Don

subsp. yannanensis Rousi

H. goniocarpa Lian,X.L.Chen et K.Sun

H. gyantsensis (Rousi)Lian

subsp. goniocarpa

H. rhamnoides cv. Indian-Summer

Annexe 3 Enzymatic Oil Extraction of Sea Buckthorn (Hippophaë rhamnoides L.) Pulp: A Preliminary Study
Luis-Felipe Gutiérrez, Cristina Ratti and Khaled Belkacemi* Soils and Agri-Food Engineering Department, Nutraceuticals and Functional Foods Institute (INAF), Université Laval, Québec, G1K 7P4, Canada *Corresponding author. Phone: 418-656-2131, ext. 6511. Fax: 418-656-3327. E-mail: khaled.belkacemi@sga.ulaval.ca Cet annexe, rédigé sous forme d’article, présente les résultats obtenus lors d’une étude préliminaire de l’extraction enzymatique de la pulpe de l’argousier. Les effets de trois enzymes commerciales, ainsi que de cinq concentrations enzyme/substrat, furent évalués.

Résumé
Trois enzymes commerciales (Pectinex Ultra SP-L, Celluclast 1.5 L and Viscozyme L) furent évaluées pour l’extraction d’huile de la pulpe d’argousier (Hippophaë rhamnoides L.) obtenue après la séparation du jus. Les extractions furent réalisées durant 24 h à pH 5.0 et 50ºC, utilisant cinq concentrations enzymatiques différentes. Les huiles brutes obtenues furent analysées dans leurs compositions d’acides gras, et fractionnées à l’aide de l’extraction en phase solide. Les profils de fusion des différentes huiles ont été caractérisés par calorimétrie différentielle à balayage. Les rendements d’extraction moyens obtenus avec Viscozyme L (2.8%w/w) et Pectinex Ultra SP-L (2.6%w/w) furent significativement plus élevés que ceux obtenus avec Celluclast 1.5L (2.1%w/w). Pour toutes les enzymes, les profils en acides gras des huiles, furent caractérisés par des teneurs élevées en acides palmitoléique (39.5%) et palmitique (36.1%), et de faibles quantités en acides linoléique (10.8%) et vaccénique (6.2%). Le fractionnement des huiles brutes a donné environ 97% de lipides neutres. Les courbes de fusion des huiles ont montré la présence de trois endothermes fondant séparément entre -30ºC et 20ºC, pour lesquels les températures de fusion furent -24ºC, -4ºC et 10ºC.

88

Abstract
Three commercial enzymes (Pectinex Ultra SP-L, Celluclast 1.5 L and Viscozyme L) were evaluated for oil extraction from the sea buckthorn (Hippophaë rhamnoides L.) pulp obtained after juice separation. Extractions were carried out for 24 h at pH 5.0 and 50ºC, using five different enzyme concentrations. The obtained crude oils were analyzed for their fatty acid compositions, and fractionated using solid-phase extraction. The melting profiles of different oil samples were characterized by differential scanning calorimetry. The average oil yields obtained with Viscozyme L (2.8%w/w) and Pectinex Ultra SP-L (2.6%w/w) were significantly higher than those obtained with Celluclast 1.5L (2.1%w/w). For all enzymes, the fatty acid profiles of oils were characterized by high concentrations of palmitoleic (39.5%) and palmitic (36.1%) acids, with minor proportions of linoleic (10.8%) and vaccenic (6.2%) acids. Lipid fractionation of crude oils yielded about 97% of neutral lipids. The melting curves of the oils showed the presence of three major endotherms melting separately between -30ºC and 20ºC, for which the melting temperatures were 24ºC, -4ºC and 10ºC.

Introduction
Canadian production of sea buckthorn berries (Hippophaë rhamnoides L.) is estimated at more than 1.6 × 103 t/year (1). These berries are of great interest because of their nutraceutical properties, and since a few years, the sea buckthorn products are among the most popular functional foods in various European countries and North America (2). Consequently, the berries become a crop with economic potential for Canada (3). Sea buckthorn berries have a high lipid content, including tocopherols, tocotrienols, carotenoids and two essential fatty acids: omega-3 and omega-6 (4). The oil contents of seeds and pulp range commonly between 10-15% and 30-35%, respectively (4-5). The pulp oil contains high amounts of palmitoleic (C16:1n-7, 16-54%) and palmitic acids (C16:0, 17-47%), whereas the seed oil is highly unsaturated, containing mainly linoleic (C18:2n-6,

89 30-40%) and α-linolenic (C18:3n-3, 20-35%) acids (4). Both seed and pulp oils have shown beneficial effects on human health (4, 6-12). The most used techniques to obtain commercial seed and pulp sea buckthorn oils are solvent extraction and supercritical fluid extraction (4). Aqueous extraction and pressing have been also reported recently (13). Other methods comprise the use of additional vegetable oils to extract oils from seeds and pulp, to obtain oils of mixed composition (14). Enzymes have been used in oil extraction of various fruits and seeds, and the results in both laboratory and industrial scale have been excellent (15). Enzymatic oil extraction of sea buckthorn berries is a field practically not studied. Only one study (16) partially available indicates the use of enzymes to obtain sea buckthorn oils and food-grade sea buckthorn juice. Given the increasing interest and applications of the sea buckthorn pulp oil, and with the aim to avoid the use of toxic organic solvents, the objective of this work was to investigate the extraction yields and composition of oils from sea buckthorn pulp, using three commercial enzymes (Pectinex Ultra SP-L, Celluclast 1.5 L and Viscozyme L).

Materials and methods
Sea buckthorn berries (Hippophaë rhamnoides L cv. Indian-Summer) from Sainte-Annede-Beaupré (Québec, Canada) were washed with boiling water at short time periods, to inactivate deteriorative enzymes, and then rinsed with cold water. The fresh extracted juice was allowed to stand 48 h in the refrigerator at 4ºC. The upper pulp phase was treated enzymatically for 24 h at 50ºC, after adjusting the pH to 5.0 with NaOH, with three commercial enzyme preparations (Celluclast 1.5 L from Trichoderma reesei, Pectinex Ultra SP-L from Aspergillus aculeatus and Viscozyme L from a group of Aspergillus) purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Five different concentrations enzyme/substrate (0.25, 0.5, 1.0, 2.0 and 4.0% v/v) were tested and compared with a control sample (without enzymes). Extractions were carried out in Erlenmeyer flasks under permanent agitation (400 rpm) using a thermoregulated bath. After centrifugation at 10000 rpm during 60 min

90 at 25ºC (Refrigerated Multipurpose Centrifuge 5804 R Eppendorf, Germany), the supernatant oils were collected, weighted, and stored under nitrogen in sealed amber glass vials at -20ºC until analysis. Oil extraction yields (%w/w) were calculated as the mass ratio percentage of extracted oil (g) to pulp material (g).

Fatty acid composition
The fatty acid composition of the oils was determined by GC. Oils were converted into their methyl esters (FAME) and analyzed on a 5890 series II gas chromatograph (HewlettPackard, Palo Alto, CA) equipped with a flame ionization detector and a split-splitless capillary inlet. The oven temperature was programmed as follows: from 60ºC (isothermal for 1 min) to 190ºC at 20ºC/min, and isothermal period of 30 min at 190ºC. The injector and detector temperatures were set at 250°C. Hydrogen was used as carrier gas. Gas chromatography separation was performed on a BPX-70 capillary column (60 m×0.25 mm i.d.×0.25 µm film thickness; SGE, Melbourne, Australia). Fatty acids were identified by comparing their retention times with those of the FAME standards purchased from Nu Chek Prep (Elysian, MN, USA) under the same conditions. Peak areas were measured with a Hewlett-Packard ChemStation software. Fatty acid composition was expressed as percentage of the total amount of fatty acids.

Lipid fractionation
Separation of individual lipid fractions was achieved using solid-phase extraction (SPE) cartridges (Bakerbond SPE amino [NH2] disposable extraction columns, 1000 mg, J.T. Baker Inc., Phillipsburg, NJ, USA), as described by Oomah et al. (17). The cartridges were preconditioned with 2 mL methanol, 2 mL chloroform, and 4 mL hexane. A micropipet was used to inject oil samples (∼100 mg) dissolved in chloroform. Lipid fractions were recovered by sequential elution under vacuum with 4 mL each of chloroform/isopropanol (2/1, v/v), diethyl ether/acetic acid (95/5, v/v), and methanol to separate neutral lipids, free fatty acids and phospholipids, respectively. The collected eluted fractions, were evaporated under nitrogen, weighed, and stored at -20ºC for subsequent fatty acid analysis.

91

Melting profiles
Melting profiles of the oils were determined using a differential scanning calorimeter (Pyris 1 DSC, Perkin Elmer, Norwalk, CT, USA) equipped with an intracooler II (Perkin Elmer, Norwalk, CT, USA). The system was purged during analysis with nitrogen at 30 mL/min. Oil samples (10-20 mg) were poured into aluminium pans, weighted and then hermetically sealed. DSC melting curves were performed within the temperature range of -50 to 50ºC. Samples were cooled and held at the lowest temperature for 5 min and then heated at 4ºC/min. An empty pan was used as an inert reference to balance the heat capacity of the sample pan. Calibration of DSC was carried out using indium (mp = 156.6ºC, ∆Hf = 28.71 J/g). Data were analyzed using a thermal analysis software (Pyris 1 Version 3.5, Perkin Elmer). The solid fat index (SFI) was determined from the DSC melting curves by sequential integration of peak areas (18).

Experimental design and statistical analysis
The experimental units were grouped in three blocs, and the treatment structure adopted was a 3×5 factorial design (three enzymes×five concentrations). Results were analyzed using the analysis of variance by the general linear models (GLM) procedure. To analyze the effects of the independent variables on the oil extraction yields, qualitative contrasts and means comparisons by the least significant difference (LSD) test were performed according to the Statistical Analysis System (19). Probability of p<0.05 was considered statistically significant.

Results and discussion
After settling, sea buckthorn juice separates into an emulsion pulp layer on the top, an aqueous phase in the middle, and some solids on the bottom. Later than removing the solids and the aqueous phase, the moisture content of the cream pulp layer was 84.4±0.1%. The effects of the enzymatic treatments on oil extraction yields from this material are shown in Figure A.3.1. When comparing with the control sample (oil yield 1.8±0.1%), it is clear that

92 enzyme concentrations greater or equal than 0.5% v/v improve the oil extraction yields of the cream pulp phase. It was also observed that the higher oil yields were obtained with Viscozyme L (a multienzyme complex containing a wide range of carbohydrases, including arabanase, cellulose, β-glucanase, hemicellulase and xylanase) and Pectinex Ultra SP-L (an enzyme preparation that contains pectolytic and a range of hemicellulolytic activities). In contrast, Celluclast 1.5 L (a liquid cellulose preparation), produced the lowest oil yields, reaching its maximum performance at a concentration of 1.0 % v/v.
4,0 Pectinex Ultra SP-L Celluclast 1,5 L Viscozyme L Control

Oil yield (%w/w)

3,0

2,0

1,0

0,0 0,25 0,50 1,00 2,00 4,00

Enzyme concentration (%v/v)

Figure A.3.1. Oil extraction yields obtained from sea buckthorn pulp using three commercial enzymes at different concentrations. No significant differences were found between the oil yields obtained with Viscozyme L and Pectinex Ultra SP-L, and their average values (2.8% and 2.6% respectively) were significantly higher (p<0.01) than those obtained with Celluclast 1.5L (2.1%). On the other hand, as showed in Figure A.3.1, the oil yields increase as the enzyme concentration increases. However, from concentrations higher than 1.0%v/v, the oil extraction yields were not significantly different. Our results are in according with those reported by Nokolov & Heilscher (16), who using enzymes containing pectolytic and acid proteinase activity (Novozyme AP and Rohapect D5L) for about 24 h at 20ºC and 50°C, obtained 1-3% of sea buckthorn oil. In addition, as

93 shown in other studies (20-21), the use of the multienzyme complex resulted more effective than used enzymes individually.

Fatty acid composition
The fatty acid composition of the obtained oils is summarized in Table A.3.1. As shown, the fatty acids profiles of the oils were similar, and independent of the type of enzymes. The major fatty acids were palmitoleic (39.5%), palmitic (36.1%) and linoleic (10.8%) acids. Similar values were recently reported for sea buckthorn (cv. Indian-summer) pulp oil from (22), while Yang & Kallio (15) reported lower concentrations of palmitic (26.7% and 27.8%) and palmitoleic (27.2% and 32.8%) acids, and higher proportions of oleic acid (∼17%), in pulp oils from subspecies sinensis and rhamnoides respectively. Table A.3.1. Fatty acid composition (percent of total) of oils from sea buckthorn pulp, extracted with three different commercial enzymes during 24 h at pH 5.0 and 50ºC Fatty acid C14:0 (Myristic) C16:0 (Palmitic) C16:1 (Palmitoleic) C17:0 (Margaric) C18:0 (Stearic) C18:1n-9 (Oleic) C18:1n-7 (Vaccenic) C18:2n-6 (Linoleic) C:18:3n-3 (α-linolenic) Pectinex Ultra SP-L 0.4±0.0 36.1±0.3 39.4±0.3 2.1±0.1 0.8±0.0 2.8±0.0 6.2±0.2 10.8±0.3 0.9±0.0 Celluclast 1.5 L 0.4±0.0 36.1±0.4 39.5±0.3 2.1±0.1 0.8±0.0 2.8±0.1 6.2±0.2 10.8±0.3 0.8±0.0 Viscoayme L 0.4±0.0 36.2±0.3 39.5±0.3 2.1±0.1 0.8±0.0 2.8±0.0 6.2±0.2 10.8±0.3 0.9±0.1

Polyunsaturated fatty acids (PUFA) of the oils amounted between 12% of the total fatty acids, while the monounsaturated (MUFA) and saturated (SFA) fatty acids were 48.5% and 37.3% respectively. The increasing interest and applications of the MUFA, give to the sea

94 buckthorn pulp oil an interesting economic potential, because of its high content in palmitoleic acid. This fatty acid is present in the majority of fish oils (∼10% w/w), and is found at low levels in plant and animal tissues (23). Other than sea buckthorn, the most available source of palmitoleic acid is macadamia nut, which contains 17–34% (24-25). Associations have been reported between high-monounsaturated fat diets and cardiovascular diseases. Curb et al. (26) reported that a based diet high in monounsaturated oils had potentially beneficial effects on cholesterol and LDL cholesterol levels. However, studies carried out by Nestel et al. (27), showed that palmitoleic acid behaves like a saturated and not a MUFA in its effect on LDL cholesterol. Others beneficial effects of palmitoleic acid on cancer, hypertension, hyperlipemia and diabetes have been also reported (23, 28-29).

Lipid fractions
Enzyme extracted sea buckthorn pulp oils consisted mainly of neutral lipids (NL) (∼97%), with minor amounts of free fatty acids (FFA) (∼2%) and phospholipids (PL) (1%) (Table A.3.2). The fatty acids profiles of the NL fractions were very close to the corresponding crude oils, because of the quantitative dominance of this fraction in the oils. In FFA fractions, palmitoleic acid was slightly lower than in crude oils, whereas the proportions of myristic, palmitic, stearic and α-linolenic acids were higher than in crude oils. On the other hand, significant differences were found in the contents of palmitic and vaccenic acids in PL fractions, when comparing the type of enzymes. As showed in Table A.3.2., palmitic acid was higher in oils extracted with Viscozyme and Celluclast than in oils extracted with Pectinex, whereas vaccenic acid was slightly lower in oils treated with Viscozyme and Celluclast than in oils treated with Pectinex. The PL fractions were poorer in palmitic and palmitoleic acids, but richer in stearic, vaccenic, linoleic and α-linolenic acids, than in crude oils. Linoleic and α-linolenic acids reached 12% and 8%, respectively, whereas palmitoleic was about 33%. Kallio et al. (2) and Yang & Kallio (5) reported contents of

95 linoleic (32%, 22% and 24%), palmitoleic (22%, 15% and 19%), palmitic (21%, 16% and 17%) and α-linolenic (10%, 15% and 13%) acids in the PL fractions of the sea buckthorn pulp oils from subspecies mongolica, sinensis and rhamnoides, respectively. Genetic differences among subspecies, as well as climate, soil conditions, cultivating activities and lipid extraction processes, could explain the differences (30).

96

Table A.3.2. Fatty acid composition (percent of total) in individual lipid fractions of oils from sea buckthorn pulp, extracted with three different commercial enzymes during 24 h at pH 5.0 and 50ºC a Pectinex Ultra SP-L NL 96.8±1.6 0.4±0.0 36.4±0.1 39.6±0.2 2.1±0.0 0.8±0.0 2.8±0.1 6.0±0.0 10.5±0.1 0.9±0.0 1.6±0.2 8.1±0.1 9.9±0.2 12.5±0.6 5.6±0.2 9.0±0.4
a

Celluclast 1.5 L NL 97.8±0.3 0.4±0.0
a

Viscozyme L PL 0.9±0.1 2.1±0.6 29.7±0.8 2.2±0.3 2.6±0.5 2.4±0.1
b

FFA 2.2±0.6 2.2±0.3 38.3±1.1 36.0±1.7 1.8±0.2 1.7±0.4 3.0±0.3 6.0±0.0 10.5±0.0 0.9±0.0 2.5±0.5 2.8±0.0 3.6±0.5 0.8±0.0 2.1±0.3 2.1±0.0 2.0±0.4 1.6±0.7 2.8±0.1 5.6±0.3 10.3±0.3 1.6±0.4 32.6±0.4 39.6±0.1 36.2±2.8 27.5±0.4 36.5±0.1 37.9±1.1 2.1±0.3 1.9±1.0 0.9±0.2 1.5±0.5

PL

FFA

NL 97.9±0.5 0.4±0.0 36.4±0.0 39.8±0.1 2.1±0.0 0.8±0.0 2.7±0.0

FFA 1.5±0.7 2.6±0.6 38.6±1.5 34.9±0.6 1.9±0.2 1.8±0.3 2.8±0.1

PL 0.9±0.2 2.0±0.9 31.9±1.3b 33.3±2.3 2.3±0.5 3.3±0.6 2.1±0.4

Composition (mass%)

C14:0 (Myristic)

C16:0 (Palmitic)

C16:1 (Palmitoleic)

34.4±0.6

C17:0 (Margaric)

C18:0 (Stearic)

C18:1n-9 (Oleic)

C18:1n-7 (Vaccenic)

7.9±0.3

b

6.0±0.0 12.3±0.4 6.3±0.9 10.5±0.1 0.9±0.0

5.5±0.1 9.9±0.0 2.0±0.7

7.5±0.8b 11.5±0.5 6.8±2.0

C18:2n-6 (Linoleic)

C:18:3n-3 (α-linolenic)

a

Different letters in rows, indicate significant differences (p<0.05) between enzymes.

97

Melting profiles
The melting curves of the extracted oils are shown in Figure A.3.2. As it can be observed, no significant differences were found between the melting profiles of the oils extracted with different enzymes, indicating resemblances in their triglyceride compositions. These melting curves indicate the presence of three major groups of triglycerides melting separately between -30ºC and 20ºC. The melting profiles showed that there is one major peak at 10ºC, and two minor peaks at -4ºC and -24ºC. The low melting endotherm (LME), representing the melting transition of the more unstable crystals of the low melting triglycerides, had a melting enthalpy of about 20 J/g. The melting enthalpies of both medium (MME) and high melting endotherms (HME), corresponding to medium and high melting triglycerides are given in Table A.3.3. There were no significant differences between the melting temperatures and enthalpies of individual endotherms. According to Timms (31), the large area of the highest melting peak would partly due to the higher heat of melting of the triglyceride groups conforming this endotherm, and also because the high melting triglycerides crystallizes together with lower melting triglycerides in a semi-stable mixture. Table A.3.3. Thermal characteristics of enzyme extracted sea buckthorn pulp oils a
LME ∆Hm (J/g)
20.6±0.4 20.5±3.2 21.6±1.5

Enzyme
Pectinex Ultra SP-L Celluclast 1.5 L Viscozyme L
a

MME Tm (ºC) ∆Hm (J/g)
11.3±0.5 12.0±1.3 12.1±0.4

HME ∆Hm (J/g)
43.6±0.4 40.6±4.0 43.3±1.2

Tm (ºC)
-4.6±0.6 -3.9±0.9 -4.1±0.3

Tm (ºC)
10.4±0.3 10.7±0.5 10.7±0.3

-24.4±0.4 -24.3±1.0 -24.1±0.5

n=3. Tm: Melting temperature. ∆Hm : Melting enthalpie.

The solid fat indices (SFI) of the oils, calculated from their corresponding thermograms by sequential peak areas integration, indicate that SFI decreases as temperature increases (Figure A.3.3). As can be observed, complete melting of the oils is achieved above 20ºC.

98

0

Heat flow endo down (mW)

1

2

3

4

Pectinex Ultra SP-L Celluclast 1.5L Viscozyme L

5

6 -50 -40 -30 -20 -10 0 10 20 30 40 50

Temperature (ºC)

Figure A.3.2. Melting profiles of sea buckthorn pulp oils extracted with three different commercial enzymes during 24 h at pH 5.0 and 50ºC (4ºC/min scan rate)

100 90 80 Pectinex Ultra SP-L Celluclast 1.5L Viscozyme L

Solid Fat Content (%)

70 60 50 40 30 20 10 0 -50 -40 -30 -20 -10 0 10 20 30 40 50

Temperature (ºC)

Figure A.3.3. Solid fat content of sea buckthorn pulp oils extracted with three different commercial enzymes during 24 h at pH 5.0 and 50ºC

References
(1) Agriculture and Agri-Food Canada. Canada: Sea buckthorn. Bi-weekly Bulletin. 2003, Volume 16, Number 13. (2) Kallio, H.; Yang, B.; Peippo, P.; Tahvonen, R.; Pan, R. Triacylglycerols, glycerophospholipids, tocopherols, and tocotrienols in berries and seeds of two subspecies (ssp. sinensis and mongolica) of sea buckthorn (Hippophaë rhamnoides). J. Agric. Food Chem. 2002, 50, 3004-3009. (3) Oomah, B.D.; Mazza, G. Health benefits of phytochemicals from selected Canadian crops. Trends Food Sci. Technol. 1999, 13, 3-11. (4) Yang, B.; Kallio, H. Composition and physiological effects of sea buckthorn (Hippophaë) lipids. Trends Food Sci. Technol. 2002a, 13, 160-167. (5) Yang, B.; Kallio, H.P. Fatty acid composition of lipids in sea buckthorn (Hippophaë rhamnoides L.) berries of different origins. J. Agric. Food Chem. 2001, 49, 19391947. (6) Gao, Z.; Gu, X.; Cheng, F.; Jiang, F. Effect of sea buckthorn on liver fibrosis: A clinical study. World J. Gastroenterol. 2003, 9, 1615–1617. (7) Xing, J.; Yang, B.; Dong, Y.; Wang, B.; Wang, J.; Kallio, H. P. Effects of sea buckthorn (Hippophaë rhamnoides L.) seed and pulp oils on experimental models of gastric ulcer in rats. Fitoterapia. 2002, 73, 644-650. (8) Eccleston, C.; Yang, B.; Tahvonen, R.; Kallio, H.; Rimbach, G.H.; Minihane, A.M. Effects of an antioxidant-rich juice (sea buckthorn) on risk factors for coronary heart disease in humans. J. Nutr. Biochem. 2002, 13, 346-354. (9) Süleyman, H.; Demirezer, L.Ö.; Büyükokuroglu, M.E.; Akcay, M.F.; Gepdiremen, A.; Banoglu, Z.N.; Göçer, F. Antiulcerogenic effect of Hippophae rhamnoides L. Phytother. Res. 2001, 15, 625–627. (10) Johansson, A.K.; Korte, H.; Yang, B.; Stanley, J.C.; Kallio, H.P. Sea buckthorn berry oil inhibits platelet aggregation. J. Nutr. Biochem. 2000, 11, 491–495. (11) Yang, B.; Kalimo, K.O.; Tahvonen, R.L.; Mattila, L.M.; Katajisto, J.K.; Kallio, H.P. Effect of dietary supplementation with sea buckthorn (Hippophaë rhamnoides) seed and pulp oils on the fatty acid composition of skin glycerophospholipids of patients with atopic dermatitis. J. Nutr. Biochem. 2000, 11, 338–340. (12) Zhao, Y. Clinical effects of Hippophae seed oil in the treatment of 32 burn cases. Hippophaë. 1994, 7 (3), 36–37. (13) Yakimishen, R.; Cenkowski, S.; Muir, W.E. Oil recoveries from sea buckthorn seeds and pulp. Applied Engineering in Agriculture. 2005, 21(6), 1047−1055. (14) Li, T.S.C.; Beveridge, T.H.J. (with contributions by B.D. Oomah, W.R. Schroeder, and E. Small). Sea Buckthorn (Hippophaë rhamnoides L.): Production and Utilization. 2003. NRC Research Press, Ottawa, Ontario. 133 p. (15) Domínguez, H.; Núñez, M.J.; Lema, J.M. Enzymatic pretreatment to enhance oil extraction from fruits and oilseeds: A review. Food Chem. 1994, 49, 271-286. (16) Nikolov, L.; Heilscher, K. Enzyme-thermal treatment of sea buckthorn (Hippophae ramnoides L.) for producing of oil and juice. Khranitelno-vkusova-Promishlenost. 2002, 7, 10-11. (17) Oomah, B.D.; Ladet, S.; Godfrey D.V.; Liang, J.; Girard, B. Characteristics of raspberry (Rubus idaeus L.) seed oil. Food Chem. 2000, 69, 187-193.

100 (18) Deroanne, C. L’analyse calorimétrique différentielle, son intérêt pratique pour le fractionnement de l’huile de palme et la détermination de la teneur en phase solide. Lebensm.-Wiss. U.-Technol. 1977, 10, 251-255. (19) SAS Institute. SAS/STAT User’s Guide, Version 8. SAS Institute Inc., Cary, NC. 2000. (20) Abdulkarim, S.M.; Lai, O.M.; Muhammad, S.K.S.; Long, K.; Ghazali, H.M. Use of enzymes to enhance oil recovery during aqueous extraction of Moringa oleifera seed oil. J. Food Lipids. 2006, 13, 113-130. (21) Moreau, R.A.; Johnston, D.B.; Powell, M.J.; Hicks, K.V. A comparison of commercial enzymes for the aqueous enzymatic extraction of corn oil from corn germ. J. Am. Oil Chem. Soc. 2004, 81 (11), 1071-1075. (22) Cenkowski, S.; Yakimishen, R.; Przybylski, R.; Muir, W.E. Quality of extracted sea buckthorn seed and pulp oil. Canadian Biosystems Engineering. 2006, 48, 3.9-3.16. (23) Yang, B.; Gunstone, F.D.; Kallio, H. Oils containing oleic, palmitoleic, γ-linoleic and stearidonic acids. In Lipids for functional foods and nutraceuticals. Ed. F.D. Gunstone, Oily Press, Bridgwater (England), 2003, pp. 263-290. (24) Padley, F.B.; Gunstone, F.D.; Harwood, J.L. Occurrence and characterisitcs of oils and fats. In The Lipid Handbook, F.D. Gusntone, J.L. Harwood and F.B. Padley, Eds.; Chapman & Hall, London, 1994, pp. 47-183. (25) Klaas, M.R.G.; Meurer, P.U. A palmitoleic acid ester concentrate from sea buckthorn pomace. Eur. J. Lipid Sci. Technol. 2004, 106, 412-416. (26) Curb, J.D.; Wergowske, G.; Dobbs, J.C.; Abbott, R.D.; Huang, B.J. Serum lipid effects of a high-monounsaturated fat diet based on macadamia nuts. Arch. Intern. Med. 2000, 160, 1154-1158. (27) Nestel, P.; Clifton, P.; Noakes, M. Effects of increasing dietary palmitoleic acid compared with palmitic and oleic acids on plasma-lipids of hypercholesterolemic men. J. Lipid Res. 1994, 656-662. (28) Hayatsu, H.; Arimoto, S.; Negishi, T. Dietary inhibitors of mutagenesis and carcinogenesis. Mutat. Res. 1988, 202, 429-446. (29) Yamasaki, M.; Chujo, H.; Nou, S.; Tachibana, H.; Yamada, K. Alleviation of the cytotoxic activity induced by trans10, cis12-conjugated linoleic acid in rat hepatoma dRLh-84 cells by oleic or palmitoleic acid. Cancer Letters. 2003, 196, 187-196. (30) 14Yang, B.; Kallio, H. Effects of harvesting time on triacylglycerols and glycerophospholipids of sea buckthorn (Hippophaë rhamnoides L.) berries of different origins. Journal of Food Composition and Analysis. 2002, 15, 143-157. (31) Timms, R.E. The phase behavior and polymorphism of milk-fat, milk-fat fractions and fully hardened milk-fat. Aust. J. Dairy Tech. 1980, 35, 47-5

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