TEMA 3: Métodos para el análisis de proteínas 3.1. Cuantificación de proteínas totales. 3.2. Técnicas de separación de proteínas. Análisis de proteínas específicas.

INTRODUCCIÓN A lo largo de este tema vamos a estudiar las distintas técnicas que nos permiten analizar desde un punto de vista cuali y cuantitativo, el contenido proteico de las muestras biológicas haciendo especial hincapié en el estudio de las proteínas plasmáticas. Las proteínas están presentes en todas las células y en los distintos líquidos corporales: suero o plasma (66-83g/L), orina (100-200 mg/L), líquido cefalorraquídeo (15-45 mg/dL). Si nos centramos en las proteínas plasmáticas, podemos diferenciar: • Proteínas plasma-específicas: componentes habituales del plasma. • Proteínas no plasma-específicas: aquellas que aparecen en el plasma por rotura de otras células. Las proteínas plasma-específicas (albúmina + globulinas) se sintetizan fundamentalmente en el hígado, pero también en: células plasmáticas, ganglios linfáticos, bazo y médula ósea. En caso de enfermedad, tanto la concentración total como la de las distintas fracciones pueden verse alteradas. Así, la determinación de las proteínas totales sirve para el diagnóstico de: • Afecciones hepáticas • Afecciones de la médula ósea • Otras afecciones del metabolismo o nutricionales 3.1. Cuantificación de proteínas totales Los principales métodos empleados para la determinación de proteínas totales son los siguientes: • Método del Biuret En solución alcalina el Cu+2 reacciona con el enlace peptídico de las proteínas dando un color purpúreo que se cuantifica espectrofotométricamente (540nm). Como estándar se utiliza una solución de albúmina. Proteína + Cu+2 Complejo Cu-Proteína (púrpura)

Muestra: suero o plasma (heparina o EDTA). Separar el suero del coágulo o el plasma de las células antes de 3h. Si el paciente está acostado durante la extracción el resultado será menor. • Método de Lowry Dependen de la concentración de tirosina y triptófano de la muestra. Consiste en dos reacciones: 1. Reacción de Biuret

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Reacción de Folin: característica de los grupos –OH reductores de los aminoácidos tirosina y triptófano que. reducen el reactivo de Folin generando un color azul.2. la cuantificación de las mismas sea de valor considerable en el diagnóstico clínico. Está sujeto a muchas interferencias. para dar como resultado una concentración de proteína concreta. Técnicas de separación y análisis de las proteínas La proporción de las fracciones proteicas individuales cambia en el transcurso de un gran número de enfermedades lo que conlleva que. 2. 7. • Turbidimetría Medición de la turbidez resultante de la precipitación de proteínas • Absorción en el ultravioleta Se mide la absorbancia a 270nm originada fundamentalmente por los anillos aromáticos de triptófano y tirosina. del tamaño de la partícula y del índice de refracción de la partícula en relación con el medio que la rodea. 6. • Métodos de unión a colorantes NOTA: para semicuantificar la concentración de proteínas en orina se utilizan tiras reactivas. 4. Los procedimientos más utilizados actualmente en el laboratorio clínico para el estudio de las proteínas son los siguientes: 1. 2 . 3. se compara la cantidad de luz dispersada o la tasa de aumento de dispersión con los valores de dichos parámetros en estándares proteicos conocidos.. 3. Se utiliza fundamentalmente en orina. junto con los complejos Cu+2 . La dispersión de la luz se puede medir por turbidimetría o por nefelometría. Turbidimetría y nefelometría Inmunodifusión Electroforesis Inmunoelectroforesis Inmunoelectroforesis en cohete Inmunofijación Cromatografía 1. En ambas técnicas. La dispersión de la luz depende de: la longitud de onda de la luz (?). 5.2. parte de la luz se refleja y parte de la luz se absorbe.TURBIDIMETRÍA Y NEFELOMETRÍA Cuando un haz de luz choca con una partícula en suspensión parte de la luz se dispersa.

lipoproteínas. se utilizan anticuerpos que reaccionan con dichas proteínas de la muestra. Muy frecuentemente. por todo ello se suele trabajar a ? que oscilen entre 320-380nm y 500-600nm. 3 . • La intensidad de la luz dispersada aumenta al disminuir la ?. determinación de proteínas totales en suero. 1. para cuantificar proteínas concretas. Para enteder estas técnicas necesitamos tener claro unos conceptos previos: • Antígenos (Ag): sustancias. Utiliza como instrumento el nefelómetro (en el que el detector se ubica con un ángulo que oscila entre 15 y 90º ej. a 90º). generalmente de gran tamaño. se mide A o T). quilomicrones También puede interferir la suciedad. Se suele utilizar para concentraciones más diluidas. Aspectos prácticos: • Tanto en los reactivos como en el suero pueden existir partículas que produzcan una dispersión de luz no deseada ej. La turbidimetría mide la disminución de la luz transmitida a través de una suspensión de partículas utilizando para ello un espectrofotómetro (detector en la misma dirección del haz de luz. Las proteínas suelen tener un pico de absorción en el ultravioleta ( < ? 300nm) y los cromógenos del suero entre 400-425nm. La nefelometría: mide la luz dispersada en dirección distinta a la luz emitida (generalmente con ángulos que oscilan entre 15 y 90º).1. capaces de estimular el sistema inmunológico de un animal y originar una respuesta dirigida específicamente contra él.2. en este caso se habla de inmunoturbidimetría e inmunonefelometría. LCR u orina (haciendo que las proteínas precipiten con TCA o ácido sulfosalicílico). Se suele utilizar para soluciones concentradas (para que haya una buena disminución de la luz transmitida) ej.1.

características propias del Ac como afinidad y avidez y. 2. Así. El antígeno difunde en el gel durante varias horas y va reaccionando con el Ac.INMUNODIFUSIÓN La inmunodifusión se basa en la formación de bandas de precipitación Ag-Ac en medios semisólidos (generalmente de agarosa).. temperatura. Entre otras modalidades podemos hablar de: a) Inmunodifusión radial: en este caso se añade un antisuero específico a la agarosa que. producidas por linfocitos B y su progenie (células plasmáticas) que se combinan específicamente con los antígenos. La formación de inmunocomplejos se ve afectada por variables como: pH. existe una segunda fase de crecimiento de complejos más lenta y. fuerza iónica del medio. a su vez . Para visualizar el resultado de la inmunodifusión. Cuando se ponen en contacto un Ag y un Ac específico contra ese antígeno ambos reaccionan y forman un complejo Ag-Ac. La zona óptima de concentración para la formación del precipitado Ag-Ac se llama zona de equivalencia. es precisamente en ésta fase en la que aparece la dispersión de la luz. Se forman pozos en el gel y se colocan en ellos estándares d e proteínas y problemas (antígenos). Inicialmente los complejos se forman rápidamente pero. en la inmunoturbidimetría e inmunonefelometría se mide la dispersión de la luz provocada por los compeljos Ag-Ac. la concentración relativa de Ag y Ac. Em la zona de equivalencia se produce un anillo de precipitación 4 . En ocasiones los Ac se unen a bolitas de látex para aumentar el tamaño de los complejos (inmunoanálisis potenciados).• • Epítopo o determinante antigénico: lugar del antígeno que reconoce y se une al anticuerpo. La inmunodifusión puede ser simple (sólo se mueve el Ag o el Ac) o doble (se mueven Ag y Ac). se vierte sobre placas. negro amido o azul brillante de Coomassie). una vez terminada la difusión se lava el gel y se tiñe con colorantes para proteínas (ej. Anticuerpo (Ac): grupo de proteínas llamadas inmunoglobulinas. La inmunodifusión se puede clasificar atendiendo a distintos criterios. la más importante.

3.a) Inmunodifusión doble o técnica de Ouchterlony: se forman pozos en el gel de agarosa. La posición y forma de la banda se determinan según la concentración del antígeno y del anticuerpo. donde el anticuerpo y el antígeno alcanzan la equivalencia. Este principio se puede aplicar para separar las fracciones de proteínas puesto que los aminoácidos (aa) constituyentes de la proteínas. las partículas cargadas negativamente migran hacia el ánodo o polo positivo mientras que. Se depositan antisueros específicos en los pozos centrales y los estándares de proteínas y los problemas en los pozos circundantes. y sus tamaños. 2. Si hay grandes cantidades de Ac. La distancia de las bandas con respecto al anticuerpo es directamente proporcional a la cantidad de antígeno presente. Es necesario que las concentraciones de Ag y Ac sean similares o de lo contrario no se alcanza la equivalencia y no se forma el precipitado. Al difundir las muestras en el gel. Cuando se aplica un campo eléctrico a un medio que contiene partículas cargadas. Inconvenientes de la inmunodifusión: 1. y por tanto las proteínas. el antígeno no se difunde muy lejos antes de alcanzar la equivalencia y el anillo es más grueso o espeso. generalmente en patrón de roseta. las cargadas positivamente migran hacia el electrodo negativo (cátodo). se forman bandas de precipitados insolubles. 3. Las moléculas más pequeñas migran con más rapidez que las de gran tamaño y conforme la migración continúa el precipitado puede redisolverse y volverse a formar de acuerdo con los cambios de concentración de Ag o Ac en el gel. El precipitado solo se forma en el punto de equivalencia o cuando hay un ligero exceso de Ag. son compuestos anfóteros que se comportan como ácidos 5 . ELECTROFORESIS Una de las técnicas más sencillas para la separación (y posterior cuantificación) de proteínas es la electroforesis (técnica en la cual una partícula cargada se hace desplazar a través de un medio aplicando un campo eléctrico).

si el pH del medio es superior al pI. sin que exista un pH al que todos los aa sean neutros.6 (básico) todas las proteínas migran hacia el ánodo (tienen carga global negativa). mientras que en soluciones muy básicas los aa se encuentran en forma aniónica. Los pI varían desde 3 a 10. La albúmina.(ceden protones y quedan con carga negativa) o bases (captan protones y quedan con carga positiva) dependiendo del medio en el que estén. las proteínas se compo rtan como cationes y. • • a pH superior 2 o + unidades a pI. el aa aparece cargado negativamente a pH inferior 2 o + unidades a pI el aminoácido aparece cargado positivamente pH = pI los aa aparecen como iones dipolares neutros • En soluciones muy ácidas todos los aa aparecen como cationes. que tiene un pI de 7. Hay numerosos sistemas de electroforesis de proteínas comercialmente disponibles. lo anterior explica que la albúmina recorra una mayor distancia que la gamma-globulina cuando se sitúen en un campo eléctrico. A pH 8. En clínica el suero es la muestra de elección. También se puede analizar orina y líquido cefalorraquídeo si se aumenta su contenido proteico (hasta 20-30 g/l) por ultracentrifugación. su forma y tamaño La fuerza del campo eléctrico Características del soporte La cantidad de carga neta en la molécula es variable y depende del pH del amortiguador. NOTA: El pH al que un aa no se comporta ni como ácido ni como base se denomina punto isoeléctrico pI (en él la estructura del aa no posee carga neta). con pI de 4. Si el pH del medio es menor que el punto isoeléctrico.7 tendrá una mayor carga negativa que la gamma-globulina. se comportan como aniones.. diálisis u otras técnicas de concentración. Se puede usar plasma pero.2. Los pasos a seguir en una electroforesis se pueden resumir en: 6 . La carga de la proteína se hace más negativa a medida que el pH del amortiguador se hace más básico. en ese caso se observará una banda adicional de fibrinógeno. En definitiva. Si una disolución de proteínas se somete a la acción de un campo eléctrico la tasa de migración durante la electroforesis depende de: • • • La carga neta de la molécula.

Revelado de las proteínas para identificar su presencia y separación. negro amido. según el colorante utilizado con tal de que se decolore el soporte sin elución del colorante fijado a las proteínas. Separación electroforética mediante un campo eléctrico 2. El exceso de colorante se arrastra con mezclas acético -agua. que se fijan sobre las funciones básicas de las proteínas. y con ello la representación gráfica de la separación (proteinograma: gráfica que representa las fracciones proteícas del suero sanguíneo). o metanol-acético.. 4. Se realiza mediante colorantes ácidos. Fijación de las proteínas sobre el soporte 3. rojo Ponceau.1.. Cuando el soporte utilizado para llevar a cabo el desarrollo electroforético es de “acetato de celulosa” las principales fracciones proteícas son 7 . Cuantificación de las fracciones electroforéticas mediante fotómetros especiales (densitómetros) que permiten cuantificar el colorante fijado a diferentes distancias del punto de aplicación.

6. aprox.5%). Cuando el soporte es gel de agarosa las ß-globulinas. El o los anticuerpos 8 . es la banda que menos se desplaza y en sueros no patológicos es la banda más ancha). 4. aprox. 64. el resto de las fracciones corresponden a grupos de proteínas. 3. beta (ß-globulinas. Además.6%). Es muy importante tener en cuenta que cada fracción está formada por un conjunto de proteínas con una movilidad electroforética semejante aunque muy distintas en cuanto a su estructura y función. puede existir variación porcentual en sus componentes. El fibrinógeno aparece entre las ß y ? globulinas cuando la muestra utilizada es plasma no así en el suero (se ha co nsumido en la coagulación).• • La fracción de albúmina (aprox. en un surco paralelo a la dirección del campo eléctrico. Esta técnica se realiza en dos fases: • • Electroforesis para separar las proteínas de la muestra en función de su carga. INMUNOELECTROFORESIS La inmunoelectroforesis es una inmunodifusión en la que se aplica una corriente eléctrica para separar las proteínas de la muestra.9%. mono o poliespecífico. por ello . alfa 2 (a-2 globulinas. aprox.6%). aunque el resultado de la fracción sea normal.5%): la que más migra respecto al punto de aplicación de la muestra (cátodo) Las globulinas que se subdividen en las siguientes fracciones: alfa 1 (a-1 globulinas. y gamma (? globulinas. excepto la albúmina. 7. inmunoglobulinas o anticuerpos. se dividen en: ß-1 y ß-2. Aplicación de un antisuero. Conviene corroborar los resultados del proteinograma con ensayos inmunológicos más específicos como la inmunodifusión radial o la inmunoelectroforesis. aprox. 12.

El Ag se desplaza en la agarosa y precipita al encontrarse con el Ac. Si se produce el reconocimiento Ag-Ac se forman bandas de precipitación. 5. INMUNOELECTROFORESIS EN COHETE La inmunoelectroforesis en cohete es una técnica cuantitativa equivalente a la inmunodifusión radial pero. el antisuero (Ac) se incorpora al gel de manera que el Ac no pueda migrar. Una vez depositadas éstas se activa el campo eléctrico. Así. alteraciones de distintas proteínas. Al igual que en la inmunodifusión radial. Comparando los resultados de la muestra con los obtenidos en las diluciones patrón obtendremos un resultado cuantitativo. orina o líquido cefalorraquídeo. La precipitación va produciéndose a medida que el Ag avanza hacia el ánodo de manera que al ir disminuyendo la concentración de Ag los bordes laterales se van acercando hasta unirse. En el gel se realizan unos pocillos (generalmente en el cátodo) que se rellenarán con la muestra o con diluciones patrón. a en la que la placa se expone a un campo eléctrico. Se utiliza fundamentalm ente para analizar. especialmente inmunoglobulinas en suero. cualitativamente. se produce una precipitación triangular (en estela de cohete). La concentración de Ag de la muestra es directamente proporcional al área y altura del triángulo. 9 .difunden durante 18-24h.

Un paciente con un mieloma: a) ¿Tendría hiper o hipoproteinemia? b) Si quisiera identificar la inmunoglobulina que aparece alterada ¿qué técnica podría utilizar? c) ¿Y si quisiera cuantificarla? 6. Es una técnica muy rápida que se utiliza especialmente en le detección de bandas oligoclonales en líquido cefalorraquídeo. La unión Ag-Ac da lugar a la formación de bandas de precipitación visulalizadas tras lavar y teñir. 3. 4. a) b) c) d) e) 9. 10 . INMUNOFIJACIÓN La inmunofijación consiste en la separación electroforética de las proteínas de una muestra seguida del contacto del gel con una tira de acetato de celulosa impregnada con antisuero. a) b) c) d) e) 10.6. ¿Podría utilizar la espectrofotometría con luz U.V. para cuantificar proteínas? Conteste razonadamente. Preguntas de revisión 1. 7. a) b) c) d) e) 8. a) b) c) La nefelometría difiere de la turbidimetría en: Mide el índice de refracción Ángulo de medida de la luz dispersa Tiene menor sensibilidad Se pueden medir partículas de bajo peso molecular La solución no necesita ser homogénea La La La La La La La La La La La La nefelometría mide: luz dispersada luz transmitida disminución de la luz transmitida disminución de la luz dispersada luz reflejada turbidimetría mide luz dispersada luz transmitida disminución de la luz transmitida disminución de la luz dispersada luz reflejada Conteste razonadamente verdadero o falso a las siguientes afirmaciones de las medidas nefelométricas Su principal aplicación es en la medida de reacciones Ag-Ac Trabajan con medidas en distintas zonas del espectro. Si pretendiera cuantificar la concentración de proteínas en una muestra de suero ¿Qué método emplearía? 2. Describa el fundamento del método anterior ¿Sabría idear un protocolo experimental para llevar a cabo dicho método? ¿Sería necesario preparar algún blanco? Razone su respuesta 5. Se hacen en ángulos de 15 a 90º respecto a la luz incidente.

a) b) c) d) e) 13. La inmunodifusión radial es una técnica cuantitativa ¿Por qué? 16 ¿Cuál cree que es el principal inconveniente de las técnicas inmunológicas? a) Es necesario que las concentraciones de Ag y Ac se encuentren dentro de la zona de equivalencia b) Son téc nicas poco sensibles c) Son técnicas poco específicas 17. a) b) c) d) e) 12. a) b) c) La turbidimetría se puede medir: En turbidímetros especiales. d) ayc 11 . En un campo eléctrico. En cualquier espectrofotómetro o analizador de química clínica. En aparatos con un monocromador de turbidez. una molécula cargada negativamente migra hacia el: a) Ánodo b) Cátodo c) Polo negativo d) Polo positivo e) a y d 19. a) Tamaño y forma de la partícula. a) b) c) d) e) 14. La inmunodifusión doble es una técnica cualitativa o semicuantitativa ¿por qué? 18. Debe ser lo menor posible Deber ser lo mayor posible 15. El punto isoeléctrico es: a) El pH al cual una partícula no se mueve b) El pH al cual una partícula migra al ánodo c) El pH al que la carga neta de la partícula es cero.11. c) Todos 20. ¿Qué factores afectan a la movilidad de una partícula en el seno de un campo eléctrico) a) pH del tampón b) Fuerza iónica del tampón. En aparatos con cubetas especiales El ángulo de medida de la luz dispersa en turbidimetría es: 0o 10o 15 a 90o 90o Cualquiera El ángulo de medida de la luz dispersa en nefelometría es: 0º 10º 15 a 90º 90º Cualquiera La longitud de onda que se emplea en las medidas de luz dispersa: Debe ser tal que no se absorba luz por los componentes del suero. En aparatos con un detector especial para la luz dispersa. b) Potencial del campo.

6. Hemos sometido una muestra de suero a una separación electroforética. ¿Cuál es el medio de soporte más empleado en electroforesis? 22.e) ay b 21. a pH 8. ¿Sería conveniente llevar a cabo la electroforesis de proteínas a pH 6? ¿ Por qué? 12 . ¿Cuál es el método de elección para la lectura de un espectro electroforético? a) Nefelometría b) Turbidimetría c) Elusión d) Fotodensitometría 23. sobre acetato de celulosa a) ¿Qué componentes se nos han separado en el proceso? b) ¿A qué cambios en el proceso recurriremos según queramos cuantificar proteínas o lipoproteínas? 24.