You are on page 1of 15

16.04.

2008

GVENL VE ETKN LABORATUVAR UYGULAMALARI

111-546

HCRE KLTR

Do. Dr. Hill zda

FZK ALTYAPI
Ayr bir oda ClassII Biyogvenlik Kabini Soutmal santrifj Ters mikroskop Pipet seti Pipet yardmcs Tezgah alt buzdolab ve derin dondurucu

16.04.2008

KLTR TPLER
Hcrelerin kkeni: Fetal veya erikin hayvan dokusu; Tmr dokusu; Primer hcre hatt .. Bytlme usulleri: Sspansiyon; adherent; ankoraj baml veya bamsz

KLTR TPLER Orijin


Primer hcre kltrleri hayvan veya bitki dokusundan izole edilip kltre alnan hcrelerden oluur. Devam hcre kltrleri daha hzl blnen, tmrijenitesi daha yksektir. Transforme hcreler normal hcreden kanser hcrelerinin birok zelliini tayan hale geen hcrelerdir.
Yksek younlukta rerler Byme faktr ve seruma daha az ihtiya duyarlar. Daha ziyade ankoraj bamszdrlar. Sonsuz blnme kapasiteleri mevcuttur.

16.04.2008

KLTR TPLER Byme Tipi


Sspanse hcreler besiyerinde asl olarak byrler. Kltr edildikleri kaba balanmadan yaayp oalma zelliine sahiptirler. Kan, dalak, kemik iliinden alnan hcreler genelde sspanse olarak byrler. Yapk hcreler tek kat halinde kltr kabna balanarak byrler. Ektodermal veya endodermal embriyonik hcre katmanlar genellikle bu ekilde byr. Buna fibroblastlar ve epitelyal hcreler dahildir.

KLTR TPLER Byme Tipi


Ankoraj baml hcreler hcre oalmas iin bir yzeye ihtiya duyar. Ankoraj bamsz hcreler kltr kabnn yzeyine zayf olarak tutunmulardr. Byme iin yzeye ihtiya duymazlar.

16.04.2008

HCRELERN GZLEMLENMES
Besiyerinin rengi: Besiyerlerinin ounda pH indikatr bulunur. Sar ise asidite, mor gibi ise alkalilii iaret eder. Besiyerinin ok bazik veya asidik olmas kontaminasyonu, fazla remi kltr, lm kltr, veya hatal C02 lm veya verimini iaret eder. Besiyerinde bulutsu grnt kontaminasyonu veya fazla remi kltr iaret eder. Sspanse bir kltrde topaklanm hcreler ile yapk kltrde soyulmu hcreler bir problemi iaret eder.

HCRELERN GZLEMLENMES
Flasktaki hcrelerinizi kabin iine almadan 40X objektif altnda ters mikroskopta incelemeyi rutin haline getirin.
Yapk hcreler: yzeyde dzenlice yerlemi olurlar. Her tip hcrenin kendine gre bir ekli vardr (yuvarlak, genimsi, karemsi, uzam). Sspanse hcreler: Kre eklindedirler. Baz hcreler flaskn yzeyine hafife tutunmu olabilir.

16.04.2008

HCRELERN ELDE EDL

Primer hcre hatlar veya kan hcreleri ile alan bir laboratuvarda alyorsanz mutlaka Hepatit B as yaptrmalsnz.

HCRELERN ELDE EDL Primer Hcreler


Primer hcrelerin zor ve zahmetlidir. Bir hayvann ldrlp dissekte edildikten sonra hcrelerin izole edilip kltre alnmasn gerektirir. Birok hcre tipinin primer kltrnde hcre says azdr ve hcrelerin mr ksadr. Ancak gerek hcreye en yakn model primer hcrelerdir. Primer hcreleri kendiniz retmeye kalkmadan nce:
Kendi labnzda veya blmnzde bu hcrelerle altn bildiiniz bir meslektanzdan rica edebilirsiniz. Hcrelerin hazrlanmasna yardmc olabilirsiniz. Bu hcrelerin hazrlanmas ok zahmetli olduu iin talebiniz reddedilirse armayn. Baka bir labdan isteyebilirsiniz ancak bu genellikle ortak alma protokoln beraberinde getirecei iin byle bir yola girmeden nce patronunuzla konuun.

16.04.2008

HCRELERN ELDE EDL Primer Hcreler


Primer hcreleri bir baka aratrc veya labdan alyor olsanz da hcrelerin elde edili prosedrn en az bir kez izleyin. Bir gn hcreleri kendiniz hazrlamanz gerektiinde hazrlkl olmu olursunuz. Ayrca verilen emee sayg gsterdiinizi de ifade etmi olursunuz. Hastane ve tp faklteleri baz insan doku ve hcrelerini elde etmek iin iyi bir kaynaktrlar.

HCRELERN ELDE EDL Devaml Hcreler


Eer bir hcre hatt iyi ve hzl blnyorsa hcrelerin eldesi kolaydr ancak blnmesi problemli ise primer hcre hatlarnda olduu gibi zorluklarla karlalr. Unutmayn ki devam hcre hatlar srekli kltr edilmeleri nedeni ile fenotipik kayma yaarlar. Bu nedenle ayn hcre hatt iki farkl labda farkl karakteristikler gsteriyor olabilir. Labdaki dier aratrmaclarla ayn hcre hattn kullanyorsanz bir alma arkadanzdan bir tp donmu hcre isteyebilirsiniz. Donmu hcreleri yeni split olmu hcreye tercih edin zira pasaj says daha az olacaktr.

16.04.2008

HCRELERN ELDE EDL Devaml Hcreler


Devaml hcre hatlarn The European Collection of Cell Cultures (ECACC) veya American Type Culture Collection (ATCC)den satn alabilirsiniz. Bu kaynaklar insan ve hayvan hcrelerinin yansra mikroorganizma, virus, DNA problar salayan zel kurululardr. Kltrlerin yaar durumda ve kontaminasyonsuz olmalar garantilidir. Aksi durumda hcreler yenileri ile cretsiz olarak deitirilmektedir. alacanz hcreleri elde etme araynda bu hcrelerle yaplm en iyi yaynlarn materyel-metod ksmlarn inceleyin. Buradaki pasaj says, besiyeri benzeri ayrntlara dikkat edin.

Dondurulmu Hcrelerin Kltre Edilmesi


karyotik hcreler serumlu besiyeri ve dondurucu ajan (DMSO) varlnda dondurulup sv nitrojende (-196oC) saklanr. Dondurulmu hcreler kuru buzda transfer edilir. Dondurulmu hcrelerin hzlca zlp derhal kltre edilmesi hcrelerin hayatiyetlerinin salanmas iin esastr

16.04.2008

Hcrelerin Bakm Rutin


Beslenmeli: Taze besiyeri ile Split Edilmeli (blnmeli): Kltr flask kapasitesi dolduka hcreler split edilmeli. Dondurulmal: Hcreleri depolamak arttr. retilen hcrelerin bir ksm sv nitrojende dondurulmaldr.

Hcrelerin Bakm Rutin

16.04.2008

Hcrelerin Bakm Besleme ve Pasaj


Hcreler ne kadar hzl byyorlarsa o kadar sk beslenip blnmeleri gerekir. Bir hcre aldnzda ilk renmeniz gerekenler:
Antibiyotik kullanlm m? Hangi antibiyotik kullanlm? Hangi besiyeri tercih edilmi? Hcrelerin seruma ihtiyac var m? Hcreleri ne kadar sklkla besleyip split etmem gerekecek?

Hcrelerin Bakm Antibiyotik


Antibiyotik kullanm birok lab iin standart uygulama olmakla beraber eer laykyla aseptik teknikler uygulanyorsa antibiyotie ok da ihtiya olmaz. Deerli veya kontaminasyona hassas hcrelerde tedbirli olup antibiyotii ihmal etmemekte fayda vardr. Antibiyotikler toz halinde steril ielerde gelir. Steril su ile sulandrlrlar. Filtre sterilizasyona gerek yoktur.

16.04.2008

Hcrelerin Bakm Kltr Kaplar


Flask veya petri kaplar kullanlr. Tek kullanmlk, polistrenden mamuldur ve radyasyon ile sterilize edilmitir. Yapk hcreler iin ilem grm plastik malzeme tercih edilmelidir (Polistren yzey amino gruplar ile kaplanm olabilir). Plateler ise non-spesifik balanarak pozitif yzey oluturan bir protein ile (poly-D-lysine) kaplanm olabilir. Kltr kaplar laboratuvar artlarnda da ilem grebilir.

Hcrelerin Bakm Besiyeri


Hazr olarak satn alnr. Raf mr dolmu olan besiyerlerini hcre ykamada kullanmak mmkndr. Besiyerleri birbirlerine benzer grnt olarak. Genellikle pH indikatr olarak hepsinde fenol krmzs bulunur. Alacanz besiyerinin mikoplazma kontaminasyonuna kar garantili olmasna dikkat edin.

10

16.04.2008

Hcrelerin Bakm Besiyeri


Fenol Krmzs
Limon sars < pH 6.5 Sar pH 6.5 Turuncu pH 7.0 Krmz pH 7.4 Pembe pH 7.6 Mor pH 7.8 Birok hcre pH 7.4te optimum reme gsterir.

Sarms asidik besiyeri:


Fazla remi kltr Bakteri kontaminasyonunu Fazla CO2i iaret ediyor olabilir.

Morumsu bazik besiyeri:


rememi kltr Kf kontaminasyonunu Az CO2i iaret ediyor olabilir.

Hcrelerin Bakm Besiyeri


Besiyeri kullanlmadan nce 37oCye stlmaldr. Su banyosunun iinde (yaklak 10 dak). Besiyerinin iindeki baz bileenler (antibiyotik) uzun sre scakta beklemeye dayankl deildir.

11

16.04.2008

Hcrelerin Bakm Serum


Serum pahaldr. Her zaman blnp dondurularak saklanmaldr. Besiyerine kullanmadan nce eklenir. Erimi paralar tekrar dondurulmadan buzdolabnda birka hafta saklanabilir. Bilinmesi gerekenler:
Serumun yzdesi: %5-20 Serumun tipi: Standart olan dana serumudur. Fetal dana serumu da tercih eden hcreler mevcuttur. Is ile inaktive edilmi mi: Gerekiyorsa kendiniz donmu serumu erittikten sonra 65oCde 30 dak tutup paralara ayrp tekrar dondurarak prosedr tamamlayabilirsiniz. Serumu nereden almalsnz: retimden retime fark gsterebilen bir bileendir. Ucuza kamamalsnz.

Hcrelerin Bakm Hcrelerin Ayrlmas (split)


Hcrelerin reme hzna baldr. Genellikle haftada iki kez yetecektir. Hcreleri ayrmak iin ok beklemek (fazla remi kltr) Yeteri kadar rememi hcreleri ayrmak Taze besiyeri yerine eski besiyeri kullanarak hcreleri ayrmak sk yaplan hatalar arasndadr. Hcreleri split ederken flask/petri yzeyinden ayrmak gerekir bunun iin ekstraseller matriksi degrade eden Tripsin ve bu balanmada esas tekil eden Ca2+y bloke eden EDTA kullanlmaktadr.

12

16.04.2008

Hcrelerin Bakm Hcrelerin Dondurulmas


Hcreleri dondurmadan nce
ATCC kataloundan kullandnz hcrenin dondurulma protokoln kontrol edin. Laboratuvarda uygulanan prosedr arkadalarnzdan renin. Olas modifikasyonlar ATCC protokol ile karlatrarak tespit edin. Eer yeni bir hcre hatt ise hatt gelitiren lab ile irtibata gein veya literatre bakn. Hcreler kryotplerde dondurulup sv nitrojen tanklarnda saklanr. Saklama iin kullanlan sv nitrojen tanklarnn rakl sistemde olmas gerekir. Tpler bu tanklara kataloglanarak yerletirilmelidir. Nitrojen tanklardaki sv nitrojen tankn zelliine bal bir hzda buharlar. Periyodik olarak nitrojen seviyesinin kontrol ve tamamlanmas gerekmektedir. Sv nitrojen tanklar ile allrken mutlaka kryoeldivenler giyilmeli ve koruyucu gzlk taklmaldr. Sv nitrojen buhar solunmamaldr. Elinizle oluan buhar datmamaya gayret edin.

Hcrelerin Bakm Kontaminasyon


Kontaminasyon bakteri, kf, mantar, mikoplazma veya baka hcre kltrlerinden kaynakl olabilir. Makroskopik olarak
Bulutsu grnm Besiyerinin renk deiimi Koku: Flask kapa alp koklanmaz phesiz ancak ilerlemi kontaminasyon inkbatrn kaps alr almaz kendisini hissettirecektir.

Mikroskopik olarak
Dier organizmalarn varl bakteri veya kf gibi kendisini hemen gsterecektir. Hasar grm hcreler mikroskop altnda kolayca gzlenir.

13

16.04.2008

Hcrelerin Bakm Mikoplazma Kontaminasyonu


Mikoplazmalar 0.3um byklnde ok kk organizmalardr. ounlukla ters mikroskopta gzlenmezler. Hcre duvarlar yoktur ve bu nedenle antibiyotikten etkilenmezler. zel boyama yollar ve tekniklerle varlklar tespit edilebilir. Enfeksiyon ar ise hcre hasar da enfeksiyonun varln gsterecektir. Mikoplazma kontaminasyonunu engellemek iin kullanlan besiyeri ve serumlarn mikoplazmasz olmas gerekir. Garantili rn kullann. Baka bir aratrmacdan hcre aldnzda mikoplazma testi yaplp yaplmadn sorun, en iyisi siz kendiniz bu testi yapn.

Hcrelerin Bakm Mikoplazma Kontaminasyonu


Mikoplazma kontaminasyonun varl bir hcre yzey proteinine kar onca uraya ramen neden antikor retilememi olmasnn nedeni olabilir. Mikoplazma testi iin
Floresan boyama PCR

Eer kontaminasyon varsa


lgili hcreyi atn Mikoplazma hcrenin biyolojisini bozar. Deneylerinizi ve sonularnz anlamsz klar. Bir karantina hcre kltr odanzn olmas ve test edilmemi hcreleri yalnzca burada amanz mikoplazma kontaminasyonunun hcrelerinize yaylmasn engelleyecektir.

14

16.04.2008

Hcrelerin Bakm Hcreden hcreye kontaminasyon


Hcrelerinizi gvenilir kaynaktan aln. Ayn anda birden fazla hcre tipi ile almayn. Asla ayn pipeti farkl hcreler iin kullanmayn. Hcreye kullandnz bir pipetle asla besiyeri iesine girmeyin.

Hcrelerin Bakm CO2 nkbatrleri


nkbatr iindeki tepsiyi steril distile su ile doldurmay unutmayn ve her hafta bu suyu tazeleyin. Her hafta raflar %70 EtOH ile silip her ay otoklavlayn. nkbatr kapsn uzun sre ak brakmayn. CO2 okumasnn doruluunu zaman zaman kontrol ettirin. Is takibi iin ayrca bir termometreyi inkbatr iinde bulundurun.

15