MICOBIOTA ALTERNATE EN MILANESAS DE SOJA Y VERDURA

Adrián Hernández Tipa

Universidad Nacional de Mar del Plata

Facultad de Ciencias Agrarias

Agosto de 2005

MICOBIOTA ALTERANTE EN MILANESAS DE SOJA Y VERDURA

Adrián Hernández Tipa

Monografía presentada como requisito parcial para optar al grado de Licenciado en Ciencia y Tecnología de los Alimentos.

Licenciatura en Ciencia y Tecnología de los Alimentos Facultad de Ciencias Agrarias Universidad Nacional de Mar del Plata.

Agosto de 2005

MICOBIOTA ALTERANTE EN MILANESAS DE SOJA Y VERDURA

Adrián Hernández Tipa

Director: Dr. Federico Laich Asesor: Ing. Agr. Yolanda Andreoli Asesor: Lic. Osvaldo Cuello Delegado del Decano:

................................ ................................ ............................... ...............................

AGRADECIMIENTOS
Al dueño de la empresa donde realice este proyecto. Sin A Federico Laich, Yolanda Andreoli y Osvaldo Cuello, A Yoli y Elsa del Laboratorio de Microbiología de Suelos

• • •

su permiso no hubiera sido posible mi trabajo. quienes me guiaron en mi trabajo. de I.N.T. A. Balcarce, quienes me a yudaron cuando el trabajo me desbordaba. • A la profesora Graciela Vacarezza de la Facultad de Ciencias Veterinarias, UNICEN, Tandil, quien me permitió utilizar el servidor de la Facultad y acceder a valiosísima información.

ÍNDICE
1. INTRODUCCIÓN. ................................................................. 1 1.1. Los hongos como contaminantes y degrad adores de los alimentos. ........................................................................... 1 1.1.1. Principales es pecies cont aminantes. ........................... 3 1.1.2. Condiciones ambientales para el desarrollo de la mic obiota. ......................................................................... 5 1.2. Problemas del consumo de alimentos contaminados con hongos. ............................................................................... 7 1.2.1. Principales mic otoxinas y su efecto en el humano. ....... 8 1.3. M étodos de control del crecimiento de contaminantes. . 12 1.4. Objetivos. .................................................................... 14 2. MATERI ALES Y MÉTODOS. ................................................ 16 2.1. Proceso de elaboración. ............................................... 16 2.2. Identificación de la micobiota contaminante. ................ 18 2.2.1. Muestreo. ................................................................ 18 2.2.2. Aislamiento y purific ación. ........................................ 19 2.2.3. Identificación primaria. ............................................. 20 2.3. Origen de los contaminantes identificados en las milanesas. .......................................................................... 20 2.4. Tratamiento térmico. .................................................... 21 2.5. Efecto del pan rallado como contaminante. .................. 23 2.6. Contaminación cruzada. ............................................... 24 2.8. Control de la contaminación con Sorbato de Potasio. ... 26 3. RESULT ADOS. ................................................................... 27 3.1. Identificación de la micobiota contaminante. ................ 27 3.1.1. Materias primas. ...................................................... 27 3.1.2. Milanesas. ............................................................... 27 3.1.3. Ambiente. ................................................................ 30 3.2. Origen de los contaminantes identificados en las milanesas. .......................................................................... 30 3.3. Tratamiento térmico. .................................................... 35 3.4. Efecto del pan rallado como contaminante. .................. 37 3.5.Contaminación cruzada. ................................................ 38 3.6. Control de la contaminación con Sorbato de Potasio. ... 40
4. DISCUSIÓN FIN AL. ............................................................ 42 5. BIBLIOGRAFÍ A. ................................................................. 46

ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1: Escala visual de contaminación utilizada en la evaluación de las milanesas de zapallo y cebolla. ................................. 36 Tabla 2: Efecto de la contaminación cruzada en milanesas de cebolla y zapallo. La escala utilizada para cuantificar el grado de contaminación se detalla en el apartado 2.6. ................... 50

ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1: Proceso de fabricación de las milanesas de Soja. ........ 28 Figura 2: Esquem a del ensayo aplicando un shock térmico a las milanesas una vez escaldadas. ........................................... 33 Figura 3: Estado de 4 milanesas de verdura con una semana de almacenamiento, después de la incubación a 25º C en cámara húmeda durante 7 días. ...................................................... 41 Figura 6: Recuento de contaminantes en muestras de pan rallado recolectadas en diferentes tiempos del proceso de elaboración. ........................................................................................ 45 Figura 7: Desarrollo de colonias fúngicas en las placas de Petri con el medio de cultivo APA 5% Rosa de Bengala, 2% NaCl y pH 5,5. Las placas corresponde a las muestras de pan rallado sin usar (izquierda) , pan rallado usado (centro), y pan rallado de las bandejas (derecha). Todas las placas corresponden a la misma dilución, lo que permite la comparación entre ellas. ... 46 Figura 8: Milanesas sin rebozar sin shock (izquierda) y con shock (derecha). ......................................................................... 47 Figura 9: Milanesas rebozadas sin shock (izquierda) y con shock (derecha). ......................................................................... 48 Figura 10: Milanesas de cebolla incubadas en cámara húmeda durante 6 días (2 repeticiones). En cada fotografía se presentan dos milanesas, en cada caso la milanesa de la izquierda se enfrió sobre las bandejas (con contaminación cruzada) y la derecha sobre papel estéril (sin contaminación cruzada). ........................................................................... 51 Figura 11: Milanesas de zapallo incubadas en cámara húmeda durante 6 días (2 repeticiones). En cada fotografía se presentan dos milanesas, en cada caso la milanesa de la izquierda se enfrió sobre las bandejas (con contaminación cruzada) y la derecha sobre papel estéril (sin contaminación cruzada). ........................................................................... 52 Figura 12: Crecim iento fúngico a 20º C sin el agregado de sorbato de potasio, con sorbato y con sorbato sobre papel estéril evitando la contaminación cruzada. ..................................... 53

RESUMEN
Los hongos filamentosos tienen la capacidad de desarrollarse sobre la superficie de muchos alimentos con un típico aspecto aterciopelado o algodonoso, a veces pigmentado. Si bien es cierto de de que los ciertas mismos, especies muchas son útiles en o la de

elaboración componentes

ciertos

productos

alimenticios especies

fúngicas

intervienen en la formación de micotoxinas y en la alteración de diferentes tipos de alimentos. En estos casos se considera que el producto no es apto para el consumo. El objetivo del presente trabajo fue determinar el origen de la contaminación fúngica e identificar las especies existentes en la elaboración de milanesas de soja y verdura en una fábrica ubicada en el SE bonaerense. Para ello, se realizó un estudio cuantitativo desarrollaban almacenamiento y cualitativo a través de las de del diferentes proceso En especies de este que se y se elaboración análisis

milanesas.

determinó la micobiota existente a partir de los productos utilizados como materia prima (harinas, pan rallado, etc.), y sobre el producto elaborado y almacenado. Las principales especies aisladas fueron identificadas como Penicillium spp.,

Aspergillus spp., Rhizopus spp. Alternaria sp. y Cladosporium
spp. La presencia de hongos filamentosos en el alimento se debió principalmente a la contaminación ambiental rallado utilizado de un en el rebozado final del previo aplicación tratamiento térmico al y al pan La rebozado producto.

disminu yó significativamente la concentración de levaduras en unidades formadoras de colonia por gramo (ufc), mientras que el recuento de ufc de hongos filamentosos se incrementó luego del rebozado y a través del periodo de almacenamiento. Por último, la utilización de sorbato de potasio y la conservación

de

las

milanesas

a

bajas

temperaturas,

incrementó

significativamente la vida útil del producto.

ABSTRACT
Moulds have the aptitude to develop on surfaces of man y food w ith their typical velvet or cotton y aspect, sometimes pigmented. Though it is true that certain species are useful in the production of food products or their components, many fungi species intervene in the formation of m ycotoxins and in the alteration of different types of food. In these cases it is considered consumption. The aim of the present w ork was to determine the origin of the fungi spoilage and to identify the species in the production of soybean and vegetable escalopes in a factory located in the SE of Province of Buenos Aires. There, a quantitative and qualitative stud y of different species developing during the process of production and storage of the product w as realized. In this anal ysis the existing m ycobiota w as determined from the products used as raw material (flours, breadcrumbs, etc.), and from the elaborated and stored product. The principal isolated species spp., w ere identified spp. as that the product is not suitable for the

Penicillium
sp.

spp., and

Aspergillus

Rhizopus

Alternaria

Cladosporium spp. The presence of spoilage moulds in the
food w as related principall y to the environmental contaminants and to the breadcrumbs used. The application of a thermal shock before the final rolled in breadcrumbs, decrease significantl y the yeast colon y forming units per gram (cfu), w hereas moulds cfu increased after the treatment and during storage. Finall y, the application of potassium sorbate and conservation at low temperature, increase the shelf-life of the product.

1. INTRODUCCIÓN.
En los últimos años la dieta de los argentinos se ha visto orientada hacia alimentos más saludables y de menor costo y la soja ha desempeñado un papel mu y importante como reemplazante de las proteínas de origen animal, ya sea bajo la forma de leche, milanesas o hamburguesas de soja. Si bien las cantidades de soja que se pierden por contaminaciones microbiológicas durante la elaboración de los alimentos son importantes, no existen publicaciones que citen el problema y menos aún, que traten de enumerar o explicar cuáles son los microorganismos implicados, ni como evitar la alteración de este tipo de alimentos. El presente trabajo se llevó a cabo en una fábrica familiar de milanesas de soja ubicada en la ciudad de Tandil. Si bien la producción de la fábrica es pequeña y la ma yoría de la mercadería se vende en comercios de la ciudad, la intención del propietario fue aumentar su producción y el área de venta hacia otras ciudades. En estas circunstancias el tiempo que transcurre entre elaboración y consumo es ma yor y por lo tanto se detectaron problemas de contaminación y desarrollo de microorganismos. trabajo Ante fue esta situación la los finalidad del presente identificar principales

microorganismos contaminantes, detectar su fuente de inóculo y proponer modificaciones durante la elaboración para evitar la aparición y desarrollo de microorganismos.

1.1. Los hongos como contaminantes y degradadores de los alimentos.
Los consumidores de los países desarrollados tienen una actitud más crítica a la hora de elegir que comer y que beber como consecuencia de la vida moderna. Por ende los microbiólogos en alimentos tienen cara a cara el enorme

desafío de garantizar la frescura de los alimentos que está implícita en la demanda de los consumidores. Los alimentos con procesos menos severos, libres de aditivos, más seguros y fáciles de preparar son buscados debido a la alta concientización del consumidor en lo que respecta a nutrición y salud (Loureiro y Querol, 1999). Actualmente existe un amplio conocimiento y comprensión de los hongos en la contaminación alimenticia. En los últimos 5-10 años se lograron los mayores progresos que han contribuido a prevenir la contaminación causada por hongos, remarcándose su importancia en la contaminación alimenticia tras el descubrimiento de las micotoxinas (Filtenborg et al., 1996). A pesar de las innovaciones científicas aplicadas a la identificación de microorganismos, la mayoría de los métodos de análisis estándar, así como otros métodos utilizados en la industria de alimentos, siguen utilizando los pasos clásicos establecidos hace ya algunas décadas: 1) mezcla/homogeinización de la muestra; 2) dilución

decimal del homogeneizado; 3) siembra de las diluciones en el medio apropiado 4) aislamiento, purificación e identificación de los microorganismos. En algunos casos se necesita aplicar técnicas de preenriquecimiento o de selección previo a la siembra. (Loureiro y Querol, 1999). Generalmente los alimentos no son tratados como un

ecosistema, tal vez porque no sean considerados sistemas “naturales”. Sin embargo, si lo son, ya que los almacenes de alimentos son vastos. Los alimentos como hábitat de microorganismos son mu y ricos en contraste del suelo, agua y vegetales. Dadas las condiciones fisicoquímicas correctas, una población de microorganismos será capaz de crecer y

desarrollarse en ese alimento. En los alimentos “vivientes” como las frutas y vegetales frescos, un gran número de mecanismos de defensa son aplicados en contra de la invasión de microorganismos. Pero en los alimentos que se encuentran en un estado de latencia o no vivos los factores a tener en cuenta tensión carbono), son de actividad temperatura gases consistencia, de (de agua, concentración y oxígeno y de iones de hidrógeno, procesado almacenamiento), dióxido efectos

(especialmente

composición

nutricional,

específicos de solutos y la presencia de conservantes (Pitt y Hocking, 1997).

1.1.1. Principales especies contaminantes.
Los mohos son capaces de crecer en todo tipo de

alimentos: cereales, carne, lácteos, frutas, vegetales, frutos secos y productos de éstos. El crecimiento fúngico resulta en diversos de tipos de alteraciones o alimenticias: flavores desagradables, toxinas, decoloración, pudrición y formación propágulos es patógenos a menudo alérgenos por (Chelkowski,1991; la producción de Bigelis, 1992; Tipples, 1995). El deterioro de las propiedades sensoriales causada exoenzimas: lipasas, proteasas y carbohidratasas (Bigelis, 1992). Una vez que éstas enzimas se encuentran dentro del alimento continúan su actividad independientemente de la destrucción o la remoción del micelio (Tindale et al ., 1989; Whitfield et al ., 1991; Lily y Viani,1995). Con respecto a las levaduras, los reportes publicados hace unos 30-40 años atrás, afirmaban que el riesgo que provocaban las levaduras en la salud humana no era significante. Sin embargo, a partir de la década de los 80 existen trabajos de investigación que refieren por primera vez la necesidad de reevaluar el impacto en la salud pública causada por las levaduras en alimentos (Loureiro y Querol, 1999). La

contaminación alteración ácidas de o

producida las sin

por

levaduras físicas las por o

consiste

en

una del más

propiedades azúcar

sensoriales alteraciones una

alimento como resultado de su actividad. En las bebidas con ocurren conocidas, estando caracterizadas abundante

producción de gas que puede llegar a deformar envases, formar sedimentos, aromas y gustos alterados. En otro tipo de alimentos pueden flavores las principales son y alteraciones el que las levaduras la y provocar crecimiento de superficial, (Loureiro

decoloración, la producción de gas, la formación de biofilms, desagradables cambios textura Querol, 1999). La micobiota xerofílica está caracterizada por ser la de mayor capacidad para crecer bajo condiciones de actividades de agua (a w ) de 0,85 y es asociada mu y comúnmente a alimentos de humedad intermedia, inclu yendo cereales, nueces, especias y un amplio espectro de alimentos secos (Hocking y Pitt, 1988). Según un estudio realizado en harinas Australianas (Berghofer, 2003) los microorganismos más frecuentemente detectados en las harinas fueron Bacillus spp., coliformes y mohos. Se aislaron 102 Unidades Formadoras de Colonia por gramo (U.F.C./g) de levaduras y 103 U.F.C./g de mohos, spp. Los causantes más frecuentes de la contaminación de panificados son los hongos y levaduras. Los géneros de hongos más importantes aislados a partir de los panificados españoles son Eurotium , Cladosporium y las especies mas xerotolerantes de siendo los mohos más comúnmente aislados

Aspergillus, Penicillium Penicillium, Cladosporium y Eurotium

Penicillium

Penicillium

y

Aspergillus

(Abellana et al . 1997b). Según Ramos (2002) a causa de la a w de los productos panificados (0,75–0,90), los hongos alterantes son comúnmente xerófilos, encontrándose especies de

Eurotium y Aspergillus . Estos mohos son destruidos durante el
horneado, por lo tanto la contaminación proviene de las esporas ambientales o de las superficies que se encuentra en contacto con el producto durante el enfriado (Seiler, 1988; Fustier et al. 1998 ). El crecimiento fúngico en panificados durante el almacenamiento es un problema serio que ocasiona importantes pérdidas económicas. A causa de la baja a w de estos productos (0,75-0,90), la contaminación fúngica es comúnmente producida por las especies más xerofílicas del género Aspergillus. Las especies de Eurotium , formalmente conocidas como las del grupo de Aspergillus glaucus tienen u n crecimiento óptimo a 0,70-0,80 a w en sustratos que contienen altas concentraciones de sal o azúcar (I.C.M.S.F., 1980). En porotos de soja se ha encontrado que los mohos son importantes contaminantes. Los géneros aislados más frecuentemente son Penicillium , Aspergillus , Scopulariopsis ,

Mucor , Rhizopus y Cladosporium . Las especies de Aspergillus
encontradas y aisladas fueron A. candidus, A. flavus, A.

fumigatus, A. niger, A. ochraceus, A. sydowii y y A. versicolor.
(Kacàniovà, 2003) . Rabie (1997) encontró que la micobiota de los granos de cebada sometidos a malteado también variaba según su etapa de proceso: los granos sin remojar dieron conteos más altos de Alternaria alternata, Rhizopus oryzae, Epicoccum nigrum y

Mucor spp, sin embargo, en los granos preremojados se
obtuvieron conteos más altos de Penicillium spp.

1.1.2. Condiciones ambientales para el desarrollo de la micobiota.
Anderson y Smith (1971) y Deans et al . (1980), demostraro n que la formación y germinación de conidios y esporas depende principalmente de las condiciones de crecimiento (sustrato, a w

y temperatura), lo que revela las limitaciones de los métodos microbiológicos basados en la enumeración de esporas formadas para evaluar el crecimiento fúngico. El concepto de a w introducido por Scott (1957) es la forma más útil para expresar la disponibilidad de agua existente para el crecimiento de microorganismos (Lace y y Magan, 1991) y su actividad enzimática (Acker, 1963). La a w no es el único factor ambiental crecimiento temperatura, que y pH, influencia sobrevivencia el crecimiento de oxígeno fúngico. por y dióxido Su la de estarán influenciados

concentración

carbono, y la presencia de conservantes. Cuando uno de estos factores es subóptimo, el efecto inhibitorio de la a w reducida tiende a incrementarse. Los niveles de a w correspondientes al rango de contenidos de humedad pueden ser trazados para proveer una isoterma de sorción de agua. Esta isoterma es mu y útil, pues no sólo nos muestra indican guía a que contenidos de humedad son conseguidos cambios periodo reducida. del de El niveles de a w deseables o indeseables, sino que también nos que significativos determinar de alimentos en serán la solo pequeños del a aw contenido de humedad en términos de a w . Por ende, es una útil para y longitud por su almacenamiento moderadas crecimiento conservados alimentos temperaturas

preservados fúngico

inadecuadamente

almacenados puede provocar la inducción de producción de micotoxinas (Jimenez et al ., 1991; Scudamore y Hetmanski, 1995). Las isotermas de sorción de agua de cereales y de otros productos han sido estudiadas y publicadas por diferentes autores: en arroz por Rahgaswami (1973), Hunt y Pixton (1974) y Gough y King (1980); en harina de trigo por Bushuk y Winkler (1957), Pratap et al . (1982) y Leiras e Iglesias (1991); y en harina de arroz, harina de arroz aglutinada y arroz aglutinad o Abdullah et al. (2000).

1.2. Problemas del consumo de alimentos contaminados con hongos.
La consecuencia más grave de la presencia de mohos en los alimentos es que éstos pueden llegar a ser capaces de producir toxinas si las condiciones son favorables. Estas toxinas se denominan micotoxinas y son metabolitos tóxicos que ingeridos en cantidad suficiente, provocan intoxicación en el hombre y animales. Una micotoxicosis es un problema alimentario, que no es infeccioso ni contagioso (Bourgois, 1994). Como para todas las sustancias tóxicas ha y que distinguir entre las intoxicaciones agudas que se producen por la ingestión de una sola vez o varias veces seguidas de una dosis relativamente elevada de toxinas, y las intoxicaciones crónicas que se manifiestan después de la ingestión de pequeñas dosis repetidas durante largos periodos. Estas últimas son las que afectan en ma yor grado al ser humano ya que al demostrarse que la Aflatoxina B1 es cancerígena, las concentraciones necesarias para producir una intoxicación son mínimas (Moss, 2002). Estas intoxicaciones provo can problemas pasajeros o crónicos, que afectan a varias funciones del organismo: alteraciones hepáticas, renales, de los centros nerviosos, circulatorias, del tracto digestivo, etc. Las micotoxinas son producto del metabolismo secundario de los mohos y no todos las elaboran. Además el tipo de sustrato y las condiciones ambientales juegan un papel importante en el nivel de su producción. Es por esta razón por la que no es suficiente detectar en un alimento una especie de moho tóxico para considerar a un alimento peligroso.

Las micotoxinas más importantes son las:

Aflatoxinas,

producidas por A. flavus y A. parasiticus ; la Zearalenona producida por especies del género Fusarium ; la Ocratoxina que es producida por

A.

ochraceus

y

P.

viridicatum ;

los

Tricotecenos que son producidos sobre todo por especies del género Fusarium y también por otras especies de mohos como

Stachybotris , Trichotecium , Myrothecium , Dendrodochium , etc;
la Patulina que es producida por numerosos mohos pero principalmente por P. expansum y la Fumonicina producida principalmente por F. moniliforme. En la alimentación humana la diversificación de la dieta impide la absorción regular de cantidades suficientes de toxinas para llegar a ser peligrosas a excepción de países castigados por el hambre. Actualmente, el consumidor tiene la tendencia a creer que todo lo natural es bueno, pues precisamente las micotoxinas son un ejemplo de moléculas naturales elaboradas espontáneamente por mohos en nuestro ambiente y que pueden ser el origen de graves intoxicaciones. Son típicos contaminantes biológicos y por lo tanto se debe prestar especial atención en el control de su desarrollo. Una de las principales fuentes de contaminación de mohos micotoxigénicos, es el aire (Cvetni et. al, 1997). En Croacia se expusieron al aire 350 cajas de Petri durante 10 minutos y se identificaron 3.400 colonias de 22 géneros distintos, siendo los géneros mas frecuentes Cladosporium (44.7%), Penicillium (34.4%), géneros

Alternaria

(26.3%),

Aspergillus
y

(21.6%)

y

Absidia
eran

(12.2%). Encontrándose que el 16,9 % de los aislados de los

Aspergillus ,

Fusarium

Trichoderma

potencialmente productores de micotoxinas.

1.2.1. Principales micotoxinas y su efecto en el humano.

Las

aflatoxinas además

son de

compuestos

con

efectos

tóxicos

inmediatos,

inmunosupresores,

mutagénicos,

teratogénicos y carcinogénicos. El principal órgano afectado por la carcinogénesis de las aflatoxinas es el hígado. La evaluación de los resultados epidemiológicos y de laboratorio llevada a cabo en 1987 por el Centro Internacional de Investigaciones sobre el Cáncer (CIIC) determinó que existen suficientes datos demostrativos del efecto carcinogénico de mezclas naturales de aflatoxinas en el ser humano, las cuales se clasifican por ello como carcinógeno del Grupo 1, salvo en el caso de la aflatoxina M1, que se considera posiblemente carcinogénica para el hombre (Grupo 2B) (I ARC, 1987) Se han registrado varios brotes de aflatoxicosis en países tropicales, la ma yoría entre adultos de las poblaciones rurales con una nutrición deficiente y cuyo alimento básico era el maíz. El cuadro clínico llevaba a sospechar una intoxicación hepática aguda, que se confirmó en las por las alteraciones de necropsia morfológicas observadas muestras

hepática, indicativas de hepatitis tóxica. (Tandon et. al. 1977) Las tasas de mortalidad en la fase aguda eran del 10%-60%. Transcurrido un año, los supervivientes no presentaban ictericia y la mayoría se habían recuperado clínicamente. (Bha t and Krishnarnachari, 1977). También se han señalado a las aflatoxinas como posibles factores etiológicos de un cuadro de encefalopatía y degeneración grasa similar al síndrome de Re ye, frecuente en países de clima cálido y húmedo. Con degeneración grasa, palidez y aumento de tamaño del hígado y los riñones, unidos a edema cerebral grave. El ácido 3-nitropropiónico (3-NPA) es un metabolito

secundario de Artbrinium sp., género de hongos considerados causantes de una forma de intoxicación alimentaria aguda

denominada “intoxicación por la caña de azúcar mohosa” (Liu, 1988). Durante el periodo 1972-1988, resultaron afectadas 884 personas y se produjeron 88 (10%) defunciones. (Liu et al ., 1992). El principal dato epidemiológico es el reducido número de personas en cada brote (entre una y cinco), siendo las víctimas en su mayoría niños y jóvenes. El periodo de incubación suele ser de entre 2 y 3 horas a partir de la ingestión de la caña de azúcar mohosa, y se desarrolla principalmente con vómitos, distonía, desviación unilateral de la mirada, convulsiones, espasmo cardopedal y coma. Entre el 10% y el 50% de los pacientes se ven afectados por un cuadro de distonía tardía, consecuencia de la necrosis simétrica y bilateral de los núcleos basales. En el adulto, el 3-NP A causa síntomas gastrointestinales; no son frecuentes los signos de encefalopatía grave. (Ludolph et al. , 1991) Las ocratoxinas son metabolitos secundarios de cepas de

Aspergillus y Penicillium presentes en los cereales, el café y el
pan, así como en todo tipo de productos alimenticios de origen animal en muchos países. (Speijers y Van Egmond, 1993) La más frecuente es la ocratoxina A, que también es la más tóxica. Se ha comprobado que tiene efectos nefrotóxicos, inmunosupresores, carcinogénicos y teratogénicos en todos los animales de experimentación estudiados hasta el momento (Criterios de Salud Ambiental). Se registró en Italia un caso de insuficiencia renal aguda debido posiblemente a la inhalación de ocratoxina A en un granero que había permanecido cerrado por 2 años (Di Paolo e t

al., 1994). Los síntomas aparecieron al cabo de 24 horas,
durante las cuales el paciente presentó tensión epigástrica transitoria, dificultad respiratoria y pirosis retroesternal. La biopsia investigó mostró la una necrosis de fina tubular demostró aguda, A en pero no se La la presencia de capa ocratoxina sangre.

cromatografía

cualitativamente

presencia de la micotoxina en el trigo del granero. No existe fase aguda; los primeros signos y síntomas son inespecíficos, consisten en cansancio, cefaleas, pérdida de peso y palidez. A lo largo de varios años va instaurándose una proteinuria leve de proteínas de bajo peso molecular, sin hipertensión, pero con anemia aplásica o normocrómica. La nefropatía endémica se caracteriza por lesiones bilaterales y fundamentalmente crónicas de la corteza renal (degeneración tubular, fibrosis intersticial e hialinización glomerular). En fases avanzadas de la enfermedad disminu ye mucho el peso y el tamaño de los riñones, que muestran una fibrosis cortical difusa, por lo general sin signos de inflamación (Radoni ć et al ., 1966; Vukeli ć

et al ., 1992).
El CIIC clasificó la ocratoxina A como un compuesto

posiblemente carcinogénico para el ser humano (Grupo 2B) (I ARC, 1987). Los tricotecenos son micotoxinas producidas sobre todo por miembros del género de

Fusarium ,
géneros

aunque (como

también

las

sintetizan

hongos

otros

Trichoderma,

Trichothecium, Myrothecium y Stachybotrys) . Hasta la fecha se
han aislado 148 tricotecenas pero sólo unas pocas se han detectado como contaminantes de los alimentos. De ellas las más importantes como son el desoxinivalenol el (DON), conocido y el también vomitoxina, nivalenol (NIV)

diacetoxicirpenol (D AS), mientras que la toxina T-2 es menos común. (Criterios de Salud Ambiental , 1990). Las manifestaciones consisten de habituales en La de la intoxicación y micotoxicosis po r por

tricotecenos acompañadas

inmunodepresión primera

náuseas,

vómitos.

tricotecenos que se identificó fue la aleucía tóxica alimentaria, en la URSS en el año 1932, con una tasa de mortalidad del 60%. (Gajdušec, 1953).

En varios casos, la micotoxicosis por tricotecenas se debió a una única ingestión de pan elaborado con harina tóxica (Bhat et al. , 1989) o de arroz (Ueno, 1971), (Wang et al., 1993). En los animales de experimentación los tricotecenos son 40 veces más tóxicos por inhalación que por vía oral (98). La zearalenona es producida principalmente por Fusarium

graminearum y especies afines, sobre todo en el trigo y el
maíz, pero también en el sorgo, la cebada y los piensos compuestos. La zearalenona y sus derivados tienen efectos estrogénicos en varias especies animales (infertilidad, edema vulvar, prolapso vaginal e hipertrofia mamaria en hembras, y feminización de los machos, con atrofia testicular y aumento de tamaño de las mamas) (Peraica et al. , 2000). Las fumonicinas son micotoxinas producidas en todo el mundo por Fusarium moniliforme y especies afines cuando crecen en maíz. Tienen importancia toxicológica las fumonicinas B1 y B2; las demás aparecen en concentraciones mu y bajas y son menos tóxicas. En la India se informó de un brote único de La intoxicación enfermedad aguda se y transmitida por por los alimentos y causada posiblemente por la fumonisina B1. (Bath

et

al., 1987).

caracterizaba diarrea

dolores que

abdominales,

borborigmos

transitorios,

comenzaban entre media hora y una hora después de consumir pan ácimo preparado con sorgo o maíz mohos. Los pacientes se recuperaron por completo al suprimir la exposición a la toxina y no se produjeron defunciones. Las toxinas de F. moniliforme han sido clasificadas por un grupo de trabajo del CIIC como posiblemente carcinogénica para el ser humano (Grupo 2B) (I AR C, 1987).

1.3. Métodos de control del crecimiento de contaminantes.
Un método a para prevenir procesar la contaminación ser la fúngica en del

alimentos

medio

puede

aplicación

"concepto barrera" o el método de conservación combinada. Este método utiliza varias “barreras”, que separadamente no otorgan la conservación adecuada, pero combinadas brindan la conservación conveniente. Estas barreras pueden ser cambios en la temperatura, a w , pH, calentamiento mínimo o la adición de conservantes. Para que éste concepto sea utilizado en forma exitosa, la influencia de varios factores intrínsecos y extrínsecos ambientales sobre que el crecimiento la fúngico necesitarán crecimiento ser y cuantificados. El factor más importante dentro de los factores afectan germinación, establecimiento fúngico sobre sustratos ricos en nutrientes probablemente sea la disponibilidad de agua (Magan, 1988; Cooke y W hipps, 1993). El rango de valores de a w que permiten la germinación de esporas es ma yo r a la temperatura óptima, y generalmente es requerida una ma yor a w para la formación de la espora que para la germinación. Es por ello que el nivel de a w es de importancia práctica para controlar la aparición y severidad de la alteración producida por mohos. Comúnmente se observa que los alimentos más fácilmente degradables por la actividad de microorganismos y cambios químicos, son usualmente los que poseen una a w 2000). La ácidos mayoría débiles de los agentes conservantes moléculas clásicos inhiben son el mayor (Abdullah, et al .,

orgánicos.

Estas

crecimiento de células bacterianas y fúngicas. El ácido sórbico también inhibe la germinación de esporas bacterianas (Sofos y Busta, 1981; Blocher y Busta, 1985). Según Eklund (1983, 1985) y Peth ybridge et al ., (1983). La actividad antimicrobiana de todos estos ácidos débiles depende principalmente de la molécula sin disociar. Los conservantes ácido débil existen en

solución en un equilibrio dependiente del pH entre el estado disociado y no disociado. La actividad inhibitoria es óptima a bajo pH debido a que favorece al estado no disociado y cargado de la molécula. De esta forma, la molécula no es

permeable a través de la membrana y por ello capaz de ingresar a la célula. Sin embargo, la acción inhibitoria se debe a los compuestos que atraviesan la membrana plasmática en el estado disociado. Subsecuentemente, al encontrarse con un pH ma yor dentro de la célula, la molécula se disocia resultando que el escape de los aniones y protones hacia el exterior de la membrana no sea posible. Una reducción del pH desde 6,0 a 5,0-5,2 resulta en un gran incremento relativo en la proporción de la forma no disociada (Chirife y Favetto, 1992). En conclusión, las moléculas de conservantes difunden al interior de la célula hasta que el equilibrio es alcanzado y provoca la acumulación de aniones y protones dentro de la célula (Booth y Kroll,1989). Por otro lado, se ha propuesto que la inhibición del crecimiento por los conservantes ácido débil se debe a un gran número de acciones, incluyendo la disrupción de la membrana (Freese et al ., 1973; Stratford y Anslow , 1998; Brace y et al ., 1998), inhibición de las reacciones metabólicas esenciales, estrés en la homeostasis del pH intracelular (Salmond et al ., 1984; Cole y Keenan, 1987; Brace y et al ., 1998) y acumulación de aniones tóxicos (Eklund, 1985). En las levaduras, también se ha propuesto que la acción inhibitoria de los conservantes ácido débil es debida a la inducción de una respuesta a un stress enérgico que atenta a restaurar la homeostasis y resulta en la reducción de los pooles de energía disponible para el crecimiento y otras funciones metabólicas esenciales. Stratford y Anslow (1998) propusieron que el ácido sórbico actúa como una sustancia activa a las membranas de los microorganismos y no como un conservante ácido-débil.

1.4. Objetivos.

La soja es uno de los cultivos más importantes de la Argentina tanto en superficie sembrada como en niveles de producción. Tanto los aceites como las harinas de soja son ampliamente consumidos en el país ya sea por sus propiedades nutritivas como por sus bajos precios. De las comidas con soja, la milanesa de soja es la más conocida y aceptada en nuestro medio. Ha y innumerables variantes para este preparado. Estas recetas se publican mu y usualmente en revistas, libros e internet y van desde triturar los porotos y formar una masa con condimentos, hasta mezclar distintas harinas, entre ellas la harina de soja con huevo y especias. A medida que se extendió su consumo apareció en el mercado la venta minorista de harinas de soja en comercios naturistas fueron y fraccionadores. pequeñas de y En la medida que la soja a la reemplazó a otros alimentos en la dieta de los argentinos, apareciendo de empresas soja. dedicadas elaboración innumerables milanesas Actualmente empresas existen (P yMES)

pequeñas

medianas

dedicadas exclusivamente a la elaboración de éste producto. Además, la popularidad de éste producto es tal que figura en las cartas de numerosos restaurantes de Argentina. En lo que respecta a alimentos a base de soja no existen antecedentes que describan su micobiota. Tampoco éste producto se encuentra bajo una legislación y no es nombrado en el Código Alimentario Argentino (C. A. A.). Sólo, existen trabajos que enumeran los contaminantes encontrados en productos cárnicos con agregados de proteínas o aislados de soja. Como se expreso anteriormente, el desarrollo del presente trabajo se llevó a cabo en una fábrica familiar de milanesas de soja ubicada en la ciudad de Tandil.

Los objetivos fueron: 1. Identificar la micobiota contaminante durante la

elaboración del producto. 2. Detectar las principales fuentes de contaminación y los puntos críticos durante su manufactura. 3. Realizar modificaciones durante la elaboración que permitan disminuir el desarrollo de microorganismos a través de cambios en el proceso y mediante la adición de conservantes.

2. MATERIALES Y MÉTODOS.
2.1. Proceso de elaboración.
En la fábrica se elaboran principalmente dos tipos de milanesas: milanesas de soja y de verdura. Las milanesas de soja son producidas con una mezcla de harina común, harina aglutinada y harina de soja. En el caso de las milanesas de verdura, la harina de soja es reemplazada por verdura fresca hervida y triturada o por verdura deshidratada que se reconstitu ye antes de formar la masa. Estos ingredientes son inicialmente mezclados e hidratados en una amasadora de panadería, hasta formar una masa con la consistencia deseada. Posteriormente, la masa se estira por medio de una sobadora eléctrica hasta obtener una lámina de medio centímetro de espesor. Estas láminas son cortadas manualmente con un molde que posee la forma definitiva de la milanesa. Para el armado final se ubica una porción de queso cremoso en el centro de dos láminas de masa y se cierra presionando sobre los bordes. Una vez armadas las milanesas, se someten a un proceso de escaldado en agua hirviendo. Para ello se sumergen en el agua hasta que las mismas emergen a la superficie. Por último, las milanesas se escurren y se rebozan con pan rallado y una mu y pequeña cantidad de orégano y perejil deshidratado. El proceso implica gran cantidad de mano de obra y se detalla en la figura 1.

Mezcla

AMASA Ma

Agu

ESTIRA Lámi CORTAD Tap a COLOC ACIÓN ALMAC ENADO ALMAC ENADO

Tapa

COLOCA CIÓN PEGA milan DO DE ENVASA REFRIG

Ques ESCAL DADO REBO ZADO Per Pan Rall

Figura 1: Proceso de fabricación de las milanesas de Soja.

2.2. Identificación de la micobiota contaminante.
2.2.1. Muestreo.
En todos los casos, las muestras se tomaron asépticamente y se conservaron en placas de Petri o en tubos de ensayo estériles para su posterior traslado al laboratorio. En el caso de las materias primas (harinas y especias deshidratadas) se extrajeron las muestras a partir de los recipientes que habían recibido menor manipulación en la empresa, para determinar la calidad microbiológica al momento de llegada a la fábrica. Las muestras de milanesas fueron extraídas durante las diferentes etapas del proceso de elaboración (figura 1). Se analizaron milanesas de soja y de verdura, obteniéndose en ambos casos las siguientes muestras: masa sin estirar. masa estirada (en el caso de la masa de soja, se obtuvo

• •

además una muestra a las 24 h posteriores a su elaboración y conservada en frío). milanesa sin cocinar. milanesa cocida y sin rebozar. milanesa cocida y rebozada.

• • •

Paralelamente, se realizó un muestreo ambiental con la finalidad de identificar la micobiota presente en la fábrica. Para ello se realizaron dos tipos de muestreos. En uno de ellos se analizó la contaminación existente en el aire y en el otro la contaminación de las superficies de trabajo. Para el primer caso, se destaparon en diferentes lugares de la fábrica placas de Petri conteniendo el medio de cultivo AP A (papa 200 g sometida a una decocción de 1 hora; azúcar 20 g; agar 15 g; agua destilada 1.000 ml; pH 6,0; autoclavado a 121º C durante

20

min.)

durante

5

minutos

(método

gravimétrico).

Posteriormente, las placas fueron incubadas en el laboratorio a 25º C durante 5 días. En el segundo caso, se realizaron hisopados de la superficie de las mesas de trabajo y de las bandejas donde se colocaban las milanesas a enfriar. Para ello, se utilizaron hisopos comerciales estériles que fueron introducidos en un tubo de ensayo con solución fisiológica estéril (cloruro de sodio 0,85%) y posteriormente se frotaron en un área de 10 cm 2 por distintas partes de la mesa de trabajo. Una vez recolectada de la la muestra, los hisopos de con ésta, AP A se se e conservaron sembradas dentro en solución. en placas A partir de Petri

realizaron diluciones seriadas de 1/10 y las mismas fueron superficie incubadas a 25º C durante 5 días.

2.2.2. Aislamiento y purificación.
Las muestras de masas y milanesas fueron incubadas en cámaras húmedas a 25º C durante 7 días. Para ello se utilizaron bandejas con tapa que fueron desinfectadas con alcohol etílico comercial y ubicadas bajo luz UV en la cámara de flujo laminar durante 10 minutos. Luego se colocaron en su interior tres papeles de diario estériles por cámara y se hidrataron con agua estéril. También se dejaron en cámara húmeda 3 milanesas de soja, con más de una semana de elaboración, que presentaban signos de alteración fúngica con distinta micobiota predominante. Transcurridos los 7 días, se repicaron las colonias de mohos y levaduras con diferencias morfológicas entre sí, en placas de Petri con medio AP A. Este procedimiento se repitió tantas veces como fue necesario hasta obtener un cultivo puro.

Los conidios de los diferentes aislamientos de hongos filamentosos y las células de levaduras fueron conservados en glicerol al 20 % a –20º C para su posterior análisis.

2.2.3. Identificación primaria.
Se realizó la identificación primaria de los aislamientos obtenidos utilizando la clave taxonómica de Pitt y Hocking (1997).

2.3. Origen de los contaminantes identificados en las milanesas.
Debido a la diversidad de hongos filamentosos obtenidos a partir de las muestras de milanesas, se realizó un nuevo muestreo con la finalidad de determinar el origen de las contaminaciones. Para ello, se obtuvieron muestras a partir de: Perejil deshidratado. Acelga deshidratada. Harina de soja. Harina común. Pan rallado. Harina aglutinada. Milanesa de espinaca con queso sin cocinar. Milanesa de espinaca con queso cocida sin rebozar. Milanesa de espinaca con queso cocida y rebozada. Milanesa de soja sin queso sin cocinar. Milanesa de soja sin queso cocida sin rebozar. Milanesa de soja sin queso cocida y rebozada. Milanesa de soja con queso sin cocinar.

• • • • • • • • • • • • •

Cada una de las muestras fueron procesadas de la siguiente manera: se colocaron 10 g de muestra en 90 ml de solución

fisiológica

estéril

dentro

de

recipientes

cerrados

herméticamente y fueron agitados vigorosamente durante 15 min. En el caso de las muestras con mu y baja densidad, como el perejil y la acelga deshidratada, se colocó 1 g de muestra en 99 ml de solución fisiológica. A partir de las diluciones obtenidas y después de ser agitadas se realizaron diluciones seriadas de 1/10 en solución fisiológica estéril hasta 10 - 8 . Estas diluciones fueron sembradas por duplicado en placas de Petri con el medio de cultivo AP A e incubadas a 25º C durante 5 días, para luego realizar los recuentos de mohos y levaduras. A partir de éstas placas se aislaron los microorganismos predominantes identificación. En el caso de los aislamientos que presentaron dificultades durante la purificación como consecuencia de una contaminación masiva con hongos Mucorales, se realizó la siembra en el medio AP A con el agregado de ácido láctico hasta llegar a pH 5,6 y con un 5% de rosa de bengala para inhibir el crecimiento de Rhizopus spp. y Mucor spp. de cada muestra para su posterior

2.4. Tratamiento térmico.
Con la finalidad de disminuir el tiempo de enfriado de las milanesas en la fábrica luego del escaldado, se realizó un

shock térmico con agua fría después de realizar el tratamiento
térmico. El tiempo de exposición de las milanesas durante el enfriado es importante ya que en su interior se encuentran una porción de queso que mantiene mucho el calor. Debido a ello las milanesas se exponen durante un tiempo largo a la contaminación ambiental ya que se enfrían a temperatura ambiente. Con el shock térmico mediante enfriado además de tener un efecto negativo para el desarrollo de los microorganismos se pretendía que las milanesas estuvieran expuestas a la micobiota ambiental el menor tiempo posible.

Para este experimento se usaron 16 muestras al azar de milanesas de soja a medida que se desarrollaba el proceso productivo. La mitad de estas muestras fueron expuestas a un

shock térmico llevado a cabo por inmersión en una batea de
agua fría. Cuatro milanesas con

shock

térmico

fueron

rebozadas y cuatro se dejaron sin rebozar. Idéntico tratamiento se realizó con las milanesas sin shock térmico. Las muestras para el análisis de los microorganismos se extrajeron en dos momentos: 0 h y 12 h, según se representa en la figura 2.

tiem

Milanesa
Milanesa sin Rebozar

tiem po

Sin Shoc

Con Shoc

Figura 2: Esquema del ensayo aplicando un shock térmico a las milanesas una vez escaldadas.

Una vez realizado el ensayo, a cada una de las milanesas se le realizaron cortes longitudinales separados entre sí por 1 cm de longitud. Tres fragmentos al azar por milanesa fueron

incubados a 25º C en una placa de Petri ubicada dentro de una bandeja con papel estéril embebido en agua estéril para crear una cámara húmeda. Cada placa de Petri con sus tres cortes de milanesa fue designado como una muestra. Los restos de muestra que no fueron introducidos en cámaras húmedas se conservaron a temperatura de refrigeración para su posterior observación. Luego de 7 días de incubación a 25º C se sacaron las placas de Petri para su observación y se le tomaron fotografías con una cámara digital.

2.5. Efecto del pan rallado como contaminante.
A partir de los ensayos anteriores se observó que las milanesas al ser rebozadas incrementaban los recuentos de UFC de mohos. Es por eso que se decidió analizar el estado del pan rallado que llegaba a la fábrica y como progresaba su estado al continuar el proceso de elaboración. Para realizar este análisis se tomaron muestras al azar del pan rallado antes de ser sacado de las bolsas en las cuáles llegan a la fábrica (P AN SIN US AR), del pan rallado que va quedando en las asaderas donde se rebozan las milanesas (P AN USADO), del pan rallado que se encontraba en las bandejas donde se almacenan las milanesas (P AN B ANDEJ A), y del pan que se encontró en la mesa de trabajo (P AN MES A). Paralelamente, se tomó una muestra de la harina común, la harina aglutinada y la harina de soja. Con la finalidad de poder comparar los valores de UFC/g de pan rallado entre las diferentes muestras, se determinó el contenido de humedad en estufa hasta peso constante y se consideró dicho valor en el cálculo de la población microbiana.

Se fueron
5

tomaron

muestras

de

10

g 30

que min

se con

colocaron un

en

recipientes estériles con 90 ml de agua destilada estéril y homogeneizadas durante agitador automático. Las muestras de pan rallado se dilu yeron hasta 10 para luego ser sembradas por duplicado en placas de Petri con medio AP A con el agregado de ácido láctico hasta pH 5,5, 5 % de rosa de bengala y un 2% de NaCl (para disminuir la a w del medio de cultivo). Las muestras 10 - 2 , 10 - 3 y 10 - 4 se sembraron por duplicado. Por otra parte, se quiso determinar el efecto del pan rallado en la contaminación de origen ambiental sobre las milanesas. Para ello, se tomaron muestras de milanesas que fueron expuestas toda la noche. Un grupo de milanesas se las dejó sin rebozar, otro grupo fue rebozado con pan rallado previamente esterilizado en autoclave y un último grupo fue rebozado con el pan rallado que se usa habitualmente. A su vez, la mitad de las muestras de cada grupo se tomaron inmediatamente después de elaboradas y la otra mitad se las tomó al día siguiente luego de que ha yan pasado la noche expuestas al ambiente de la fábrica. Con este experimento se intentó comprobar el nivel de la contaminación ambiental en el que las milanesas pueden llegar a estar expuestas. Las muestras una vez tomadas se llevaron refrigeradas al laboratorio y allí fueron colocadas a 25º C durante 5 días. Se realizó una evaluación cuali-cuantitativa visual del grado de contaminación fúngica.

2.6. Contaminación cruzada.
A partir de los datos anteriores se observó que el escaldado era un proceso muy eficaz a la hora de disminuir los recuentos tanto de mohos como de levaduras. Sin embargo, después de

que las milanesas se rebocen los recuentos de levaduras se incrementaban. Como las bandejas utilizadas para almacenar las milanesas una vez elaboradas, antes de escaldar y después de escaldar, se compartían se sospechó de una contaminación cruzada. Para ello se tomaron muestras de milanesas cocidas y rebozadas. Se utilizaron 10 milanesas de cebolla y 10 de zapallo. Una mitad de cada tipo de milanesa se las ubicó sobre papel esterilizado y la otra mitad sobre las bandejas. Una vez que el interior de las milanesas alcanzó la temperatura del ambiente (aproximadamente 5 h), éstas fueron introducidas dentro de placas de Petri estériles e incubadas a 10º C durante 10 días. De ésta forma se pretendió determinar el grado de contaminación que aportaban las bandejas. Para determinar el grado de contaminación se constru yó previamente una escala visual que ponía en evidencia los diferentes niveles de contaminación (Tabla 1).

Tabla 1: Escala visual de contaminación utilizada en la evaluación de las milanesas de zapallo y cebolla.

Valor numérico 1 2 3

Descripción de la contaminación Aparición de las primeras levaduras Levaduras numerosas o aisladas Aparición de los primeros hongos filamentosos

4 5 6

7

8

9

10

11

12

Los hongos blancos afectan bordes de las milanesas Las colonias blancas afectan 1/3 de la superficie Las colonias fúngicas blancas afectan ½ de la superficie Las colonias fúngicas blancas afectan toda la superficie Las colonias fúngicas blancas afectan toda la superficie y las negras y verdes ocupan por lo menos 1/5 de la superficie Las colonias fúngicas blancas “blanquean” 1/3 de la superficie Las colonias fúngicas blancas “blanquean” la mitad de la superficie Las colonias fúngicas blancas “blanquean” casi toda la superficie Las colonias fúngicas blancas “blanquean” toda la superficie

2.8. Control de la contaminación con Sorbato de Potasio.
Con la finalidad de determinar el efecto del agregado de un conservante sobre la inhibición del desarrollo de contaminantes, se elaboró una experiencia en la cual se le agregó a la masa un 0,66 % de Sorbato de Potasio para asegurar un tiempo de vida útil del producto sin que éste sea alterado por la actividad de los mohos y levaduras. Se realizó un lote de milanesas de zapallo con un 0,66 % de sorbato de potasio y otro sin el agregado del mismo. Las muestras una vez enfriadas hasta temperatura ambiente se envasaron en una bolsa de polipropileno y se colocaron en observación a 4º C y 20º C. El grupo de milanesas almacenadas a 20º C fueron enfriadas sobre papel estéril y sobre las bandejas donde son almacenadas habitualmente. Se tomaron 2 muestras para cada tratamiento, lo que hace a un total de 12 milanesas de soja y 12 de zapallo. El día en que las muestras fueron envasadas se consideró DI A 0 y a partir de allí se contaron los días hasta la aparición de las primeras levaduras y de los primeros mohos. Las evaluaciones se realizaron visualmente, considerando la siguiente escala: las milanesas que presentaron desarrollo de colonias de levaduras en su superficie fueron calificadas con el valor 1, y las milanesas con desarrollo de colonias de mohos se calificaron con el valor 3.

3. RESULTADOS.
3.1. Identificación de la micobiota contaminante.
3.1.1. Materias primas.
En el caso de las especias deshidratadas el número de colonias de levaduras fue superior al de los hongos. En cambio en las harinas, los niveles de contaminación detectados no fueron importantes, existiendo predominio de hongos por sobre las levaduras. Los géneros de hongos filamentosos encontrados mas comúnmente fueron Penicillium,

Aspergillus y Rhizopus .
Con respecto al queso el microorganismo encontrado más comúnmente fue Geotrichum candidum . En este ensa yo era de esperar que el pan rallado contuviera altos niveles de contaminación fúngica, sin embargo, dichos niveles no fueron lo suficientemente altos como para poder justificar la contaminación de las milanesas. Dentro de los mohos más comúnmente encontrados en esta materia prima se destacan los géneros Aspergillus, Penicillium, Eurotium y algunas levaduras filamentosas.

3.1.2. Milanesas.
Una vez realizados los aislamientos y la purificación de los principales hongos filamentosos que se desarrollaban sobre la superficie de las muestras de masa y milanesas (ver apartado 2.2.1.), se identificaron los mismos como:

Penicillium, Cladosporium,

Aspergillus, Alternaria,

Geotrichum, Monascus
y

Rhizopus,

Mucor,
(

levaduras

filamentosas y no filamentosas).

Se encontró que a medida que el proceso de elaboración avanzaba, el número de especies contaminantes y la cantidad presente de cada una de ellas se incrementaba. En la masa de acelga sólo se encontraron algunas colonias aisladas de levaduras filamentosas, sin embargo, una vez estirada la masa el número y la diversidad morfológica de las levaduras, se incrementó. En todos los casos la masa de soja contenía una mayor contaminación que la masa de acelga. Algo similar ocurrió al comparar la masa antes y después de estirarla. Previo que a éste procedimiento del estirado el se encontraron y la colonias variedad de se levaduras color blanco y algunas colonias de mohos, mientras después número incrementaron. Todas las muestras de milanesas que fueron tomadas antes de que éstas fueran sometidas al escaldado presentaron una contaminación inferior al observado luego de que éstas fueran hervidas. En este caso el producto estaba totalmente invadido. Es probable que el escaldado elimine la población de bacterias y transformen a los nutrientes del alimento en formas que se presenten más disponibles para ser utilizadas por los mohos y levaduras. Como se expresó anteriormente, en todos los casos se encontró que las milanesas de acelga tenían menor contaminación que las de soja. En ambos casos las muestras sin escaldar poseían un bajo número de colonias en superficie de levaduras, bacterias y mohos. En las muestras ya escaldadas el número de colonias aumentó considerablemente. En la ma yoría de los casos las muestras escaldadas estaban prácticamente invadidas en toda la superficie por colonias de

Rhizopus spp. y por colonias de levadura blancas. Estas
últimas generalmente se desarrollaban sobre las muestras sin escaldar en los lugares donde no se desarrollaban los mohos. Las milanesas escaldadas y rebozadas se encontraban

invadidas

por

microorganismos

en

toda

la

superficie,

predominando Rhizopus spp. a excepción de algunos sectores colonizados por levaduras blancas o de pigmentación rosada. En el caso de las milanesas que se recolectaron en fábrica después de transcurrida una semana de elaboración (Figura 3), se identificaron mohos de los géneros Aspergillus, Rhizopus,

Penicillium y Geotrichum , además de levaduras color blanco o
rosa.

Figura 3: Estado de 4 milanesas de verdura con una semana de almacenamiento, después de la incubación a 25º C en cámara húmeda durante 7 días.

3.1.3. Ambiente.
A partir de las placas de Petri expuestas a la contaminación ambiental (ver apartado 2.2.1.) se aislaron e identificaron mohos de los géneros Aspergillus, Penicillium, Cladosporium y

Geotrichum . En el caso de las placas de Petri ubicadas en las
bandejas, utilizadas para el enfriado de las milanesas, se aislaron los géneros encontrados en las placas anteriores además de algunas especies de los géneros Alternaria y

Monascus .
De los hisopados realizados en las mesas de trabajo, mesadas y en las bandejas antes y después de ser utilizadas se llegó a la conclusión de que las superficies de trabajo podrían llegar a ser una fuente de contaminación importante de levaduras. El análisis cuantitativo de dichas muestras fue inconsistente, existiendo muestras con altísimos niveles y otras con niveles casi nulos lo que podría estar generado en una limpieza poco homogénea de las superficies.

3.2. Origen de los contaminantes identificados en las milanesas.
A partir de las muestras de diferentes ingredientes y

milanesas recolectadas en la fábrica (ver apartado 2.3.) se determinó que los recuentos en el pan rallado no justificaban el incremento de la contaminación que se observaba al rebozar las milanesas (Figura 4), a pesar de los comentarios del fabricante. Debido a sus apreciaciones el pan rallado aparecía como una posible fuente de contaminación importante, sin embargo, esto no se demostró a través de los recuentos. Otro ingrediente con altos niveles de contaminación fúngica dentro de las materias primas utilizadas durante la

elaboración, fue el perejil deshidratado, que se utilizó junto con el pan rallado para rebozar a las milanesas. Sin embargo, la cantidad de perejil deshidratado utilizada como rebozador fue ínfima, por lo que tampoco justificaría el incremento en la contaminación de las milanesas rebozadas. A partir del recuento de microorganismos realizado en las harinas utilizadas en la fábrica, se observó que ninguna de las muestras presentó concentraciones de mohos y levaduras importantes, sin embargo, en algunas repeticiones las colonias de bacterias impedían el desarrollo de los microorganismos fúngicos. En la harina de soja las concentraciones de U.F.C. de mohos duplicaron a las de las harinas comunes y las harinas aglutinadas. Los recuentos de las U.F.C. de levaduras fueron siempre nulos como se puede observar en la figura 4. Si bien en el apartado 3.1.2. se expresó que los

microorganismos invadían con mayor facilidad las milanesas ya escaldadas, en los recuentos en placa se encontró que el número de éstos era mucho más bajo que en las milanesas sin escaldar. Con respecto a las muestras de milanesas rebozadas se observó una tendencia a aumentar el número de contaminantes. Este efecto podría estar explicado por el ma yor manipuleo que recibe el producto o por una ma yor exposición a la contaminación ambiental (Figura 5).

1.000.000

100.000

Log U.F.C. / g

10.000

1.000

100

10

1
D es hi dr at ad o D es hi dr at ad a So ja Ag lu tin ad a R al la do Pa n
M. Soja Rebozada

H ar in a

de

Ac el ga

Pe re jil

Mohos

Levaduras

Figura 4: Recuento de mohos y levaduras en diferentes materias primas.

100000000 10000000 1000000 100000 U.F.C. / g 10000 1000 100 10 1 M. espinaca s/ cocinar M. espinaca cocinada M. espinaca rebozada mohos M. Soja s/ cocinar levaduras M. Soja cocinada

Figura 5: Recuento de mohos y levaduras en milanesas de espinaca con queso y milanesas de soja con queso durante el proceso.

H ar in a

Al comparar las milanesas de espinaca y de soja antes de ser cocinadas se puede observar que los recuentos de mohos de las milanesas de espinaca son menores que los de soja. Es mu y posible que la espinaca contenga naturalmente alguna sustancia que inhiba el crecimiento fúngico. Una vez escaldadas las milanesas, presentaron una fuerte disminución de los recuentos de mohos y más aun de levaduras que llegaron a ser casi nulos. Sin embargo, se pudo observar una importante recontaminación después de rebozar con pan rallado las milanesas, lo que indicaría que algunas de las materias primas utilizadas en el rebozado, como el pan rallado o el perejil deshidratado, están fuertemente contaminadas o bien la fuente de esta contaminación podría ser atribuida al medio ambiente en el cual se rebozan.

1.000.000 100.000 Log. U.F.C. / g 10.000 1.000 100 10 1 Pan sin Usar Pan Usado Pan Bandeja Pan Enfriado Pan Enfriado Pan Mesa Estado del Pan Hongos totales Hongos xerofilos Aspergillus / Eurotium Levaduras totales Levaduras filamentosas Se desarrollaron bacterias que inhibieron el desarrollo fúngico

Figura 6: Recuento de contaminantes en muestras de pan rallado recolectadas en diferentes tiempos del proceso de elaboración.

En la figura 6 se puede observar los géneros que prevalecen en la micobiota presente del pan rallado a medida que éste va avanzando en las etapas del proceso de producción.

Un dato que llama la atención es el nivel de U.F.C. de levaduras del pan de las bandejas. Las bandejas son utilizadas para almacenar las milanesas una vez terminadas y luego de ser cocidas vuelven a ser depositadas sobre las mismas bandejas, para su enfriado. En el Pan Mesa los recuentos fueron nulos por estar los medios de cultivo totalmente contaminados por bacterias que podrían haber interferido en el crecimiento de posibles hongos contaminantes. En la Figura 7 se observan las diferencias en el tipo de población contaminante que se desarrollan en las distintas muestras de pan rallado. La fotografía de la izquierda representa el pan rallado sin usar y en este caso se observan 50 colonias de mohos, de los cuales 40 pertenecen al género

Eurotium . La fotografía del centro representa al pan rallado
usado. En la misma se observan 25 colonias de mohos, donde solamente 6 corresponden al género Eurotium . Finalmente la fotografía de la derecha corresponde al pan de las bandejas, la cual presenta muy pocos mohos y un gran predominio de las levaduras.

Figura 7: Desarrollo de colonias fúngicas en las placas de Petri con el medio de cultivo APA 5% Rosa de Bengala, 2% NaCl y pH 5,5. Las placas corresponde a las muestras de pan rallado sin usar (izquierda) , pan rallado usado (centro), y pan rallado de las bandejas (derecha). Todas las placas corresponden a la misma dilución, lo que permite la comparación entre ellas.

3.3. Tratamiento térmico.
En este ensa yo se le aplicó un enfriado mediante inmersión en agua fría a un lote de milanesas ( shock térmico). Luego se tomaron muestras rebozadas y sin rebozar de milanesas con y sin shock (ver apartado 2.4.) . A partir de las muestras (cortes de milanesas) ubicadas en cámara húmeda se observó que: No existió diferencias entre las muestras con y sin Cuando las milanesas fueron rebozadas no se observó Cuando las milanesas no fueron rebozadas las muestras

• • •

shock .
diferencias entre las muestras del tiempo 0 y 12 h. recolectadas a las 12 h presentaron mayor contaminación que las del tiempo 0. En las figuras 8 y 9 se observa el desarrollo fúngico sobre las milanesas incubadas a 25º C durante 7 días en cámara húmeda.

0

12

0

12

Figura 8: Milanesas sin rebozar sin shock (izquierda) y con shock (derecha).

0

12

0

12

Figura 9: Milanesas rebozadas sin shock (izquierda) y con shock (derecha).

Al no existir diferencias entre las muestras con y sin shock pero si entre las muestras rebozadas y sin rebozadas, sumado a que los recuentos en pan rallado no son tan elevados como eran de esperar, se consideró la posibilidad de que el pan rallado podría ejercer un efecto adicional con respecto a la captación de contaminantes.

3.4. Efecto del pan rallado como contaminante.
Para comprobar la existencia de algún fenómeno físico del pan rallado que origine una ma yo r captación de esporas del medio ambiente, se realizó la siguiente experiencia. Se utilizaron milanesas sin rebozar, rebozadas con pan rallado previamente esterilizado y rebozadas con pan rallado común. De los resultados obtenidos se observó que: Las muestras rebozadas con pan estéril tenían una Las milanesas rebozadas con pan rallado común estaban Las diferencias y las entre las 12 muestras h tomadas no en el

• • •

contaminación similar a las milanesas sin rebozar. mucho más contaminadas y totalmente colonizadas. momento Los tomadas después, fueron fueron

significativas.

principales

contaminantes

identificados

Penicillium spp. y Rhizopus spp.
De todos los resultados anteriores se conclu yó que ninguna de las materias primas poseía niveles de contaminación de levaduras importantes como así tampoco niveles de mohos suficientes como para justificar los encontrados en las milanesas una vez rebozadas. La materia prima con recuentos más altos de levaduras que se pudo hallar fue el Pan Rallado de las bandejas. Esto podría indicar una posible contaminación cruzada en ese punto del proceso, lo que incrementaría significativamente las U.F.C. de levaduras en la superficie de las milanesas.

3.5.Contaminación cruzada.
Debido a que las bandejas donde se dejaban enfriar las milanesas escaldadas eran las mismas donde se almacenaban las milanesas antes de ser escaldadas, se decidió comprobar si existía una posible contaminación cruzada. Para ello se realizó un ensa yo que consistió en enfriar sobre papel estéril y sobre las bandejas utilizadas habitualmente en fábrica, milanesas de cebolla y de zapallo escaldadas y rebozadas (ver apartado 2.6.). En la tabla 2 se representan los resultados.
Tabla 2: Efecto de la contaminación cruzada en milanesas de cebolla y zapallo. La escala utilizada para cuantificar el grado de contaminación se detalla en el apartado 2.6.

Nivel de contaminación de las milanesas almacenadas a 10ºC Día Día Día Día Día Día 6 Día 7 D 1 2 3 4 5 Cebolla en 0,00 0,00 0,00 0,60 3,00 5,80 7,00 9 papel estéril Cebolla en 0,00 0,00 0,80 2,00 4,80 6,40 8,40 10 bandeja Zapallo en 0,00 0,00 0,00 0,40 5,00 6,40 7,20 11 papel estéril Zapallo 0,00 0,00 0,00 2,00 6,80 11,40 12,00 12

en bandeja
Se pudo observar que las milanesas de cebolla tuvieron una tendencia a inhibir el crecimiento de los mohos ya que su crecimiento se ve retardado con respecto a las milanesas de zapallo. Este efecto inhibitorio de la cebolla sobre el desarrollo de microorganismos fue reportado por Mei-chin y Shih-ming (1999) y por Abdel-Hafez y El-Said (1997). Benkeblia (2004) encontró que las cepas de Aspergillus niger, Penicillium

cyclopium

fueron de

fuertemente aceites

inhibidas de

por cebolla y

bajas ajo.

concentraciones

esenciales

Fusarium ox ysporum presentó una menor sensibilidad a los
extractos de estos aceites esenciales. En la figura 10 y 11 se exponen fotografías que

corresponden a milanesas en el sexto día de incubación.

Repeti

Repeti

Figura 10: Milanesas de cebolla incubadas en cámara húmeda durante 6 días (2 repeticiones). En cada fotografía se presentan dos milanesas, en cada caso la milanesa de la izquierda se enfrió sobre las bandejas (con contaminación cruzada) y la derecha sobre papel estéril (sin contaminación cruzada).

Repeti

Repeti

Figura 11: Milanesas de zapallo incubadas en cámara húmeda durante 6 días (2 repeticiones). En cada fotografía se presentan dos milanesas, en cada caso la milanesa de la izquierda se enfrió sobre las bandejas (con contaminación cruzada) y la derecha sobre papel estéril (sin contaminación cruzada).

3.6. Control de la contaminación con Sorbato de Potasio.
Se elaboraron milanesas de zapallo con el sistema

habitualmente utilizado en fábrica y con el agregado de 0,66 % de sorbato de potasio. Las milanesas fueron enfriadas sobre las bandejas y sobre papel estéril, según se expresa en el apartado 2.8. Las muestras se incubaron a 4 y a 20º C y se registraron los niveles de contaminación en la escala explicada en el apartado 2.8.

3,5 Nivel de Contaminación 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 Días Sin Sorbato Con Sorbato Con Sorbato Sobre Papel

Figura 12: Crecimiento fúngico a 20º C sin el agregado de sorbato de potasio, con sorbato y con sorbato sobre papel estéril evitando la contaminación cruzada.

3,5 Nivel de Contaminación 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 Días Sin Sorbato Con Sorbato Con Sorbato Sobre Papel

Figura 13: Crecimiento fúngico a 4º C sin el agregado de sorbato de potasio, con sorbato y con sorbato sobre papel estéril evitando la contaminación cruzada.

De los resultados obtenidos (Figuras 12 y 13) se observa que: 1. Las milanesas tratadas con sorbatos (enfriadas en bandejas o en papel estéril) e incubadas a 4º C, permanecieron durante más tiempo sin la aparición de mohos en superficie. 2. El enfriamiento de las milanesas (con sorbato e incubadas a 4º C) sobre papel estéril retardó 3 días la aparición de las levaduras. 3. La disminución de la temperatura de almacenamiento a 4º C provocó un retraso en la aparición de los contaminantes mayor al observado por el agregado de sorbato. 4. En todas las muestras excepto las que no estuvieron en contacto con las bandejas, las levaduras se desarrollaron antes que los mohos. 5. Al evitar la contaminación cruzada a 4º C, el desarrollo de microorganismos se retarda 3 días.

4. DISCUSIÓN FINAL.
Antes de dar comienzo a la pasantía se visitó la fábrica para conocer la problemática y mediante una observación general del proceso se sugirió al fabricante envasar las milanesas a 20º C y no a mayores temperaturas debido a que el vapor que condensaba dentro del envase generaba humedad que podría ser utilizada por los microorganismos. Además, se propuso reemplazar el material de envase se polietileno por uno de polipropileno. Durante el desarrollo de la presente pasantía se llevaron a cabo dos etapas de trabajo claramente diferenciadas. En la primera, el objetivo principal fue detectar el origen de las contaminaciones fúngicas a través del análisis de las materias primas utilizadas durante la elaboración de las milanesas (harinas, puntos especias, críticos de en pan rallado, etc) y y se el análisis a de la población ambiental. En una segunda etapa se detectaron los contaminación el proceso llevaron para cabo la modificaciones productivo mejorar

calidad sanitaria y vida útil del producto final. Durante el desarrollo de la primera etapa, se determinó que muchos de los microorganismos presentes en las materias primas también lo estaban en los productos intermedios. Sin embargo, a medida que el proceso de elaboración avanzaba, se incrementaba el número de especies y sus concentraciones. El tratamiento térmico o escaldado a que son expuestas las milanesas durante su elaboración, provocó una importante disminución de la población de microorganismos. No obstante, el producto final contenía un número de especies mucho ma yor y concentraciones más altas de microorganismos que los productos intermedios o las milanesas recién escaldadas. Este hecho podía deberse principalmente a dos motivos:

contaminación de las materias primas utilizadas después del escaldado o contaminación ambiental. Por tal motivo se realizaron una serie de muestreos y ensayos que permitieran determinar el origen concreto de los microorganismos aislados. El pan rallado utilizado en el rebozado, fue la materia prima más estudiada debido a que parecía ser una posible fuente de contaminación. A través de los análisis se determinó que el pan rallado contenía un importante número de mohos, pero éstos no parecían ser suficientes para causar la contaminación producida en las milanesas rebozadas. Por otro lado, a partir de este ingrediente no se aislaron levaduras y sin embargo, éstas eran frecuentemente aisladas desde muestras de milanesas. Debido a esto, se comenzaron los estudios de contaminación ambiental. En este caso se encontró que en el aire y en las bandejas de enfriamiento existían las mismas especies que fueron encontradas en las milanesas. Además, a partir de muestras recogidas en la superficie de las bandejas donde se colocaban las milanesas sin escaldar y que más tarde se colocaban las milanesas ya rebozadas, se aislaron las mismas colonias de levaduras que se desarrollaban en las milanesas. De esta forma se comprobó que la contaminación cruzada en las bandejas donde se enfrían las milanesas y la exposición al medio ambiente, eran los causales de la mayor parte de la micobiota asociada o crítica. Una vez detectado el origen de las contaminaciones se inició con la segunda etapa del trabajo. En este caso se realizaron una serie de experimentos que permitieron confirmar y evitar la contaminación cruzada en las bandejas. Por tal motivo, la sugerencia principal que se realizó al fabricante fue la de mantener una estricta limpieza de las bandejas y evitar compartir las mismas con milanesas escaldadas y sin escaldar. A su vez, es importante mencionar

que en el caso de que se use el mismo carro para colocar milanesas crudas y cocidas, las bandejas donde se colocan las cocidas se deberán encontrar en la parte superior del carro ya que de lo contrario las esporas fúngicas, restos de pan rallado y otras materias contaminadas, podrían caer sobre las milanesas ya escaldadas. Para disminuir el nivel de contaminación ambiental, se sugiere la colocación de un presurizador de aire. Este artefacto tomará el aire del exterior, lo filtrará y lo enviará al interior. De esta manera siempre que una puerta o ventana se abra el aire saldrá y nunca podrá ingresar. La importancia de que no entre aire sin filtrar radica en que de esta forma se evita el ingreso de partículas de polvo con esporas fúngicas y células de microorganismos adheridas a él. En caso de no ser posible crear una presión positiva dentro de la fábrica se deberán evitar las corrientes de aire dentro de la misma. De esta forma se disminuirá la cantidad de partículas de polvo en el aire que vehiculizan a los microorganismos presentes en el aire. Con el objetivo de aumentar la vida útil del producto, se realizaron pruebas adicionando un conservante a la mezcla de las milanesas. Para ello se utilizó un inhibidor del desarrollo fúngico, como es el sorbato de potasio. De acuerdo a las características bajas del producto su y al mercado es al cual y está es orientado, este conservante es el que mejor se adapta ya que a concentraciones sabor indetectable considerado GR AS (Generalmente Reconocido Como Seguro) por el Codex Alimentario. Sin embrago, se debe recalcar la importancia de prevenir la contaminación antes de inhibirla con conservantes ya que según Steels (2000) la concentración inhibitoria mínima aumenta con el tamaño del inóculo. Altas concentraciones conservantes de células requieren concentraciones para evitar de el considerablemente mayores

crecimiento. Es por esto que la recomendación final que se realizó al fabricante, fue aplicar una dosis de 0,10 a 0,66% de sorbato, mantener a 4º C la y temperatura evitar la de las milanesas cruzada almacenadas contaminación

producida por las bandejas de enfriamiento. Otra alternativa a considerar es el agregado de una pequeña cantidad de ácido cítrico para aumentar la eficiencia del sorbato de potasio. Marin et al. (2002) encontró que en los panificados españoles el sorbato de potasio actúa más eficientemente a valores bajos de pH (Blocher and 1985) y de a w . Es indispensable que el envasado del producto se realice a una temperatura inferior a 20 ° C. De esta forma el agua de las milanesas se terminará dentro de del evaporar envase y no se producirán llevar al condensaciones que podrían Busta,

desarrollo de colonias de microorganismos.

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