Mediada por Agrobacterium transformación de la planta: la biología detrás de la "Gene-Las maniobras" Herramienta

INTRODUCCIÓN Veinticinco años atrás, el concepto de la utilización de Agrobacterium tumefaciens como vector para crear plantas transgénicas fue visto como una perspectiva y un "deseo". Hoy en día, muchos agronómica y hortícola especies importantes son sistemáticamente transformados con esta bacteria, y la lista de especies que son susceptibles de transformación mediada por Agrobacterium parece crecer día a día. En algunos países desarrollados, un alto porcentaje de la superficie de cultivos económicamente importantes tales como maíz, soja, algodón, canola, patatas y tomates es transgénica, un número creciente de estas variedades transgénicas son o pronto serán generados por Agrobacterium, en lugar de bombardeo de partículas mediada por la transformación. Todavía quedan, sin embargo, muchos desafíos para el genotipo independiente de la transformación de muchas especies de cultivos de importancia económica, así como las especies forestales utilizadas para madera, papel y celulosa. Además, la expresión predecible y estable de los transgenes sigue siendo problemática. Varios excelentes críticas han aparecido recientemente que describen en detalle los aspectos diversos de la biología de Agrobacterium. En esta revisión, se describe cómo los científicos utilizan el conocimiento de la biología básica de Agrobacterium Agrobacterium para el desarrollo como una "herramienta" para la ingeniería genética de plantas. También exploro cómo nuestra creciente comprensión de la biología de Agrobacterium puede ayudar a prolongar la utilidad de la transformación mediada por Agrobacterium. Es mi creencia de que las mejoras en la tecnología de transformación implicará necesariamente la manipulación de estos procesos biológicos fundamentales. AGROBACTERIUM "especie" y rango de hospederos El género Agrobacterium se ha dividido en una serie de especies. Sin embargo, esta división se ha reflejado, en su mayor parte, la enfermedad y la sintomatología rango de hospederos. Así, A. radiobacter es un "virulento" de especies, A. tumefaciens causa la enfermedad de agalla de la corona, A. rhizogenes causa la enfermedad de raíz peluda, y A. rubi causa la enfermedad de la caña de la vesícula. Más recientemente, una nueva especie ha sido propuesta, A. vitis, lo que provoca agallas en las uvas y algunas otras especies de plantas (244). Aunque Manual Bergey de Bacteriología Sistemática aún refleja esta nomenclatura, la clasificación es complejo y confuso, ahora sabemos que los síntomas se deben, en su mayor

parte, el tipo de tumorigénico plásmido contenido dentro de una cepa en particular. Curar un determinado plásmido y la sustitución de este plásmido con otro tipo de tumorigénico plásmido puede alterar los síntomas de la enfermedad. Por ejemplo, la infección de las plantas con A. tumefaciens C58, que contiene la nopalina tipo de plásmido Ti pTiC58, los resultados en la formación de teratomas agalla de la corona. Cuando este plásmido se cura, la cepa se convierte en patógena. Introducción de plásmidos Ri en la cepa curada "convierte" la bacteria en una cepa rizogénica (191, 358). Además, se puede introducir un Ti (inductor de tumores) plásmido de A. tumefaciens en A. rhizogenes, la cepa resultante incita a los tumores de la alteración de la morfología de las plantas Kalanchoe (53). Por lo tanto, ya que A. tumefaciens puede ser "convertida" en A. rhizogenes la simple sustitución de un tipo oncogénico del plásmido por otro, el término "especie" carece de sentido. Tal vez un sistema de clasificación más significativa divide el género Agrobacterium en "biotipos", basada en el crecimiento y las características metabólicas (171). El uso de este sistema, la mayoría de A. tumefaciens y A. rubí (316) pertenecen a cepas biovar I, A. rhizogenes cepas encajar en biovar II y biovar III está representado por las cepas de A. vitis. Más recientemente, un nuevo sistema de clasificación taxonómica para el género Agrobacterium se ha propuesto (374). La reciente finalización de la secuencia de ADN de todo el genoma de A. tumefaciens C58 (que se compone de una lineal y un cromosoma circular, un plásmido Ti, y otro gran plásmido [114, 115, 363]) puede proporcionar un punto de partida para la reclasificación de Agrobacterium "tensiones" en un verdadero "especie". A pesar de la confusión actual en la clasificación de las especies, a los fines de ingeniería genética de plantas, el aspecto más importante puede ser la gama de huéspedes de diferentes cepas de Agrobacterium. Como género, Agrobacterium puede transferir ADN a un grupo muy amplio de organismos, incluyendo numerosas especies de angiospermas dicotiledóneas y monocotiledóneas (12, 68, 262, 341) y gimnospermas (198, 206, 215, 228, 307, 357, 371). Además, Agrobacterium puede transformar los hongos, así como las levaduras (32, 33, 260), ascomicetos (1, 71), y basidiomicetos (71). Recientemente, se informó Agrobacterium para transferir ADN a las células humanas (187). Las bases moleculares y genéticas de la gama de huéspedes de una cepa de Agrobacterium dado no está claro. Los primeros trabajos indican que los genes del plásmido Ti, en lugar de los cromosomas, era el principal determinante genético de la gama de los huéspedes (207, 315). Varios de virulencia (vir) loci en el plásmido Ti, incluyendo Virc (367, 368) y VirF (220, 267), se muestra para determinar el rango de especies de plantas que pueden ser transformados para producir tumores agalla de la corona. El virH (antes llamado PINF) lugar parecía estar implicado en la capacidad de Agrobacterium para transformar el maíz, según lo establecido por un ensayo

en el que los síntomas de la infección por virus del rayado del maíz se determinaron los siguientes agroinoculation de las plantas de maíz (153). Otros genes vir, incluyendo virG, contribuir a la "hypervirulence" de determinadas cepas (41, 146). Sin embargo, ahora está claro que van de acogida es un proceso mucho más complejo, que está bajo el control genético de múltiples factores, tanto dentro de la bacteria y la planta huésped. La única forma para los ensayos de transformación puede afectar la forma en un rango de hospederos puntos de vista. Por ejemplo, muchas especies de plantas monocotiledóneas, incluyendo algunas variedades de gramíneas como el maíz (152), arroz (39, 40, 85, 139, 265, 321), cebada (317), y el trigo (42), ahora pueden ser genéticamente transformado por muchas cepas de Agrobacterium con el fenotipo de resistencia a los herbicidas o antibióticos. Sin embargo, estas especies de plantas no soportan el crecimiento de tumores agalla de la corona.

Figura. 1. Representación esquemática de un típico plásmido octopina de tipo Ti (A) y la región de T-ADN de una típica octopina de tipo plásmido Ti (B). (A) El ADN-T se divide en tres regiones. TL (T-ADN de la izquierda), TC (T-ADN centro) y TR (T-ADN de la derecha). El círculo negro indica T-DNA de secuencias repetidas frontera. oriV, el origen vegetal de la replicación del plásmido Ti, se indica mediante un círculo blanco. (B) Los distintos T-ADN codificada transcripciones, y su sentido de la transcripción, se indican con flechas. Los genes que codifican las funciones implicadas en la síntesis de auxina (auxina), la síntesis de citoquininas (CyT), y la síntesis de la octopina opina (OCS), manopina (MAS), y agropina (AGS) se indican. Gama de huéspedes más puede resultar de la interacción de determinados plásmidos Ti con ciertos antecedentes cromosómicas bacterianas. Por ejemplo, el pTiBo542 plásmido Ti, cuando en su huésped natural cepa A. tumefaciens Bo542, dirige potencial tumorigénico limitada cuando se ensaya en muchas especies de plantas leguminosas. Sin embargo, cuando se coloca en el fondo C58 cromosómicas, pTiBo542 dirige virulencia fuerte hacia la soja y otras leguminosas (143). Finalmente, la susceptibilidad a la enfermedad de la agalla de corona tiene una base genética en cucurbitáceas (292), guisantes (272), soja (15, 214, 246), y la vid (312) e incluso entre diferentes ecotipos de Arabidopsis thaliana (231). Las funciones de los genes de virulencia bacteriana y los genes de acogida en el proceso de transformación, y las formas en las que posiblemente pueden ser manipulados para propósitos de ingeniería genética, se analizan a continuación. BASES MOLECULARES DE LA transformación mediada por Agrobacterium ¿Qué es el ADN-T?

En primer lugar. Por lo tanto. 148. Muescas de la frontera está asociado con el firme (probablemente covalentes) la vinculación de la proteína VirD2. ya que estas secuencias son el blanco de la frontera específica VirD1/VirD2 endonucleasa que procesa el ADN-T del plásmido Ti. 250. 155. 369) e in vitro (281). Sin embargo. 177. mientras que otros contienen múltiples T-regiones (17. 150. T-ADN de las fronteras se componen de ADN de doble cadena. 175. a través de la tirosina 29 (351). 344). 378). 353). 99. 366). T-regiones están definidas por secuencias borde del ADN-T. 111. Parece haber una polaridad establecida entre T-ADN de las fronteras: las fronteras de la derecha que inicialmente parecía ser más importante que las fronteras de la izquierda (136. Que flanquean la región T en una orientación directa repetida (257. Estos límites son de 25 pb de longitud y altamente homóloga en secuencia (167. 249). 342. 373). 208. 137. 174. 100. T-regiones en Ti nativos y los plásmidos Ri son aproximadamente 10 a 30 kpb de tamaño (17. los bordes del T-ADN delimitar el T-ADN (véase más adelante para las excepciones). y no una doble cadena de ADN-T molécula. 345. 1A). la doble cadena de división de la frontera de T-ADN también se ha observado (155. VirD2 proteína por sí sola puede romper una sola hebra de ADN-T secuencia de la frontera (154. Algunos plásmidos Ti contienen una región T. 99. 353). 34. 305. sin embargo. 147. En el plásmido Ti o Ri (o T-ADN de vectores binarios [ver abajo]). 166. que . Ahora sabemos que esta polaridad puede ser causada por varios factores. 352. 352). y no la secuencia de la frontera en sí misma. Por lo tanto. 145. entre los nucleótidos 3 y 4 de la secuencia de la frontera (301. 311. La escisión de los resultados de la frontera de 25 pb de ADN-T sobre todo de la formación de muescas de la T-DNA "menor cadena". 261. 286. 303 ). 1B) se conoce como la región T. Este es el T-cadena. al final 5 de la resultante singlestranded T-molécula de ADN denominado T-hilo (91. 276. El ADN transferido (T-ADN) (Fig. 251. La escisión de las secuencias frontera doublestranded requiere VirD1 y VirD2 proteínas. T-regiones por lo general representan menos del 10% del plásmido Ti. tanto in vivo (82. como convencionalmente se presentan. 311. In vitro. El procesamiento de los tDNA del plásmido Ti y su posterior exportación de la bacteria a la célula de la planta resultado en gran parte de la actividad de la virulencia (vir) los genes transportados por el plásmido Ti (106. 375). En general. 114. Plásmidos Ti son del orden de 200 a 800 kpb de tamaño (81. 332. no las secuencias de las fronteras sólo sirven como blanco para la endonucleasa VirD1/VirD2 sino también servir como sitio de unión covalente de la proteína VirD2. 355. que se transfiere a la célula vegetal (318.La base molecular de la transformación genética de las células vegetales por Agrobacterium es la transferencia de la bacteria y la integración en el genoma de la planta nuclear de una región de un gran inductor de tumores (Ti) o rizogénica (Ri) residente en el plásmido de Agrobacterium (Fig. 363). 335. 197. es la proteína VirD2 adjunto a la orilla derecha. 156. 245. 311). cuando se encuentra en el plásmido Ti o Ri.

En segundo lugar. cualquier efecto de Virc debe ser posterior a T-ADN de procesamiento. la mutación de estos genes da lugar a la pérdida de virulencia en muchas especies de plantas (299). 328. Proteínas vira y Virg constitutivamente activa que no requieren inductores fenólicos de la . pero no las fronteras a la izquierda. Algunas de estas funciones se han discutido en varios artículos de revisión excelente (44. es posible que el proceso T-hilos de estas regiones de Ti y los plásmidos Ri y de vectores binarios T-ADN (182. en la fosforilación de la proteína ayuda a activar o aumentar el nivel de la transcripción de los genes vir. 384). 337. 256. 344). virC1 y virC2 funciones son importantes para la virulencia. 87. 264. 252). aunque el mecanismo molecular de cómo ocurre esto sigue siendo desconocido (131. la presencia de T-ADN "overdrive" secuencias de cerca de muchos de T-ADN bordes derecho. Los primeros reportes sugieren que la proteína VirC1 une a la secuencia overdrive y puede mejorar el T-ADN división fronteriza por la endonucleasa VirD1/VirD2 (322). Virg en forma nonphosphorylated está inactivo. 161). 109. codificadas por muchos genes vir juegan un papel esencial en el proceso de transformación mediada por Agrobacterium. 325. 291. 356). 327. autophosphorylates Vira y posteriormente transphosphorylates la proteína Virg (160. Secuencias Overdrive mejorar la transmisión de la Thilos para las plantas. 60. El problema de los vectores de transferencia de "espina dorsal" de secuencia para las plantas se discute a continuación. sin embargo. 345). 195. que debido a que la izquierda de la frontera mellar también se asocia con VirD2 apego a la molécula restante (el "no-T-ADN" de la Ti "columna vertebral" del plásmido o de una región del vector binario T-DNA [ 91]). 303. Por lo tanto. Sin embargo. 162. también puede ayudar a establecer la polaridad funcional de los bordes derecho e izquierdo. Vira es una antena periplásmico que detecta la presencia de determinados compuestos fenólicos de plantas que son inducidos por heridas (3.establece la polaridad y la importancia de las fronteras de la derecha en relación a las fronteras de la izquierda. limitaré mi descripción de las funciones de las proteínas Vir que pueden servir como puntos de manipulación para la mejora de el proceso de transformación. Cabe señalar. 156. y por lo tanto. Proteínas vira y Virg función como miembros de una twocomponent sensorial de transducción de señales reguladoras del sistema genético. En coordinación con el ChvE transportador de monosacáridos y en presencia de los fenólicos apropiado y moléculas de azúcar. 324. sin embargo. ¿Cómo se trata T-ADN transferido de las células vegetales Agrobacteriumto? Como se ha indicado anteriormente las proteínas. muy probablemente por la interacción con secuencias de caja de vir-que forman un componente de los promotores de genes vir (59. varios laboratorios han señalado que la T-cadena de producción en Virc cepas mutantes de Agrobacterium se produce en los niveles de tipo salvaje (301. 359). 336.

las cepas de Agrobacterium es más estable a temperaturas más bajas (aproximadamente 18 a 20 ° C) (18. 189. ya que puede servir como conducto para el T-ADN y la transferencia de proteínas Vir. 189. una "T-complejo" que es la forma de transferir el ADN-T (149). Por lo tanto. Junto con la proteína VirD4. Varias proteínas. La función del pilus de T-ADN de transferencia aún no está claro. que se procesa y se cicla. ya sea en el canal de exportación de bacterias o dentro de la célula vegetal. Por lo tanto. 193. o de las proteínas que interactúan Virg de forma más productiva con las secuencias de caja de vir-para activar la expresión de genes vir. Varios laboratorios han demostrado que VirE2 puede transferir a la célula vegetal en ausencia de un T-hilo (27. Uno de los aspectos de la biología pilus que pueden ser importantes para la transformación es la labilidad de la temperatura. 163. el pilus de algunos. Un informe reciente sugiere que tal vez otro papel para VirE2 temprano en el proceso de exportación: Dumas et al. 188). 190). 309. VirB5 y VirB7 posiblemente. el 11 proteínas virB conforman un sistema de secreción tipo IV necesarios para la transferencia del T-ADN y otras proteínas Vir. es la proteína pilin principales (94. Los experimentos se describen algunos intentos de manipulación de Vira y / o Virg para estos fines se discuten a continuación. Si este complejo reúne dentro de la bacteria sigue siendo controvertido. Citovsky et al. puede ser útil para aumentar la eficiencia de transformación con Agrobacterium o rango de hospederos. Estas dos proteínas se han propuesto para constituir. 349). 105 . pero no todas. VirB2. 349). o simplemente puede funcionar como un "gancho" para apoderarse de la célula de la planta receptora y llevar a las bacterias y las plantas en las proximidades de efectuar la transferencia molecular. 323). Los primeros experimentos de Riker indica un efecto de la temperatura de transformación (268). El VirD2 y VirE2 proteínas juegan un papel esencial y complementaria tal vez en transformación mediada por Agrobacterium. 162. 244. con el T-cadena. es posible que una función de . VirD4 puede servir como un "conector" para promover la interacción de los procesados ??T-DNA/VirD2 complejo con el aparato de secreción virB codificados (126). 278. y es posible que VirE2 complejos con el T-cadena.actividad. hacer que el T-pilus (94. 163. se puede considerar cocultivating Agrobacterium con las células vegetales a temperaturas más bajas durante los primeros días algunos de los procesos de transformación. (90) demostró que VirE2 podría asociar con membranas artificiales in vitro y crear un canal para el transporte de moléculas de ADN. (50) demostró que VirE2 podría funcionar en una célula vegetal: VirE2 transgénicos que expresan las plantas de tabaco podrían "complementar" la infección por una cepa mutante virE2 Agrobacterium. La mayoría de las proteínas virB una u otra forma el canal de la membrana o servir como ATPasas para proporcionar energía para el montaje del canal o los procesos de exportación. A pesar de la inducción de genes vir es máxima en aproximadamente 25 a 27 ° C (8. incluyendo VirB2. 190. 283). incluyendo VirE2 y VirF (44.

VirE2 interactúa en la levadura con Arabidopsis importina las proteínas de una manera dependiente de NLS (Bhattacharjee y Gelvin. 380). 50. Una vez en la célula vegetal. Bhattacharjee y Gelvin SB. VirD2 contiene la señal de localización nuclear (NLS) secuencias que pueden ayudar a dirigirlo y el adjunto de T-ADN al núcleo de la planta. 138. VirE2 probablemente interactúa con la chaperona molecular VirE1 y por tanto no estarán disponibles para obligar a T-hilos (77. sin embargo. Cuando T-ADN se entrega . 151. cuando se unen a ADN de cadena sencilla (tal vez en la célula vegetal?). 286). VirD2 pueden jugar un papel en la integración del T-ADN en el genoma de la planta. Debido a su apego a la final 5 de la T-hebra. 310. Importina-es un componente de una de las vías de transporte de proteínas nucleares se encuentran en los eucariotas. VirD2 puede asociar con un número de Arabidopsis importina proteínas de una manera dependiente de NLS. 119. Sin embargo. inédito). VirD2 podría afectar a los ataques nucleares de pequeña oligonucleótidos ligados generados in vitro. VirD2 puede funcionar en los pasos adicionales del proceso de transformación. 185. El NLS de VirD2 puede dirigir fusionado proteínas periodista e in vitro-ensamblados T-complejos a los núcleos de las células vegetales. VirE2 además tuvo que ser asociado con el T-capítulos. Sin embargo. La causa de estos resultados contradictorios no está claro. 319. Un informe indica que VirE2 obligado a ADN de cadena sencilla y de microinyección en células vegetales puede dirigir el ADN en el núcleo (381). 84. VirE2 es una proteína no-secuencia específica de ADN de cadena sencilla de unión (45. pero puede reflejar diferencias en los tipos de células y sistemas de entrega de ADN utilizados por los dos grupos. VirE2 puede alterar el ADN de una conformación al azar de la bobina a una forma que se asemeja a un cable de teléfono en espiral (47). Esta forma alargada puede ayudar a dirigir la T-cadena a través del poro nuclear. 49. sugieren que VirD2 puede no ser suficiente para dirigir T-hilos del núcleo. Por último. VirD2 puede servir como una proteína piloto para guiar a los T-hilo a través del aparato y el tipo de exportación IV. 229. 46. 186. 382 ). Varias mutaciones en VirD2 puede afectar tanto a la eficiencia (229) o la "precisión" (320) de T-ADN de integración. pero no pudo dirigir el transporte nuclear de moléculas más grandes ligados. VirE2 también contiene secuencias NLS que puede dirigir proteínas fusionadas reportero a los núcleos de las plantas (48. datos no publicados). (382) mostró que en las células permeabilizadas. 326. Para alcanzar objetivos nucleares de estas moléculas más grandes. 383). animales y hongos (48. 112. S. tanto en la levadura e in vitro (16. 326. 381. Los datos más recientes. En las células de Agrobacterium. Además.VirE2 es para formar un poro en la membrana citoplasmática de plantas para facilitar el paso de la T-cuerda. Al igual que con VirD2. El papel de VirE2 de T-ADN de transporte nuclear sigue siendo polémica. Ziemienowicz et al. otros informes demuestran que no puede dirigir VirE2 obligado ADN de cadena sencilla a los núcleos de cualquiera de las células vegetales o animales que se permeabilized con el fin de llevar a cabo la absorción de ADN (380).

Grupo de Hohn ha hipótesis de que la función principal de VirE2 en el transporte nuclear es independiente y que NLS VirE2 sólo da forma a la T-cadena para que pueda serpentean a través de los poros nucleares (274). Es posible que otras proteínas. mientras que en la microinyección de Drosophila y células de Xenopus. 233. ya sea directa o indirectamente. El papel de los genes de los cromosomas se estableció por primera vez por mutagénesis aleatoria inserción de todo el genoma de Agrobacterium (106). 313]) y otros papeles en la adhesión bacteriana a las células de las plantas (genes att [212. los motivos de NLS VirE2 puede ser ocluido e inactivos. Por último. Aunque la razón de esta discrepancia no se conoce. 374). 89. 213] ). Aunque el papel de los genes vir Ti plásmidos codifican a menudo ha sido considerado de importancia primordial para la transformación. y la secreción (PSCA / exoC. ya sea en Agrobacterium o células de las plantas. el lector debe ser consciente de que este complejo no ha sido identificado. La investigación adicional se definen las funciones de muchos de estos genes. pueden interactuar. con el T-cadena para formar grandes complejos de T en la célula vegetal . y T-ADN de transporte . VirE2 puede proteger T-hebras de la degradación nucleolytic que puede ocurrir tanto en el citoplasma de las plantas y tal vez en el núcleo (274. como importins (16). Cuando se une al ADN. además. 88. VIP1 (329). modificación. una disminución del 40% en la eficiencia de transformación (229.a las células vegetales de las cepas de Agrobacterium que codifica una forma mutante de VirD2 contiene una supresión precisa de la NLS. Mayor controversia implica la capacidad de VirE2 proteínas para localizar a los núcleos de las células animales. no es probable que los resultados de la utilización de octopina contra nopalina tipo VirE2 por los dos grupos (326). (381) mostró que en permeabilized células HeLa. por lo general ha sido aceptado por la comunidad de investigación Agrobacterium (149). Sin embargo. Plantas transgénicas que expresan VirE2 puede complementar una cepa doble mutante que carece de Agrobacterium virE2 y contiene una supresión en la región de codificación de NLS virD2 (110). Entre estas funciones están la producción de exopolisacáridos. muchos de los genes cromosómicos Agrobacterium también son esenciales para este proceso. Ziemienowicz et al. e incluso VirF (285). la secuencia NLS de nopalina tipo VirE2 tuvo que ser cambiado a fin de efectuar la localización nuclear de la proteína alterada (50). la regulación de la inducción de genes vir (chvD [204]). los transportistas de azúcar que participan en coinduction de los genes vir (chvE [86. Esto se debe a los dominios de NLS y la unión al ADN de VirE2 superposición (50). que a su vez está recubierto por VirE2 moléculas. octopina tipo VirE2 podría apuntar al núcleo. 290). Estos resultados sugieren que en ausencia de las secuencias NLS VirD2. chvA y chvB [36. otro mecanismo nuclear objetivo (tal vez VirE2) puede tener lugar. 37. 172. La existencia de un T-complejo formado por una sola molécula de VirD2 covalentemente al extremo 5 de la T-hebra. hay a lo sumo. 289]).

que fue trasladado de manera estable y se propaga a en el genoma de la planta (30). el T-ADN. fueron los responsables de la tumorigénesis (339) y que una parte de estos plásmidos. El plásmido . El gen exógeno de interés. en el plásmido Ti de tal manera que el nuevo gen fue en cis con los genes de virulencia en el mismo plásmido. 2). Por otra parte. es el siguiente clonado en un sitio de endonucleasa de restricción únicos en la región de destino de ADN. 363) seguramente será un terreno fértil para el descubrimiento de nuevos genes implicados en la transformación mediada por Agrobacterium. como MIAA (116). El primer método se basa en una estrategia desarrollada por Ruvkin y Ausubel (277) (Fig. tumefaciens C58 toda la secuencia (114.(ACVB [168. Estos plásmidos pueden replicarse tanto en Escherichia coli. junto con un marcador de resistencia a los antibióticos. los plásmidos Ti son muy grandes y de T-ADN regiones por lo general no contienen sitios únicos de restricción de endonucleasa que no se encuentran en otras partes del plásmido Ti. Una región del ADN (ya sea la T-región o región de ADN específicas para la ruptura). en el que la clonación inicial se lleva a cabo. Armin Braun propuso el concepto de un "principio de la inducción de tumores". fue transferido a las células vegetales y se incorporan en el genoma de la planta (43). Era. un gen de resistencia a los antibióticos pueden ser introducidos en el fragmento de ADN de interés por la transposición (107. que contiene sitios únicos de restricción de endonucleasa se clona en una amplia gama de hospedadores plásmido. El esclarecimiento reciente de la A. pues. evidente para proponer que los plásmidos Ti ser utilizado como vector para introducir genes extraños en células vegetales. Por lo tanto. también pueden desempeñar un papel más secundario en el proceso de transformación. Se utilizaron dos métodos para la clonación de ADN extraño en el plásmido Ti. La investigación en la década de 1970 resultó en la identificación de los grandes plásmidos en cepas virulentas de Agrobacterium (376). Estas estrategias implicadas dos enfoques diferentes: la clonación del gen. 360. uno no puede simplemente clonar un gen de interés en la T-región. 362 ]). aunque ahora sabemos que muchas cepas contienen plásmidos relacionados con la virulencia. 361. o clonar el gen en un T-región que estaba en una por separado replicón de los genes vir (T-ADN de vectores binarios). tal como un vector basado en IncP. Los experimentos genéticos indican que una clase particular de plásmidos. Por lo tanto. Sin embargo. el Ti (y más tarde Ri) plásmidos. por medios indirectos. MANIPULACIÓN DE AGROBACTERIUM DE INGENIERÍA GENÉTICA CON FINES Introducción de genes en las plantas mediante Agrobacterium Años antes que los científicos dilucidar el mecanismo molecular de la transformación mediada por Agrobacterium de las plantas. los científicos desarrollaron una serie de estrategias para la introducción de genes extraños en el ADN-T. 297). 248. y en el Agrobacterium. Otros genes.

estreptomicina para seleccionar a la presencia de la plásmido de Agrobacterium. Una variante de este procedimiento utiliza un gen sacB en el esqueleto del plásmido del primer plásmido. El uso de este sistema.resultante se introduce en Agrobacterium por conjugación o transformación. y una región de homología con una parte no oncogénico de octopina de tipo T-región. y la tensión resultante es seleccionado para la resistencia a los antibióticos segundos. De ADN para ser integrados en el T-región se clona en un aparte pBR322 derivado de molécula que contiene un segundo marcador de resistencia a antibióticos. un marcador de resistencia a la espectinomicina. pero alberga otro marcador de resistencia a los antibióticos. en la región T de un plásmido Ti. las bacterias pueden volverse resistentes a ambos antibióticos sólo si (i) la cointegrates primer plásmido en el plásmido Ti y utiliza el oriV del plásmido Ti de replicar o (ii) un intercambio de ADN en el plásmido primero y el plásmido Ti se produce por doble recombinación homóloga (homogenotization) utilizando secuencias homólogas en el plásmido Ti que flanquean ambos lados del gen de interés. pero que contienen el ADN-T región . otro plásmido del grupo de incompatibilidad mismo que el primer plásmido. Este plásmido se introduce en la alteración de la tensión de Agrobacterium. un gen de interés se clona en un vector basado en pBR322 que contiene un borde derecho del T-ADN. En el segundo caso (homogenotization). más el marcador de resistencia. A continuación. tales como pBR322. se introduce en la cepa de Agrobacterium que contiene el primer plásmido. Doble recombinación homóloga puede ser confirmado por análisis de ADN blot de ADN total de la cepa resultante (107). Una modificación de este procedimiento se utilizó para desarrollar el "split-vector final" del sistema. estas bacterias son examinados para detectar y desechar. un gen quimérico que nos-nptII para la selección de las plantas transgénicas. En el primer caso (cointegración del plásmido entero con el plásmido Ti). el marcador de resistencia codificada por el esqueleto del plásmido se pierde. Cointegración del plásmido con un plásmido Ti falta un borde derecho. Porque ColE1 replicones no puede funcionar en Agrobacterium. el marcador de resistencia del esqueleto del plásmido se expresaría. el plásmido pBR322 basada tendría que cointegran en el segmento de pBR322 de la alteración de T-región de la expresión estable del gen de resistencia codificada por plásmidos (379). Otro método para introducir ADN extraños en la región T del plásmido Ti implica en primer lugar la introducción de un replicón ColE1. La presencia de este plásmido en Agrobacterium se confirma con la selección de resistencia a los antibióticos codificada por tanto el esqueleto del vector plásmido y el marcador de resistencia cerca del gen de interés. Las bacterias resultantes se colocan en medio de antibióticos que contienen a seleccionar para el segundo (el desalojo) plásmido y el marcador de resistencia al lado del gen de interés. Sólo la eliminación de la columna vertebral del plásmido después de homogenotization hace que la bacteria resistente al crecimiento de la sacarosa (194). Debido a que los plásmidos del grupo de incompatibilidad mismo por lo general no puede coreside dentro de la célula bacteriana misma.

en que se ha intercambiado el gen de tipo salvaje. pero permite cointegración del gen foráneo sólo en Ti-plásmido pBR322 lugares donde habían sido colocadas anteriormente. (C) Un plásmido del grupo de incompatibilidad mismo que el primer plásmido se introduce en Agrobacterium. (B) Después de doble recombinación homóloga. Estos autores determinaron que la región T y los genes vir se pueden separar en dos replicones diferentes. El segundo método es técnicamente más fácil. 377). mientras que el replicón que contiene los genes vir que se conoce como el ayudante de vir. Un ejemplo es el pPH1JI plásmido de la RIPC. Cuando estos replicones estaban dentro de la célula de Agrobacterium mismo. (D) Debido a que los plásmidos del grupo de incompatibilidad mismo (en este IncP caso) no puede replicar de forma independiente en la célula. Hoekema et al. Doble recombinación homóloga se le permite tomar su lugar. que contiene un gen de resistencia a la gentamicina (Gent). (70). El ayudante general vir plásmido contenía una . (A) Un gen de resistencia a los antibióticos (en este caso. Cada uno de estos métodos de integración cis-tiene ventajas y desventajas. que codifica una lactamasa que confiere resistencia a carbenicilina) se ha insertado en el gen diana que ha sido clonado en un plásmido IncP (que contiene un gen de resistencia a kanamicina [kan] en su columna vertebral) e introducido en Agrobacterium. la selección de los resultados de resistencia a la gentamicina en el desalojo de la RIPC otro plásmido.homóloga restaura la actividad fronteriza y se localiza el gen de interés y el marcador de la planta puede seleccionar dentro de la reconstituida región T (101). 2. Esta estrategia se basa en conclusiones fundamentales de Hoekema et al. Las líneas verdes representan las regiones seleccionadas para la ruptura. (140) y de Frammond et al. 277]). llamó a este sistema binario-vector. es complicado de realizar y consiste en un tanto sofisticados procedimientos genéticos microbianos que muchos laboratorios rechazados. Una de las ventajas de ambos sistemas es que mantienen el gen extraño en el número de copias del mismo bajo que el del plásmido Ti de Agrobacterium. La primera estrategia puede dirigirse al gen ajeno a cualquier parte de la región T (u otra región en el plásmido Ti). una modificación de este procedimiento permite cointegración de un plásmido pBR322 basada en cualquier región del plásmido Ti (338. Sin embargo. Representación esquemática de los pasos involucrados en la sustitución de genes por doble recombinación homóloga (homogenotization [107. varias desarrollado una estrategia alternativa a la utilización de Agrobacterium para entregar genes extraños a las plantas. Debido a la complejidad de la introducción de genes foráneos directamente en la región T de un plásmido Ti laboratorios. Figura. al mismo tiempo. los productos de los genes vir podría actuar en trans en la región T para llevar a cabo de T-ADN tratamiento y la transferencia de una célula vegetal. Sin embargo. el gen alterado se intercambia en el plásmido Ti (PTI). el replicón que alberga la región T constituye el vector binario.

tumefaciens y vectores de uso común para la ingeniería genética de plantas. 26. 314). los científicos deseen introducir en las grandes instalaciones de T-ADN con la capacidad de codificar productos de múltiples genes en una vía biosintética. haciendo que las cepas que contienen este plásmido no puede incitar a los tumores. sin formación especializada en genética microbiana ahora podría manipular fácilmente Agrobacterium para crear plantas transgénicas. 224). (134) proporcionan un resumen de muchas cepas de A. 216. y NT1 (pKPSF2) (247 ). que contienen marcadores de diferentes plantas seleccionables. coli y Agrobacterium y generalmente contienen múltiples sitios únicos de restricción de endonucleasa en el T-región en la que los genes de interés podría ser clonado. 113. algunos plásmidos Ti y Ri contienen múltiples T-regiones. la definición original colocado los dos módulos sólo en replicones diferentes. 364 y ??386 y en http://www . Por ejemplo. Varios grupos han demostrado que el ADN-T. Aunque el término "sistema de vector binario" se utiliza generalmente para describir dos componentes (un componente del ADN-T y un componente de ayuda de la boca). 20. ¿Qué tamaño de T-región se pueden transferir a las plantas? . 146). T-ADN de vectores binarios revolucionado la utilización de Agrobacterium para introducir genes en las plantas. y poli (A) Además de las señales entre las que los genes de interés se podrían insertar. cada una de las cuales se pueden transferir a las plantas de forma individual o en combinación (34. Por otra parte. 25. Los científicos. ¿Cuánto ADN puede ser transferido de Agrobacterium para las plantas? El T-regiones de los plásmidos Ti y Ri naturales pueden ser lo suficientemente grande como para codificar decenas de genes. incluyendo LBA4404 (242). potenciadores de traducción para aumentar la expresión de los transgenes. Un número de cepas de Agrobacterium que contiene no oncogénico plásmidos auxiliares vir se han desarrollado. 120. promotores. EHA101 y su cepa derivada EHA105 (144. se puede movilizar a las células vegetales por un ayudante vir plásmido (141.org). cuando se encuentra en el cromosoma de Agrobacterium. Además. por la complementación genética. cada uno situado en un plásmido separado. tanto en E. AGL0 (192). Estos plásmidos son pequeños y fáciles de manipular.deleción total o parcial de la T-región. GV3101 MP90 (181). 62. los genes responsables de un fenotipo particular. Para los fines de ingeniería genética de plantas. el T-región de pTiC58 es de aproximadamente 23 kpb de tamaño. Muchos vectores se han diseñado para propósitos especiales. Hellens et al. cambia. y la proteína de metas de las señales para dirigir el transgén proteína codificada a determinados lugares dentro de la célula de la planta (algún representante del T-ADN sistemas vector binario se describen en las referencias 10. la reintroducción de grandes regiones del genoma de una planta en una planta mutante puede ser útil para identificar. Estos replicones no necesariamente tienen que ser los plásmidos.

Sin embargo. Hamilton et al. Sin embargo. La sobreexpresión de Vire formado parte del sistema de BIBAC que se utilizó para transformar grandes (30 . que podría movilizar a todo un plásmido Ti.Miranda et al. Aunque el evento fue poco frecuente. Ramanathan y Veluthambi (264) también mostró que un casete de nosnptII.150 kpb) fragmentos de ADN en el tabaco y el tomate más recalcitrantes y Brassica (56. Porque virG es un activador de la transcripción de los operones vir (303). podría ser transferida y confieren resistencia a la kanamicina en las células infectadas por el tabaco. T-ADN repetir secuencias definidas las fronteras de la región T (366). Sin embargo. 123. y las regiones del plásmido Ti fuera de estas fronteras no se encontraron inicialmente en las células tumorales (43). Liu et al. Este sistema no requiere la sobreexpresión de virG o vire a efectuar la transferencia precisa de grandes fragmentos de Arabidopsis. Estos autores mostraron que un inserto de 150 kpb clonado del ADN humano podría ser introducido en las células vegetales mediante el uso de este sistema. la transferencia de diferentes tamaños T-ADN de varias cepas de Agrobacterium tenía diferentes requisitos para la sobreexpresión de virG y vire (103). Ooms et al. VirE2 codifica una proteína de ADN de cadena sencilla vinculante que protege el ADN-T de la degradación en la célula vegetal (275). (224) demostraron que mediante la inversión de la orientación de un borde derecho del T-ADN. . la transferencia de plásmido Ti secuencias fuera de la región T convencionales pueden en un primer momento se han perdido debido a la falta de seleccionable conocido (por ejemplo. (124) demostró por primera vez la transferencia dirigida de grandes moléculas de ADN de Agrobacterium a las plantas mediante el desarrollo de un sistema binario BAC (BIBAC) del sistema. Lo que el ADN es transferido desde Agrobacterium a las plantas? T-ADN fue inicialmente definido como la parte (la región T) del plásmido Ti que fue trasladado de Agrobacterium a células de plantas para formar tumores agalla de la corona. la tumorigénesis) o screenable (por ejemplo. la producción de opinar) marcadores. en las plantas. situado fuera de la frontera de T-ADN a la izquierda. 125). 103. expresión de copias de este gen vir regulación fue pensado para mejorar la expresión de proteínas Vir VirE2 y otros involucrados en la transferencia de T-ADN. 204) desarrolló un sistema artificial transformationcompetent vector cromosoma basado en un origen de replicación y P1 utiliza este sistema para generar bibliotecas de gran tamaño (40 .120 kpb) de Arabidopsis y las moléculas de ADN de trigo. la transferencia eficaz de este segmento de ADN de gran tamaño requiere la sobreexpresión de uno o ambos virG virG y Vire. (241) observaron la incorporación al ADN de las plantas de las regiones del plásmido Ti más tarde demostrado que fuera de los clásicos del T-ADN de las fronteras. (203. este estudio demostró que las moléculas de ADN de gran tamaño podrían ser introducidos en las plantas mediante transformación Agrobacteriummediated. aproximadamente 200 kpb.

(356) encontró que el vector binario completo. Estas plantas serían inicialmente seleccionadas por su resistencia a un antibiótico o un herbicida. con frecuencia podrían ser transferidos a Nicotiana plumbaginifolia y las células de Arabidopsis thaliana. De hecho. Frary y Hamilton (103) observaron la incorporación de BIBAC secuencias de plásmido en 9 a 38% de los transformantes de tomate a prueba. 348) para eliminar el marcador. 57. Martineau et al. La transferencia de múltiples T-ADN en la célula vegetal mismo. 347. Debido a la presencia de ADN caracterizado en las plantas transgénicas es importante que las preocupaciones regulatorias. pero el marcador de selección sería eliminado en la manipulación posterior y el crecimiento de las plantas. con una composición más alta se define transgénicos. Wenck et al. sugiere que la transferencia de secuencias de vector columna vertebral de las plantas fue una consecuencia natural del mecanismo de VirD2 función. (211) por primera vez la transferencia de secuencias de vectores binarios de columna vertebral en el ADN de plantas transgénicas y cuestionó la definición de T-ADN. los científicos han desarrollado varios métodos para generar marcadores libre de plantas transgénicas. que la transferencia de no tDNA secuencias a las plantas puede ser un resultado inevitable. y la generación de "Marcador-Free" Plantas transgénicas Debido a la preocupación por la propagación de los genes de resistencia a los antibióticos en la naturaleza o el escape de genes de resistencia a herbicidas a especies silvestres de malezas. 19. o el uso de . pues.El uso de vectores binarios relativamente pequeña del ADN-T hizo más fácil para los científicos para evaluar la transferencia de la "no-T-ADN" a las plantas de las regiones. 235. Varios métodos han sido propuestos para eliminar el marcador de selección de los transformantes primarios. 209. Estos incluyen el uso de un sistema de recombinación específica de sitio. transposón basado en el movimiento del marcador de selección de la inicial del sitio de inserción del genoma de la planta entera o no vinculados a otro sitio desde el cual puede ser segregados en las generaciones subsiguientes (93). incluyendo secuencias de columna vertebral. Teniendo en cuenta la observación anterior por Durrenberger et al. Kononov et al. así como secuencias de ADN-T. como Cre-salmón o Flp Frt-(2. Por lo tanto. este enfoque puede ser útil en el futuro para la producción de plantas (especialmente difícil para transformar especies). la definición de T-ADN y la columna vertebral de vectores constituye un argumento semántico. Parece. Kononov et al. pero con frecuencia no observadas y no probada. (182) examinó cuidadosamente la estructura de las secuencias del vector binario columna vertebral que se puede encontrar hasta en un 75% de las plantas transgénicas de tabaco y la conclusión de que dicha transferencia podría resultar de saltar a la izquierda de T-ADN en la frontera de T-ADN fue procesada a partir del binario vector o el inicio de T-ADN de transferencia desde el borde izquierdo para traer secuencias del vector columna vertebral en las células vegetales. (91) que VirD2 proteína covalentemente pudo unirse al extremo 5 de la cadena no-T-ADN. de la transformación.

de 10 a 20% de ellos también se muestra fitohormona independiente de crecimiento. Los dos T-ADN separados en plantas de la progenie. Estos experimentos se extendieron por el de Frammond et al. Los primeros experimentos con estos distintos enfoques indicó que cotransformación podría ser un caso frecuente. 314 ). y (iii) la introducción de la de dos TADN se encuentra en el mismo replicón en una bacteria. cuando las células fueron seleccionados para la fitohormona independiente de crecimiento. La segregación de los marcadores puede ocurrir sólo en la descendencia cuando se la generación de la planta transgénica inicial y se limita a las especies naturales propagan a través de la semilla y no los propagan vegetativamente. Las primeras investigaciones que caracteriza el patrón de integración de TADN en los tumores de la agalla de corona indicó que cada uno de los dos TADN codificado por un plásmido Ti octopina de tipo independiente podría integrarse en el genoma de la planta. lo que indica que el T-ADN se habían integrado en loci genéticamente separables. 63. cada uno de una bacteria diferente. Depicker et al.múltiples T-ADN que se puede insertar en sitios no vinculados a la segregación futuro (revisado en las referencias 142 y 372). que mostró que las plantas transgénicas fértiles pueden regenerarse a partir de tejido del tabaco que fue clonado cotransformed de T-ADN de un plásmido Ti y de un micro-Ti (el de una cepa. dos replicón enfoque para generar plantas transgénicas que expresan un principio tanto del T-ADN marcadores pero que posteriormente podrían segregar los marcadores de los demás (58). la supresión de genes marcadores con un sitio específico de sistema de recombinación requiere la introducción de la recombinasa específica de sitio en las plantas. ya sea por transformación genética o por cruce. Tres enfoques fueron utilizados posteriormente para la cotransformación: (i) la introducción de dos T-ADN. Cuando las células fueron seleccionados para la resistencia a la kanamicina. (69). el 60% del resultado callos eran también resistentes a la kanamicina. (9) demostró que las células del tabaco podría ser cotransformed a dos diferentes fenotipos de una sola cepa de Agrobacterium que contienen un plásmido Ti (fitohormonas independiente de crecimiento) y un vector binario de T-ADN (resistentes a la kanamicina de crecimiento). Cada uno de estos sistemas tiene ventajas y desventajas. Por ejemplo. (80) . Otros grupos han utilizado la onestrain. Este experimento representa un "un esfuerzo de dos replicón" para la co-transformación. An et al. dos replicón enfoque). (ii) la introducción de dos T-ADN realizado por replicones diferentes dentro de la misma bacteria. a veces en varias copias (43. Estos resultados sugieren que co-transformación se puede realizar la integración de los transgenes llevado por dos diferentes TADN y que tal vez estos de T-ADN que se segregan en las generaciones posteriores. El análisis molecular sugiere que los T-ADN puede ser integrado en los sitios enlazados. Los autores acreditan estas frecuencias diferentes a la mayor número de copias (5-10) del vector binario de la bacteria en relación con la copia del plásmido Ti solo.

las cepas que contienen el mutante virGN54D a cabo un . Por lo tanto. ha sido descrito por Komari et al. 218. los autores fueron capaces de generar marcadores de plantas libres de transgénicos a alta frecuencia. Constitutiva mutantes vira se caracteriza por varios grupos (13. seguida por la segregación del gen de selección para generar marcadores libre de plantas transgénicas. Cuando se probó en el tabaco transitorio y ensayos de maíz de transformación. 76. 254). más énfasis se ha puesto en inductor independiente de mutantes virG. 75. Aunque cotransfer de T-ADN a los sitios no vinculados genéticamente se informó. Varios grupos han identificado por lo tanto. Expresión de genes de virulencia y la transformación de plantas El tratamiento y la transferencia de T-ADN de Agrobacterium a las células vegetales está regulada por la actividad de los genes vir. (365). desde un único replicón en una cepa (la onestrain . Estas proteínas alteradas contienen mutaciones que convierten de asparagina-54 en ácido aspártico (virGN54D) o isoleucina-106 a la leucina (virGI106L). 298. 293.realizó un experimento similar en el que los marcadores de selección se fitohormona independiente del crecimiento y la síntesis de la nopalina (codificada por un plásmido Ti) y el crecimiento resistentes a la kanamicina (codificado por un vector binario de T-ADN). Se realizó el experimento de dos maneras: o bien los dos T-ADN fueron entregados por dos diferentes cepas de Agrobacterium (las dos cepas. 66. tales como moléculas acetosiringona y relacionados (28. 253). un enfoque replicón). especialmente cuando se expresa de un alto número de copias del plásmido (118). En cada uno de estos estudios. La actividad de genes de virulencia es inducida por los compuestos fenólicos inducidos por la planta de heridas. 92. no está claro cuál de los tres protocolos de cotransformación será reproducible mejor para la generación de marcador de plantas libres de transgénicos. 300). 67. Sin embargo. 228. El uso de una cepa de Agrobacterium solo cotransform plantas con dos T-ADN de la misma replicón. El uso de dos cepas de Agrobacterium para ofrecer diferentes T-ADN de las células de la misma planta fue estudiada por una serie de grupos (65. 295. Sin embargo. Ambas proteínas mutantes estimulado un alto nivel de expresión de los genes vir. los mutantes vira y virG que la función constitutiva. o ambos TADN fueron lanzadas. Los resultados de estos experimentos indicaron que cotransfer de T-ADN del plásmido mismo en una de ellas fue mucho más eficaz que fue la transferencia a partir de dos cepas diferentes. posiblemente debido a virG funciones aguas abajo de Vira. algunos autores también informaron de una estrecha vinculación de los dos diferentes T-ADN en muchos casos. (178) y Xing et al. dos replicones enfoque). Amplia estudios genéticos como resultado la identificación de una serie de mutaciones que hacen que la proteína Virg activo en la ausencia de compuestos que inducen fenólicos (127. puede haber casos en los que los científicos quieren inducir los genes vir a niveles superiores a la realizada por extractos de plantas. en la ausencia de inductores fenólicos. 74. 217).

Estos datos sugieren que la inducción de genes vir mayor y T-cadena de producción no necesariamente pueden ser predictores confiables de la eficiencia de transformación. y las cajas de vir. Un efecto aún mayor se observó cuando el alelo virGN54D fue albergado en un plásmido de alto número de copias. aumentaría la eficiencia de transformación de las cepas resultantes. la pTiBo542 plásmido Ti en el fondo C58 cromosómicas es hipervirulenta en ciertas especies de leguminosas. el apio y la zanahoria (199). Teniendo en cuenta estos resultados en su totalidad. pero no en su nativo Bo542 fondo cromosómicas (143). (23) demostraron que los genes individuales vira puede ser especialmente adecuado para funcionar en ciertos contextos genéticos y Krishnamohan et al. (273) mostraron que las copias adicionales de tipo nopalina virG dio lugar a una mayor expresión de genes vir. se puede concluir que el aumento del número de copias de Vira o virG o disminuir la dependencia de las proteínas codificadas en inductores fenólicos en general. 146. Normalmente. A. Varios laboratorios han determinado el efecto de las copias adicionales de genes virG de tipo salvaje en la inducción de genes vir y transformación de plantas. Como se señaló anteriormente.5. T-ADN de Integración y la expresión del transgén transformación de la planta no siempre se traduce en la expresión del transgén eficiente. datos no publicados). posiblemente debido a un gen asociado virG (41. (200) mostraron que las copias múltiples de virG alterado el perfil de respuesta de pH para la inducción de genes vir. tumefaciens A208 (L. Los resultados recientes de mi laboratorio indican que la inducción de genes vir y la producción de T-cadena por la eficiencia y la transformación de determinadas cepas de Agrobacterium no se correlacionan bien. Liu et al. copias adicionales de virG permite un alto grado de inducción en medio rico. la inducción de genes vir es muy pobre con un pH neutro o alcalino. tumefaciens A277. incluso a pH 8. La literatura está repleta de ejemplos de los niveles de expresión variable de los transgenes. que contiene el plásmido Ti pTiBo542 en el fondo C58 cromosómicas. Lee y Gelvin SB. que a menudo no se correlacionan con . la situación es probable que sea más compleja. la presencia de este gen mutante en el Agrobacterium aumentado la transformación transitoria de arroz y soja entre dos y siete (170).mayor nivel de transformación que se codifica el gen de las cepas de tipo salvaje virG (130). o en medio rico. Copias adicionales de virG también aumentó la frecuencia de transformación transitoria de los tejidos del arroz. Rogowski et al. en el fondo mismo cromosoma.-Y. (183) ha demostrado recientemente que los plásmidos Ti puede haber evolucionado para optimizar las combinaciones específicas de Vira. es mucho más virulenta que las cepas A348 y A208. Sin embargo. Sin embargo. Belanger et al. que contenían los plásmidos Ti pTiA6 y pTiT37. la inducción de genes vir por exudados de plantas y la producción de T-cadena son los más altos en A. virG. 159). respectivamente.

un inconveniente para algunos de estos experimentos fue que los eventos transgénicos pueden estar sesgados por la selección de plantas resistentes a los antibióticos que expresan un gen marcador antibiótico realizado por el T-ADN. Sin embargo. lo que resulta en la activación (o su ausencia) de T-ADN realizado transgenes (22. Sin embargo. Esta falta de correspondencia fue inicialmente atribuido a los efectos de posición. una sola copia transgenes introducidos en un sitio de salmón en la misma posición del genoma de la planta también mostraron niveles variables de expresión de los transformantes independientes. tales como Cre-lox. Sin embargo. por lo general asociados con la metilación del promotor del transgén (222). 173. El alto porcentaje (30%) de los eventos de integración de T-ADN que resultó en la activación de un transgén reportero promotor situado cerca de la frontera de T-ADN sugieren que el T-ADN preferentemente puede integrarse en regiones transcripcionalmente activas del genoma. Por lo tanto. 269. el silenciamiento se informó a principios de origen natural del T-ADN genes (135. Sólo los eventos de integración que uniría el transgén promotor con un activo promotor se traduciría en la actividad del reportero (180). referencia 255). 340). Metilación asociados. El silenciamiento de transgenes en estos casos puede ser el resultado de la metilación del ADN transgénico (61). 223. Un sistema alternativo para la selección de genes es el uso de sistemas de integración en sitios específicos. por ejemplo. el silenciamiento transcripcional puede ser consecuencia de la integración de los transgenes en las regiones del genoma de la planta susceptible a la metilación del ADN y puede ser una consecuencia natural del proceso de transformación de plantas. 296. T-ADN también podrían integrarse en regiones transcripcionalmente competente o en silencio transcripcional del genoma de la planta. el transgen se transcribe. 270). 237. 308).el número de copias del transgén (véase. es decir. la posición dentro del genoma en el que los integrados T-ADN fue acreditado con la capacidad de los transgenes que expresan. 35. Las plantas transgénicas generadas por métodos directos de transferencia de ADN (por . No está claro si el ADN-T inserciones en regiones transcripcionalmente inerte del genoma que han pasado desapercibidos debido a la falta de expresión del gen marcador de resistencia a los antibióticos. sino también que el silenciamiento de transgenes es a menudo "posttranscriptional". El silenciamiento de genes tales posttranscriptional se asocia con frecuencia copias de transgenes múltiples dentro de una célula. Una manera obvia de evitar los problemas de la supuesta influencia de la posición es la integración de T-ADN en conocidas regiones transcripcionalmente activas del genoma de la planta. la orientación de genes en las plantas mediante recombinación homóloga ha sido el mejor de los extremadamente ineficiente (72. sino que es el resultado de ARN inestables (219). 238. Ahora sabemos no sólo que los transgenes silenciar los resultados de "transcripción" de mecanismos. T-ADN podrían integrar cerca o lejos de la activación de la transcripción o elementos potenciadores. es decir.

es posible que el ADN-T el número de copias también se pueden correlacionar con el estado de crecimiento de la bacteria o las plantas a transformar.ejemplo. En las células . Una alternativa a este enfoque puede ser la generación de plantas transgénicas que contienen unas cuantas copias de T-ADN que están aislados unos de otros. o el bombardeo de partículas) a menudo integran un gran número de copias del transgén en las matrices de repetición en tándem o invertido. Marte son secuencias de ADN que o bien están asociadas con el cromosoma "matrices" en forma aislada o puede asociarse con estas matrices in vitro (121. los cultivares de élite. Sin embargo. 350). Por lo tanto. Grevelding et al. 304). 122. Los científicos suelen producir un número relativamente grande de los transformantes independientes y la pantalla para que las plantas que contienen una sola copia del ADN-T de inserción. Sin embargo. la generación de una sola copia de las plantas transgénicas es todavía un poco al azar. sobre todo repeticiones invertidas de cabeza a cabeza "en torno a la frontera de T-ADN derecha. 294. 164. o líneas que son recalcitrantes a la transformación. Silenciamiento de transgenes puede ocurrir en las plantas que alberga un único e integrado de T-ADN (95). Mejor de los casos. puede convertirse en un paso limitante. en loci múltiples o individuales ( 176). es común encontrar copias en tándem de unos pocos T-ADN integrados en un solo lugar (165). estos hallazgos deben ser probados rigurosamente. Entre otras propiedades. La información anecdótica de varios laboratorios indican que las cepas de Agrobacterium que son menos eficientes en la entrega de T-ADN puede ser más eficiente en la producción de una sola copia del ADN-T inserciones. El uso de las Regiones de Fijación a la Matriz Para mejorar silenciamiento del transgén En la actualidad. Sin embargo. polietileno glicol. que se han atribuido el papel de los genes de aislamiento dentro de un dominio de la cromatina en bucle de la transcripción de activación o silenciamiento de los efectos de los campos vecinos. Aunque la transformación de Agrobacteriummediated por lo general resulta en un menor número de copias de transgenes integrados. esto puede ser una molestia mucho tiempo. (117) señaló que plantas transgénicas de Arabidopsis derivada de un procedimiento de transformación de raíz tienden a tener menos del T-ADN inserciones que se derivan de las plantas de discos de hojas. una cepa de Agrobacterium procedimiento o que se podrían utilizar para generar plantas transgénicas con un único e integrado de T-ADN podría ser una bendición para la industria de la biotecnología agrícola y biología molecular de plantas en general. para las especies de importancia agronómica. o la transformación mediada por liposomas. no está claro si esta observación puede ser aplicable en general a otras especies vegetales. Un mecanismo propuesto para lograr esto es a los transgenes en el flanco de T-ADN con las regiones de unión de la matriz (Marte). con frecuencia resulta en el silenciamiento del transgén (51. Sin embargo. electroporación. la integración de las repeticiones de ADN-T.

11. 21. los experimentos en los que los supresores de silenciamiento viral han sido utilizados para aumentar los niveles de la expresión transitoria de Agrobacterium transgenes introducidos parecen prometedores. 38. O. de gran utilidad para reducir el silenciamiento de transgenes entregados a las centrales de transformación mediada por Agrobacterium. Como se indica en algunas de las referencias citadas anteriormente.animales. Mayores aumentos en la expresión del transgen se han observado con bombardeo de partículas mediada por la transformación (5. 31. confundiendo la interpretación de los experimentos originales (29. 226. como los efectos de aislamiento pueden hacer que la expresión del transgén proporcional al número de copias del transgén (306). 259). los supresores virales de silenciamiento de los genes puede activar un transgén estable antes silenciadas. . Como tal. El uso de supresores virales de silenciamiento de genes para aumentar la expresión del transgén Los datos recientes de una serie de laboratorios indican que algunos virus de plantas. o tomate Cf-9 y CF-4 proteínas resistencia a las enfermedades. 169. algunos de los MARs inicialmente utilizado en los experimentos con animales también pueden contener elementos potenciadores. Uno podría preguntarse si tales supresores silenciador podría evitar el silenciamiento de transgenes introducidos en las plantas de forma estable por transformación mediada por Agrobacterium. no está claro si Marte será. Sin embargo. tanto de virus ADN y ARN. 201. Sin embargo. 198. 333). Voinnet y sus colegas (datos no publicados) han demostrado recientemente que cuando cotransformed con transgenes que codifican varias proteínas verdes fluorescentes. este aumento se asocia generalmente con la expresión de transgenes en células de las plantas en lugar de plantas enteras (330. Cuando los transgenes flanco entregados a las centrales a través de transformación mediada por Agrobacterium. 334). 225. 55. por su propia cuenta. 266). Aunque esta hipótesis aún no ha sido probado y las posibles consecuencias negativas (como el aumento de la susceptibilidad del virus) pueden derivarse de la incorporación estable de los genes antisilencing en un genoma de la planta. Marte parecen tener sólo un efecto pequeño sobre la expresión del transgén (128. 210). el virus de la papa Y Nia proteína. supresores virales de silenciamiento puede ser útil para mitigar el silenciamiento de transgenes. Varios investigadores han especulado que antisilencing viral ha evolucionado como un mecanismo para que los virus para evadir la defensa de la planta a través de silenciamiento de los genes virales (55. 6. 227. 236). Es posible que los efectos de los transgenes más alta expresión de Marte usando el bombardeo de partículas refleja el número transgén copia mayor integración resultante de esta técnica en comparación con el número de copias relativamente más bajos de T-ADN integrado entregado por Agrobacterium (7). contienen genes que suprimen el silenciamiento de genes (4. Independientemente de la razón y el mecanismo de antisilencing.

de Agrobacterium a las células vegetales. lo que permite la expresión de transgenes en las condiciones noninduced.varios supresores de silenciamiento viral aumentó drásticamente la expresión de estas proteínas otros. Los autores concluyeron que los supresores virales de silenciamiento de los genes podría ser útil para la producción de grandes cantidades de proteínas en las plantas. como los experimentos de ingeniería genética de plantas se hizo más refinada. De estos. 196 . Dichos rasgos son los que ayudan en el proceso de transformación en sí o que efecto reordenamientos de ADN de plantas deseadas sólo durante el evento inicial de transformación (por ejemplo.25 pb) las moléculas de ARN asociada con el silenciamiento génico postranscripcional. como el virus del mosaico de la coliflor 35S y 19S promotores o promotoras opinan sintasa. medio ambiente. Los niveles de expresión de hasta 50 veces superiores a los alcanzados en las transformaciones de control (que carecen de los genes supresores de silenciamiento viral) se obtuvieron. 343). Muchos de estos sistemas con fugas. la orientación de genes usando sitespecific sistemas de recombinación). o en tejidos específicos. Varios supresores de silenciamiento viral diferentes. Nonintegrating T-DNA de los sistemas incluyen el uso de cepas mutantes de Agrobacterium y / o células de las plantas que son competentes en T-ADN . 234. en lugar de las moléculas de ADN. 179. los científicos recurrieron a los promotores regulados que expresan un transgén en un determinado patrón de desarrollo. la proteína p19 fue el más efectivo. cuando uno no quiere un transgén o su producto para estar presente después de las primeras horas o días después de la transformación. choque térmico (284). 133. Estas son el uso de "nonintegrating" sistemas tDNA y la transferencia de las proteínas. lo que permite la sobre-expresión de un determinado producto o la expresión de un producto que puede ser tóxico durante ciertas etapas del desarrollo de la planta. 282) (véase la referencia 158 para una revisión reciente de los sistemas de inducción del gen inducible químicamente ). cobre (221). y la proteína p19 del virus de la atrofia de tomate espesa. sin embargo. Sin embargo. Dos estrategias se están desarrollando actualmente para permitir la expresión transitoria única de productos de los genes en las plantas. Estos sistemas inducible incluidos los regulados por la tetraciclina (108). alcohol (279). la proteína P1-HcPro del virus del grabado del tabaco. Los sistemas fueron desarrollados también que permitiría a los científicos para inducir la expresión de los transgenes a voluntad. Cuando la expresión del transgén no es para siempre Experimentos para expresar transgenes en las plantas inicialmente utilizó elementos. que expresan el transgen de una manera relativamente constitutiva (24. 280. fueron capaces de mejorar la expresión del transgén transitoria tanto del promotor del virus del mosaico de coliflor 35S y del promotores nativos transgén. tanto en el aumento transitorio la expresión del transgén y la disminución de los niveles de pequeña (21 . y las hormonas esteroides (14. incluyendo la proteína p25 de PVX. Puede haber casos.

pero deficiente en la integración de T-ADN. Shurvinton et al. un fenotipo asociado con una deficiencia en la integración de T-ADN. Del período inicial de 21 mutantes. la sustitución de cuatro aminoácidos conservados por dos residuos de serina dio lugar a una proteína mutante que hizo el esfuerzo de codificación Agrobacterium muy atenuada en la virulencia. Nam et al. con mayor detalle. Narasimhulu et al. thaliana por su capacidad de ser transformados por Agrobacterium. (232) más identificado un gran número de Arabidopsis mutantes de inserción de T-ADN que eran resistentes a la transformación de Agrobacterium (mutantes rat). Aunque la función precisa del gen HTA1 en la integración del ADN-T todavía no se ha dilucidado. donde se pueden expresar de forma transitoria. A pesar de este dominio no se requiere tanto para la actividad endonucleasa VirD2 o nucleares objetivo de la TADN. (290) se define un dominio C-terminal. pero no integrar de manera eficiente. 5 fueron transitoriamente transformado de manera eficiente. sin eficientes posteriores T-ADN de integración. (230) caracteriza uno de estos mutantes. Este mutante se generó mediante la inserción de T-ADN en la región 3 no traducida del gen de la histona H2A (HTA1).de transferencia nuclear. pero mal transformado de forma estable. pero fueron muy recalcitrantes a la transformación estable. El uso del gen HTA1 para mejorar la eficiencia de transformación de plantas silvestres se discute a continuación. sino que la integración del ADN-T fue interrumpido. Los datos bioquímicos y moleculares indican que este mutante podría ser transitoriamente transformado de manera eficiente. esta mutación prestados cepas de Agrobacterium muy deficiente en la integración de T-ADN. Mysore et al. pero aún eran capaces de transformar las células de la planta transitoria en el 20% de la eficiencia de tipo salvaje cepas. que mostró alta homología de secuencia de aminoácidos de los genes virD2. Por lo tanto. (233) y Mysore et al. UE-1 se transforma fácilmente de forma transitoria. transformación de la raíz de este mutante (y quizás otros de TDNA de mutantes deficientes en la integración) se puede utilizar para la prestación transitoria del T-ADN. (349) descrito recientemente un nuevo procedimiento para la transferencia de las proteínas directamente de Agrobacterium a las células vegetales. (229) mostró además que las cepas de Agrobacterium albergar esta sustitución VirD2 fueron muy deficientes en la transformación estable (con un 2% de la eficiencia de las cepas de tipo salvaje). Este sistema se basa en la capacidad del sistema de secreción tipo IV de proteínas codificadas por los genes y virB . pero sigue siendo relativamente competentes en la entrega de T-ADN al núcleo de la planta. Caracterización genética y molecular de este ecotipo indicó que el bloque en la transformación se produjo en la etapa de integración del ADN-T. (231) utilizaron una prueba para detectar la raíz de casi 40 ecotipos de A. Nam et al. Durante un registro para los dominios de VirD2 necesarias para la orientación nuclear de la T-DNA. Este mutante VirD2 proteína por lo tanto puede ser utilizada para combatir T-hilos en el núcleo. Vergunst et al. el mutante rat5. denominado. Entre estos ecotipos.

por ejemplo. Agrobacterium o el investigador?" El rango de hospederos muy amplio de Agrobacterium. La respuesta incluyó una rápida necrosis de los tejidos y la escisión del ADN nuclear en oligonucleosome del tamaño de los fragmentos por nucleasas endógenas y es característico de una cascada de la caspasa-proteasa. 102. 271. 239. sugiere que en muchos casos de T-ADN de integración puede seguir siendo el paso limitante. incluyendo las especies de importancia agronómica como el maíz y la soja (170. Infección por Agrobacterium de los tejidos vegetales. Hansen (129) se describe una respuesta apoptótica de maíz a la infección por Agrobacterium. Estos experimentos conducen a la posibilidad de utilizar las proteínas Vir como portadores de introducir otras proteínas de forma transitoria en las células vegetales. 288). 263). tales manipulaciones de las condiciones de transformación pueden tener limitaciones. ha aumentado la probabilidad de transformar de manera estable los tipos de células que pueden ser regenerados (96. Varios grupos han descrito una necrosis lenta. e incluso células animales.Agrobacterium virD4 la transferencia de ciertas proteínas Vir a las células vegetales. en algunos casos resultado de la necrosis de tejidos vegetales. La manipulación de estos genes durante el proceso de transformación mediada por Agrobacterium por lo tanto puede ser útil para aumentar tanto la viabilidad de las células de plantas y la eficiencia de . incluyendo las gimnospermas y tal vez menor de plantas phyla. La cuestión ha surgido a menudo. Agrobacterium que transitoriamente puede transformar un número de estas especies de manera eficiente. 240. una variedad de hongos. arroz. Alteración de las condiciones de cultivo de tejidos. la difusión de uvas infectadas por cepas de Agrobacterium en particular (79.la transferencia de ADN para el receptor (es decir. Más recientemente. p35 y el IAP. "¿Quién tiene el problema de la transformación. Sin embargo. muchas especies importantes o las líneas puras siguen siendo muy recalcitrantes a transformación mediada por Agrobacterium. La expresión de dos genes supresores de células baculovirus muerte. en gran medida inhibe tanto la necrosis del tejido y la escisión del ADN endógeno. Asimismo. Manipulación de los genes de plantas para mejorar TRANSFORMACIÓN Respuesta de la planta a la infección por Agrobacterium A pesar de los grandes avances se han hecho en la última década para aumentar el número de especies de plantas que se pueden transformar y regenerar con Agrobacterium. 258 ). mostró que el C-terminal de 37 aminoácidos de VirF eran suficientes para la transferencia de la proteína de fusión. maíz y soja. VirD2. Estos autores mostraron que las fusiones traduccionales de la proteína recombinasa Cre en el extremo N de cualquiera de VirE2 o VirF podría ser transferido a las células vegetales y la recombinación del efecto en los sitios lox. sugiere que la T. el uso de antioxidantes en la transformación de la uva. la exclusión de entrada) no puede ser el problema. VirE2 y VirF son las tres proteínas identificadas hasta la fecha que se pueden transferir por este sistema.

inédito). abrigos la Thebra. Estos incluyen la forma procesada de VirB2. los resultados en un muy atenuada fenotipo de la transformación (Bhattacharjee y Gelvin. y VirB1 (un producto elaborado de VirB1 que se pueden encontrar en el medio extracelular).transformación de las especies de plantas con una respuesta de apoptosis a Agrobacterium. Los primeros trabajos (16) utilizados VirD2 como la proteína cebo en una levadura de dos sistema híbrido para identificar a un A. Identificación de Genes vegetales que codifican proteínas que interactúan con las proteínas de virulencia de Agrobacterium Varias proteínas de virulencia de Agrobacterium se espera que interactúe con proteínas vegetales. VirD2. y VirF. que se transfiere a las células vegetales. (iii) "genética inversa" de cribado para detectar si los genes de interés en particular pueden estar involucrados en la transformación. la proteína que cubre el extremo 5 de la transfiere T-capítulo. presumiblemente. Una de las razones de estos experimentos es la esperanza de que la identificación de estos genes puede llegar a producir en su manipulación ya sea para mejorar la transformación o para hacer plantas resistentes a la enfermedad de la agalla de corona. Varios grupos han empezado a identificar los genes de plantas y productos de proteína implicada en el proceso de transformación. también puede interactuar con proteínas en la superficie de las células vegetales. inédito). pero cuya función se desconoce. o la inhibición antisentido de la expresión de la importina-1 (AtKAP) de genes. tales como VirB5 y VirB7 (componentes menores de la Tpilus). (ii) directa "hacia adelante genética" de selección para identificar plantas mutantes que no pueden se transforma. y Arabidopsis codifica por lo menos nueve de estas proteínas (Bhattacharjee y Gelvin. . Varios enfoques han sido empleados para identificar estos genes de plantas. la proteína ADN de cadena única unión que. ahora conocido como importina-1) como un socio que interactúan. La importancia de la importina proteínas en el proceso de transformación con Agrobacterium se ha sugerido recientemente al demostrar que una inserción de T-ADN en el gen importina-7. Importina-proteínas están involucradas en la translocación nuclear de muchas proteínas albergar secuencias NLS. y (iv) los diversos enfoques genómicos para identificar genes de plantas que pueden ser inducidos o reprimidos después de la infección por Agrobacterium. incluyendo (i) el uso de la levadura de dos híbridos de sistemas de identificación de proteínas de origen vegetal que pueden interactuar con las proteínas de virulencia. VirE2. Varias proteínas Vir otros que están en la superficie celular de las bacterias. thaliana importina (AtKAP. Ballas y Citovsky (16) mostraron que la interacción de VirD2 con importina-AtKAP NLS se depende tanto de la levadura e in vitro. el componente principal de la T-pilus que se requiere para la transformación.

(285) identificaron recientemente un Arabidopsis Skp1 proteína como un interactor con el dominio de la caja de VirF. Tabaco VIP1 plantas antisentido también fueron muy recalcitrantes a la infección por Agrobacterium. que puede ayudar a otras proteínas de la meta Vir para la proteólisis. Tzfira et al. (329) identificado dos proteínas que interactúan de Arabidopsis. un inhibidor de la ciclofilinas. Skp1 proteínas pueden estar involucrados en la selección proteínas como ciclinas que el proteosoma 26S.. Los resultados recientes sugieren además un uso para VIP1 en la mejora de la transformación de plantas: las plantas transgénicas que sobreexpresan VIP1 se hipersusceptibles de transformación por Agrobacterium (327. La sobreexpresión de esta fosfatasa en el tabaco transfectadas AP-2 células resultó en disminución nuclear objetivo de una GUS-VirD2 NLS-proteína de fusión. VIP1 y VIP2. interactuó intensamente con VirD2 in vitro. Esta puede ser la fosfatasa implicada en la fosforilación y desfosforilación de un residuo de serina cerca del motivo Cterminal de NLS VirD2. (78) identificaron tres VirD2 y dos proteínas interactúan VirE2. Deng et al. Schrammeijer et al. lo que sugiere que VirF puede funcionar en el establecimiento del ciclo celular de las plantas para obtener una mejor transformación. también puede sugerir un mecanismo de rotación de proteínas Vir: si VirF está dirigido a los proteosomas. como la glutatión S-transferasa fusión. VIP1 pueden estar implicados en objetivos nucleares de la T-complejo debido a la inhibición antisentido de VIP1 expresión dio lugar a una deficiencia en la orientación nuclear de VirE2. Los autores sugieren que esta proteína vegetal puede servir como un acompañante para ayudar en la Tcomplejo tráfico dentro de la célula vegetal. pendiente de publicación). una de ciclofilina Arabidopsis. Rao P. Los autores mostraron que el dominio de interacción de VirD2 fue en la parte central de la proteína. pero no VirE2. inhibe la transformación mediada por Agrobacterium de las raíces de Arabidopsis y cultivos de tabaco suspensión celular. Utilizando VirE2 como la proteína cebo en una levadura sistema híbrido de dos. lo que sugiere que la fosforilación de la región NLS VirD2 pueden estar implicados en objetivos nucleares del complejo VirD2/T-strand (Y . y Gelvin SB. inédito).VirD2 también interactúa con al menos dos proteínas de plantas por medio de una levadura sistema híbrido de dos. Los experimentos en mi laboratorio identificado un tipo de tomate la proteína fosfatasa 2C como socio de la interacción con VirD2. La ciclosporina A. La interacción de VirF con VIP1. . 330). una región para que no se había atribuido la función anterior. VirE2 también interactúa en la levadura con varias de las proteínas de Arabidopsis importina. El T-pilus es esencial para la transformación mediada por Agrobacterium. Se caracteriza más a fondo uno de los VirD2 interactores. Tao. Las mutaciones en las proteínas de diferentes virB alterar la transformación. Esta proteína. lo que sugiere que VirD2 y VirE2 puede haber un mecanismo común de importación nuclear (Bhattacharjee y Gelvin.

datos no publicados). Los experimentos en mi laboratorio han comenzado a abordar los posibles socios plantinteracting con T-pilus componentes. 312). Involucrados en transformación mediada por Agrobacterium Los científicos han demostrado una base genética para la susceptibilidad a la enfermedad de la agalla de corona. Kopecki A. En vivo los datos indican que cada una de estas proteínas está implicada en la transformación mediada por Agrobacterium. mi laboratorio se embarcó en un proyecto importante para identificar el ADN de Arabidopsis mutantes de inserción de T-que son resistentes a la transformación por Agrobacterium (mutantes rat [232]). se han identificado dos clases de proteínas de Arabidopsis que con fuerza y ??específicamente interactuar con este gran Tpilus constituyentes (H. 231. Hwang y SB Gelvin. pero no cicla. VirB5. pero no con otras proteínas de virulencia de prueba. el principal T-pilus componente es el procesado y cicla VirB2 proteína (189). Cada una de estas cuatro proteínas vegetales en la levadura interactúa consigo misma y con los demás. Estos estudios han dado como resultado la identificación de más de 70 mutantes hasta la fecha. se espera que el T-pili podrían interactuar con la pared celular de las plantas o de la membrana. sus perfiles de hidroterapia sugieren que contienen dominios que atraviesa la membrana. 246. de VirB2 como cebo de proteína. 283). VirB1. en algunas especies de plantas (15. 292. una línea de Arabidopsis mutante que contiene una inserción de TADN en la región promotora de uno de los "desconocidos de proteínas" genes también es muy recalcitrantes a la transformación mediada por Agrobacterium. 272. Otros genes de ratas que pueden afectar a la estructura de la pared celular son una sintasa xilano (rat4 [232]) y un expansina (A. En un esfuerzo por identificar los genes involucrados en la planta de transformación mediada por Agrobacterium. Como se mencionó anteriormente. VirD2. Zhu. también son menores T-pilus componentes (278. Por lo tanto. Kaiser. Aunque el papel preciso de la Tpilus sigue siendo controvertido. Y. Antisentido o RNAi inhibición de la expresión de los genes que codifican estas proteínas en un fenotipo transformación deficientes. datos no publicados). Las funciones de muchos de los genes mutados en el proceso de transformación han sido revelados por diversos ensayos.-H. rat1 (que codifica una proteína arabinogalactano) y rat3 (probablemente codifica una proteína de la pared celular de las plantas) están implicados en la adhesión bacteriana a las raíces (23). aunque otras proteínas de virulencia. Además. Utilizando una levadura sistema híbrido de dos y la forma procesada. La interacción de proteínas otra es una GTPasa Rab tipo. incluyendo VirB1. Debido a la adhesión bacteriana a los orígenes del mutante . Una de estas clases de proteínas de origen vegetal está codificada por un gen de la familia de tres miembros. VirE2 y VirF. Aunque la identidad de estas tres proteínas relacionadas no se conoce actualmente. 214. incluyendo VirB5 VirB7 y posiblemente. Adelante Selección genética para identificar genes de la planta. 344).pero no de T-ADN de procesamiento (301. y Gelvin SB..

232]). el gen se expresa en los primordios de las raíces laterales. Debido a la mutación de la histona H2A-1 gen dio lugar a la transformación disminución de la raíz de Arabidopsis. datos no publicados). la sobreexpresión de la histona H2A RAT5-1 gen en . Matthysse. Plantas transgénicas de Arabidopsis que contienen genómica adicional (230) o cDNA (H. Yi.y importins son probablemente bloqueado en el T-ADN nuclear proceso de focalización (S. Yi y Gelvin SB. datos no publicados) H2A-1 copias son de dos a seis veces la transformación más competentes que son las plantas que contienen el normal histona H2A-1 complemento de genes. hemos identificado una serie de mutantes otra rata en las etapas posteriores del proceso de transformación.. y la zona de elongación. codificado por RAT5. datos no publicados) . la expresión transitoria de la histona H2A-1 gen de una entrada de T-ADN tanto complementa el mutante rat5 (230) y aumenta la eficiencia de transformación de los ecotipos de Arabidopsis normalmente sensibles y altamente recalcitrantes (L. se expresa en numerosos tipos de células. Zhu Y. T-DNA de las inserciones en los genes que codifican .. El conocimiento de las competencias de transformación de células vegetales puede ser importante para la ingeniería genética de las especies de plantas recalcitrantes y cultivares. H. La Arabidopsis de la familia de genes histona H2A incluye 13 miembros.rat4 parece casi normal (A. Cao H. Humara. Li. Además. la región de meristemas. datos no publicados). Bhattacharjee. Hemos iniciado un estudio del patrón de expresión de cada uno de estos genes y un examen del papel que cada uno de estos genes pueden jugar en la transformación mediada por Agrobacterium (370. Otros experimentos indican que las histonas H2A-1 la expresión génica y la susceptibilidad a la transformación Agrobacteriummediated están altamente correlacionados. Este patrón de expresión es una característica de un "reemplazo" de genes histona. Curiosamente. entre ellos el rat5 (a las histonas H2A mutante [230. En las raíces. la zona de elongación de la raíz es la región más susceptible a la transformación mediada por Agrobacterium (370). incluyendo células que no se encuentran en rápida división. y los mutantes rat22. La histona H2A-1 gen. rat17. Una inserción de T-ADN entre dos genes de reemplazo muy próximas entre sí histona H3 (histona H3 y H3-4-5) también se traduce en el fenotipo de la rata (J.-Y.. y Gelvin SB. y Gelvin SB. Finalmente. probablemente están involucrados en la integración de T-ADN (232). rat20. datos no publicados). Fujinuma T. la expresión de este gen puede ser predictivo de los tipos de células que son más sensibles a la transformación. datos no publicados). rat18. Zhu Y. El hallazgo de que la histona H2A-1 gen afecta a la T-ADN de la integración ha dado lugar a una caracterización más amplia de este gen. J. El uso de este enfoque con visión de la genética. RAT4 pueden estar involucrados en la transferencia de T-ADN en el citoplasma. Así.. y Gelvin SB. Otros mutantes. se examinó si la sobreexpresión de este gen podría aumentar la eficiencia de transformación mediada por Agrobacterium. Lee y Gelvin SB.

184). RNAi. histonas acetiltransferasas (incluyendo HAC4. Sin embargo. HAC6.. las histonas diferentes (incluyendo las histonas H2A1. Sus funciones deben ser detectada directamente. tomate (52). H2A3. He discutido sobre el uso de ARN antisentido y RNAi para demostrar que VIP1 (un interactor VirE2). HAC10 y HAC11). mi laboratorio ha identificado Arabidopsis mutante que contiene las líneas de las interrupciones en varias importina y importina-genes (supuestamente implicados en el transporte nuclear de la T-complejo) y diversos genes implicados en la estructura de la planta de la cromatina (supuestamente implicados en la integración de T-ADN en el genoma de la planta). J. y Gelvin SB. 104. H2B6.-Y. y una . y Gelvin SB. Zhao X. A. y H4-1). una GTPasa Rab. Cao. Humara H. Tales interacciones son el mejor de los que sugieren un papel de estos genes en la transformación de plantas. El uso de una estrategia de este tipo. Davis. y varias proteínas de la función no identificados (VirB2 interactores) están involucrados en transformación mediada por Agrobacterium. Li. y el arroz (157). H3-5. Otro método para evaluar el papel de un gen en particular en la transformación sería la mutación de ese gen y después del ensayo de la susceptibilidad de la planta de transformación. RAT5 epistáticos sobre el fenotipo de los mutantes de rata rata otros y por lo tanto pueden sensibilizar células de las plantas de transformación Agrobacteriummediated. Una forma de lograr esto es la inhibición de la expresión genética en las plantaciones. Lee. o mutagénesis. datos no publicados ). Varias estrategias basadas en PCR han sido descritas para identificar tales mutaciones nocaut en Arabidopsis (98. Supresión de la expresión de estos genes puede ser un método para generar plantas resistentes a la enfermedad agalla de la corona. HAC9. H2B5. utilizando técnicas tales como el ARN antisentido. H. H3-4. datos no publicados). Detección genética inversa para los genes de plantas que participan en los genes mediada por Agrobacterium transformación de plantas codificación varias proteínas que interactúan con las proteínas de virulencia se han identificado utilizando una levadura sistema híbrido de dos. Un enfoque alternativo genética inversa consiste en identificar las plantas mutantes que contienen transposones o inserciones de T-ADN en los genes de interés. en la actualidad la mutagénesis dirigida no es un método eficiente para el uso en las plantas. Bhattacharjee. Sui X. Sugerimos que la sobreexpresión de la histona H2A RAT5-un gen puede mejorar la eficiencia de transformación de plantas recalcitrantes. Kopecki A. La expresión del gen es por lo tanto. y contienen ADN T-inserciones en o cerca de genes que codifican importina-7 o importina-3.. Algunas de estas mutaciones son moderadamente o altamente resistentes a la transformación mediada por Agrobacterium (S. Kaiser. S.ratas mutantes diferentes (que no sea el mutante rat5) también se restaura la capacidad de transformación (L.

Los autores especularon que este gen nodulin puede responder a las señales de la bacteria para regular la división celular de los vegetales o la diferenciación. (97) han descrito recientemente una estrategia inversa novela genética para producir agallas de la corona de plantas resistentes. Usando cDNA de amplificación del polimorfismo de longitud de fragmentos (AFLP) para amplificar fragmentos de 16. Mientras que la mayoría de las bandas investigadas (codificación. las plantas pueden responder a la infección por Agrobacterium. establece las funciones precisas de estos genes de la planta en el proceso de transformación mediada por Agrobacterium. Escobar et al. Ream. una RNasa. Algunas de estas bandas también fueron inducidos o reprimidos de 24 horas después de la inoculación. datos no publicados). Muchas plantas transgénicas que expresan estas construcciones RNAi eran altamente resistentes a la enfermedad de agalla de la corona dirigido por una amplia gama de cepas oncogénicas. . aunque no fueron generalmente resistentes a la transformación mediada por Agrobacterium per se. Todavía no hemos. Transcripción inversa-PCR y análisis de algunos de estos genes se confirmaron los resultados de los análisis de cDNA-AFLP. una peroxidasa y una proteína relacionada con la patogénesis) también fueron regulados diferencialmente tras la incubación de las células vegetales con E. sin embargo. coli. una respuesta concreta a la infección por Agrobacterium. para identificar estos genes expresados ??diferencialmente planta. entre ellos uno que codifica una nodulin-como la proteína. tumefaciens (233).histona deacetilasa (hda1). Un enfoque similar ha sido utilizado para generar agalla de la corona resistente a las enfermedades y las plantas de tabaco de manzana (W. Enfoques genómica para identificar genes de plantas que responden a la infección de Agrobacterium Como se describió anteriormente (129). Estos genes son altamente homólogos entre una gran variedad de diferentes cepas de Agrobacterium. y esta respuesta puede implicar la planta la expresión génica diferencial. cuatro genes. una quinasa recpetor supuesto. se identificaron 251 bandas que son regulados diferencialmente 48 h después de la infección. Los genes que son inducidos o reprimidos durante las primeras etapas de transformación mediada por Agrobacterium puede proporcionar metas para la manipulación de la máquina para mejorar la eficiencia de la transformación de las especies de plantas recalcitrantes. Ditt et al. Varios laboratorios han iniciado investigaciones por consiguiente. (83) recientemente investigó la respuesta de los cultivos celulares Ageratum conyzoides suspensión a la infección por una cepa nontumorigenic supervirulent A.000. por ejemplo. Que generaron Arabidopsis transgénicas y las plantas de tomate que expresan de doble cadena de ARN construcciones destinadas a T-ADN codificado auxina y citoquinina oncogenes biosintéticas.

La mayoría de estos genes mostraron una respuesta diferencial general de Agrobacterium inoculación. Mediante hibridación sustractiva supresores seguido por análisis de ADN y ARN macrochips de muestras de ARN a partir de ocho diferentes puntos de tiempo después de la inoculación (de 0 a 36 h). aún quedan muchos desafíos. sino que ahora a los científicos a aprovechar la capacidad natural de esta bacteria. Además de ampliar la gama de huéspedes y la eficiencia de transformación de plantas mediante Agrobacterium. y Gelvin SB. el uso de Agrobacterium para transformar genéticamente plantas ha avanzado de un sueño a una realidad. se podría transferir proteínas de virulencia. sin embargo. A unos pocos genes respondió específicamente a T-ADN o proteína de transferencia de Vir solamente. Muchos científicos consideran que la recombinación homóloga para ser uno de los otros "santos griales" de la biología molecular de plantas. el uso del tabaco AP-2 o la suspensión cultivos celulares inoculados con cinco diferentes no tumorigénicos cepas de Agrobacterium (Veena. La capacidad de realizar experimentos de sustitución de genes se ha convertido en un . Muchas especies de plantas de importancia económica o variedades de élite de las especies en particular. PERSPECTIVAS 1111111 En menos de 20 años. Sin embargo. siguen siendo muy recalcitrantes a la transformación mediada por Agrobacterium. Doerge RW. (I) El primero es la utilización de Agrobacterium para homóloga o dirigida a un sitio de recombinación. La actividad de varios genes de plantas respuesta de defensa y el estrés fue reprimida por la infección por Agrobacterium. También siento que Agrobacterium desarrollado hace millones de años para transformar genéticamente un rango muy amplio de organismos. algunos de los retos pendientes para la comunidad científica la biotecnología se resumen a continuación. se propone que la infección por Agrobacterium induce la expresión de genes de plantas necesarias para la transformación y al mismo tiempo la represión de la respuesta de defensa del huésped. y el día no ha llegado aún cuando las flores serán las únicas cosas que veía venir desde los cañones de las pistolas de genes. pero no VirE2 proteína. se puede transferir ninguna de las dos y dos pueden transferir tanto. creo que ese día no está muy lejos en el futuro distante. Debido a la importancia de las histonas en el proceso de integración del ADN-T (230).Nuestro laboratorio ha realizado un estudio similar. Sin embargo. Un análisis más detallado de estos genes expresados ??diferencialmente se notifiquen si desean desempeñar un papel directo o indirecto en la transformación de plantas mediada por Agrobacterium. y es difícil pensar en un área de investigación de las plantas que la ciencia no se ha beneficiado de esta tecnología. Una cepa puede transferir ADN-T. Entre los genes que fueron inducidos (o cuya expresión se mantuvo en un nivel alto) fueron las histonas y codificación de las proteínas ribosomales. se identificaron más de 400 genes que son regulados diferencialmente después de varios períodos de la infección. algunos genes respondió específicamente a un T-ADN y la proteína de transferencia de Vircompetente cepa.. pendiente de publicación). La biotecnología agrícola moderna depende en gran medida el uso de Agrobacterium para crear plantas transgénicas. pero no de TADN. Jiang H.

269. Con demasiada frecuencia. Incluso si estas secuencias NLS pueden ser destituidos sin alterar otras funciones esenciales de estas proteínas. 270). Muchos hongos patógenos médicamente o agronómicamente importantes siguen siendo muy recalcitrantes a la transformación genética. (Iv) La cuarta es la transformación de plastidios genética por Agrobacterium. pero es deficiente en T-ADN al azar de integración. A menudo. A pesar de algunas referencias dispersas a la transformación del cloroplasto por Agrobacterium existen en la literatura (véase. por ejemplo. Sin embargo. 173. 223. (Ii) El segundo se refiere a la expresión del transgén estable y predecible en las plantas. 71) sugieren que la Agrobacterium puede ser un útil "gen-maniobras de herramientas" por más de especies de plantas justo.elemento básico de la célula bacteriana. La existencia de secuencias de proteínas NLS VirD2 y VirE2 puede garantizar T-ADN dirigido al núcleo. 363) nos presenta una oportunidad sin precedentes para investigar Agrobacterium patrones de expresión génica y las formas en que pueden ser alterados durante el co-cultivo de la bacteria con varias especies de plantas. Necesitamos un sistema de transformación mediada por Agrobacterium que ofrece T-ADN al núcleo de la planta de manera eficiente. tumefaciens C58 completar la secuencia genómica (114. incluso la investigación y la biología molecular. y T-ADN patrones de integración en el silenciamiento génico transcripcional y postranscripcional con el fin de desarrollar estrategias para mejorar el alcance y la estabilidad de la expresión del transgén. La disponibilidad de la A. Rao y SB Gelvin. hongos y animales. las líneas de plantas transgénicas que son "expresadores bueno" perder esta característica después de varias generaciones de crecimiento bajo condiciones de campo. (Vi) El desafío final consiste en la transformación genética de células humanas y animales. Los informes recientes de transformación mediada por Agrobacterium de varias especies de hongos filamentosos (1. Esta información puede proporcionar pistas a los métodos para manipular más de Agrobacterium a fin de efectuar un mayor nivel de transformación de las especies de plantas recalcitrantes. la recombinación homóloga en las plantas por lo general se produce a 10 5 la frecuencia de recombinación ilegítima (71. estos informes no han sido confirmadas por la comunidad científica. datos no publicados) puede impedir la redirección de la TEl ADN del núcleo de plástidos. (V) La quinta es la transformación genética de hongos patógenos de plantas y animales. El reciente informe de la transformación Agrobacteriummediated genética de células humanas (187) sugiere que la . 238. las referencias 64 y 346). Tenemos que entender las funciones de los efectos de posición. (Iii) La tercera es la manipulación del genoma del Agrobacterium. el reciente descubrimiento de que el citoesqueleto de actina planta está involucrado en transformación mediada por Agrobacterium (P. 237. los efectos de la cromatina. el nivel de expresión de los transgenes en las plantas es muy variable.

excitante posibilidad de la utilización de Agrobacterium. . o los procesos de Agrobacterium como por la terapia génica humana y animal.

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