LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA UJI KUALITATIF PROTEIN

DISUSUN OLEH : LALU IRFAN HADIMI (G1C 008 017)

PROGRAM STUDI KIMIA FAKULTAS MIPA UNIVERSITAS MATARAM 2010

ACARA III UJI KUALITATIF PROTEIN

A. Pelaksanaan Praktikum 1. Tujuan Praktikum: Secara khusus, praktikum ini bertujuan untuk mengidentifikasi protein secara kimia dengan mengenal sifat pengendapan dan perubahan warna yang terjadi bila ditambahkan dengan senyawa kimia tertentu. 2. Waktu Praktikum 3. Tempat Praktikum : Selasa, 23 November 2010 : Laboratorium Kimia Lantai 3 Fakultas MIPA, Universitas Mataram.

B. Landasan Teori Protein ialah biopolimer yang terdiri atas banyak asam amino yang berhubungan satu dengan yang lainnya lewat ikatan amida (peptida). Protein memainkan berbagai peran dalam sistem biologis. Beberapa protein merupakan komponen utama dari jaringan struktur (oto, kulit, kuku, rambut). Protein lain mengangkut molekul dari satu bagian ke bagian yang lainnya dalam makhluk hidup. Masih ada lagi yang bertindak sebagai katalis dalam berbagai reaksi biologis yang diperlukan untuk mempertahankan hidup (Hart, harold. at al, 2003). Protein merupakan molekul besar dengan Mr sekitar 6000 sampai dengan 1.000.000. Protein yang terdapat dalam organisme sangat bervariasi dalam ukuran dan strukturnya. Struktur itu ditentukan oleh jenis, jumlah, dan urutan asam aminonya. Protein sendiri adalah polimer asam amino. Asam amino adalah senyawa yang mengandung gugus karboksilat (-COOH) dan amino ( - NH2) dengan rumus umum :

H R C NH2 C

O OH

Asam amino jenis ini disebut -asam amino, karena gugus amino(-NH2)-nya terikat pada atom pertama ( ) gugus karboksil. R adalah atom atau gugus yang mengandung rantai alifatik, siklik, atau aromatik. Berdasarkan R-nya di alam terdapat 200 lebih jenis asam amino, tetapi di dalam protein hanya terdapat 20 macam (Syukri, 1999). Protein bersifat amfoter, yaitu dapat bereaksi dengan larutan asam dan basa. Daya larut protein berbeda di dalam air, asam, dan basa; ada yang mudah larut dan ada yang sukar larut. Namun, semua protein tidak larut dalam pelarut lemak seperti eter dan kloroform. Apabila protein dipanaskan atau ditambah etanol absolut, maka protein akan menggumpal (terkoagulasi). Hal ini disebabkan etanol menarik mantel air yang melingkupi molekul-molkeul protein. Buiret adalah senyawa dengan dua ikatan peptida yang terbentuk pada pemanasan dua mulekul urea. Ion Cu2+ dari preaksi Biuret dalam suasana basa akan berekasi dengan polipeptida atau ikatanikatn peptida yang menyusun protein membentuk senyawa kompleks berwarna ungu atau violet. Reaksi ini positif terhadap dua buah ikatan peptida atau lebih, tetapi negatif untuk asam amino bebas atau dipeptida.

Semua asam amino, atau peptida yang mengandung asam-

amino bebas akan bereaksi dengan ninhidrin

membentuk senyawa kompleks berwarna biru-ungu. Namun, prolin dan hidroksiprolin menghasilkan senyawa berwarna kuning.(Trevor,1995:76) Sebagian besar protein dapat diendapkan dari larutan air dengan penambahan asam tertentu, seperti misalnya, asam triklorasetat dan asam perklorat. Penambahan asam ini menyebabkan terbentuknya garam protein yang tidak larut. Zat pengendap lainnya adalah asam tungstat, fosfotungsat, dan metafosat. Protein dapat juga diendapkan dengan kation tertentu seperti Zn2+ dan Pb2+. Berbagai protein globular mempunyai daya kelarutan yang berbeda di dalam air. Variable yang mempengaruhi kelarutan ini adalah: pH, kekuatan ion, sifat dielektrik pelarut, dan temperatur. Pemisahan protein dari campuran dengan pengaturan pH didasarkan pada harga pH isoelektrik yang berbeda-beda untuk tiap macam protein. Pada umumnya molekul protein mempunyai daya kelarutan minimum pada pH isoelektriknya. Pada pH isoelektriknya beberapa protein akan mengendap dari larutan. Sehingga dengan cara pengaturan pH larutan, masing-masing protein dalam campuran dapat dipisahkan satu dari yang lainnya dengan teknik yang disebut pengendapan isoelektrik (Wirakusumah. 2008). Protein, yang namanya berarti pertama atau utama merupakan makromolekul yang paling berlimpah di dalam sel dan menyusun lebih dari setengah berat kering pada hampir semua organisme. Protein adalah instrument yang mengekspresikan infor- masi genetik. Seperti juga terdapat ribuan gen di dalam inti sel, masing-masing mencirikan satu sifat nyata dari organis- me, di dalam sel terdapat ribuan protein yang berbeda, masing-masing membawa fungsi spesifik yang ditentukan oleh gen yang sesuai. Protein, karenanya, bukan hanya merupakan makromolekul yang melimpah jumlahnya, tetapi juga amat bervariasi fungsinya. Fungsi suatu protein ditentukan oleh 1) jumlah asam amino pembentuknya, 2) jenis asam amino, dan 3) urutan asam amino di dalam rantai polipeptidanya. Penggolongan protein berdasarkan fungsi biologisnya antara lain (Anonim, 2010): Golongan Enzim Protein transport Protein nutrient dan penyimpan Protein konraktil atau motil Protein struktural Protein pertahanan in Protein pengatur Contoh Ribonuklease, Tripsin Hemoglobin, Albumin serum- lipoprotein 3. Gliadin (pada gandum) Ovalbumin (telur), Casein (susu) Feritin Aktin, Miosin, Tubulin, Dynein Keratin, Fibroin, Kolagen, Elastin Proteoglikan Antibodi, Fibrinogen, TrombToksin botulinum, Toksin difteri Bisa ular, Risin Insulin, Hormon pertumbuhan Kortikotropin, Reseptor membran

C. Alat dan Bahan 1. Alat-alat: Tabung reaksi Pipet tetes

Rak tabung reaksi Penangas air(diganti dengan pemanasan menggunakan Bunsen) Gelas kimia Penjepit

2.

Bahan-bahan: Putih telur ZnSO4 encer HNO3 pekat Asam cuka NaOH 40% CuSO4 0,5% Aquades Alpha naftol H2SO4 pekat HgSO4 PbSO4

D. Prosedur Percobaan a) 1. Uji protein dengan pengendapan Pengendapan dengan logam berat ke dalam tabung reaksi larutan protein encer + setetes larutan ZnSO4 encer. Bila terjadi endapan putih, bagilah endapan dalam 2 tabung dan pada salah satu tabung ditambahkan ZnSO4 berlebihan. Hasil 2. Ulangi percobaan tersebut dengan penambahan garam-garam besi, tembaga, air raksa dan timbale.

b)

Uji Warna Protein Reaksi Biuret (untuk ikatan peptida) ke dalam tabung reaksi 3 ml larutan protein +1 ml larutan NaOH 40% +1 tetes larutan CuSO4 0,5% sehingga terjadi warna merah muda atau Ungu Hasil :

Reaksi millon-nasse (untuk tirosin) kedalam tabung reaksi 2ml larutan protein +1 ml larutan reagen merkuri sulfat (HgSO4 1% dilarutkan dalam H2SO4 10%) Dinginkan dibawah air ledeng/air kran, larutan NaNO2 1%. endapan atau larutannya yang menjadi merah menunjukan adanya terosin. Hasil Reaksi Hopksins-Cole (untuk triptofan) ke dalam tabung reaksi 1 ml larutan protein +1 larutan formaldehid encer (diencerkan 500 kali) + 1 tetes reangan merkuri sulfat. Gojoklah + perlahan-lahan 1 ml asam sulfat pekat melalui dnding tabung yang dimiringkan sehingga terjadi 2 lapisan dengan lingkaran ungu di bidang batas. Jika digojok akan menjadi ungu. Hasil Reaksi Ksantoprotein (untuk asam amino dengan inti benzena: ke dalam tabung reaksi 3 ml larutan protein +1 ml larutan asam nitrat pekat dengan penangas air mendidih, Dinginka di bawah air leding, kemudian dibagi dalam 2 tabung, 1 tabung diberi ammonia maka warnanya akan menjadi kuning. Hasil

Reaksi Uji Sulfur ke dalam tabung reaksi 1 ml larutan protein(serum darah) +1 ml larutan NaOH 40%. Masaklah selama 1 menit untuk mengubah S organik menjadi S organik (Na-sulfida). + 1 tetes larutan Pb asetat, akan terjadi PbS yang berwarna hitam atau coklat.

Hasil Reaksi molisch ke dalam tabung reaksi 1 ml larutan protein. + 2 larutan alpha-Naftol dan kocok. Alirkan ke dalam tabung reaksi 1 ml asam sulfat pekat berlahan-lahan melalui dinding tabung (tabung agak dimiringkan) hingga membentuk lapisan di bawah campuran. Hasil

E. Hasil Pengamatan 1. Uji Kualitatif Protein Pengendapan dengan Logam Berat Langkah Kerja Tabung I Larutan protein encer + setetes ZnSO4 encer endapan (bagi 2 tabung) Tabung II Endapan 1 + larutan ZnSO4 berlebih Tabung III Endapan 2+ larutan garam-garam besi Tabung IV Endapan ditambah CuSO4 Tabung V HgSO4 Tabung VI PbSO4 Uji Warna Protein Langkah kerja Reaksi Biuret 3 ml larutan protein + 1 ml larutan NaOH 40% tambahkan 1 tetes CuSO4 0,5% b) Reaksi millon-Nasse 2 ml larutan protein + 1 ml reagen merkuri sulfat panaskan dinginkan pada air kran, + 1 tetes larutan NaNO2 1%. c) Reaksi Hopkins-Cole 1 ml larutan protein + 1 tetes larutan formadehid encer + 1 tetes reagen merkuri sulfat. Gojoklah perlahan-lahan ( 1 ml larutan asam sulfat pekat melalui dinding tabung) d) Reaksi Santoprotein 1) 3 ml larutan protein dan 1 ml larutan HNO3 pekat dipanaskan dengan penangas 2) Dinginkan dibagi dalam 2 tabung a) o Tabung I ditambahkan ammonia Pengamatan Protein + NaOH 40% bening(timbul gelembunggelembung diatasnya)+CuSO4 merah muda. Protein + H2SO4 didinginkan. dipanaskan kuning kemudian Pengamatan (Perubahan Warna) Terbentuk sedikit gumpalan-gumpalan putih melayang Terjadi

Larutan putih, masih ada gumpalan-gumpalan gumpalan di atas merah kecoklatan (encer) Gumpalan melayang (berlebih) Encer = terbentuk gumpalan putih melayang Berlebih =Terdapat endapan biru muda Encer = Terbentuk endapan putih sedikit Berlebih = gumpalan lebih banyak di atas Encer = Terdapat endapan putih (jelly) Berlebih = endapan larut, warna putih susu.

+ HgSO4= terbentuk 2 fase, atas bentuk gel berwarna putih susu. +H2SO4 pekat = terbentuk cincin ungu, ada gumpalan putih, setelah dikocok warna menjadi ungu susu. Endapan putih (gumpalan) diatas dan kuning dibawah, kuning menggumpal pada bagian tengah tabung reaksi hal ini terjadi setelah Larutan menjadi kuning dan endapannya diatas juga

kuning setelah didinginkan e) o Tabung II tampa amonia Uji Sulfur o 1 ml larutan (serum darah) + 1 ml larutan NaOH 40% o masak selama 1 menit o tambahkan 1 tetes larutan Pb asetat Reaksi Molisch o 1 ml larutan protein + 2 larutan alphaNaftol dan kocok Berwarna kuning Berwarna kuning keruh Bening, terbentuk Kristal yang memanjang ( monoklin) Larutan menjadi warna kuning Larutan menjadi hitam/coklat.

f)

Alirkan ke dalam tabung reaksi 1 ml H2SO4 pekat berlahan-lahan melalui dinding tabung (tabung agak dimiringkan)

Putih keruh terdapat endapan putih pada dinding tabung pada bagian atas alarutan terdapan lingkaran seperti cincin pada dinding tabung reaksi. Terbentuk 2 lapis pada dasar tabung yakni warna pink diatas dan kuning dibawah. Diatas kedua lapisan ini larutan berwarna putih keruh.

F. ANALISIS DATA 1. Pengendapan Dengan Logam Berat - Putih telur diencerkan

- + ZnSO4

- + CuSO4

- + HgCl2

2. pengendapan oleh asam

3. Uji Warna Protein a. Reaksi biuret Albumin + NaOH ( basa)

b. Reakso ksantoprotein O O NH2 OH

HNO3

N O NH2

O OH

H2 O

Tirosin dalam protein

tirosin ternitrasi (kuning)

c. Reaksi molisch

G. PEMBAHASAN

Protein ialah biopolimer yang terdiri atas banyak asam amino yang berhubungan satu dengan yang lainnya lewat ikatan amida (peptida). Protein memainkan berbagai peran dalam sistem biologis. Beberapa protein merupakan komponen utama dari jaringan struktur (oto, kulit, kuku, rambut). Pada praktikum ini dilakukan uji kualitatif protein yang bertujuan untuk mengidentifikasi protein

secara kimia dengan mengenal sifat pengendapan dan perubahan warna yang terjadi bila ditambahkan dengan senyawa kimia tertentu. Praktikum pertama yaitu pengendapan protein dengan logam berat dimana logam-logam akan membentuk kompleks dengan atom sulfur. Hal ini dapat dilihat dari terbentuknya endapan yang berwarna putih susu dan endapan-endapan yang terjadi selanjutnya karena adanya pembentukan kompleks antara logam dan sulfur pada protein menjadi PbS, ZnS, dan HgS. Hal ini dapat terjadi karena adanya peristiwa denaturasi protein

atau perusakan struktur protein karena adanya pengaruh logam berat, perubahan pH, perubahan suhu dan sebagainya. Kerusakan ini disebabkan karena ketidakmampuan protein dalam mempertahankan struktur aslinya (natif) namun suatu protein asli (natif) yang terdenaturasi, protein tersebut hanya mengalami kerusakan pada struktur (konformasi) alamiahnya yang berbentuk tiga dimensi (strukturtersier atau quarterner), sedangkan struktur kerangka kovalennya (struktur primer) dari protein tersebut tidak mengalami kerusakan. Kehadiran logam berat di dalam larutan yang mengandung protein akan mengakibatkan ketak-stabilan pada struktur tiga dimensi protein sehingga terbentuk endapan. Garam-garam dari logam berat seperti Hg2+, Ag+ dan Pb2+ dapat berikatan dengan gugus SH dari protein. Disamping itu dapat membentuk ikatan yang sangat kuat dengan gugus COO- dari asam aspartat dan asam glutamate yang terdapat dalam molekul protein pecah sehingga proteinnya sendiri akan mengendap. Dengan terjadinya pengendapan atau disebut juga koagulasi, protein mengalami perubahan konformasi serta posisinya sehingga aktivitasnya berkurang atau kemampuannya untuk menunjang aktivitas organ tubuh tertentu akan hilang. Praktikum selanjutnya yaitu uji warna protein dengan menggunakan reaksi-reaksi antara lain reaksi biuret, reaksi millon-nasse, Hopkins-Cole, Santoprotein, mollisch, dan uji sulfur. Buiret adalah senyawa dengan dua ikatan peptida yang terbentuk pada pemanasan dua mulekul urea. Pada reaksi biuret diperoleh hasil reaksi berupa warna ungu pada bagian atas dan bagian bawah kental. Hal ini terjadi karena ion Cu2+ dari pereaksi biuret yang berasal dari penambahan CuSO4 dalam suasana basa akan bereaksi dengan polipeptida atau ikatan-ikatan peptida yang menyusun protein membentuk senyawa kompleks bewarna ungu seperti yang dihasilkan. Reaksi ini positif terhadap dua buah ikatan peptida atau lebih, tetapi negatif untuk asam amino bebas atau dipeptida. Ini berarti bahwa protein yang terkandung dalam putih telur adalah tidak kurang dari dua ikatan peptida. Jadi ikatan peptida hanya terbentuk apabila ada dua atau lebih asam amino esensial yang bereaksi. Reaksi biuret menghasilkan urea menurut persamaan reaksi : CO(NH2)2 + NaOH + CuSO4 kompleks Cu

Urea bukan merupakan protein, namun karena urea mengandung gugus NH2 (amin) yang mempunyai kesamaan dengan gugus protein sehingga membentuk warna ungu sebagai hasil reaksi antara Cu2+ dengan NH. Oleh karena itu urea memberikan hasil positif pada uji biuret. Selanjutnya adalah pengujian dengan reaksi Hopkins cole dimana reaksi ini memberikan hasil positif dengan adanya cincin yang berwarna ungu dengan gumpalan-gumpalan putih. Hal ini disebabkan karena Pereaksi Hopkins-Cole terdiri dari asam glioksilat (CHO.COOH) dalam H2SO4 (p). Triptofan diduga berkondensasi dengan aldehida ini,dan dengan asam pekat membentuk kompleks berwarna dari jenis asam 2,3,4,5-tetrahidro- -karbolin-4-karboksilat. Test ini berhasil bila terdapat oksidator kuat seperti nitrat dan klorat. Asam sulfat yang digunakan harus sangat murni yang berarti tidak mengandung bahan-bahan yang bertindak sebagai oksidator. Hasil tersebut menunjukkan bahwa dalam putih telur terdapat asam amino triptofan. Warna ungu diberikan oleh gugus indol yang terdapat dalam triptofan. Reaksi uji yang ketiga yaitu reaksi xantoprotein untuk asam amino dengan inti benzen. Pereaksi Xanthoprotein terdiri dari HNO3 pekat panas. Reaksi ini digunakan untuk asam amino tirosin, triptofan dan fenilalanin. Hasil positif ditunjukkan dengan terbentuknya warna kuning. Reaksi ini berdasarkan nitro inti

benzene yang terdapat dalam molekul protein. Senyawa nitro yang terbentuk berwarna kuning dan dalam lingkungan alkalis akan terionisasi dengan bebas dan warnanya menjadi lebih tua atau menjadi jingga Berdasarkan hasil percobaan, putih telur memberikan hasil positif (terbentuk warna yang tadinya kuning menjadi jingga). Hal ini menunjukkan bahwa putih telur memiliki inti benzene. Kemudian reaksi yang keempat adalah reaksi uji sulfur yaitu reaksi yang bertujuan untuk mengetahui asam amino yang mengandung unsur S dengan reaksi positif berupa terbentuknya endapan PbS hitam setelah protein alkali garam dan dipanaskan. Alkali garam berguna untuk melepas S organik menjadi S anorganik. Paraktikum ini menghasilkan hasil akhir berupa PbS hitam. Pb berfungsi sebagai donor Pb2+ . Reaksi uji yang kelima adalah reaksi millon-nase yang bertujuan untuk mengetahui adanya gugus hidroksifenil (tyrosin). H2SO4 memberi suasana asam agar Hg tidak mengendap serta berfungsi sebagai penghidrolisa protein agar terdapat tyrosin. Prinsip pengikatan Hg pada hidroksifenil menghasilkan kompleks berwarna merah. Dan yang terakhir adalah reaksi mollisch dimana dihasilkan lingkaran ungu di dasar tabung dan seperti terdapat serat-serat berwarna coklat, serat-serat ini diperkirakan adalah protein yang terdenaturasi. Dari semua langkah praktikum di atas dapat diketahui bahwa Protein mengandung asam amino berinti benzen, jika ditambahkan asam nitrat pekat akan mengendap dengan endapan berwarna putih yang dapat berubah menjadi kuning sewaktu dipanaskan. Senyawa nitro yang terbentuk dalam suasana basa akan terionisasi dan warnanya akan berubah menjadi lebih tua atau jingga. Reaksi ini didasarkan pada uji nitrasi inti benzena yang terdapat pada mulekul protein menjadi senyawa intro yang berwarna kuning.

H. KESIMPULAN Dari hasil dan analisis di atas dapat ditarik kesimpulan sebagai berikut : y Protein dapat terdenaturasi oleh sebab antara lain : perubahan pH, suhu dan penambahan ion atau logam berat ttertentu. y y y y y y y Protein dapat didentifikasi oleh reaksi pengendapan oleh logam berat. Test Hopkins-Cole untuk protein yang mengandung triptofan Test Biuret yang merupakan tes umum untuk protein Test Xanthoprotein untuk asam amino yang mempunyai inti benzen protein yang terkandung dalam putih telur adalah tidak kurang dari dua ikatan peptida. Warna ungu diberikan oleh gugus indol yang terdapat dalam triptofan. Reaksi xantoprotein berdasarkan nitro inti benzene yang terdapat dalam molekul protein.

DAFTAR PUSTAKA Anonim, 2010. Struktur Asam Amino dan Protein. Didownload dari : http://dc265.4shared.com/download/EgR3uJV/Struktur_Asam_Amino_dan_Protei.pdf?tsid=20101024-103500-b83fa2bf. Pada tanggal 25 november 2010 pukul 14.30 Wita. Hart, harold. At al, 2003. Kimia Organik : Suatu Kuliah Singkat. Jakarta : Penerbit Erlangga. Syukri, S. 1999. Kimia Dasar 3. Bandung : Penerbit itb. Wirakusumah, muhammad. 2008. Biokimia : Protein, Enzim, dan Asam Nukleat. Bandung : Penerbit itb. Robinson, Trevor. 1995. Kandungan Organik Tumbuhan Tinggi.Bandung : Penerbit ITB