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Tecnologia do DNA Recombinante

BIOTECNOLOGIA – CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

Prof. Esp. Roberto Venerando Fundação Educacional Miguel Mofarrej. – FIO robertovenerando@fio.edu.br

FIO – Faculdades Integradas de Ourinhos.

Tecnologia do DNA recombinante.

Engenharia Genética
VENERANDO,R .2009

INTRODUÇÃO
• Década de 70 ⇔ surgimento da Engenharia Genética ou Tecnologia do DNA recombinante ou Biotecnologia Moderna.

• Engenharia Genética – Conjunto de técnicas que tornam possível a criação de novas combinações gênicas, inexistentes na natureza, mediante recombinação ou alteração de seqüências de DNA.

– Consiste em isolar e transferir genes responsáveis pela produção de certas substâncias para outros seres vivos que não produziam estas substâncias. .TECNOLOGIA DO DNAr • Caracteriza-se pela aplicação de técnicas para manipulação de ácidos nucléicos. – Permite manipular diretamente os genes de determinados organismos com objetivos práticos. dando origem a uma molécula de DNA recombinante (rDNA). mas não necessariamente de espécies diferentes. – Permite combinar na mesma molécula de DNA genes provenientes de fontes diferentes.

necessita que: – DNA recombinante seja duplicado.TECNOLOGIA DO DNAr • No entanto. ainda. deverão sofrer passos adicionais de processamento pós-traducional na célula hospedeira. – DNA recombinante deve ser transcrito e traduzido. . – Produtos da tradução por vezes.

. – Produção de grandes quantidades de uma proteína específica.TECNOLOGIA DO DNAr • Objetivos – Produção de grandes quantidades de um gene específico.

– Seqüênciamento de DNA. – Animais transgênicos. – Plantas transgênicas. – Vetores de expressão (procariotos e eucariotos).TECNOLOGIA DO DNAr • Aplicação prática – Clonagem de fragmentos de DNA em plasmídios de bactérias. especifica de DNA pela técnica da reação em cadeia da polimerase (PCR). . – Construção de bibliotecas genômicas e de cDNAs. – Amplificação de uma seq.

o vetor genético. capaz de multiplicá-lo. . apenas aquelas que tiverem efetivamente incorporado o rDNA. – Um elemento transportador de genes. possibilitará que o gene estrangeiro que transporta também o seja. – Um meio de introduzir o vetor numa célula viva. – Uma maneira de selecionar.TECNOLOGIA DO DNAr • Requer: – Um método para clivar e voltar a ligar in vitro diferentes moléculas de DNA originando moléculas de DNA recombinante. que. dentre uma grande população de células. ao ser multiplicado por uma célula hospedeira.

. – Terceiro ⇔ célula hospedeira com o DNA recombinante (transformante). – Quarto ⇔ divisão celular resultando em milhares de cópias do DNA recombinante (clonagem).TECNOLOGIA DO DNAr • Metodologia de obtenção de DNAr – Primeiro ⇔ fragmento do DNA de interesse (inserto) é obtido por enzima de restrição e ligado (DNA ligase) a uma outra molécula de DNA (vetor) para formar o DNA recombinante. – Segundo ⇔ a molécula do DNA recombinante é introduzida numa célula hospedeira compatível (transformação).

em lugares determinados (sítios). não são encontradas em eucariotos. II e III. Reconhecem seqüências específicas de nucleotídeos na molécula de DNA e cortam ambas as fitas da hélice.TECNOLOGIA DO DNAr Primeiro passo: obtenção do gene de interesse • Enzimas de restrição ou endonucleases de restrição – Encontradas nas bactérias e são utilizadas como sistema de defesa contra vírus (cortam o DNA viral que penetrar no citoplasma). onde a II apresenta importância na Engenharia Genética. O sítio de reconhecimento é normalmente uma seqüência palindrômica (ARARA) – – – . Três tipos: tipo I.

images.google. • Coesiva: fora do eixo de simetria.com.br . Fonte: http://www.TECNOLOGIA DO DNAr Primeiro passo: obtenção do gene de interesse • Enzimas de restrição ou endonucleases de restrição – Tipos de clivagem • Cega ou Abrupta: no eixo de simetria.

• Exemplo: EcoRI – Escherichia coli que carrega um fator de transferência de resistência RI. • Algarismo romano (ou outra letra) ⇔ indica a ordem da descoberta ou a linhagem da qual ela foi isolada. .TECNOLOGIA DO DNAr Primeiro passo: obtenção do gene de interesse • Enzimas de restrição ou endonucleases de restrição – Nomenclatura • Primeira letra ⇔ representa o gênero • Segunda e terceira letra ⇔ espécie.

TECNOLOGIA DO DNAr Primeiro passo: obtenção do gene de interesse • Enzimas de restrição ou endonucleases de restrição Fonte: http://www.br .com.images.google.

– A família de fragmentos gerados por digestão com enzima de restrição é geralmente detectada pela separação destes fragmentos por eletroforese em gel de agarose.. Os fragmentos migram em função de seus pesos moleculares sendo que os menores migram mais rapidamente. ..TECNOLOGIA DO DNAr Primeiro passo: obtenção do gene de interesse • Depois da clivagem.

com.google.images.Fonte: http://www.br .

Isso permite a separação de moléculas de DNA de diferentes tamanhos !!! Fonte: http://www.google.TECNOLOGIA DO DNAr Primeiro passo: obtenção do gene de interesse • Moléculas de menor massa irão migrar mais rapidamente que moléculas de maior massa.com.br .images.

google.com.br .Cortes com várias enzimas: Fonte: http://www.images.

banco genômico ou genoteca ⇔ arquivo de DNA de interesse inserido num vetor para uso posterior. – obtenção do DNA complementar (cDNA) ⇔ obtido pela ação da transcriptase reversa a partir de um mRNA. – biblioteca genômica.TECNOLOGIA DO DNAr Primeiro passo: obtenção do gene de interesse • Em alguns casos não é possível utilizar enzimas de restrição. . logo: – procede-se à fragmentação mecânica do DNA. – síntese química do DNA.

TECNOLOGIA DO DNAr Primeiro passo: obtenção do gene Biblioteca de cDNA Biblioteca genômica Fonte: adaptado de www.unb.br/ib/cel/pg/tecnologiaDNArecombinante2006 .

TECNOLOGIA DO DNAr Primeiro passo: obtenção do gene de interesse • Em alguns casos não é possível utilizar enzimas de restrição. logo: – Técnica de PCR (Reação da polimerase em cadeia) .

TECNOLOGIA DO DNAr Primeiro passo: vetores genéticos • Vetores genéticos – Moléculas de DNA que transportarão o DNA heterólogo para o interior da célula hospedeira. . – Molécula de DNA que aceita introdução de DNA estrangeiro em regiões não essenciais para sua multiplicação dentro da célula hospedeira.

• Possuir uma origem de replicação.: Antibiótico). . • Dois ou mais sítios únicos de clivagem para as enzimas de restrição – Múltiplos sítios de Clonagem (MSC) – local onde o inserto é incorporado ao vetor de clonagem. cosmídios. • Exemplos: plasmídio. bacteriófagos. • Possuir um marcador que permita a seleção do hospedeiro transformado (Ex.TECNOLOGIA DO DNAr Primeiro passo: vetores genéticos • Vetores genéticos – Características básicas necessárias • Ser uma pequena molécula de DNA.

pt/lab.esa.biologia/disciplinas/bcm/recombinante.pdf .ipcb.TECNOLOGIA DO DNAr Primeiro passo: vetores genéticos • Vetores genéticos – Características básicas necessárias Fonte: docentes.

br/extensao/acidos_nucleicos/material_didatico/9_clonagem_genes_fragme ntos_DNA_de_interesse.pdf .unesp.ibb.TECNOLOGIA DO DNAr Primeiro passo: vetores genéticos • Vetores genéticos Plasmídio Fago Cosmídio Fonte: www.

vetor e DNA ligase: DNAr Fonte: adaptado de www.unb.br/ib/cel/pg/tecnologiaDNArecom binante2006 .TECNOLOGIA DO DNAr Primeiro passo: ligação do gene no vetor Digestão do vetor e do DNA pela enzima de restrição Fragmentos de DNA.

Estáveis em cultura. Hospedeiro eucariótico ⇔ S. . células de mamíferos em cultura. coli. cerevesiae. Não patogênicos.TECNOLOGIA DO DNAr Segundo passo: hospedeiros do DNAr Hospedeiros do DNA recombinante Características ideais: Capacidade de crescer em meios de cultura baratos. Organismos utilizados: Hospedeiros procarióticos ⇔ E. subtilis. B.

ppt .br/aulas/producao%20proteinas%20recombinantes.labimuno.TECNOLOGIA DO DNAr Segundo passo: hospedeiros do DNAr Transformação Transformação Transfecção Microprojéteis Eletroporação Fonte: www.org.

Transfecção ⇔ quando o vetor de clonagem tem características de vírus ou plasmídio. a célula hospedeira pode ser transfectada para inserir a molécula recombinante. normalmente empregada para procariotos.TECNOLOGIA DO DNAr Segundo passo: inserção dos vetores recombinantes em uma célula hospedeira Transformação ⇔ a célula hospedeira é tornada competente (cloreto de cálcio e choque térmico) para o vetor de clonagem ser introduzido. . normalmente empregada para eucariotos.

Fonte: http://www.htm .br/dbg/trab2002/TRANSG/TRG004.TECNOLOGIA DO DNAr Segundo passo: inserção dos vetores recombinantes em uma célula hospedeira Microprojéteis ⇔ partículas cobertas com DNA são projetadas contra uma célula e penetram em sua membrana.ufv.

ppt .br/ib/cel/pg/tecnologiaDNArecombinante2006. Fonte: www.unb.TECNOLOGIA DO DNAr Segundo passo: inserção dos vetores recombinantes em uma célula hospedeira Eletroporação ⇔ a célula é submetida a um campo elétrico que faz com que pequenos poros sejam abertos temporariamente em sua membrana por onde o DNA pode ser inserido.

com/fundamentosdeengenhariagenética2 .googlepages.TECNOLOGIA DO DNAr Terceiro e quarto passos Transformação Transformante Células transformantes Fonte: miguelcorreia25.

ibb.unesp.TECNOLOGIA DO DNAr Terceiro e quarto passos Seleção das células recombinantes Crescimento de bactérias em meio de cultura contendo antibiótico Fonte: www.pdf .br/extensao/acidos_nucleicos/material_didatico/9_clonagem_genes_fragme ntos_DNA_de_interesse.

Apontamentos de aula.esa.com/fundamentosdeengenhariag en%C3%A9tica2 – www..htm . et al. 3 ed. W. Edgard Blucher: São Paulo.br/ib/cel/pg/tecnologiaDNArecombinante2006.br/dbg/trab2002/TRANSG/TRG004.br/extensao/acidos_nucleicos/material_didatico/9_cl onagem_genes_fragmentos_DNA_de_interesse. 2001.pdf – docentes.ufv.pt/lab.biologia/disciplinas/bcm/recombinante. 2007.D. V.ppt – http://www. Bioquímica. 2006. VOET. J.unb.googlepages. SOUZA. 1: Fundamentos. Recombinação gênica.Referências bibliográficas BORZANI. R. Sites: – http://miguelcorreia25.pdf – ww.ipcb. Porto Alegre: Artmed. VOET.ibb. G.unesp. 1 ed. S. Biotecologia industrial.