You are on page 1of 17

Universitatea de Medicina si Farmacie Gr.T.

Popa Iasi 2012

Microscopul Electronic: tipuri in relatie cu principiul fizic, evolutie, aplicatii medicale

1

........ Anul I ... Seria A ..pag. Grupa 2 Cuprins : 1) Scurt Istoric.....Microscopul Eletronic cu transmisie...........……………. 4 3)Generalitati.13 2 .. 8 6) Tipuri:1.. pag..Microscopul Electronic cu scanare sau cu baleiaj………………………………………………..... 3 2) Premiul Nobel....pag.……………………………………..……….pag...pag. 6 5) Semnalele rezultate în urma interacţiei dintre fasciculul de electroni şi corpul solid.pag....pag...Schaas Bogdan Andreas...………….....……………………………………... 5 4) Principiul Fizic …………………………………........10 2..

1) Scurt Istoric Primul microscop electronic a fost construit în 1931 de către inginerii germani Ernst Ruska și Max Knoll.(1) 2) Premiul Nobel Fig 1. Helmut să lucreze la aplicații. În 1937 Siemens a început să-i finanteze pe Ruska si pe Bodo von Borries pentru dezvoltarea unui microscop electronic. în particular cu specimene biologice. instrumentul era capabil să mărească obiectele de patru sute de ori. directorul de cercetări al companiei Siemens. Desi primitiv si nepotrivit utilizărilor practice. Reinhold Rudenberg. desi Siemens nu făcea cercetări în domeniul microscoapelor electronice la acea vreme. a patentat microscopul electronic în 1931. Siemens l-a angajat si pe fratele lui Ruska. Microscopul electronic construit de Ernst Ruska in 1933 3 . Acesta era bazat pe ideile și descoperirile fizicianului francez Louis de Broglie.

cat si pentru proiectarea designului primului microscop electronic iar cealalta jumatate a fost acordata echipei formate din Gerd Binnig si Heinrich Rohrer pentru realizarea designului microscopului electronic prin efect tunel. Schita primului microscop.(2) Fig 3. Cei 3 laureati ai Premiului Nobel pentru Fizica din anul 1986.Ecuatia lui Louis de Broglie pentru identificarea lungimii de unde a electronilor in miscare : λ=h/mv unde: λ = lungimea de unda h = constanta lui Planck m = masa particulei considerate v = viteza de propagare a oscilatiei particulei Fig 2. Premiul Nobel in Fizica din anul 1986 a fost impartit astfel: jumatate pentru Ernst Ruska atat pentru cercetarile sale in optica electronica. proiectat de Ernst Ruska 3)Generalitati 4 .

Microscoapele electronice sunt folosite pentru a observa o gama larga de probe biologice si anorganice. metale si cristale. microscopul electronic este adesea folosit pentru controlul calitatii si analizarea defectelor de fabricatie de marimi foarte mici/microscopice. Microscopul electronic foloseste lentile electrostatice si electromagnetice pentru a controla fasciculul de electroni pe care il concentreaza pentru a forma o imagine. dar diferite de lentilele de sticla a unui microscop optic care formeaza o imagine marita. inclusive microorganisme. (3) Fig 4. probe de biopsie. 4) Principiul Fizic 5 .Aceste lentile sunt analoage.Microscoapele electronice au o putere mai mare decat un microscop optic.000x. molecule mari. Dreapta schema de principiu a microscopului electronic.000.Un microscop electronic este un tip de microscop care utilizeaza un fascicul de electroni pentru a ilumina specimenul si produce o imagine marita. deoarece electronii au o lungime de unda in jur de 100. concentrandu-se pe lumina sau prin specimen. celule.000 de ori mai mica decat lumina vizibila ( fotoni ) si pot realiza mai mult de 50 pm rezolutie si o marire de pana la aproximatic 10.Industrial. pe cand un microscop optic este limitat la o rezolutie de aproximativ 200nm si o putere de 2000x. Stanga ( schema de principiu a microscopului optic).

O secţiune transversală printr-un microscop electronic modern relevă următoarele elemente constructive: coloana electrono-optică. magneti cu rol echivalent lentilei condensor din microscopul optic. proba. lentilele condensoare şi lentila obiectiv. lentila ocular.Fig 5. sistemele de detecţie (prelucrarea procesarea şi redarea informaţiei) şi blocul de alimentare cu energie a tuturor componentelor. Dreapta : de sus in jos : sursa emitatoare de fascicul de electroni (tunul de electroni). Se compune din : tunul de electroni. Stanga in dreptul sagetilor orificiu de observare. ecran. traiectul fasciculului de electroni. 6 . lentila obiectiv. sistemul de vidare.

mărită. asigurând un paralelism cât mai bun al radiaţiilor cu axa optică. Constructiv. lentila condensoare (sau condensorul). Obiectivul formează imaginea primară. Condensorul are rolul de a focaliza fasciculul de electroni pe probă. Tunul de electroni are rolul de a genera fasciculul de electroni. obiectul de studiat. în funcţie de tipul de microscop folosit. construcţia unui microscop electronic este într-o oarecare măsură analogă construcţiei microscopului optic obişnuit. a obiectului. dar au ca scop comun generarea unui fascicul de electroni direcţionat. de electroni la microscopul electronic). *** 7 . *** În momentul de faţă sunt utilizate căteva tipuri de tunuri de electroni: cu wolfram (W). Fasciculul de electroni. având curent stabil şi diametru cât mai mic posibil. 2. sunt următoarele: sursa (de iluminare la microscopul optic.000V. cu energii cuprinse între căteva zeci şi zeci de mii de electronvolţi.Fig 6. lentila proiectoare şi sistemul de vizualizare şi înregistrare a informaţiei. În interiorul tunului de electroni un câmp electrostatic dirijează electronii emişi de o porţiune foarte mică a suprafeţei unui filament. Principial. emis de tunul electronic. tunul accelerează electronii prin coloană spre probă. printr-o apertură foarte îngustă. este compus din electroni monocinetici şi poartă numele de fascicul incident sau primar. El poate fi supus unei tensiuni de accelerare de la 100V până la 40. 3. care bombardează suprafaţa probei. După aceea. aceasta este preluată de lentila proiector care o măreşte mai mult. comune celor două instrumente. Părţile principale. Mod de functionare : 1. sunt utilizate materiale şi principii fizice diferite pentru obţinerea tunurilor de electroni. cu hexaborură de lantan (LaB6) şi cu emisie de câmp. pentru observarea pe ecranul instrumentului.

amplificate şi procesate permit obţinerea unor informaţii privind morfologia. O serie de lentile electromagnetice şi de diafragme din coloană reconverg şi focalizează fasciculul într-o imagine micşorată. Electronii parcurg tunul ca un fascicul divergent. semnalele corespunzatoare si tipuri de microscopie electronica in functie de semnalul utilizat in crearea de imagini. Aceasta încorporează dispozitivul de manevrare a probei. analiza dispersiva in energie Fascicul electronic incident Radiatii X Radiatii infrarosii Radiatii luminoase (fotoni optici) Microscopie electronica cu baleiaj sau de tip analitic Curent indus Electroni absorbiti Imprastiere elastica necoerenta Imprastiere neelastica Imprastiere elastica coerenta Fascicul nedeviat de electroni transmisi Fig 7. Aproape de zona de jos a coloanei există câteva bobine de scanare în rastere. După parcurgerea coloanei de electroni. (4) 5) Semnalele rezultate în urma interacţiei dintre fasciculul de electroni şi corpul solid Electroni retroimparstiati (reflectati elastic) Electroni secundari (emisi) PROBA Microscopie electronica prin transmisie. fasciculul ajunge în camera probei.4. În momentul interacţiei fasciculului de electroni cu suprafaţa probei rezultă o serie de semnale. Lentila finală focalizează fasciculul într-o arie cu o dimensiune cât mai mică pe suprafaţa probei. structura şi compoziţia probelor. 5. Interactiunile la nivelul probei. care deflectează fasciculul de electroni într-o grilă de baleiere pe suprafaţa probei. care după ce sunt detectate. o uşă pentru introducerea sau extragerea eşantionului analizat şi câteva dispozitive pentru montarea detectorilor de semnale sau a altor accesorii. microsopie electronica cu baleiaj prin transmisie. 6) Tipuri de semnale 1) Electronii secundari 8 .

ceea ce conduce la obţinerea unei arii mai luminoase în imagine.Electronii secundari (SE) sunt electronii atomilor din probă care sunt ejectaţi în mediu datorită interacţiei cu electronii primari din fascicul. mulţi electroni secundari produşi nu pot părăsi proba şi sunt anihilaţi. sunt electronii primari care au fost împrăştiaţi în afara suprafeţei probei. evaluate corect. Cu cât volumul de interacţie este mai aproape de suprafaţa probei. Mecanismul acestei fotoemisii este similar cu luminiscenţa în sensul că este stimulată de o serie de elemente active. În general. electronii secundari oferă imagini de cea mai bună rezoluţie. Semnalul oferit de electronii retrodifuzaţi este detectat de doi detectori cu corp solid. 3) Recombinarea şi catodoluminiscenţa Prin interacţiunea unui fascicul incident cu o probă. 2) Electronii retrodifuzaţi Electronii retrodifuzaţi (BSE – backscattered electrons). În general. prin procese de recombinare electron-gol. lucrând în regim de substituţie-adiţie permit obţinerea unor imagini privind topografia sau compoziţia suprafeţelor analizate. În aceste imagini. Din zonele ce conţin elementele cu numere atomice mai mari vor fi reflectaţi mai mulţi electroni. 9 . catodoluminiscenţa poate indica distribuţia în probă a acestor elemente cu concentraţii mici. ceea ce contribuie la pierderea rezoluţiei în imaginile de electroni retrodifuzaţi. Dacă procesul de recombinare este însoţit de emisia de fotoni optici. contrastul este determinat de diferenţa numerelor atomice din fiecare punct bombardat cu fasciculul de electroni. cât şi în cele mai joase. interpretarea imaginilor de electroni secundari devine foarte intuitivă. Prin urmare. iar văile mai întunecate. Exact la fel ca în cazul luminiscenţei normale. cu atât mai mulţi electroni secundari pot fi emişi din probă. datorită ciocnirilor elastice cu nucleele din atomii probei. Acest tip de electroni provin dintr-un volum mai mare de interacţie cu substanţa. Aceşti electroni posedă energii mari. Astfel se obţin imagini în care vărfurile vor fi mai luminoase. în urma împrăştierilor. acest fenomen producându-se atât în zonele cu vârfuri. completând astfel informaţia privind compoziţia chimică a ariei bombardate. Imaginile de electroni retrodifuzaţi nu sunt atât de uşor de interpretat dar. ei au energii foarte mici (prin convenţie mai mici de 50 eV). obţinute prin emisie de radiaţii X sau electroni Auger. care. intensitatea curentului de electroni retroîmprăştiaţi creşte cu creşterea unghiului de împrăştiere. pot oferi informaţii importante privind compoziţia probei. Imaginile date de electronii secundari sunt oferite în principal de toporafia suprafeţei probei. de media numerelor atomice ale elementelor din compoziţia probei. Datorită faptului că au energii foarte mici. acest tip de electroni poate scăpa din suprafaţa probei doar dintr-o regiune de foarte mică adâncime. apare fenomenul de catodoluminiscenţă. aflate în cantităţi foarte mici în aria probei bombardate cu fasciculul de electroni. cuprinse (prin convenţie între 50eV şi tensiunea de accelerare a fasciculului). Datorită acestui fapt. nu variază sensibil cu energia fasciculului primar şi creşte cu numărul atomic al probei.

Este posibil ca anumiţi electroni să fie reflectaţi din probă. după ce în prealabil au interacţionat neelastic cu atomii din probă. sau senzor de lumină cum ar fi un senzor CCD. stările de suprafaţă în unele materiale semiconductoare pot fi studiate prin acest efect care furnizează date privind timpul de viaţă al purtătorilor de sarcină majoritari. îşi pierd din ce în ce mai mult din energie. Intensitatea maximă a spectrului continuu creşte cu tensiunea de accelerare. Locul vacant este ulterior ocupat de un alt electron care cade de pe un nivel energetic superior şi emite un foton de radiaţie X.Catodoluminiscenţa în probele semiconductoare este dependentă de tensiunea electrică aplicată şi. Ceilalţi electroni.1 ) Microscopul Electronic cu Transmisie (MET) si utilizarile sale Forma originală a microscopiei electronice. după fiecare coliziune. Fenomenul de catodoluminiscenţă este afectat de asemenea de topografia superficială şi de prezenţa unor defecte interne (dislocaţii. etc. 4) Emisia de radiaţii X şi electroni Auger Emisia de radiaţii X se produce dacă un electron de pe un nivel energetic inferior este excitat de fasciculul primar de electroni şi trece pe un nivel energetic superior. de energie hυ egală cu diferenţa ∆ Ε dintre energiile corespunzătoare celor două niveluri energetice între care a avut loc tranziţia. până când nu mai pot participa la un proces de ionizare prin impact (de obicei energia de ionizare este cuprinsă între 3 şi 8 eV). Raza de electroni care a fost transmisă printr-un specimen parțial transparent pentru electroni transportă informație despre structura internă a specimenului în raza care ajunge la sistemul de formare a imaginii. 10 . cu intensitatea fasciculului şi cu numărul atomic al probei. Acest fenomen de excitare a luminiscenţei prin bombardament electronic a fost observat şi în unele materiale plastice. precipitate. lungimi de difuzie.(4) 6. placă fotografică. organice şi în unele probe minerale. microscopia electronică cu transmisie implica o rază de electroni la tensiune înaltă emisă de un catod. limite intercristaline). sau părăseşte complet atomul (fotoelectron). în consecinţă. Imaginea detectată de CCD poate fi afişată în timp real pe un monitor sau transmisă pe loc unui calculator. de regulă filament de tungsten. şi focalizată de lentile electrostatice şi electromagnetice. Variația spațială a acestei informații ("imaginea") este apoi mărită de o serie de lentile electromagnetice până când este înregistrată la coliziunea cu un ecran fluorescent. care sunt împrăştiaţi la unghiuri mai mici spre interiorul probei. Energia rezultată în urma frânării acestor electroni este emisă sub forma unor fotoni de radiaţii X ce alcătuiesc spectrul continuu de emisie a probei.

dar o nouă generaţie de sisteme de corecţie a aberaţiilor a avut ca efect depăşirea parţială a aberaţiilor sferice şi creşterea rezoluţiilor. suport pentru specimen si orificiu etans pentru aer.Fig 8. prima lentila condensor. lentila obiectiv si dispozitiv de reglare a acesteia.78 ångströmi (78 picometri). fasciculul de electroni transmisi. tun de electroni. cat si cele batrane sa fie observate diferit de microscopul electronic. Corecţiile din software ale aberaţiei de sfericitate pentru microscoapele electronice cu transmisie de înaltă rezoluţie a permis producerea unor imagini cu rezoluţie suficient de bună pentru a evidenţia atomii de carbon în diamante. dispozitiv de reglare a aperturii condensorului 2.89 ångströmi (89 picometri) unii de alţii şi atomi din silicon la distanţe de 0. Astfel. ecran fluorescent si camera. dispozitiv de reglare a aperturii condensorului 1. atat proteinele tinere .(5).(6) Proteinele recombinate care contin etichete tetracisteine pot fi cu usurinta distribuite in celule vii cu diferite culori a “biarsenical fluorescent chromophore”* astfel incat . De sus in jos in sagetile indica: sursa de inalta tensiune. a doua lentila condensor. noua proteina sintetizata connexin43** a fost transportata predominant intre 100 si 150 de nanometri prin plasma membranei si incorporata la periferia 11 . Rezoluţia unui microscop electronic cu transmisie este limitată în principal de aberaţia de sfericitate. aflaţi la distanţe de doar 0.

membranei unde exista “gap junctions”***.(10) **** in situ = in habitatul natural (11) Fig 10. Imaginea unui virus cu o dimensiune de 30 nm prin microscopul electronic cu transmisie.(9) *** gap junctions ( sau nexus ) reprezinta o conexiune specializata intercelular intre o multitudine de celule animale. Acesta se conecteaza direct la citoplasma si permite moleculelor si ionilor sau treca intre celule.(8) Fig 9. 12 . celulelor sau materialelor pentru imagine fluorescenta sau spectroscopie. ** connexin ( sau gap junction proteins ) reprezinta o serie de proteine care formeaza aceste jonctiuni.(7) *Fluorescent chromophore ( fluorophore ) reprezinta un flourcrom covalent la o macromolecula care ajuta la patarea tesuturilor.Aceasta metoda are rolul de a clarifica procesele de transport de proteine in situ****.

Imaginea virusului subtilis la microscopul electronic de transmisie 6.2 ) Microscopul electronic cu scanare ( sau cu baleiaj MES) si utilizarile sale 13 . Fig 11.

Spre deosebire de MET. acesta este capabil să vizualizeze probe mai mari. unde semnalele electronilor transmisi formeaza imaginea. detectorul de electroni. Dreapta. În general.(12) 14 . de sus in jos sagetile indica: imaginea vazuta pe ecranul format din tub catodic sincronizat la bobina. proba. Schema de principiu a microscopului electronic de scanare. emisi de pe suprafaţa specimenului datorită excitării acestuia de către raza principală de electroni. microscopul electronic cu scanare produce imagini prin detecţia electronilor secundari. Datorită faptului ca imaginea produsă de microscoapele cu scanare se bazează pe procese de suprafaţă şi nu pe transmisie. şi are o adâncime de penetrare mult mai mare. fasciculul de electroni. bobina. rezoluţia MET este de regulă cu un ordin de mărime mai mare decât cea a MES. În MES. electroni secundari. cu energie scăzută. de sus in jos sagetile indica: tunul de electroni. detectorii construind o imagine prin maparea semnalelor detectate la poziția razei. Stanga. magnetii condensori.Fig 11. raza de electroni parcurge întreg specimenul. producând astfel imagini care sunt o bună reprezentare tridimensională a probei. magnetii obiectiv.

Imaginea unei colonii bacteriene .Exista metode de a obtine stuctura unei molecule sau a unui scanare 15 . Microcoloniile au fost fixate pe fasii in vapor Formalin in situ. cat si orientarea lor in cadrul coloniei.Analizarea Coloniilor Bacteriene Aceasta tehnica este utilizata pentru observarea cresterii coloniilor bacteriene. Bacillus cereus si Bacillus subtilis au fost cultivate pe fasii de membrane de dializa etichetate cu nutriment agar. Fig 12. Astfel cu ajutorul acestui microscop s-au observat atat morfologia celulelor.(13) Fig 13.Evolutia Micoscopiei cu scanare ( Reconstructia structurilor 3D ) – Fig 14. Imaginea unei furnici Observarea si analizarea structurilor la nivel 3D este de o importanta majora in la nivelul microscopului cu domeniul biologic si biofizic.Apoi fasiile au fost scoate de la nutriment agar si analizate cu ajutorul microscopului cu scanare fara a fi distruse aranjamentele celulare. Imaginea unor cristale de gheata la microscopul cu scanare .

Multicolor and electron microscopic imaging of connexin trafficking.Molecular Cell 16 .(14) Bibliografie : 1. Phys Rev Lett 2009: 102 (9): 096101. Dahmen U. OÅM: World-Record Resolution at 0. Pennycook SJ . Handbook of biological confocal microscopy. Harvey F.com/doc/57678478/Microscopie-electronica 5. Ernst Ruska (1986). Science. 2..1126/science. In Pawley JB. Murfitt MF. 6. 7. 9. „Direct Sub-Angstrom Imaging of a Crystal Lattice” (în engleză).. De asemenea. Accesat la 2007-02-06.org/nobel_prizes/physics/laureates/1986/ 3. Chisholm MF. Fluorophores for confocal microscopy. Gaietta G.scribd. Ellisman MH. sistemul 3D este foarte util in intelegerea retelelor de celule . mai ales cand vine vorba de Sistemul Nervos. Rossell MD. Dellby N. Deerinck TJ. Arnold Berk. James Darnell (2004). Erni R. Mathew P. Nellist PD. Science 305 (5691): 1741. Scott.Dar nimic nu se compara cu analiza 3D in momentul in care trebui sa se reconstruiasca anumite structuri de ordinul micrometrilor si sa se analizeze cele mai mici procese. Szilagyi ZS. Adams SR. Kisielowski C. Monty Krieger.296(5567):503-7.(17). New York: Plenum Press 2008: pp. (18 mai 2001) Berkeley Lab Currents. Chris A. Krivanek OL. Sosinsky GE. 8.nobelprize. http://www. 267–74. Tour O. Tsien RY. Laird DW. Waggoner A (1995).1100965. Autobiografia lui Ernst (versiunea in engleza). Sides WH Jr.atom la nivelul microscopului optic. Lupini AR. Kaiser.Lodish. 4.78 Å. http://www. ISBN 0-306-44826-2. 2002 Apr 19. Bouwer J. Nobel Foundation. PubMed PMID: 11964472. Lawrence Zipursky. Borisevich A. S. Atomic Resolution Imaging with a sub-50-pm Electron Probe. Tsien RY. Paul Matsudaira. doi:10.

http://dexonline. pp. Freeman and Company. Annu rev physiol 61: 283–310. 1928 . PubMed ) 17 .ro/definitie/in%20situ 12. 230–1. Microscopia electronică cu scanare. Appl Microbiol. Denk W. St Julian G. 10. Scanning electron and phasecontrast microscopy of bacterial spores. 1969: 18(3): 490-95 [PMC free article][PubMed] 14.H. Rhodes RA. Heidelberg. Hesseltine CW. Max Planck Institute for Medical Research. Paul. David L. (1999). 11..). New York: W. White.Biology (5th ed. Horstmann H. ISBN 0-71674366-3. "Genetic diseases and gene knockouts reveal diverse connexin functions". Thomas W. Bulla LA.1965 13. Germany.