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OFICINA ESPANOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPANA

11 N. de publicacin: o 51
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k ES 2 063 370 kInt. Cl. : A01N 63/00

C12N 15/33 C12N 15/86 //C12N 9/12

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kNmero de solicitud europea: 90911176.7 u kFecha de presentacin : 29.06.90 o kNmero de publicacin de la solicitud: 0 432 256 u kFecha de publicacinode la solicitud: 19.06.91 o

TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA

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54 T tulo: Agentes mejorados para el control biolgico de insectos y mtodos de uso. o e

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30 Prioridad: 29.06.89 US 373952

73 Titular/es: University of Georgia

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Research Foundation, Inc. The University of Georgia Boyd Graduate Studies Building Athens, Georgia 30602, US

45 Fecha de la publicacin de la mencin BOPI: o o

01.01.95

72 Inventor/es: Miller, Lois, K. y

OReilly, David, R.

45 Fecha de la publicacin del folleto de patente: o

01.01.95

74 Agente: Carpintero Lpez, Francisco o

Aviso:

En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicacin en el Bolet europeo de patentes, o n de la mencin de concesin de la patente europea, cualquier persona podr oponerse ante la Ocina o o a Europea de Patentes a la patente concedida. La oposicin deber formularse por escrito y estar o a motivada; slo se considerar como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de o a o oposicin (art 99.1 del Convenio sobre concesin de Patentes Europeas). o
Venta de fasc culos: Ocina Espaola de Patentes y Marcas. C/Panam, 1 28036 Madrid n a

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DESCRIPCION Esta invencin se realiz con fondos de los Institutos Nacionales de Salud (N.I.H.) de los Estados o o Unidos (Subvencin n GE000918). El gobierno de los Estados Unidos puede tener ciertos derechos sobre o esta invencin. o Campo tcnico e Esta invencin se reere a procedimientos y composiciones para el control biolgico mejorado de las o o plagas de insectos. Ms concretamente, esta invencin se reere al uso y manipulacin de un gen de a o o baculovirus y a su producto gnico que es ecaz para controlar el crecimiento y el desarrollo de insectos. e Esta invencin tambin se reere a baculovirus geneicamente modicados y a otros agentes de control de o e insectos que afectan adversamente a las plagas de insectos infectadas. Antecedentes de la invencin o El inters por el control biolgico de las plagas de insectos ha surgido como resultado de los incone o venientes de los plaguicidas qu micos convencionales. Los plaguicidas qu micos, en general, afectan a las especies beneciosas as como a las no beneciosas. Las plagas de insectos suelen adquirir resistencia a estos productos qu micos de manera que pueden desarrollarse rpidamente nuevas poblaciones de plagas a de insectos que son resistentes a estos plaguicidas. Adems, los residuos qu a micos presentan riesgos para el medio ambiente y constituyen una posible preocupacin para la salud. El control biolgico constituye un o o medio alternativo de control de las plagas que puede reducir la dependencia de los plaguicidas qu micos. Las estrategias fundamentales para el control biolgico incluyen el despliegue de organismos naturales o que son patgenos para los insectos (entomopatgenos) y el desarrollo de cultivos que son ms resistentes o o a a las plagas de insectos. Las formas de enfocar el problema incluyen la identicacin y caracterizacin o o de genes o productos gnicos de los insectos que pueden servir como dianas adecuadas para los agentes e de control de insectos, la identicacin y explotacin de microorganismos previamente no utilizados (que o o incluyen la modicacin de microorganismos no patgenos naturales para volverlos patgenos para los o o o insectos), la modicacin y renamiento de los entomopatgenos actualmente utilizados y el desarrollo o o de cultivos genticamente modicados que presenten mayor resistencia a las plagas de insectos. e Los virus que causan enfermedades epizoticas naturales dentro de las poblaciones de insectos se o encuentran entre los entomopatgenos que han sido desarrollados como plaguicidas biolgicos. Los bao o culovirus son un amplio grupo de virus que infectan solamente a los artrpodos (Miller, L.K: (1981) en o Genetic Engineering in the Plant Sciences, N. Panopoulous (coordinador de edicin), Praeger Publ., New o York, pgs. 203 -224; Carstens (1980), Trends in Biochemical Science 52:107 -110; Harrap y Payne (1979) a en Advances in Virus Research, Vol. 25, Lawfer et al. (coordinadores de edicin), Academic Press, New o York, pgs. 273-355). Numerosos baculovirus infectan a los insectos que son plagas de cultivos agr a colas y forestales de importancia comercial. Estos baculovirus son potencialmente valiosos como agentes de control biolgico. La Agencia de Proteccin del Medio Ambiente de Estados Unidos ha registrado cuatro o o baculovirus diferentes para uso como insecticidas. Entre las ventajas de los baculovirus como plaguicidas biolgicos se encuentra su especicidad para el husped. No solamente los baculovirus como grupo infeco e tan slo a los artrpodos sino que tambin cepas individuales de baculovirus habitualmente slo infectan o o e o a una o unas pocas especies de insectos. Por lo tanto, no presentan ning n riesgo para el hombre o el u medio ambiente y pueden ser utilizados sin afectar desfavorablemente a especies de insectos beneciosas. Los subgrupos de baculovirus incluyen el virus de la polihedrosis nuclear (NPV), virus granulosos (GV) y baculovirus virus no ocluidos. En las formas ocluidas de baculovirus, los viriones (nucleocpsidas a envueltas) estn incrustados en una matriz proteica cristalina. Esta estructura, a la que nos referiremos a como cuerpo de inclusin u oclusin, es la forma que se encuentra en la naturraleza fuera de los organiso o mos y es responsable de la propagacin de la infeccin entre los organismos. El rasgo caracter o o stico de los virus NPV es que en cada cuerpo de oclusin se encuentran incrustados numerosos viriones. Los cuerpos o de oclusin de los NPV son relativamente grandes (hasta 5 micrmetros). Los cuerpos de oclusin de o o o los virus GV son ms peque os y contienen un solo virin cada uno. La matriz proteica cristalina de a n o los cuerpos de oclusin de ambas formas est constituida fundamentalmente por un unico polipptido de o a e 25.000 a 33.000 dalton que es conocido como polihedrina o granulina. Los baculovirus del subgrupo no ocluido no producen una prote polihedrina o granulina y no forman cuerpos de oclusin. na o En la naturalieza, la infeccin es iniciada cuando un insecto ingiere un alimento contaminado con o part culas de baculovirus, t picamente en forma de cuerpos de oclusin. Los cuerpos de oclusin se disoo o cian bajo las condiciones alcalinas del digestivo medio del insecto, liberando part culas v ricas individuales 2

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que despus invaden las clulas epiteliales que recubren el intestino. Dentro de una clula husped, el e e e e baculovirus migra al ncleo donde tiene lugar la replicacin. Inicialmente, se producen ciertas prote u o nas v ricas espec cas dentro de la clula infectada mediante la transcripcin y la traduccin de los llamados e o o genes tempranos. Entre otras funciones, estas prote nas son necesarias para permitir la replicacin o del ADN v rico, que comienza de 4 a 6 horas despus de que el virus entre en la clula. La replicacin e e o extensiva del ADN v rico transcurre hasta unas 12 horas post-infeccin (pi). Durante unas 8 a 10 horas o pi, la clula infectada produce grandes cantidades de productos gnicos v e e ricos tard os. Estos incluyen componentes de la nucleocpsida que rodea el ADN v a rico durante la formacin de las part o culas v ricas progenie. La produccin de las part o culas v ricas progenie comienza alrededor de 12 horas pi. Inicialmente, los virus progenie migran a la membrana celular donde adquieren una envoltura a medida que brotan de la supercie de la clula. Este virus no ocluido puede despus infectar a otras clulas dentro e e e del insecto. La s ntesis de polihedrina comienza entre 12 y 18 horas despus de la infeccin y aumenta e o hasta niveles muy elevados a las 24 horas pi. En ese momento, se produce una reduccin del nmero de o u part culas v ricas brotadas y despus los virus progenie son incrustados en los cuerpos de oclusin. La e o formacin de cuerpos de oclusin contina hasta que la clula muere o es lisada. Algunos baculovirus ino o u e fectan prcticamente a todos los tejidos del insecto husped de forma que al nal del proceso de infeccin, a e o todo el insecto es licuado, liberando nmeros extraordinariamente grandes de cuerpos de oclusin que u o entonces pueden propagar la infeccin a otros insectos. (Revisado en The Biology of Baculoviruses, Vol., o I y II, Granados y Federici (coordinadores de edicin), CRC Press, Boca Raton, Florida, 1986). o Otro inconveniente signicativo del uso de baculovirus como plaguicidas es el tiempo transcurrido entre la ingestin del virus y la muerte del insecto. Durante este tiempo, el insecto plaga contin a o u alimentndose y daando a los cultivos. Debido a que es poco problable que el agricultor aplique el a n insecticida hasta que no observe una infestacin establecida, es cr o tico que el tiempo de alimentacin sea o reducido al m nimo. Lo que es necesita en un plaguicida biolgico que reduzca la alimentacin del insecto de su muerte. Se o o preere un plaguicida biolgico porque crea menos riesgos medioambientales que un plaguicida qu o mico. Tambin es deseable una muerte ms rpida del insecto. La explotacin de (a) uno o varios genes que e a a o codiquen una o varias prote nas que controlan el desarrollo del insecto y su incorporacin a diversos o organismos permitir un control biolgico mejorado de las plagas de insectos. a o Enunciado de la invencin o
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En esta invencin, son identicados un gen de baculovirus y su producto gnico que afectan al crecio e miento, desarrollo o comportamiento de los insectos. Esta invencin proporciona mtodos para el uso de o e este gen y producto gnico, as como mtodos para la inactivacin de este gen o su producto gnico en e e o e las estrategias de control de insectos. En una realizacin preferida, el gen egt codica la UDP -glucosil o o transferasa ecdisteroide (EGT) de AcMNPV. La expresin del gen egt de baculovirus causa la produccin o de EGT que inactiva las hormonas que intervienen en la muda de los insectos, impidiendo as que la larva del insecto mude o forme pupa. La inactivacin del gen egt del baculovirus permite que prosiga la muda o y la pupacin de la larva infectada. o Esta invencin abarca una amplia gama de agentes de control de insectos que utilizan genes egt y sus o productos gnicos. Los agentes de control de insectos de esta invencin causan la s e o ntesis inapropiada de la prote EGT en las plagas de insectos de forma que es perturbado el desarrollo norma de la plaga na insectil. co para la plaga de insectos Preferiblemente, el organismo que contiene el gen egt es un virus espec y en el que el gen egt del virus ha sido inactivado, permitiendo con ello el desarrollo continuo del insecto husped infectado con el virus. El desarrollo del insecto husped induce cambios del comportamiento e e tales como alimentacin reducida y, cuando est infectado por el plaguicida v o a rico, el crecimiento es reducido y la muerte es ms rpida. Esta invencin tambin incluye un procedimiento para la produccin a a o e o del plaguicida v rico mejorado. Adems, esta invencin incluye un mtodo de control de las plagas de a o e insectos que consiste en exponer la plaga de insectos al plaguicida v rico mejorado. Los virus genticamente alterados contemplados en esta invencin son plaguicidas ms ecaces que e o a los virus de la tcnica anterior. Los baculovirus, tales como el virus de la polihedrosis nuclear Autographa e californica (AcMNPV) y el virus de la polihedrosis nuclear Orgyia pseudotsugata (OpMNPV), expresan o a naturalmente un gen egt cuya expresin prolonga el periodo de tiempo que pasa alimentndose una larva infectada antes de sucumbir a la infeccin v o rica. Esta invencin incluye la inactivacin del gen egt en el o o 3

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genoma de virus tales como baculovirus, pero sin limitarse exclusivamente a ellos. El gen egt puede ser inactivado empleando en su lugar o insertando dentro de l otro gen tal como el gen marcador no v e rico para -galactosidasa. Debe entenderse que podr utilizarse cualquier secuencia de ADN para romper el a o gen egt siempre que rompa la expresin de la secuencia codicante del egt. Alternativamente, la totalio dad o parte del gen egt puede ser removida del genoma por delecin de un segmento codicante de ADN apropiado o puede ser alterada o removida la parte reguladora del genoma que controla la expresin del o e gen egt. Tambin pueden producirse baculovirus con deleciones que inactivan al gen egt mediante paso seriado del virus en cultivos de clulas de insectos. Los virus delecionados resultantes tienen la ventaja e de que no contienen ADN extrao y dieren de los virus de tipo salvaje solamente en que carecen de un n gen egt funcional. Estos baculovirus modicados funcionan mejor como agentes de control de las plagas que los virus actualmente en uso. Como simples mutantes de delecin, tambin deben ser aceptables para o e las agencias reguladoras (p.ej. la EPA de Estados Unidos) como plaguicidas genticamente modicados e porque no contienen ADN heterlogo. Los baculovirus que no expresan un gen egt funcional pueden o ser modicados mediante la insercin de genes distintos del egt que intereran con el desarrollo de los o insectos, mejorando as la ecacia de estos virus como agentes de control de insectos. Esta invencin tambin incluye un mtodo de control de las plagas de insectos mediante la infeccin o e e o de las larvas de los insectos con un virus mutante que carece de un gen egt intacto o incapaz de expresar un producto EGT funcional. Las larvas infectadas con el virus mutante intentan mudar y formar pupa alimentndose, por consiguiente, durante un periodo de tiempo ms corto que las larvas infectadas con a a virus de tipo salvaje y otros virus de la tcnica anterior. Las larvas de los insectos infectadas con el virus e mutante tambin mueren ms pronto que las larvas infectadas con virus de tipo salvaje u otros virus de e a la tcnica anterior. e Un objetivo de esta invencin es proporcionar un virus recombinante que es un plaguicida ms efeco a tivo que los virus de tipo salvaje o de la tcnica anterior. Esta invencin es ilustrada por el AcMNPV e o recombinante denominado vEGTZ, en el que una parte del gen egt ha sido delecionada y sustituida por lacZ, un gen bacteriano que codica a la -galactosidasa. Puede emplearse cualquier secuencia de ADN o a que inactive al gen egt, como saben los expertos en este campo. Esta invencin es ilustrada adems por el baculovirus recombinante denominado vEGTDEL, en el que una parte del gen egt ha sido delecionada. e a Otra realizacin es un plaguicida de baculovirus en el que el gen egt ha sido eliminado. Tambin estn o incluidos los baculovirus en los que una mutacin natural, incluida una delecin ha producido la inactio o vacin del gen egt. o e Por consiguiente, un objetivo de esta invencin es proporcionar un gen egt y su producto gnico que o son utiles en el control de las plagas de insectos. Tambin cae dentro del ambito de esta invencin la e o UDP-glucosil transferasa ecolisteroide sustancialmente puricada y un anticuerpo espec co para ella. a o Los genes egt pueden ser identicados por homolog de secuencias con la secuencia de nucletidos de e o un gen egt en la Tabla I o despus de la determinacin de la actividad del enzima EGT y subsiguiente anlisis del ADN. La secuencia de ADN que codica una UDP-glucosil transferasa ecdisteroide es un a . na e gen egt como se dene aqu Una prote EGT puede ser puricada utilizando tcnicas conocidas en este campo y el procedimiento de ensayo descrito en el Ejemplo 4. Una preparacin de prote EGT o na sustancialmente pura en la que contiene como m nimo alrededor de 70% (p/p) de UDP-glucosil tranferasa ecdisteroide. Una prote EGT recombinante es la que se ha preparado en cualquier organismo distinto na de aqul en el que aparece naturalmente el gen que condica la citada prote e na. La prote recombinante na es expresada como resultado de la ingenier gentica o de la tecnolog del ADN recombinante. a e a Otro objetivo de esta invencin es proporcionar un virus genticamente modicado que es un ecaz o e plaguicida y tambin es medioambientalmente aceptable. e Todav otro objetivo de esta invencin es proporcionar un plaguicida recombinante que carece del a o gen egt funcional y expresa un segundo gen que interere con el desarrollo del insecto, donde el segundo gen no se encuentra naturalmente presenta en el organismo. Este segundo gen es un gen que codica un producto gnico que afecta a la ecdisis. Este producto gnico puede ser una hormona insectil que afecta e e al desarrollo del insecto o un enzima que inactiva una hormona insectil que regula la ecdisis. Ejemplos espec cos son la hormona protoracicotrpica, la hormona de la eclosin y la esterasa de la hormona o o juvenil. Cuando ha de incorporarse a un virus insectil genes que codican estas prote nas para producir un agente de control de insectos, ese virus debe ser un virus que no contenga un gen egt o un virus en el que un gen egt haya sido inactivado.

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Todav otro objetivo de esta invencin es proporcionar un organismo genticamente modicado para a o e e uso como agente de control de insectos que expresa un gen egt genticamente insertado, en el que no era e expresado naturalmente ningn gen egt. Estos organismos genticamente modicados que expresan EGT u inuirn perjudicialmente en las plagas de insectos, con el resultado de menores da os en las plantas. a n
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Todav otro objetivo de esta invencin es proporcionar composiciones insecticidas adecuadas para a o aplicaciones agr colas. Estas composiciones contienen un veh culo agr colamente adecuado como se entiende en este campo y un virus de insectos, tal como un baculovirus, que ha sido genticamente moe a dicado de manera que un gen egt del citado virus est inactivado. Este baculovirus Egt puede ser genticamente modicado todav ms para expresar un gen hetorlogo que codica una hormona ine a a o sectil que afecta a la ecdisis o un enzima que inactiva una hormona insectil que afecta a la ecdisis. Los genes heterlogos cuyos productos gnicos afectan a la ecdisis son, pero sin limitarse exclusivamente a o e ellos, los de la hormona protoracicotrpica, la hormona de la eclosin y la esterasa de la hormona juvenil. o o Preferiblemente, las composiciones insecticidas que contiene baculovirus genticamente modicados se e formulan para su aplicacin por pulverizacin. o o Tambin estn contempladas aqu como composiciones insecticidas las que contienen un veh e a culo agr colamente adecuado y un parsito de insectos genticamente modicado. Un parsito de insectos a e a es un organismo que vive o se replica en estrecha asociacin con la larva de un insecto y ejerce efectos o adversos sobre las larvas. Un parsito de un insecto puede ser un bacteria, un hongo, un virus u otro a a insecto. Este parsito de insectos genticamente modicado que comprende un gen egt ser mejorado a e como agente de control de insectos mediante la inactivacin de ese gen egt. o Cualquiera de las composiciones antes indicadas puede contener adems ingredientes que estimulen a la alimentacin del insecto. Las composiciones insecticidas de esta invencin pueden ser ingeridas por las o o plagas de insectos despus de su aplicacin a la planta y esas plagas de insectos susceptibles al agente de e o control de insectos en la composicin insecticida presentarn una alimentacin reducida y morirn. o a o a Otro objetivo de esta invencin es proporcionar un plaguicida biolgico modicado que inhibe con la o o o e expresin del gen egt o con la funcin de su producto gnico. o Breve Descripcin de los Dibujos o

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La Figura 1 es una representacin esquemtica del genoma de AcMNPV que muestra la posicin del o a o o gen egt. El genoma de AcMNPV se presenta en unidades de mapa y como mapas de restriccin de EcoRI y HindIII. La Figura 2 es un resumen esquemtico de los resultados de secuenciar el gen egt y analizar la sea cuencia. La Parte A describe un mapa de endonucleasas de restriccin de la regin. Los resultados del o o anlisis asistido por ordenador de la secuencia para fases de lectura abiertas estn mostrados en la Parte a a B. Las l neas verticales indican codones de terminacin. La secuencia es traducida en los tres fases de o lectura abiertas posibles para cada cadena de ADN (1, 2, 3, 1, 2, 3). La fase de lectura abierta (2) a n correspondiente al egt est se alada como EGT. La Figura 3 es una representacin esquemtica de las estructuras de las regiones del gen egt de Aco a MNPV (A) y de los virus recombinantes vEGTZ (B) y vEGTDEL (C). La caja rayada representa el gen lacZ. La Figura 4 es una representacin esquemtica de la electroforesis en gel de agarosa y del anlisis de o a a transferencia Southern para la identicacin de un gen egt en el baculovirus OpMNPV. o La Figura 5 es una mapa de restriccin esquemtico del genoma de OpMNPV. o a

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La Figura 6 es un grco del aumento de peso en larvas de control no infectadas o despus de la a e infeccin de larvas en la cuarta fase con AcMNPV de tipo salvaje (wt) o vEGTZ. o La Figura 7 es un grco de la mortalidad larval despus de la infeccin de larvas en la cuarta fase a e o con AcMNPV wt o vEGTZ.

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La Figura 8 es un grco del aumento de peso despus de la infeccin de larvas en la quinta fase con a e o AcMPV wt o vEGTZ. 5

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La Figura 9 es un grco de la mortalidad larval despus de la infeccin de larvas en la quinta fase a e o con AcMNPV wt o vEGTZ.
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La Figura 10 es un grco de la mortalidad larval despus de la infeccin de larvas en la primera se a e o o e con AcMNPV wt o vEGTCZ. a una concentracin de 4,8 x 106 cuerpos de inclusin polidricos (PIB)/ml. o La Figura 11 es un grco de la mortalidad larval despus de la infeccin de larvas en la primer fase a e o con AcMNPV wt o vEGTZ a una concentracin de 2,4 x 106 PIB/ml. o

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Descripcin detallada de las realizaciones expuestas o Los insectos lepidpteros experimentan una secuencia de acontecimientos bien caracterizada durante o el desarrollo desde el huevo hasta el insecto adulto (vase Comprehensive Insect Physiology, Biochemise try and Pharmacology, volmenes 7 y 8, Kerkut y Gilbert (coordinadores de edicin), Pergamon Press, u o Oxford, 1984, que contiene revisiones detalladas). Despus de la eclosin, la larva del insecto entra en un e o periodo de alimentacin intensiva durante el cual muda varias veces para permitir el crecimiento continuo. o Los periodos entre mudas sucesivas son conocidas como fases o edades. Al nal del periodo de crecimiento larval, la larva forma una pupa y nalmente emerge como insecto adulto. Los procesos de muda y pupacin (denominados colectivamente ecdisis) son regulados por las acciones concertadas de varios grupos o diferentes de hormonas. El est mulo inicial es la liberacin de la hormona protoracicotrpica (PTTH) por o o ciertas clulas del cerebro. Esta estimula las glndulas protorcicas para producir y secretar ecdisteroides e a a con frecuencia denominados hormonas de la muda de los insectos. En presencia de hormona juvenil, se producir una muda larval, mientras que en ausencia de hormona juvenil, las larvas se convertirn en a a pupas. La hormona de la eclosin tambin es importante para mediar varios cambios de comportamiento o e asociados a la ecdisis. El baculovirus AcMNPV, que se utiliza como sistema modlico para muchas investigaciones sobre e baculovirus, interere con el proceso de desarrollo del insecto discutido antes en forma previamente insospechada. Las larvas de los insectos infectadas con AcMNPV y no son capaces de mudar o formar pupas debido a que el AcMNPV dirige la s ntesis de un enzima, conocido como UDP-glucosil transferasa ecdisteroide (EGT), que inactiva espec camente a los ecdisteroides del insecto. El gen que codica a EGT fue identicado por estos inventores; se extiende desde 8,4 hasta 9,6 unidades de mapa sobre el genoma de AcMNPV (Figuras 1 y 2). Como muestra el Parte C de la Figura 1, los a fragmentos de ADN v rico que abarcan el gen egt han sido clonados en los plsmidos pUC19, Bluescript o o M13+ y Bluescript M13. La Figura 2 muestra el mapa de restriccin de la regin egt del genoma y el anlisis de fases de lectura abiertas asistido por ordenador de la regin egt. Solamente la Fase de a o lectura 2 contiene una fase de lectura abierta relativamente larga que ha sido identicada como la regin o o a codicante del gen egt. La secuencia de nucletidos del gen egt y la secuencia de aminocidos deducida de los 506 aminocidos est mostrada en la Tabla 1. La secuencia codicante del egt se extiende desde a a aproximadamente el nucletido 149 hasta aproximadamente el nucletido 1670. o o En una realizacin preferida de esta invencin, el gen egt del baculovirus AcMNPV es inactivado o o por sustitucin de una parte de gen egt por una secuencia bacteriana que codica -galactosidasa. Este o baculovirus recombinante es denovinado vEGTZ. En una segunda realizacin preferida, parte del gen o o egt del AcMNPV es delecionado sin ser sustituido como muestra la Figura 3. La comparacin de las prote nas sintetizadas durante la infeccin con AcMNPV wt y vEGTZ revel que la prote EGT es o o na una prote de 60 kDa que es secretada de las clulas infectadas. Un mecanismo alternativo para la na e o inactivacin del gen egt de los virus de insectos es la insercin de un gen que codica una hormona de o insectos que afecta a la ecdisis o un enzima que inactiva una hormona de insectos que afecta a la ecdisis, cuyo gen es expresable en una clula de insecto infectada con el citado virus de insecto. e Una bsqueda de la base de datos del Banco de Genes revel una homolog del 21 al 22% de la u o a fero. Tambin se e secuencia de aminocidos entre egt y varias UDP-glucuronosil transferasas de mam a hall homolog con una UDP-glucosil transferasa vegetal. La alineacin de la secuencia de aminocidos o a o a de EGT con las secuencias de aminocidos de algunos de estos enzimas est presentada en la Tabla II. a a

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La Tabla II ilustra el alineamiento de la secuencia de aminocidos de EGT con una seleccin de a o UDP-glucuronosil transferasas y una UDP-glucosil transferasa de otras especies. La secuencia prevista de aminocidos de EGT se compara con la humana (HUMUDPGAT) (Jackson et al. (1987) Biochem. a o J. 242:581); de ratn (MUSUDPGAT) (Kimura y Owens (1987) Eur. J. Biochem. 168:515) y de rata (RATUDPAGT) (MacKenzie (1987) J. Biol. Chem 262:9744); las UDP-glucuronosil transferasas y la UDP-glucosil transferasa de ma (ZMAYUDPGT) (Ralston et al. (1988) Genetics 119:185), empleando z el algoritmo FASTP (Lipman y Pearson (1985) Science 227:1435), instrumentalizado por International Biotechnologies Inc. Las letras may sculas indican las coincidencias exactas; las letras min sculas indican u u sustituciones que ocurren frecuentemente entre prote nas relacionadas (Dayho (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Vol. 5, Suplemento 3, Solver Spring, MD8; los puntos representan sustituciones que aparecen poco frecuentemente; los guiones indican huecos en una secuencia; y un signo de interrelacin marca cuando un aminocido ha sido delecionado de la o a secuencia. Los aminocidos entre las echas estn delecionados del gen egt en vEGTZ y vEGTDEL. la a a homolog del gen de AcMNPV con las UDP-glucosil transferasa y UDP-glucoronosil transferasa conocia das conrma la identicacin de esta secuencia de AcMNPV como la secuencia codicante egt. o En los mam feros, las UDP-glucuronosil transferasas catalizan la transferencia del acido glucurnico o a una amplia variedad de sustratos liplos exgenos y endgenos (revisado en Glucuronidation of Drugs o o o and Other Compounds, Dutton (coordinador de edicin), CRC Press, Boca Raton, Florida, 1986). Esta o reaccin de conjugacin es importante en la destoxicacin y eliminacin segura de ciertas drogas y caro o o o cingenos. Adems, el metabolismo y la eliminacin normales de diversos compuestos endgenos tales o a o o como la bilirrubina y las hormonas esteroideas, transcurre v la conjugacin con acido glucurnico. La a o o evidencia disponible sobre los sistemas insectiles indica que en las reacciones de conjugacin de az cares o u de este tipo est implicada la transferencia de glucosa ms que la de acido glucurnico (revisado por a a o Smith (1977) en Drug Metabolism From Microbe to Man, Parke y Smith (coordinadores de edicin), o Taylor and Francis Ltd., Londrs, pgs. 219-232). Como en el caso de los mam e a feros, en los insectos estn sometidos a conjugacin una amplia variedad de compuestos exgenos y endgenos. a o o o Los inventores han demostrado que la prote EGT de AcMNPV es una UDP-glucosil tranferasa que na conjuga espec camente la glucosa con ecdisteroides tales como ecdisona, 20 -hidroxiecdisona y maquisterona A (vase la Tabla III). Ni los lisados ni el medio extracelular de las clulas no infectadas o de las e e clulas infectadas con vEGTZ modican a la ecdisona. La mayor parte de la actividad glucosil transferasa e ecdisteroide expresada por las clulas infectadas con AcMNPV es secretada al medio extracelular; en los e lisados de clulas infectadas con AcMNPV solamente se observa un nivel relativamente bajo de actividad. e Empleando el gen egt de AcMNPV como sonda, se ha identicado un gen egt en otro baculovirus, el virus de la polihedrosis nuclear Orgyia pseudotsugata (OpMNPV), como muestra la Figura 4. Los expertos en este campo observarn gracias a esta descripcin que el gen egt de cualquier baculovirus, a o virus de insecto o insecto, puede ser localizado, caracterizado y aislado de forma similar a la ilustrada a o aqu Los genes egt con una homolog de la secuencia de nucletidos con la secuencia de la Tabla I . del 70% como m nimo se condiseran equivalentes a la secuencia de la Tabla I, siempre que estos genes homlogos codiquen un enzima que sea una UDP-glucosil transferasa ecdisteroide. o e o Tambin son equivalentes funcionales del gen egt aqullos que catalizan la inactivacin de los ecdistee roides tales como la ecdisona por transferencia de un radical glucosa desde la UDP-glucosa la ecdisteroide e o ecdisteroides. Los equivalentes funcionales del egt pueden ser identicados emplendo los mtodos de ensayo descritos aqu . Con la localizacin, identicacin y aislamiento de un gen egt, el experto puede inactivar ese gen utio o lizando las enseanzas de esta descripcin y las ense anzas conocidas para producir un agente de control n o n de insectos ms ecaz. a Comparando las propiedades de vEGTZ con las propiedades del AcMNPV de tipo salvaje (wt), los presentes inventores han demostrado que la expresin del egt impide que el insecto mude o forme pupa. o Los insectos infectados con AcMNPV wt no mudan o forman pupa pero los insectos infectados con vEGTZ mudan y tratan de formar pupa (vase la Tabla IV, en el Ejemplo 2). e Por inhibicin de la muda y de la pupacin, la infeccin de AcMNPV wt puede realmente prolongar el o o o tiempo de alimentacin larval. Las larvas infectadas al principio de la quinta fase (la ultima fase larval) o con el virus wt contin an alimentndose hasta su muerte 5 o 6 d despus de la infeccin. Sin embargo, u a as e o las larvas no infectadas dejan de alimentarse 2 a 3 d despus de entrar en la quinta fase en preparacin as e o 10

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para la pupacin (vase la Figura 8). Se observan efectos similares cuando se examinan larvas en fases o e ms tempranas. Las larvas no infectadas cesan de alimentarse durante aproximadamente 24 horas dua rante la muda mientras que las larvas infectadas con AcMNPV no mudan y, por consiguiente, no dejan de alimentarse (vase la Figura 6). e
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Los baculovirus recombinantes quecarecen de un gen egt funcional no prolongan el tiempo de alimentacin larval. Por lo tanto, las larvas infectadas con vEGTZ en la quinta fase temprana cesan de o alimentarse 2 d despus de la infeccin en preparacin para la pupacin (vase la Figura 8). Sin as e o o o e embargo, no forman pupa y, en su lugar, sucumben a la infeccin v o rica incluso ms rpidamente que a a las l arvas infectadas con el virus wt como muestra la Figura 9. Anlogamente, las larvas infectadas con a vEGTZ al principio de la cuarta fase cesan de alimentarse 2 d despus de la infeccin para mudar y as e o despus mueren ms rpidamente que las larvas infectadas con el tipo salvaje (vanse las Figuras 6 y 7). e a a e La muerte ms rpida causada por una baculovirus que carece de un gen egt funcional es observada de a a la forma ms espectacular cuando larvas recin salidas de la primera fase son infectadas con AcMNPV a e wt y con vEGTZ, como muestran las Figuras 10 y 11. Las larvas infectadas con vEGTZ sucumben a la infeccin v o rica 3 a 4 d ms pronto que las larvas infectadas con AcMNPV wt. Por lo tanto, los as a a baculovirus recombinantes que carecen de un gen egt funcional son considerablemente ms ecaces como agentes de control de los insectos que los baculovirus de tipo salvaje. Resultar evidente a los expertos en a este campo mediante la lectura de esta descripcin que el gen egt puede volverse no funcional en cualquier o baculovirus o virus de insectos por cualquier medio conocido en este campo. Los efectos descritos antes y en los siguientes ejemplos sern ms espectaculares en campo. Las larvas a a infectadas con vEGTZ presentan dicultades para la muda y solamente mudan con xito bajo condiciones e de laboratorio cuidadosamente controladas. Cuando la temperatura y la luminosidad no son rigurosamente controladas, muchos insectos no son capaces de completar la muda. Estos insectos no reinician la alimentacin y mueren poco despus. Aunque el periodo de tiempo durante el cual el virus progenie puede o e a acumularse en larvas infectadas con baculovirus que carecen de un gen egt funcional est algo reducido y el insecto infectado presenta crecimiento reducido, existe una produccin sustancial del virus progenie. o La cantidad de virus obtenida por larva despus de la infeccin con vEGTZ de larvas de fase tard es e o a alrededor de la mitad del obtenido con un virus wt. Esto es suciente para permitir la transmisin del o virus en campo y para la preparacin econmica de grandes cantidades de part o o culas v ricas. En otra realizacin de esta invencin, un virus de insectos que carece de un gen egt funcional es moo o dicado por tcnicas de ingenier gentica de manera que su ecacia como agente de control biolgico es e a e o aumentada todav ms mediante la incorporacin de un segundo gen cuyo producto afecta al desarrollo a a o del insecto. Puede insertarse el gen que codica a PTTH (una hormona pept dica) en el genoma v rico con el gen egt delecionado y puede expresarse PTTH a niveles sucientemente altos para efectuar a la ecdisis. Las larvas de insectos infectadas con tales virus experimentan un trastorno extremo del control hormonal del desarrollo. Estos insectos enferman rpidamente, dando lugar a un crecimiento y desarrollo severamente a comprometidos, alimentacin reducida y muerte ms temprana. o a La hormona de la eclosin es tambin una pequea hormona pept o e n dica cuyo gen puede ser insertado e en el genoma v rico con un gen egt no funcional, utilizando tcnicas conocidas en este campo. Debido a que la hormona de la eclosin gobierna muchos cambios de comportamiento asociados a la ecdisis, los o insectos infectados con un virus Egt que produce niveles sucientemente altos de esta hormona presentarn anormalidades de comportamiento y/o desarrollo, tales como alimentacin reducida. a o Un regulador primordial de los t tulos de hormona juvenil en el insecto es la enzima esterasa de la hormona juvenil, que inactiva a la hormona juvenil. Un virus recombinante que carezca de un gen egt funcional y exprese niveles sucientemente altos de esterasa de hormona juvenil puede afectar adversamente al comportamiento y/o al desarrollo del insecto. Es importante observar que, mientras todos los genes citados podr ser introducidos en un genoma an de un virus de tipo salvaje, no cabr esperar que afectaran signicativamente al comportamiento del a insecto en el virus de tipo salvaje porque la expresin del gen egt por el virus de tipo salvaje inactiva a o las hormonas ecdisteroides de la muda y la ecdisis es impedida, independientemente de la produccin de o otras hormonas. Por lo tanto, las estrategias ecaces que implican la generacin de virus diseados para o n interferir con la ecdisis del insecto dependen de la previa inactivacin del gen egt, como se describe en o esta invencin. o 11

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Los expertos en este campo entendern que los organismos mutantes que carecen de un gen egt intacto a a a e o incapaces de expresar un producto de egt funcional y los que ademn estn genticamente modicados de manera que expresen otro enzima modicador de hormonas o una hormona pept dica estn incluidos a como agentes de control de insectos de la presente invencin. o Se ha demostrado que el producto del gen egt interere con el desarrollo del insecto de forma intensa y espec ca. Los ecdisteroides desempe an un papel cr n tico en el desarrollo de esencialmente todas las especies de insectos (revisado en Comprehensive Insect Physiology Biochemistry and Pharmacology, Kerkut y Gilbert (coordinadores de edicin), Pergamon Press, Oxford, 1984). As el propio egt tiene consideo , rables posibilidades de uso en estrategias de control de insectos de amplia base. Por ejemplo, en una cuarta realizacin preferida de esta invencin, especies cultivadas pueden ser genticamente modicadas o o e para producir constitutivamente la prote EGT, mediante una tcnica conocida. Los insectos que se na e alimentan con estos cultivos sern incapaces de completar el desarrollo hasta insectos adultos, proporcioa nando con ello una ecaz proteccin de cultivo a largo plazo. Anlogamente, las bacterias normalmente o a presentes en el interior de o sobre la planta o insecto pueden ser genticamente modicadas por tcnicas e e conocidas en este campo para producir el enzima EGT. Estas bacterias funcionarn anlogamente como a a ecaces agentes de control biolgico. o De forma similar, bacterias que colonizan las plantas y no son topatgenas pueden ser genticamente o e e modicadas para expresar el gen egt. Las plantas colonizadas por esas bacterias genticamente modicadas quedarn protegidas de las plagas de insectos susceptibles a la accin de la prote o prote a o na nas expresadas. Bacterias colonizadoras de las plantas, no topatgenas, estn descritas, por ejemplo, en la o a Patente de Estados Unidos 4.798.723 y modicaciones genticas de ciertas bacterias que colonizan las e plantas estn descritas en la Patente de Estados Unidos 4.771.131 y en la publicacin EPO n 0.185.005. a o Son conocidas en este campo otras bacterias que colonizan las plantas. Puede utilizarse cualquier medio conocido para introducir genes expresables tales como los citados antes y producir agentes de control de insectos. La ingestin de estos materiales vegetales genticamente modicados o de material vegetal colonizado o e por estas bacterias colonizadoras de las plantas genticamente modicadas por un insecto susceptible e dar lugar a una perturbacin del desarrollo normal de este insecto. Es sabido que ciertos insectos, por a o ejemplo los dos, tienen un tejido intestinal particularmente permeable. Los expertos conocen los pasos a de biolog molecular necesarios para construir tales genes expresables en las plantas y los pasos necesaa rios para incorporar genes de este tipo al genoma de la planta. cas durante su ciclo vital y Es probable que los propios insectos expresen un gen egt en fases espec que esto constituya un importante componente de los mecanismos que regulan el desarrollo. Por lo tanto, es posible que un gen egt de insecto pueda ser una meta adecuada para nuevas estrategias de control de insectos. La descripcin de esta invencin proporciona los medios para disear tales estrategias. o o n Como una realizacin adicional de esta invencin, pueden disearse anlogos ecdisteroides que se o o n a unen al enzima EGT pero que no pueden ser escindidos y liberados del enzima. Estos substratos suicidas se unirn competitivamente e inhibirn o bloquearn la accin del enzima EGT, interriendo a a a o por consiguiente con el desarrollo del insecto. Alternativamente, organismos recombinantes pueden ser genticamente modicados empleando las ensenzas aqu incluidas y, como es sabido en este campo, de e a o forma que sea impedida la expresin del gen egt del insecto durante la produccin, por ejemplo, de RNA o antisentido. En el sentido utilizado aqu un agente de control de insectos es una composicin o el ingrediente , o activo de una composicin que ejerce un efecto adverso sobre las plagas de insectos. La alimentacin de o o los insectos se reduce en respuesta al agente de control de insectos, la ecdisis normal del insecto es perturbada y se produce la muerte del insecto. Un agente de control de insectos de esta invencin puede ser o un virus de insectos genticamente modicado para inactivar un gen que codica un enzima modicador e ecdisteroide o un virus que es adems modicado para expresar un gen heterlogo que codica a una a o prote que afecta al desarrollo del insecto o puede ser una planta, un parsito de los insectos o una na a bacteria no topatgena, que han sido genticamente modicados para expresar un gen heterlogo que o e o codica a una prote que afecta a la ecdisis. na Las composiciones insecticidas adecuadas para aplicaciones a las plantas para controlar las plagas de insectos contienen un veh culo agr colamente adecuado y un agente de control de insectos. La aplicacin o 12

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de una composicin insecticida de esta invencin pueden proteger a la planta de las plagas de insectos o o por reduccin a la alimentacin y muerte de los insectos susceptibles. o o El experto en este campo sabe como elegir el agente de control de insectos, por ejemplo, un virus de insectos, que sea adecuado para el control de una plaga de insectos determinada. El experto en este campo debe entender que las plagas de insectos pueden ser expuestas al agente de control de insectos de esta invencin por mtodos convencionales que incluyen la ingestin, la inhalacin o e o o o el contacto directo del agente de control de insectos.
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Tambin se consideran como agentes de control de insectos las plantas y los microorganismos entoe mopatgenos que han sido genticamente alterados para expresar por lo menos una prote que afecte o e na al desarrollo del insecto. Ejemplos de tales prote nas son, pero sin limitarse exclusivamente a ellas, la hormona protoracicotrpica, la hormona de la eclosin, la esterasa de la hormona juvenil y la glucosil o o transferasa de la ecdipona. Los parsitos de los insectos, incluidos bacterias, virus, hongos y otros insectos, tambin pueden a e ser genticamente modicados para expresar egt. El parasitismo de insectos apropiados mediante estos e parsitos de insectos dar lugar a la perturbacin del desarrollo normal, adems de a la sintomatolog a a o a a normalmente asociada al parsito no modicado. La perturbacin del desarrollo de los insectos infectados a o exacerba el estado patlogico de insecto. La alimentacin y la infeccin de la plaga de insectos reducir o o o a la alimentacin y acelerar la muerte. o a Las secuencias de ADN que codican a una prote EGT que afecta al desarrollo del insecto desna critas aqu expresadas bajo el control regulador de un promotor apropiado para el organismo, pueden , ser utilizadas para modicar genticamente a un organismo y producir un agente de control de insectos. e Los organismos diana para la modicacin gentica incluyen parsitos de insectos, plantas y bacterias o e a colonizadoras de plantas no topatgenas. o e El gen egt, el producto gnico, los anticuerpos dirigidos contra este ultimo y todos los otros reactivos derivados de o conectados con los anteriores estn todos ellos dentro del ambito de esta invencin. La a o prote EGT puede ser sustancialmente puricada empleando el ensayo descrito aqu y las tcnicas desna e critas en este campo. Un uso fundamental de los baculovirus genticamente modicados de esta invencin ser como come o a ponentes de composiciones agr colas para aplicar a las plantas y producir el control biolgico de las plagas o de insectos de las plantas. Se conocen numerosas variaciones de la preparacin de estas composiciones o agr colamente adecuadas para el control de insectos. La concentracin del agente de control de insecto que ser necesaria para producir composiciones o a agr colas insecticidamente efectivas para la proteccin de las plantas dependern del tipo de organismo o a y de la mutacin utilizada y de la formulacin de la composicin. La concentracin insecticidamente o o o o efectiva del agente de control de insectos dentro de la composicin puede ser determinada fcilmente por o a v experimental, como saben los expertos en este campo. Por ejemplo, la concentracin insecticidamente a o efectiva de un virus pueden ser fcilmente determinada empleando variaciones de las tcnicas descritas a e en cualquiera de los Ejemplos 6 a 11. Las composiciones agr colas deben ser adecuadas para uso agr cola y para su dispersin en los camo pos. En general, los componentes de la composicin deben ser no totxicos y no perjudiciales para o o la integridad del virus ocluido. Las aplicaciones foliares no deben daar ni lesionar a las hojas de las n plantas. Adems de los veh a culos slidos apropiados, ms preferiblemente, l o a quidos, las composiciones agr colas pueden contener agentes pegajosos y adhesivos, agentes emulsionantes y mojantes pero ning n u componente que disuada al insecto de alimentarse o impida cualquier funcin v o rica. Tambin puede ser e conveniente agregar componentes que protejan al agente de control de insectos contra la inactivacin por o la luz ultravioleta. Los composiciones agr colas para controlar las plagas de insectos tambin pueden e contener agentes que estimulen la alimentacin del insecto. o Existen revisiones que describen los mtodos de aplicacin de agentes de control biolgico de insectos e o o y su aplicacin en agricultura. Vanse, por ejemplo, Couch e Ignoo (1981) en Microbial Control of Pests o e and Plant Disease 1970-1980, Burges (coordinador de edicin), Cap o tulo 34, pgs. 621-634; Corke y Risa hbeth, ibid, Cap tulo 39, pgs. 717-732; Brockwell (1980) en Methods for Evaluating Nitrogen Fixation, a Bergensen (coordinador de edicin), pgs 417-488; Burton (1982) en Biological Nitrogen Fixation Teo a 13

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chnology for Tropical Agriculture, Graham y Harris (coordinadores de edicin) pgs. 105-114 y Roughley o a (1982) ibid, pgs. 115-127; The Biology of Baculoviruses, Vol. II, supra. a Esta invencin es ilustrada mediante los siguientes ejemplos que no deben considerarse en modo alo guno como limitaciones impuestas sobre el mbito de la misma. Se sobrentiende que puede recurrirse a a otras diversas realizaciones, modicaciones y equivalentes de esta invencin que, despus de la lectura de o e la presente descripcin, pueden resultar evidentes a los expertos en este campo, sin apartarse del esp o ritu de esta invencin y/o del ambito de las reivindicaciones del apndice. o e Ejemplo 1 a La posicin del gen egt en el genoma de AcMNPV est ilustrada en la Figura 1. Encima del mapa o del genoma de AcMNPV se encuentra una escala en unidades de mapa. Para determinar la secuencia de nucletidos de este gen y de las regiones que lo anquean y para permitir la subsiguiente manipulacin o o del gen, es necesario en primer lugar clonar en vectores plasm dicos varios fragmentos de ADN que comprenden esta regin (vase T. Maniatis et al. (1982) en Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold o e Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, donde se describen procedimientos de clonacin o estandarizados). La Parte A muestra un mapa lineal del genoma de AcMNPV despus de la escisin con e o las endonucleasas de restriccin EcoRI y HindIII. La Parte B es una ampliacin del genoma desde 7,6 o o hasta 11,1 unidades de mapa que muestra la posicin del gen egt. La cepa de AcMNPV original utilizada o es la cepa L1 (Lee y Miller (1978), J. Virol. 27:754). Los fragmentos de ADN clonados y los nombres de los plsmidos resultantes estn mostrados en la Figura 1, Parte C. El fragmento 1, que se extiende a a desde el sitio PstI a 7,6 hasta un sitio BamHI a 11,1 , es clonado en el vector plasm dico pUC19; los fragmentos 2 y 3 (desde PstI (7,6 ) hasta EcoRI (8,65 ) y desde EcoRI (8,65 ) hasta SalI (10,5 ), respectivamente) son ambos clonados en los vectores Bluescript M13+ y Bluescript M13 (Stratagene, San Diego, California). El fragmento 5 (BstEII (8,35 ) a BstEII (8,7 )) es clonado en el Bluescript M13+ . Despus se genera un gran n mero de subclones de los plsmidos BCPsE y BCES (Heniko (1984), e u a a o rica Gene 28:351). Estos subclones contienen deleciones progresivamente ms largas de la insercin v de manera que contienen diferentes cantidades de ADN v rico que oscilan entre menos de 50 pares de bases hasta el fragmento v rico completo. Muchos de los subclones y el plsmido BCB son despus sea e cuenciados (Sanger et al. (1977), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463) de manera que todo el gen o e egt es secuenciado en ambas direcciones. Las secuencias de nucletidos obtenidas son despus analizadas por ordenador, utilizando los programas de Pustell y Kefatos para determinar la presencia de fases de lectura abiertas que pueden codicar prote nas (1984), Nucl. Acids Res. 12:643 -655 y Devereaux et al. a na (1984), Nucl. Acids Res. 12:387-396. Este anlisis indica que el gen egt codica una prote de 506 a aminocidos. La secuencia nucleot a dica del gen egt y la secuencia de aminocidos predicha del producto a del gen egt estn presentadas en la Tabla I. Ejemplo 2 Para construir virus recombinantes incapaces de expresar un gen egt funcional se requiere una manipulacin adicional de los clones plasm o dicos descritos en el Ejemplo 1. El plsmido pUCBCPsB se escinde a con las endonucleasas de restriccin EcoRI y XbaI (vase la Figura 3 para los sitios dentro del gen egt) o e y se desprecia el fragmento peque o. Despus el gen lacZ de Escherichia coli, cortado del pSKS104 n e e (Casadaban et al. (1983), Methods Enzymol. 100:293-303) con EcoRI y AhaIII, se inserta despus entre los sitios EcoRI y XbaI despus de que los extremos protuberantes XbaI han sido rellenados empleando e polimerasa de ADN de T4. El plsmido resultante es denominado pEGTZ. En este plsmido, el gen a a lacZ insertado se encuentra en la misma fase que las secuencias codicantes de egt precedentes. Alternativamente, el plsmido pEGTDEL es construido simplemente ligando los sitios EcoRI y XbaI entre s a (despus de que los extremos de ambos sitios se han hecho romos) sin insertar ninguna secuencia entre e ellos. Todos los virus tienen su origen en AcMNPV L-1 (Lee y Miller (1978), supra) y son puricados en placa y propagados en la l nea de clulas de Spodoptera frugiperda IPLB-SF-21 (clulas SF) (Vaughn et e e e al. (1977) In Vitro 13 : 213-217) empleando mtodos descritos previamente (Lee y Miller (1978); Miller et al. (1986), Genetic Engineering, Principles and Methods, Vol. 8 (coordinadores de edicin J. Setlow y o A. Hollaender), Plenum Press, N.Y., pgs. 277-298, 1986). a El plsmido pEGTZ es despus contrasfectado con ADN de AcMNPV wt en clulas SF como han desa e e 14

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crito Miller et al. (1986) supra. Este procedimiento permite que tenga lugar la recombinacin homloga o o rico por la ente secuencias de los ADN v rico y plasm dico, dando lugar a la sustitucin del gen egt v o a fusin gnica egt-lacZ. Debido a que la secuencia codicante residual de egt est en la misma fase que o e a na o las secuencias de lacZ, este virus recombinante producir una prote de fusin que comprende los 84 primeros aminocidos de egt unidos a la -galactosidasa. El virus recombinante, denominado vEGTZ, a puede ser identicado porque la expresin de -galactosidasa da lugar a placas v o ricas azules en presencia de un indicador cromognico tal como 5-bromo-4 -cloro-2-indolil--D-galactopiransido (X-gal). En la e o Figura 3, Parte B, se presenta un diagrama del gen egt de vEGTZ. El virus recombinante vEGTDEL se obtiene por contransfeccin del plsmido pEGTDEL y ADN del o a virus vEGTZ en clulas SF. La recombinacin homloga da lugar a la sustitucin del gen de fusin egt-lacZ e o o o o en vEGTZ por el gen egt delecionado de pEGTDEL. El virus recombinante vEGTDEL es identicado porque no puede formar placas azules en presencia de X-gal. La estructura del gen egt de vEGTDEL est mostrada en la Figura 3, Parte C. a Ejemplo 3 nas sintetizadas por el AcMNPV wt El producto del gen egt es identicado comparando las prote (que produce EGT) con las producidas por vEGTZ o vEGTDEL (que no pueden producir EGT). Las clulas SF son infectadas con AcMNPV wt o con vEGTZ con una multiplicidad de infeccin (MDI) de e o e e 20 como han descrito OReilly y Miller (1990), J. Virol. 64:1321-1328. Las clulas no infectadas tambin son analizadas. Despus de 6 horas de infeccin, las clulas se incuban durante 1 hora en presencia de e o e nas fabricadas la [35 S]-metionina radiactivamente marcada para marcar radiactivamente todas las prote durante ese periodo. Despus las clulas se lisan y las prote e e nas se separan por electroforesis en gel de e poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE) (Laemmli et al. (1970) Nature 227:680-685). Tambin se recogen y analizan todas las prote nas secretadas por las clulas. Despus de la SDS-PAGE, las prote e e nas radiomarcadas se detectan por autorradiograf Las clulas infectadas con AcMNPV wt secretan una prote a. e na de 60 kDa pero no las clulas infectadas con vEGTZ ni las clulas no infectadas. Esta prote de 60 e e na kDa no puede ser detectada en los lisados de clulas infectadas con AcMNPV wt, lo que demustra que es e na secretada por la clula. Estos datos demuestran que el producto del gen egt es una prote secretada de e 60 kDa, cuyas propiedades concuerdan bien con los datos de las secuencias de nucletidos y aminocidos. o a Ejemplo 4
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La actividad enzimtica de la prote EGT es identicada comparando las clulas SF infectadas con a na e AcMNPV wt con las infectadas con vEGTZ. Las clulas SF infectadas con AcMNPV wt o con vEGTZ e estn descritas en el Ejemplo 3. Doce horas despus de la infeccin, las clulas y el medio extracelular a e o e se recogen y procesan por separado. Se tratan en paralelo clulas no infectadas. Los lisados celulares e o los medios extracelulares se incuban en presencia de UDP-glucosa 1 mM y 0,25 Ci de [3 H]ecdisona como han descrito OReilly y Miller (1989), Science 245:1110-1112. La actividad EDP-glucosil transferasa ecdisteroide en los lisados celulares o en los medios catalizar la transferencia de glucosa desde la UDP a -glucosa a la ecdisona para formar un conjugado de ecdisona -glucosa. La ecdisona y el conjugado de ecdisona-glucosa se separan uno de otro por cromatograf en capa na de gel de s a lice (Bansal y Gessner a. (1988), Anal. Biochem. 109:321) y se visualizan por autorradiograf Los conjugados de ecdisona glucosa (G) se forman solamente cuando se ensayan el lisado o el medio extracelular de clulas infectadas e con AcMNPV wt. No se observa ningn conjugado cuando se utilizan lisados o medios de clulas no u e infectadas o infectadas con vEGTZ, demostrando que la actividad es debida a la expresin de egt. la o mayor parte de la actividad esta localizada en el medio extracelular, en concordancia con los datos discutidos en el Ejemplo 3. La prueba de que la glucosa est conjugada a la ecdisona se obtiene analizando a los lisados infectados con wt como se ha descrito antes, a excepcin de que la UDP-glucosa se sustituye o por la UDP-[U-14C]glucosa radiomarcada. Las reacciones efectuadas con UDP-glucosa no marcada o con UDP -[U-14C]glucosa marcada, en presencia en ambos casos de [3 H]ecdisona, y el recuento por centelleo del conjugado indican que pueden detectarse el 3 H de la ecdisona y el 14 C de la glucosa. Estos datos prueban que el producto del gen egt es una UDP-glucosil transferasa que cataliza la transferencia de glucosa desde a UDP-glucosa a la ecdisona. Despus se realizaron experimentos para investigar ms a fondo la especicidad de substrato del EGT. e a En estos experimentos, se incuban varios sustratos (1 mM) en presencia de medio extracelular de clulas e infectadas con AcMNPV wt que contiene una actividad EGT signicativa. Como controles para garantizar que cualquier conjugacin observada es debida a EGT, cada sustrato es tambin incubado con medios o e procedentes de clulas no infectadas e infectadas con vEGTZ, que no pueden producir EGT. Se aaden e n 15

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a cada reaccin 0,05 Ci de UDP-[U-14C]glucosa. Cualquier compuesto que funcione como sustrato para o EGT ser conjugado con glucosa; pueden ser detectados porque la glucosa est radiactivamente marcada. a a Tabla III
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Especicidad de sustrato de EGT Pseudo (pmoles de glucosa transferidos) Tipo salvaje (pmoles de glucosa transferidos)

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Sustrato

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Acido p-aminobenzoico Bilirrubina Cloranfenicol Dietilestibestrol Ecdisona -Estradiol 20-Hidroxiecdisona Hidoxiquinolina Maquisterona A (-)Mentol Metilumbeliferol -Naftol p-Nitrofenil Fenolftaleina Testosterona -Tetralol

155,7 87,8 89,

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Los sustratos se incuban en presencia del medio derivado de clulas apropiadamente infectadas y e e 0,05 Ci de UDP-(U-14 C]glucosa. Las cantidades de glucosa transferidas se calculan despus del recuento por centelleo de las regiones apropiadas de las placas cromatogrcas. a o Otro control es la adicin de acido UDP-[U-14 C]glucurnico a una serie distinta de reacciones con o medio procedente de clulas infectadas con wt para demostrar que el cido glucurnico no es trasferido e a o por esta reaccin. Los datos obtenidos se encuentran en la Tabla III. Los unicos sustratos identicados o son ecdisona, 20-hidroxiecdisona y maquisterona A, todas las cuales son ecdisteroides. No se observa conjugacin empleando un medio de clulas pseudoinfectadas o infectadas con vEGTZ, conrmando que o e o a la actividad observada es debida a la expresin de egt. No se ebserva conjugacin cuando se emplea cido o o o UDP-[U-14C]glucurnico, demostrando que la EGT no transere acido glucurnico. Ejemplo 5 Para demostrar que otros baculovirus tambin contienen genes con homolog sustancial con el gen e a sla egt de AcMNPV, se a ADN de OpMNPV y se digiere por separado con las endonucleasas de restriccin EcoRI, BamHI y HindIII. Estos enzimas escinden el ADN v o rico en varios fragmentos de diferentes tama os cuyas posiciones en el genoma de OpMNPV ya son conocidas (Leisy et al. (1984), J. Virol. n 52:699). Se realizaron hibridaciones Southern como han descrito T. Maniatis et al. (1982) supra. Se a corta un fragmento interno del gen egt de AcMNPV de los plsmidos BCES con los enzimas EcoRI y XbaI (vase la Figura 1). Este fragmento se marca radiactivamente con 32 P y se utiliza como sonda e para identicar cualesquiera secuencias relacionadas en el genoma de OpMNPV. En condiciones apropiadas, como es conocido en este campo, un fragmento de ADN se unir a otro fragmento de ADN que a contenga secuencias similares o idnticas a la suya. as la sonda de egt de AcMNPV debe unirse sobre e , la membrana de nailon a cualesquiera fragmentos de ADN de OpMNPV que contengan secuencias de ADN relacionadas. La posicin de la sonda unida puede ser visualizada por exposicin de la membrana o o a una pel cula de rayos X. La sonda de egt se hibrida primero con la membrana de nailon bajo condiciones poco estrictas (cloruro sdico 1 M, citrato sdico 0,3 M, sulfato de dextrano al 5%, 5 x solucin o o o 16

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de Denhardt y SDS al 0,25%, a 37 C). Esto permite que la sonda se hibride a secuencias relativamente poco relacionadas. La estringencia de la hibridacin es despus aumentada por incrementos, elevando la o e temperatura de hibridacin o agregando formamida a la solucin de hibridacin hasta que se observan o o o bandas especicamente hibridantes. Las condiciones de hibridacin para la Figura 4 son: cloruro sdico o o 1 M, citrato sdico 0,3 M, sulfato de dextrano al 5%, 5 x solucin de Denhardt y SDS al 0,25% a 68 C, o o durante 15 horas. Despus la membrana se lava dos veces durante 15 minutos cada vez con cloruro sdico e o 0,3 M, citrato sdico 0,1 M, SDS al 0,1%, a 68 C. La Figura 4 muestra que la sonda de egt de AcMNPV o se une a fragmentos espec cos de ADN de OpMNPV, a saber, el fragmento B EcoRI, el fragmento A BamHI y los fragmentos N y S HindIII. Obsrvese que el gen egt de OpMNPV se encuentra en la misma e posicin relativa en el genoma que el gen de AcMNPV (Figura 5). Pueden aplicarse protocolos similares o o para la identicacin de genes homlogos de egt en otros entomopatgenos. Se sobrentiende que para o o secuencias altamente divergentes, ser necesario conrmar la actividad de EGT empleando el mtodo de a e ensayo descrito en el Ejemplo 4. Despus se requerir un anlisis gentico molecular del genoma para e a a e aislar el gen que codica el enzima EGT empleando metodolog conocida en este campo. a Alternativamente, el gen de EGT tambin puede encontrarse en otros organismos empleando el ensayo e espec co para la actividad UDP-glucosil transferasa ecdisteroide, descrito en el Ejemplo 4. Este ensayo se utiliza para identicar el enzima durante la puricacin por tcnicas bioqu o e micas convencionales. Una vez puricado, se determina la secuencia parcial de aminocidos de la prote EGT. Esta informacin a na o se utiliza para generar una sonda oligonucleot dica que despus se emplea para localizar el gen egt en el e genoma. Ejemplo 6
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Los t tulos hemolinfticos de los ecdisteroides uct an en forma c a u clica para regular las mudas larval -larval y larval-pupal y como se sospecha que la conjugacin de glucasa inactiva a los ecdisteroides o (Warren et al. (1986), J. Liq. Chromatogr. 9:1759; Thompson et al. (1987), Arch. Insect Biochem. Physiol. 4:1; Thompson et al. (1988), Arch. Insect Biochem. Physiol. 7:157), es probable que la o expresin de egt durante la infeccin con AcMNPV perturbe los procesos normales de desarrollo del o insecto infectado. Para demostrar esta perturbacin, unas larvas de S. frugiperda de la cuarta fase, que o acaban de experimentar la ecdisis, se infectan por inyeccin de AcMNPV wt o con vEGTZ y se vigilan o diariamente para observar cualquier perturbacin en su desarrollo. Se inyecta una cohorte de larvas, o empleando como control negarivo un l quido de cultivo de tejidos. Los resultados de este experimento estn presentados en la siguiente Tabla IV. Todas las larvas inyectadas con l a quido de cultivo de tejidos (pseudoinfectadas) mudan a la quinta fase como se esperaba. Solamente una de las 16 larvas infectadas con el virus wt realiza esta transicin. Por el contrario, todas las larvas infectadas con el vEGTZ mutante o experimentan una muda de la cuarta a la quinta fase. Por lo tanto, la expresin de egt por el AcMNPV o wt inhibe clara y espec camente la muda del husped. Ambos grupos de larvas infectadas sucumben e posteriormente a la infeccin v o rica, demostrando que la perturbacin del egt no impide que el vEGTZ o mate a su insecto husped. e Tabla IV Inhibicin de la muda por infeccin con AcMNPV o o

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Virus

Muda

Mortalidad

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Pseudoinfectados Tipo salvaje vEGTZ

16 1 16

0 16 16

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Se infectan larvas de S. frugiperda de la cuarta fase con 1 x 105 ufp de AcMNPV wt o de vEGTZ en 5 l. Las larvas pseudoinfectadas se inyectan con 5 l de l quido de cultivo de tejidos. Cada cohorte incluye 16 larvas que se mantienen con una dieta artical (R. L. Burton (1969), publicacin o ARS, pgs. 33-134), a 28C con un ciclo de luz/oscuridad de 14/10 horas. Las larvas se vigilan a diariamente para observar la ecdisis y la mortalidad se registra al sptimo d e a. Se obtienen resultados similares con larvas inyectadas al principio de la quinta fase. Empleando larvas de la quinta fase que acaban de experimentar la ecdisis, ninguna larva infectada con wt muestra ningn u 17

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s ntoma de formacin de pupa, mientras que la mayor de las larvas infectadas con vEGTZ presentan o a varias modicaciones del comportamiento (cese de la alimentacin, vagabundeo y descripcin de c o o rculos) caracter sticas de una muda larval-pupal inminente. Sin embargo, todas las larvas infectadas con virus murieron antes de la pupacin. Estos datos demuestran que la infeccin con AcMNPV impide que las o o larvas del insecto muden o formen pupa. Adems, los datos demuestran que esta perturbacin del desaa o rrollo del insecto es debida a la expresin del egt. o Ejemplo 7
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o Bioensayos in vivo de AcMNPV de tipo salvaje (wt) y vEGTZ revelan que la expresin del gen egt prolonga el tiempo que pasan las larvas infectadas alimentndose y que la perturbacin del egt mejora a o las caracter sticas del virus como plaguicida. En estos estudios, se inyectan al inicio de la cuarta fase AcMNPV wt o vEGTZ en larvas de S. frugiperda. Como comparacin, las larvas de control se inyectan con o un medio de cultivo de tejidos que no contienen virus. Diariamente se comprueba el aumento de peso, los s ntomas de muda o pupacin y la mortalidad de las larvas. Los aumentos diarios medios de peso de los o diferentes grupos de larvas, junto con el porcentaje de moralidad, estn representados en las Figuras 6 y a 7, respectivamente. Las larvas de control muestran un crecimiento moderado durante los 2 primeros d as. Durante el segundo d todas ellas mudan a la quinta fase. Despus crecen espectacularmente durante a, e 2 d ms antes de dejar de alimentarse en preparacin para la formacin de pupa. Solamente muda as a o o una de las 16 larvas infectadas con AcMNPV wt y, en lugar de ello, las larvas presentan un crecimiento continuo durante 3 d despus de la infeccin. En este momento, comienzan a enfermar pero ninguna as e o larva muere hasta el quinto d Todas las larvas infectadas con AcMNPV wt estn muertas al sexto d a. a a. Por el contrario, todas las larvas infectadas con vEGTZ experimentan una muda de la cuarta o la quinta fase y, durante este periodo, dejan de alimentarse. Esto explica la falta de crecimiento desde el d uno a hasta el d dos. Despus de la muda, reanudan la alimentacin pero comienzan a presentar s a e o ntomas de enfermedad el d 3. Comienzan a morir cuatro d despus de la infeccin y todas estan muertas a as e o al quinto d Las larvas infectadas con un derivado de AcMNPV que carece de un gen egt funcional a. presentan alimentacin reducida y mueren ms rpidamente despus de la infeccin que las infectadas o a a e o con AcMNPV de tipo salvaje. Estos fenmenos se observan todav ms claramente despus de la infeccin de larvas de la quinta o a a e o fase (Figuras 8 y 9). Como se esperaba, las larvas de control presentan un crecimiento considerable durante dos d antes de que dejen de alimentarse en preparacin para la pupacin. Este cese de la as o o alimentacin va acompa ado de una espectacular prdida de peso. Las larvas infectadas con AcMNPV o n e wt no presentan s ntomas de dicho cese de la alimentacin; continan alimentandose y aumentando de o u peso durante dos d ms antes de que comiencen a enfermar. La mortalidad no es total hasta el sptimo as a e d despus de la infeccin. a e o En resumen, puede observarse que las larvas infectadas con vEGTZ, como los controles, se alimentan solamente durante los dos primeros d despus de la infeccin. A partir de este punto, se produce una as e o espectacular prdida de peso mientras se preparan para la pupacin. Sin embargo, ninguna de estas larvas e o forman pupa; presentan s ntomas de enfermedada los tres d y todas estn muertas 6 d despus de as a as e la infeccin. De nuevo, la infeccin con vEGTZ produce una reduccin de la alimentacin y la muerte o o o o ms temprana. a Ejemplo 8 Se han comparado los efectos de la infeccin con vEGTZ y con AcMNPV wt sobre larvas de S. fruo giperda de primera fase, recin salidas del huevo. Las larvas neonatas de S. frugiperda se alimentan con e una dieta que contiene diversas concentraciones de cuerpos de inclusin polihdricos (PITs) y vEGTZ o o e de AcMNPV wt y se vigila diariamente su mortalidad. Los resultados obtenidos con dos dosis distintas se encuentran en las Figuras 10 y 11. Puede observarse que, para ambas dosis, las larvas infectadas con vEGTZ presentan una mortalidad considerable, sustancialmente ms pronto que las larvas infectadas con a el virus wt. En general, las larvas infectadas con el virus recombinante mueren 3 y 4 d antes que las as larvas infectadas con wt. Este resultado proporciona soporte adicional a la teor de que los baculovirus a o que contienen genes egt inactivados funcionan mejor como plaguicidas biolgicos que los baculovirus wt con genes egt intactos. Ejemplo 9

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Para construir virus recombinantes que expresan la hormona protoracicotrpica (PTTH), el gen de o PTTH se clona en el plsmido translocador pEVmodXIV, que es un plsmido descrito en la Solicitud a a 18

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de Patente de Estados Unidos n 07/353-847, presentada el 17 de mayo de 1989 e incorporada aqu por referencia. Este plsmido contiene secuencias antes y despus del gen de la polihedrina de AcMNPV que a e median la recombinacin homloga del gen de la PTTH expresable en el virus Egt . Se coloca un sitio o o de clonacin m ltiple en el sitio habitual de iniciacin de la traduccin de la polihedrina, despus del o u o o e promotor de la polihedrina modicado con LSXIV (Rankin et al., Gene 70:39 (1988)). El gen de la PTTH de Bombyx mori es cortado del plsmido pBc22k-C19 (Kawakami et al., Science 247:19333 (1990), por a digestin con el enzima de restriccin HindIII. Los extremos cohesivos HindIII se rellenan con polimerasa o o de ADN de T4 y despus el plsmido se escinde con EcoRI. El pEVmodXIV se escinde con KpnI, el e a extremo protuberante KpnI se separa con polimerasa de ADN de T4 y despus el plsmido se escinde con e a EcoRI. El fragmento que contiene el gen de la PTTH se clona el plsmido translocador mediante estos a sitios. En el plsmido resultante, pEVPTTH, el gen de la PTTH est situado inmediatamente despus a a e del promotor de la polihedrina modicado con LSXIV. Los virus recombinantes que expresan PTTH se obtienen por contransfeccin de pEVPTTH en clulas o e SF con ADN de vEGTDEL o AcMNPV wt. La recombinacin entre las secuencias anqueantes de la o polihedrina en el ADN v rico y las anqueantes del gen de la PTTH en el pEVPTTH da lugar a la sustitucin del gen de la polihedrina por el gen de la PTTH. Los virus en los que ha tenido lugar este o acontecimiento de recombinacin son identicados por su fenotipo de ausencia de cuerpos de oclusin o o (Miller et al., en Genetic Engineering, Principles and Methods, Vol. 8, J. Setlow y A. Hollander, coordinadores de edicin, Plenum Press, N.Y., 1986, pgs. 277-298). Los respectivos virus recombinantes son o a denominados vEGT PTTH y vWTPTTH. El mtodo para producir virus recombinantes que expresan la esterasa de la hormona juvenil es simie lar. En primer lugar, se corta el gen de la esterasa de la hormona juvenil de Heliothis virescens (Hanzlik a et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:12.419) del plsmido pJHE16B (Hammock et al. (1990) Nature 344:458) por digestin con EcoRI y KpnI. El plsmido translocado pEVmodXIV es tambin escindido con EcoRI y o a e KpnI y entre estos sitios se inserta el fragmento que contiene el gen de la esterasa de la hormona juvenil. Por lo tanto, pEVJHE contiene las secuencias del gen de la polihedrina que anquean al gen de la esterasa o de la hormona juvenil. Los virus recombinantes vEGT JHE y vWTJHE se obtienen por cotransfeccin de pEVJHE con ADN de vEGTZ o de AcMNPV wt, respectivamente, y probando y seleccionando las placas sin oclusin. o Para construir virus recombinantes se expresan la hormona de la eclosin, se corta el gen de la horo mona de la eclosin de Manduca sexta del plsmido pF5-3 (Horodyski et al. (1989), Proc. Natl. Acad. o a o a Sci. USA, 86:8123) por digestin con EcoRI y HpaI. El plsmido pEVmodXIV se escinde con KpnI, el extremo protuberante KpnI se separa con polimerasa de ADN de T4 y despus se escinde con EcoRI. La e intersecin del fragmento que contiene el gen de la hormona de la eclosin en el plsmido translocado o o a produce el pEVEH recombinante, en el que el gen de la hormona de la eclosin est situado despus o a e del promotor de la polihedrina modicado con LSXIV. La contrasfeccin de este plsmido con ADN o a de vEGTZ y de vDA26Z permite el aislamiento de los virus recombinantes vEGT EH y vDA26ZEH, respectivamente. vDA26Z es un virus recombinante con el gen lacZ de E. coli insertando en el gen DA26 (OReilly et al., J. Gen. Virol., en prensa). No es conocida la funcin del gen DA26 y vDA26Z es un o tipo fenot picamente salvaje con respecto a la ecdisis. Debido a la presencia del gen lacZ, los derivados de vDA26Z dan lugar a placas azules en presencia de X-gal. Ejemplo 10 Para determinar los efectos in vivo de estos virus recombinantes, se inyectaron 2 x 105 ufp de vEGTDEL, vEGT PTTH, vWTPTTH o ambos vEGT PTTH y vEGTJHE juntos (1 x 105 ufp cada uno) en larvas de S. frugiperda al nal de la tercera fase o al principio de la cuarta fase. El porcentaje diario de moralidad esta presentado en la Tabla V. Para todos los virus EGT , los insectos infectados atraviesan la cuarta fase y presentan deslizamiento de la cpsula de la cabeza, que indica una muda a o o inminente, el d tres. Despus de la infeccin con vEGT PTTH slo o por infeccin con vEGT PTTH a e o o a y vEGTJHE juntos, la expresin de PTTH hace que los insectos infectados enfermen rpidamente y se observa una mortalidad signicativa al cuarto d Por el contrario, los insectos infectados con vEGTDEL a. no presenten una mortalidad considerable hasta el quinto d Como se esperaba, los insectos infectados a. con vWTPTTH nunca presentan signos de muda a la quinta fase. No se observa ningn delizamiento de u la cpsula de la cabeza y los insectos no presentan una mortalidad conseiderable hasta el sexto d La a a. expresin de PTTH en ausencia de EGT, por lo tanto, adelanta en un d la fecha de la muerte despus o a e de la infeccin, en comparacin con el vEGTDEL. Estos datos muestran la mejora de las propiedades o o plaguicidas de los baculovirus por expresin de genes que afectan a la ecdisis del insecto y demuestran o que el egt debe ser inactivado para que estas estrategias sean ecaces. 19

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Tabla V Mortalidad, %
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Virus

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D 4 a

D 5 a

D 6 a

D 7 a

D 8 a

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vEGTDEL vWTPTTH vEGT PTTH vEGT PTTH y vEGT JHE Ejemplo 11

4,5 0 4,2 8,7

4,5 0 62,5 60,9

68,2 13,0 87,5 91,3

90,9 39,1 100,0 95,7

90,9 78,3

95,5 95,7

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La generacin de virus que forman cuerpos de oclusin que expresan prote o o nas heterlogas que afectan o al desarrollo de los insectos puede ser conseguida mediante el siguiente esquema. En primer lugar, se o construye un virus EGT sin oclusin que expresa -galactosidasa, como sigue. El gen lacZ de E. coli, que codica al enzima -galactosidasa, se clona en el vector translocado pSynVI descrito en la Solicitud a de Patente de Estados Unidos n 07/353.847, presentada el 17 de mayo de 1989. El plsmido pSynVI incluye secuencias antes y despus del gen de la polihedrina de AcMNPV, con un sitio de clonacin e o m ltiple situado inmediatamente despus de un promotor sinttico de la polihedrina modicado. El gen u e e a o lacZ se corta el plsmido pSKS105 (Casadaban et al. (1983)supra) por escisin con PstI. El extremo protuberante PstI se separa con nucleasa de jud mungo y el plsmido se escinde con SstII. El plsmido a a a a pSYnVI se escinde con EcoRV y SstII y el gen lacZ se clona en estos sitios. El plsmido resultando e se denomina pSynVI gal y contiene el gen lacZ inmediatamente despus del promotor de la polihedrina e modicado sinttico. El plsmido pSynVI gal se contransfecta en clulas SF con ADN de vEGTDEL y e a se a slan las placas sin oclusin que expresan -galactosidasa, dando el virus vEGT SynVI gal. o Para construir un virus recombinante con oclusin que expresa PTTH, el gen de la PTTH se clona o en el vector de translocacin pSpXIVVI+ X3. o a Para construir pSpXIVVI+ X3, se construye en primer lugar un plsmido intermedio, pSpXIVVI+ . El plsmido pSpLSXIVVI+ CAT (descrito en la Solicitud de Patente de Estados Unidos n 07/353.847, a presentada el 17 de mayo de 1989) se corta con BglII y los estremos se rellenan con polimerasa de ADN. El plsmido pSynVI+ wtp (descrito en la Solicitud de Patente de Estados Unidos n 07/353.847, presentada a el 17 de mayo de 1989) se corta con EcoRV y SacI y se purica el fragmento pequeo EcoRV-SacI. Se n a ligan los fragmentos de los dos plsmidos y se selecciona pSpXIVVI+ . El plsmido pSpXIVVI+ es igual a o o u al pSPLSXIVVI+ CAT a excepcin de que el sitio de clonacin m ltiple que se extiende desde el sitio o u BglII hasta el sitio SacI es el mismo que el de pSynVI+ wtp. Para construir el sitio de clonacin mltiple #3 (descrito en la Solicitud de Patente de Estados Unidos n 07/353.847, presentada el 17 de mayo de 1989), se inserta un policonector entre los sitios EcoRI-SacI de pSpXIVVI+ . La secuencia del sitio de multiclonacin en pSPXIVVI+ X3 desde el sitio BglII fusionado hasta el sitio SacI es: o AGATCATC EcoRV/Bgl GAATTCTCGAG EcoRI-XhoI CTGCAGATCT PstI-BglI CTCGACCCGGG SalI-SmaI AATAAA poli A GAGCTC SacI

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Este plsmido incluye un gen intacto de la polihedrina bajo el control de un promotor de la polihea drina de tipo salvaje. Antes del gen de la polihedrina, y en la orientacin opuesta al mismo, est situado o a un promotor sinttico de la polihedrina modicado. Un sitio de clonacin m ltiple est situado para e o u a permitir la insercin de genes que han de ser expresados bajo el control del promotor de la polihedrina o modicado sinttico. El gen de la PTTH se corta del plsmido pBc22k-C19 (Kawakami et al. (1990) e a supra) por digestin con HindIII. El extremo protuberante HindIII se rellena con polimerasa de ADN de o T4 y el plsmido se escinde con EcoRI. El plsmido pSpXIVVI+ X3 se escinde con EcoRI y SmaI y el a a gen de la PTTH se clona en estos sitios, formndose el plsmido pSpPTTH. En este plsmido, el gen de a a a la PTTH est despus del promotor de la polihedrina modicado sinttico, que esta situado adyacente a e e al promotor de la polihedrina de tipo salvaje y las secuencias codicantes, y en la orientacin opuesta. o Ambos genes, de la PTTH y de la polihedrina, estn anqueados por secuencias anteriores y posteriores a 20

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al gen de la polihedrina en AcMNPV. El plsmido pSpPTTH es cotransfectado en clulas SF con ADN de vEGTSynVI gal. La recoma e binacin entre las secuencias anterior y posterior a la polihedrina en el ADN v o rico y las que anquean a los genes de la PTTH y de la polihedrina en pSpPTTH da lugar a la sustitucin del gen lacZ de o vEGTSynVI gal por los genes de la PTTH y de la polihedrina de pSpPTTH. El virus recombinante o vEGTSpPTTH es identicado por un fenotipo de presencia de oclusin y ausencia de -galactosidasa. Para construir un virus con oclusin que expresa la esterasa de la hormona juvenil, se corta el gen o de la esterasa de la hormona juvenil del plsmido pJHE16B (Hammock et al. (1990) supra) por dia gestin con KpnI, eliminacin del extremo protuberante con polimerasa de ADN de T4 y digestin con o o o EcoRI. El gen de la esterasa de la hormona juvenil es despus clonado en el plsmido pSpXIVVI+ X3 que e a ha sido escindido con EcoRI y SmaI. El plsmido resultante, pSpJHE, es contrasfectado con ADN de a o vEGTSynVI gal para generar el virus recombinante vEGTSpJHE. Este virus con oclusin expresa la esterasa de la hormona juvenil bajo el control del promotor de la polihedrina modicado sinttico. e Anlogamente, el gen de la hormona de la eclosin se corta del plsmido pF5-3 (Horodyski et al. a o a (1990) supra) por digestin con EcoRI y HpaI y se clona en pSpXIVVI+ X3 que ha sido escindido con o EcoRI y SmaI. El plsmido resultante, pSpEH, es cotransfectado con ADN de vEGTSynVI gal para a generar el virus recombinante vEGT SpEH. a e na Los virus con oclusin, EGT , que son adems genticamente modicados para expresar una prote o que afecta a la ecdisis (una hormona pept dica de insectos o un enzima que inactiva a las hormonas de los insectos) reducirn la alimentacin y producirn muerte ms rpida de las larvas de insectos infectadas a o a a a por los baculovirus wt o los baculovirus genticamente alterados para inactivar el gen egt. e Debido a que los agentes de control de insectos del Ejemplo 11 estn ocluidos, estos virus pueden a ser incorporados a composiciones insecticidamente efectivas y agr colamente aceptables que pueden ser aplicadas a cultivos infectados. La ingestin de estas part o culas v ricas ocluidas da lugar a la propagacin o de esos virus en el campo y la diseminacin del agente de control de insectos. la infeccin causar la o o a muerte de los insectos y, por lo tanto, proteger a los cultivos contra las plagas de insectos. a Debe entenderse que los anterior se reere solamente a realizaciones espec cas preferidas de esta invencin y que pueden introducirse numerosas modicaciones y alteraciones sin apartarse del esp o ritu y a mbito de la invencin tal como se establece en las reivindicaciones adjuntas. o

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REIVINDICACIONES 1. Un agente para el control de insectos que comprende un parsito de los insectos en el que se ha a inactivado un gen natural que codica a un enzima modicador de los ecdisteroides.
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2. Un agente para el control de insectos de la Reivindicacin 1, donde el citado gen es un gen egt. o 3. Un agente para el control de insectos de la Reivindicacin 2, donde el citado parsito de los insectos o a es un virus de insectos.

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4. El agente para el control de insectos de la Reivindicacin 3, donde el citado virus de insectos es un o baculovirus. 5. El agente para el control de insectos de la Reivindicacin 4, donde el citado baculovirus es un virus o de la polihedrosis nuclear. 6. El agente para el control de insectos de la Reivindicacin 5, donde el citado virus de la polihedroo sis nuclear est seleccionado entre el grupo formado por el virus de la polihedrosis nuclear Autographa a californica y el virus de la polihedrosis nuclear Orgyia pseudotsugata.

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7. El agente par el control de insectos de la Reivindicacin 6, donde el citado virus de insectos contiene o un gen inactivado que codica a la UDP-glucosil transferasa ecdisteroide es uno de los virus vEGTZ o vEGTDEL. 8. El agente para el control de insectos de la Reivindicacin 3, donde el citado virus de insectos ha o sido modicado adems mediante la insercin de por lo menos un gen heterlogo, donde el citado gen o a o o genes heterlogos son expresables en clulas de insectos infectadas con el citado virus y donde el gen o o e genes mencionados codican una prote que afecta a la ecdisis. na 9. El agente para el control e insectos de la Reivindicacin 8, donde el citado gen heterlogo est seleco o a cionado entre el grupo de genes que codican prote nas constituidas por la hormona protoracicotrpica, o la hormona de la eclosin y la esterasa de la hormona juvenil. o 10. El agente para el control de insectos de la Reivindicacin 9, que est seleccionado entre el grupo o a formado por vEGT SpPTTH, vEGT SpEH y vEGT SpJHE. 11. Un procedimiento para la produccin de un agente mejorado para el control de insectos, que o comprende las siguientes etapas: a) aislar un gen que codica una prote que afecta a la ecdisis y na

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b) insertar dicho gen en un organismo que no expresa naturalmente dicho gen. 12. El procedimiento de la Reivindicacin 11, donde el citado gen codica una prote seleccionada o na entre el grupo de prote nas que afetan a la ecdisis que comprenden la UDP-glucosil transferasa ecdisteroide, la hormona protoracicotrpica, la hormona de la eclosin y la esterasa de la hormona juvenil. o o 13. El procedimiento de la Reivindicacin 11, donde el citado organismo est seleccionado entre el o a grupo formado por parsitos de insectos, bacterias no topatgenas colonizadoras de las plantas, bactea o rias entomopatgenas, hongos entomopatgenos y plantas. o o 14. Un procedimiento para producir un agente mejorado para el control de insectos que comprende la operacin de inactivar un gen que codica un enzima modicador de los ecdisteroides en un organismo, o siendo dicho gen una parte natural del genoma del citado organismo.
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15. El procedimiento de la Reivindicacin 14, donde el citado gen codica UDP-glucosil transferasa o ecdisteroide. 16. El procedimiento de la Reivindicacin 15, donde el citado organismo es un agente para el control o de insectos de cualquiera de las Reivindicaciones 3 a 6. 17. El procedimiento de la Reivindicacin 16, donde se a un derivado del virus de la polihedrosis o sla nuclear Autographa californica con una delecin que inactiva al gen que codica UDP-glucosil transferasa o 22

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ecdisteroide, despus de pasos seriados del citado virus en clulas de insectos. e e 18. El procedimiento de la Reivindicacin 16, donde el citado virus de la polihedrosis nuclear es uno o de los virus vEGTZ o vEGTDEL.
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19. El procedimiento de la Reivindicacin 14, que comprende adems la operacin de alterar o a o genticamente dicho organismo mediante la insercin de un gen heterlogo expresable en un clula de e o o e insecto y cuyo gen codica una prote que afecta a la ecdisis. na
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20. El procedimiento de la Reivindicacin 19, donde el segundo gen citado est seleccionado entre o a el grupo formado por genes que codican la hormona protoracicotrpica, la hormona de la eclosin y la o o esterasa de la hormona juvenil. 21. Un mtodo para controlar un insecto que comprende la operacin de exponer dicho insecto a un e o agente para el control de insectos, cuyo agente para el control de insectos ha sido genticamente moe dicado para expresar un gen que codica un enzima modicador de los ecdisteroides, donde el citado enzima afecta adversamente a dicho insecto. 22. Un mtodo para el control de insectos que comprende la operacin de exponer el insecto a un e o agente para el control de insectos de cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 10. 23. Un mtodo para el control de insectos que comprende la operacin de exponer un insecto a un e o agente para el control de insectos que contiene un gen que codica un enzima modicador de los ecdisteroides, donde el citado gen ha sido inactivado mediante la insercin de un gen hetorlogo expresable en o o una clula de insecto infectada con dicho virus, cuyo gen heterlogo codica una prote que afecta a la e o na ecdisis. 24. El mtodo de la Reivindicacin 23, donde el segundo gen citado est seleccionado entre el grupo e o a formado por genes que codican la hormona protoracicotrpica, la hormona de la eclosin y la esterasa o o de la hormona juvenil, cuyos genes son expresables en clulas de insectos infectadas con dicho virus. e 25. Una composicin insecticida que contiene un agente para el control de insectos de cualquiera de o las Reivindicaciones 1 a 10 y un portador agr colamente adecuado, habiendo sido genticamente modie cado el citado agente para el control de insectos de manera que inactiva a un gen natural que codica UDP-glucosil transferasa ecdisteroide. 26. Una molcula de ADN recombinante que comprende una secuencia nucleot e dica de un gen que codica UDP -glucosil transferasa ecdisteroide.

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27. La molcula de ADN recombinante de la Reivindicacin 26, donde la citada secuencia es la see o cuencia de la Tabla I, desde aproximadamente el nucletido 149 hasta aproximadamente el nucletido o o 1670, o uno de sus equivalentes funcionales. 28. Un virus de insectos preparado por el mtodo de cualquiera de las Reivindicaciones 11, 12, 14-17 e y 19-20. 29. Un procedimiento para la preparacin de vEGTZ que comprende las siguientes etapas: o a) digerir pUCBCPsB con las endonucleasas derestriccin EcoRI y XbaI y puricar un fragmento o grande resultante; o b) cortar el gen lacZ de pSRS104 con las endonucleasas de restriccin EcoRI y AhaIII;

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e c) ligar dicho gen lacZ con el citado fragmento grande EcoRI-XbaI de pUCBCPsB despus de hacer romo el extremo XbaI con polimerasa de ADN de T4 para formar pEGTZ; d) contransfectar pEGTZ y AcMNPV en clulas SF; e

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e) identicar los recombinantes v ricos por expresin de la -galactosidasa y o

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f) puricar dicho virus recombinante, que es vEGTZ. 30. Un procedimiento para la preparacin de vEGTDEL que comprende las siguientes etapas: o
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a) digerir pUCBCPsB con las endonucleasas de restriccin EcoRI y XbaI y puricar un fragmento o grande resultante; b) hacer romos ambos extremos de dichos fragmento grande de ADN de la etapa (a);

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c) ligar dicho fragmento grande de ADN de la etapa (b); d) cotransfectar pEGTDEL y vEGTZ en clulas SF para permitir la recombinacin homloga; e o o
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e) identicar el vEGTDEL recombinante por la falta de expresin de -galactosidasa y o f) puricar dicho vEGTDEL recombinante. 31. Una UDP-glucosil transferasa ecdisteroide pura con la secuencia de aminocidos de la Tabla I o a una secuencia de aminocidos que presenta una homolog con aqulla de aproximadamente el 70% como a a e m nimo y que posee la actividad biolgica de dicha UDP-glucosil transferasa ecdisteroide. o
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NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE) y a la Disposicin Transitoria del RD 2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la o aplicacin del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a o Espaa y solicitadas antes del 7-10-1992, no producirn ningn efecto en Espaa en n a u n la medida en que coneran proteccin a productos qu o micos y farmacuticos como e tales. Esta informacin no prejuzga que la patente est o no inclu en la mencionada o e da reserva.

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