Universidad Industrial de Santander Facultad de Salud Escuela de Bacteriologa y Laboratorio Clnico Programa de Microbiologa y Bioanlisis Asignatura: Biologa Molecular

TALLER: ELECTROFORESIS La electroforesis es una tcnica que permite, mediante la generacin de un campo elctrico separar molculas de diferentes tamaos que migran a travs de un medio slido, como geles de agarosa o poliacrilamida. La molcula se desplaza hacia el nodo (electrodo positivo) por su carga negativa, aportada particularmente por la presencia de los grupos fosfatos. Se han determinado factores que afectan la capacidad de migracin de las molculas, siendo las ms determinantes, el tamao y la conformacin de los cidos nuclicos, la porosidad del gel y el voltaje aplicado durante el corrido electrofortico. Tamao del cido nuclico Los geles de agarosa permiten una mayor resolucin para macromolculas de gran tamao y por tanto se utilizan principalmente para separar cidos nuclicos. El ADN de doble cadena migra a una velocidad que es inversamente proporcional a su peso molecular, pero a diferentes estructuras secundarias su migracin ser a velocidades diferentes, por ejemplo el ADN superenrollado corre ms rpido que el ADN circular relajado y este ms que el ADN lineal, por lo tanto su localizacin en el gel ser diferente. Electroforesis de ADN plasmdico: pUC18,

ADNp Relajado ADNp Superenrollado Matriz del gel: Bsicamente se utilizan dos tipos de geles, de agarosa y poliacrilamida. La agarosa es un polisacrido compuesto de residuos de galactosa purificado de algas del gnero Gelidium y Gracilaria; la poliacrilamida es el resultado de la polimerizacin de acrilamida y N,Nmetilen-bisacrilamida inducida por la adicin de persulfato de amonio y tetrametil etilendiamina (del ingls: TEMED), donde el TEMED cataliza la liberacin de iones persulfato que inician la polimerizacin de la acrilamida. El uso de una u otra matriz depender bsicamente del tamao del poro que se desea utilizar y la concentracin bien sea de la agarosa o la poliacrilamida. Los geles de poliacrilamida permiten la separacin de molculas de tamaos ms cercanos y detecta concentraciones menores de protena. Adicionalmente este gel permite tinciones con azul de Coomasie o plata. En contraste la electroforesis en gel de agarosa podra ser ms adecuada para separacin de
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molculas de unos cientos de pares de bases en adelante y con el uso de tipos de agarosa como Low melting temperatura agaroses que permite utilizar una mayor concentracin de agarosa sin que se solidifique rpidamente a temperatura ambiente, ser posible resolver fragmentos de tamaos similares facilitando procesos de purificacin, actividad enzimtica y transformacin bacteriana con adicin directa de los cidos nuclicos en el gel. Relacin concentracin de agarosa/intervalo de separacin por tamao: Teniendo en cuenta la linearidad de la relacin emprica, logaritmo decimal del peso molecular/movilidad, siempre que las macromolculas tengan una relacin carga/masa constante y conformaciones hidrodinmicas equivalentes, se pueden medir los pesos moleculares de las macromolculas usando patrones de peso molecular conocido. Existe una relacin lineal entre el logaritmo decimal de la movilidad electrofortica del ADN y la porosidad del gel. Concentracin de Intervalo de agarosa separacin 0,3 5 - 60 Kpb 0,7 1 - 20 Kpb 1,2 0,4 - 6 Kpb 1,5 0,2 - 4 Kpb 2 0,1 - 2 Kpb La migracin se puede seguir por la adicin de colorantes: azul de bromofenol (BPB) y/o xileno cianol (XC). Como aproximacin a la utilizacin de agarosa para separar diferentes rangos de tamao de ADN, existen datos de la movilidad de los colorantes mencionados, segn la concentracin de agarosa: Agarosa 0,50% 0,80% 1,00% 1,50% 2,50% Voltaje aplicado A voltajes bajos la migracin de las molculas lineales de ADN es proporcional al voltaje aplicado. Sin embargo, si la fuerza inica del campo es elevada, la movilidad de los fragmentos de alto peso molecular se incrementa diferencialmente. Por lo tanto, el rango de separacin efectiva en los geles de agarosa decrece cuando se eleva el voltaje aplicado. Tampn utilizado El buffer de corrido debe escogerse segn la capacidad tampn que se requiera en el ensayo. El uso de TBE (Tris-borato-EDTA) se realiza cuando la electroforesis se hace a alto voltaje porque tiene ms capacidad tampn que el TAE (Tris- acetato-EDTA). El buffer debe contar con un balance de iones que genere una fuerza inica suficiente para lograr la conductancia elctrica.
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XC 12000 pb 4500pb 2400pb 1900pb 1000pb

BPB 1500 pb 1000 pb 600 pb 390 pb 150 pb

La visualizacin de las molculas de ADN se da por la utilizacin del bromuro de etidio el cual se intercala entre las bases de ADN, generando mayor fluorescencia cuando se encuentran unidos el ADN y el colorante que cuando el colorante est solo. A 254 nm se absorbe la radiacin UV por el ADN y transmitida al colorante y la energa es re-emitida a 590 nm en la regin rojo-naranja del espectro visible.

ELECTROFORESIS PARA ADN EN GEL DE AGAROSA

La electroforesis, mtodo simple y altamente efectivo para separar, identificar y purificar fragmentos de 0.5 25Kb de ADN. Se adelanta en tres etapas: 1- La preparacin del gel con la concentracin apropiada para separar los tamaos de los fragmentos de ADN. 2- La suspensin de las muestras de ADN en un tampn de carga, con el tampn de corrido y condiciones ptimas de voltaje y tiempo.

3- La visualizacin con luz UV por la adicin de bromuro de etidio, bien sea en el gel o en
el tampn de electroforesis. Materiales, reactivos y equipos. Tampn de electroforesis (TAE: Tris, Acetato, EDTA; TBE: Tris, Borato, EDTA). Solucin de bromuro de etidio (Solucin de trabajo de 0,5 g/ml; mutagnico con potencial de carcinognesis) Agarosa grado electroforesis Buffer de carga (20% ficoll400, EDTA di-sdico 0,1% a pH 8, dodecil sulfato sdico 1%, azul de bromo-fenol 0.25%, xileno cianol 0.25%). Marcador de peso molecular para ADN. Fuente de poder, cmara de electroforesis, horno, bao mara a 55C o microondas. Preparacin del gel de agarosa.

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Definir la concentracin apropiada de preparacin del gel de agarosa, que ser utilizado para separar los fragmentos de ADN deseados. Determinar la cantidad y definir segn su uso el tipo de tampn a ser utilizado, siendo los ms comunes: el TAE que es el ms empleado pero tiende a agotarse su capacidad de amortiguamiento durante electroforesis a altas tensiones o el TBE que tiene una mayor capacidad de amortiguamiento. Acondicionar previamente el molde para el gel de electroforesis o la cmara para su uso. Adicionar el bromuro de etidio 0,5 g/ml bien sea al tampn de corrido o al propio gel cuando an est en fase lquida. Pesar y adicionar la cantidad deseada segn la concentracin seleccionada de agarosa para el gel y adicione la cantidad de tampn definida para esta concentracin. Diluir el gel por calentamiento hasta obtener una solucin homognea y si es el caso adicione el bromuro de etidio cuando la temperatura no est tan alta. Dispensar la solucin en el molde para el gel de electroforesis y colocar el peine con el nmero de espacios deseados, recuerde evitar la formacin de burbujas y si es el caso retrelas antes que se condense la solucin. Una vez solidificado el gel, retirar el peine y llevar el gel dentro de la cmara de electroforesis posteriormente adicionar tampn hasta tener completamente sumergido el gel sin sobrepasar los lmites sealados por el indicador presente en la cmara de electroforesis. Preparado el gel y listo para ser usado, preparar la muestra seleccionada, adicionando buffer de carga 1X, segn el volumen final que sea posible agregar al pozo. Seleccionar un marcador de peso molecular, el voltaje y tiempo de corrido de la electroforesis.

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CUANTIFICACIN Y DETERMINACIN DE LA PUREZA DE LOS ACIDOS NUCLEICOS La absorcin de la luz en el espectro ultravioleta con un mximo cerca a 260 nm, es una propiedad caracterstica de las bases purnicas y pirimidnicas, debida a su carcter aromtico. Esta propiedad de los cidos nucleicos permite su utilizacin anlitica para cuanificarlos. La medicin a diferentes longitudes de onda permite realizar un analisis cualitativo y cuantitativo del estado de pureza y concentracin de los cidos nuclicos. Para medir el valor de la absorbancia a 260 nm en una solucin, sta debe estar suficientemente transparente, es conveniente realizar algunos controles, especialmente por la posible contaminacin con protenas, cuya presencia contribuye a la absorcin y por lo tanto interfiere en la determinacin. Se debe considerar que los mximos de absorcin son caractersticos de cada uno de estos compuestos (260 nm para cidos nuclicos y 280 nm para protenas), ambos absorben en cierta medida a las dos longitudes de onda; por ejemplo: A 260 nm la absorcin de protenas es unas 20 a 30 veces inferior a la de los cidos nuclicos; para poder corregir la interferencia mutua se deben emplear ambos valores de absorbancia y determinar correctamente la concentracin de protena y cido nuclico. La determinacin de la pureza del ADN se establece mediante el radio de las lecturas A260/A280 nm, siendo radios entre 1,8 y 2,0 indicadores de alta pureza. Contaminaciones con constituyentes proticos presentan un pico de absorcin a 280nm que reduce el radio A260/A280.

Materiales. Tampn 1X TBE o en su defecto agua Muestra de ADN a cuantificar Microcubeta de cuarzo con 1cm de longitud de pozo, para espectrofotometria. Espectrofotmetro con luz ultravioleta y visible. Anlisis por espectrofotometra Calibrar con un 1ml de tampn una por una las longitudes de onda antes de ser utilizadas. Diluir la muestra en el tampn o agua destilada a un volumen final de 1000 l y medir su absorbancia a longitudes de onda de 260 y 280 nm. Una vez determinadas las absorbancias de cada una de las longitudes de onda se deber calcular la concentracin de los cidos nuclicos presentes en la solucin, para ello se multiplica el valor de la densidad ptica (D.O) por 50 g/ml x el factor de dilucin. Donde: 1 D.O corresponde a 50 g/ml de ADN de cadena doble, a 40 g/ml de ARN y a 20 g/ml de oligonucletidos.

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