Curs BIOSENSORI

Introducere Ce este un biosensor? Definitia unui biosensor Proiectarea si constructia biosenzorilor; Principiul de functionare Principiul detectiei *Detectia electrochimica Clasificare Componentele biosensorului Exemple de electrozi enzimatici din generatia a I-a Electrozi enzimatici din generatia a II-a Electrozi enzimatici bazati pe enzime FAD-dependente Electrozi enzimatici bazati pe enzime NAD-dependente

• Notiuni de voltametrie ciclica • Electrozi chimic modificati • Mediatori redox

Ce este un biosensor?

Este un detector (instrument analitic) care converteste (transforma) semnalul biochimic intr-un semnal -electric, optic, termic sau mecanic- masurabil (cuantificabil)

Analiti

Bioreceptor Traductor (catalitic fizico-chimic afinitate)

Componenta electronica

Reprezentarea schematica a unui biosenzor

Ce au in comun?
Biosensor

Analit / bioreceptor / traductor / procesor

Nas

Molecule mici / membrana olfactorie / celule nervoase / creer

Ochi

Lumina / bare si conuri / celule nervoase / creer

Principiul de constructie si functionare a unui biosenzor
Un biosensor este un instrument analitic constand dintr-un component biologic imobilizat, responsabil pentru recunoasterea selectiva a speciei de analizat, aflat in contact intim cu un traductor adecvat.

Interactie “cheielacat“

Analati

METABOLITI, IONI, GAZE VAPORI ORANICI

Etapa generarii semnalului BIOCOMPONENT

ENZIME, ANTICORPI ORGANITE, CELULE

Transmiterea

TRADUCTOR

semnalului

ELECTROCHIMIC, OPTIC CALORIMETRIC PIEZOELECTRIC

Amplificare si procesare

Interactia specifica de bioafinitate (ex. “lacat-cheie”) dintre analit de determinat si elementul de recunoastere conduce la o modificare fzico-chimica, care este detectata de traductor, masurata si procesata adecvat.

Principiul Detectiei Masoara modificari de masa Masoara modificari de distributie electrica Masoara modificari de intensitate luminoasa Masoara modificari de caldura .

Sa permita o masurare selectiva a analitului de determinat in cadrul unei metode care necesita un minimum de preparare a probei §Poate fi reutilizabil (prezinta un raspuns reversibil) §“Disposable” (de unica folosinta) .

CLASIFICAREA BIOSENSORILOR Functie de: Elementul de recunoastere moleculara Tipul traductorului Reactiile monitorizate ex. redox hidroliza Speciile monitorizate Monitorizare directa a -concentratiei de analit -reactiilor in care se consuma sau se produc substrate noi Monitorizare indirecta a Inhibitorilor sau a activatorilor elementelor de recunoastere biologica .

Diferitele categorii de biosensori .

posibilitati de regenerare Selectivitate mare Relative ieftini Cresterea interferentelor si a timpului de raspuns al biosenzorului Selectivitate redusa. simplitatea constructiei.TRADUCTORUL BIOMOLECULAR (asigura selectivitatea biosenzorului) Enzime Sinzime Sisteme mutienzimatice Avantaje Dezavantaje Selectivitate mare si activitate Stabilitate limitata Cresterea posibilitatilor de Cresterea interferentelor. marirea probleme legate de gamei de compusi optimizarea conditiilor detectabili de lucru Simplitatea constructiei biosenzorului. timp mare de raspuns Organite celulare Tesut animal sau vegetal Microorganisme Anticorpi monoclonali policlonali Acizi nucleici Aptameri Receptori celulari Receptori sintetici Cost ridicat Selectivitate limitata selectivi instabili . marirea gamei de compusi detectabili Varietate mare. imobilizare.

unda evanescenta) Piezoelectric Termistor Conductivitatea (conductanta) Optic fibre optice Domeniu mare de Variatie logaritmica a raspuns. dificultati de lucru in faza gazoasa Magnetic .TRADUCTORUL FIZICO-CHIMIC (asigura sensibilitatea biosenzorului) Modul de masurare (marimea masurata) Avantaje Dezavantaje Electrochimic Potentiometric (potentialul) Amperometric (curentul) Impedimetric (impedanta) Coductometric Optic/optoelectronici (absorbanta. speciala. Instrumentatie raspuns rapid. fluorescenta. luminiscenta. raspunsului. liniar Raspuns lent Modificari de (frecventa) Calorimetric/termometric (caldura/temperatura) raspuns Neselectivi. maresc domeniul probleme in cazul compusilor solutiilor tulburi detectabili masa Dimensiuni reduse Simpli. instrumentatie selectivitate simpla limitata Posibile interferente Variatie liniara a raspunsului Pret de cost scazut neselectivi Dimensiuni mici.

enzime. acizi nucleici care recunoaste un analit specific. Traductor care converteste etapa de recunoastere intr-un semnal masurabil. anticorpi.Componentele biosensorului • Bioreceptor care costa dintr-o biomolecula ex. Procesarea semnalului • • Elementele biosensorului .

penicilina. CO. uree.1. alcool. pesticide. Analit (substrat) Tipul/natura: biologic.coli. paracetamol. CO2. E. aspirina. chimic (chiar anaorganic) Microbi (antrax. TNT. ARN. hormoni. Salmonella) Molecule mici (glucoza. amino acizi) Bio-macromolecule (AND. colesterol. proteine. Candida. virusuri) . enzime.

Anticorp Acizi nucleici Receptori proteici FAD din Gox Selectivittate/ stabilitate Receptori biochimici Organisme Tesuturi Cellule Organite Membrane Enzime Anticorpi Acizi nucleici Chemoreceptori .

Membrana este un amestec de proteine si alte molecule imbibate in matricea fluida a dublului strat lipidic Glicoproteine Fluid extracelular Glicolipide Fosfolipide Colesterol Proteina periferica Proteine transmembranare Citoplasma Filamentele citoscheletului .

Functiile Proteinelor Membranare Exterior Membrana plasmatica Interior Transportor Activitate enzimatica Receptor celular de suprafata Marker de suprafata Adeziune celulelor de identificare Atasare de citoschelet .

Oxigenul. cofactori) ØProbleme legate de imobilizarea biocomponentilor ØPerformante scazute in medii neapoase ØCompatibilitate scazuta relativa la tehnologia de microfabricare rezultind in dificultati legate de proiectarea multisenzorilor ØDimensiunile moleculare .PROBLEME LEGATE DE TRADUCTORUL BIOCHIMIC ØStabilitate mica a biomoleculelor ØPret de cost ridicat pentru enzime si receptori ØNecesitatea adaugarii unor compusi suplimentari (ex.

Biosensorul ideal • • • • • Sensibilitate mare Selectivitate mare Timp de raspuns si revenire rapid Pret de cost scazut Usor de utilizat .

receptor .Dializa Receptor Traductor Componenta electronica Prima generatie ® ® ® MEMBRANA SENSOR A doua generatie ® ® ® SENSOR MODIFICAT BIOCHIMIC A treia generatie ® ® ® Biochip Generatiile de biosensori. R .

Electrozi enzimatici .

BIOSENSORII au fost clasificati functie de modul de transfer de electroni dintre enzima si electrod in 3 generatii La o valoare de potential controlata aplicata la suprafata senzorului amperometric biosenzorii genereaza un semnal analtic (curent) care este corelat direct cu concentratia compusului de analizat .

Chem.Int.200 si 0.Domeniul optim de potential: . on Anal.0 mV *curenti de baza mici. zgomot redus *nu are loc reducerea oxigenului *interferente minime datorate oxidarii acidului ascorbic acidului uric paracetamol. 2004 .Conf. etc 3rd Rom.

Heller. 96 (1992) 3579-3587 . Phys. J.Oxido-reductazele “enzimele redox” reprezinta o clasa bine cunoscuta de macromolecule chimice care sunt comercializate si folosite drept element de biorecunoastere in constructia biosenzorilor Transfer de electroni S Enzox - e electrod P Enz red Ele reprezinta o provocare pentru chimistii electroanalisti acestea fiind ideal de utilizat in constructia biosenzorilor deoarece ele catalizeaza reactii de oxido-reducere ale diferitelor substrate si ar putea fi implicate in reactii cu transfer direct de electroni cu suprafata electrodului A.Chem. Electrical Connection of Enzyme Redox Centre to Electrodes.

on Anal. 2004 .Conf.Chem.Int.Prima generatie 3rd Rom.

Electrod enzimatic Solutie de analit Strat bioactiv Traductor ectrochimica .

Nature 214. J. Russ. in 2005 a obtinut Premiul Fritz J. Am. and Hicks. and Dolores H. 986-988 (1967) . 41-48 (1956) Ann.Foto realizata cu aceea ocazie “constructiei unor sensori electrochimici mai inteligenti prin fixarea unei enzime” β − D − glucoza + O 2 GOx → δ − D − glucono . Sci. Soc. Organs 2. 102. Artif. Electrodul de oxigen a stat la baza Trans. Intern. 29-45 (1962).P. NY Acad.J. S.lactona + H2O2   Updike.Inventator Leland C. Clark Jr.

Lubrano. 1967 .P. Updike.Biosensorul pentru glucoza Detectia apei oxigenate folosind un electrod de Pt Reactia enzimatica Glucoza Glucozoxidaza + O2 Glucolactona + H 2O2 E E H 2 O2 S Reactia electrochimica H 2O2 E > + 0. G. Hicks. 60 (1972) 254 FS.6 V 2 H + + O2 + 2 e- H2O2 formata difuzeaza atit in afara membranei spre solutie cit si spre suprafata unui electrod de platina unde este oxidata electrochimic FG.J.J.G. G. Nature. "The Enzyme Electrode". Anal. Guilbault.Chim.Acta. 214.

Exemple de biosensori din prima generatie METABOLIT PRODUS ELECTROACTIV Reactia Substrat + O2 ENZIMA PRODUS ELECTROACTIV VARIATIE SEMNAL ELECTRIC Produs + H2O2 SENZOR electrochimic Enzima (oxidaza) Glucoza + O2 Lactatul + O2 Urea E1 acidul gluconic + H2O2 Piruvat + H2O2 E2 hidrolaza ureaza HCO3.+ NH4+ .

.

CN-. mol/l 10-5 – 10-2 10-7 – 10-3 10-4 – 10-2 Oxygen 10-5 – 10-4 . NH4+. Na+. Conc.BIOSENZORI CLASICI (prima generatie) DOMENIUL CONCENTRATIILOR DE SUBSTRAT CARE POT FI DETERMINATE PRIN INTERMEDIUL DIFERITILOR SENZORI ELECTROCHIMICI METODA Potentiometrie Amperometrie Sensor de gaz potentiometric Sensor de gaz amperometric SENZOR H+. IPt/H2O2 NH3. CO2 Dom.

PANCREASUL ARTIFICIAL POMPA ANALITICA INJECTAREA INSULINEI ANALIZA GLUCOZEI COMPUTER .

5 C B I (nA) 0.1 0 15 30 TIMP (minute) SEMNALUL DAT DE UN SENZOR PENTRU GLUCOZA IN TIMPUL VARIATIEI DE GLUCOZA INTR-UN SOARECE ANESTEZIAT A = MASURAREA GLUCOZEI INITIALE B = MASURAREA GLUCOZEI DUPA ASIMILAREA DE GLUCOZA C = MASURAREA GLUCOZEI IN URMA INJECTARII DE INSULINA .INJECTAREA INSULINEI 0.3 A ASIMILAREA GLUCOZEI 360 mg/dL 0.

Biosensor pentru determinarea alcoolului

El are la baza un sensor amperometric de Pt pentru H2O2 acoperit cu o membrana continind alcool-oxidaza (Aox) imobilizata si cu o membrane hidrofoba gaz permeabila, care elimina majoritatea interferentelor posibile. Alcoolul din saliva difuzeaza prin membrane gaz permeabila si reactioneaza cu enzima conform ecuatiei:

AOx

Alcool + O2 H2O2 + Acetaldehidea Aox = alcool oxidaza H2O2 produsa este masurata de sensorul amperometric si corelata cu concentratia de alcool din saliva. Alcoolul are o presiune de vapori relativ mare ceea ce duce la eliminarea interferentelor datorate compusilor nevolatili.

Etanol
ADH

Acetaldehidă

NAD+

NADH + H+

ADH=alcool dehidrogenaza

Detecţie la 340nm

Principiul determinarii spectrometrice a alcoolului

Concentraţia de NADH creşte proprorţional cu cea a etanolului. NADH-ul este determinat pe baza absorbanţei lui la 340nm

• exemplu reprezentativ de steroid • component esential in membranele celulare animale • precursor in biosinteza tuturor steroizilor, hormonilor, a vitaminei D etc. • stocat in celule sub forma unui ester a acizilor grasi

Valori normale: colesterol liber- 1,29-2,07 mM colesterol total- 3,36-6,47 mM

Reactia catalizata de enzima • Colesterol oxidaza (COx) Colesterol + O2 COx Colesterol-4-en-3-ona + H2O2 Reactia bioelectrochimica de detectie a colesterolului .

O2 Dezavataje: solubilitate limitata a O2 H2O2 denatureaza enzima H2O2 poate reationa cu alte substante din solutie species Eappl > -600mV O2 + 2H + 4e + - 2OH- C Electrodul Clark dezavanaje: masoara scaderea semnalului (semnal de baza mare) Supra-potential Eappl > +600mV H2O2 O2 + 2H+ + 2e- C dezavantaje: supra-potential raspunsul electrodului nu este stabil .C OXIDAZE acceptorul natural de e.

Prima generatie de biosensori Oxidarea electrochimica a H2O2 la suprafata electrozilor conventionali are loc la valori de potentiale ≥ + 600 mV fata de Ag|AgCl •Sistemul este supus unor reactii de interferenta •Raspunsul nu este stabil in timp Electrochimia O2 si H2O2 sufera de aplicarea unor valori mari de potentiale = suprapotentiale .

I. Ø necesara realizarea unei orientari speciale proteina-electrod • Adsorptia la suprafata electrodului Ø proteinele trebuie sa fie de puritate analitica (!!) Ambele fenomene impun necesitatea modificarii suprafatei de electrod . Probleme in electrochimia proteinelor • Existenta unor viteze mici cu transfer de electroni cu sau in interiorul proteinelor (viteza transferului de electroni reprezinta etapa limitativa de viteza).

Am.ADSORBTIA ORIENTATA A PROTEINELOR REDOX LA SUPRAFATA ELECTRODULUI MODIFICAT CU PROMOTOR M. H. 771-772 (1977). . Chem. Chem.. Hill. Commun. J. Soc. Eddowes. J.A..O.

TIOLI FOLOSITI CA PROMOTORI PE Au .

EFECTUL Promotorilor ASUPRA ENZIMEI Ecresterea stabilitatii operationale si pe termen lung a enzimei in pasta

Eimbunatatirea cineticii enzimatice

E produce legarea corecta a enzimei redox pe suprafata electrodului, facilitand transferul direct de electroni

L. Guo and H. A. O. Hill, Direct Electrochemistry of Proteins and Enzymes, Adv. Inorg. Chem., 36 (1991) 341- 375.

Mono-straturi auto-asamblate (SAM) folosite in orientarea-reconstructia enzimelor

+ apo-HRP + hemina (si EDC) + diaminoalcani SAM mixte
ex., Gox, GDH-PQQ

Refacerea HRP la suprafaţa unui electrod de aur modificat cu grupări tiol-heminice
H. Zimmermann, A. Lindgren, W. Schuhmann, L. Gorton, Chem. Eur. J. 6 (2000) 592-599

II. Probleme in electrochimia proteinelor • Difuzia lenta a proteinei
Ø trebuie utilizati transportori de electroni redox activi (mediatori).

• Reactiile cu transfer de electroni (ET) sunt deseori cuplate cu transferul de protoni
Ø potentialele redox sunt puternic dependente de pH.

Elctrozi chimic modificati .

.existenţa unor viteze de reacţie electrochimică mici pentru anumite specii chimice care în aceste condiţii necesită aplicarea unui suprapotenţial pentru realizarea reacţiei.pasivarea electrodului datorită adsorbţiei sau depunerii pe suprafaţa acestuia a unor compuşi chimici sau a unor precipitate nedorite. .Electrozi chimic modificati Llimitarile metodelor electrochimice în analiza şi sinteza chimica: .

Acesta funcţionează ca un mediator pentru transferul rapid de electroni Spre molecula de substrat. care in lipsa mediatorului este oxidat sau redus lent (sau deloc în unele cazuri) la suprafaţa unui electrod convenţional.ELECTROZI CHIMIC MODIFICATI (CME) Un electrod chimic modificat poate fi definit ca reprezentând o modificare raţionala intentionată a structurii moleculare a suprafeţei electrozilor convenţionali în scopul utilizării lor în cadrul unor aplicaţii specifice Electrozii chimic modificaţi (CMEs) se bazează pe fixarea unui centru redox (mediator) pe suprafaţa electrodului. .

M. Pividori. Merkoçi. Alegret.I. and M. vol. Encyclopedia of Sensors.(Bio)compozite/Integrate electroanalitice (bio)sisteme (Bio)sensori amperometrici bazati pe particule conductoare (bio)compozite Electrozii chimic modificati (Chemosensori) Electrozii modificati biologic (Biosensori) R R R R Modificarea suprafetei R R R R R R R R R R R T T R R R R Modificarea in masa “Bulk” Biocompozite • moi/rigide R Modificatori Electrocatalizatori Enzime Anticorpi ADN T Carbon Aur Platina S. A. 3 (2006) pp 23-44 Compozite . del Valle. Electrochemical biosensors based on rigid conducting carbonpolymer composites.

ne- Sred Sox+Mred La elctrod Mox la interfaţa electrod modificat/soluţie Reprezentarea schematică a unui CME si a reacţiei de electrod .Medred e - SUBSTRATox SOLUŢIE Medox SUPRAFAŢA ELECTRODULUI SUBSTRATred Mox + Mred .

. Sadakane. 98 (1998) 219. E.. Stechkhan. Chem. Rev.Reactiile chimice si electrochimice Reactie omogena Substrat Substrat Produs Produs Mediator Mediator oxidat oxidat Reactie heterogena Mediator Mediator redus redus Electrod M.

Necesitatea unei astfel de medieri apare ori de câte ori viteza directă a transferului de electroni este mică şi la nivelul unui electrod convenţional este necesară aplicarea unui suprapotenţial .

precum şi a legăturii dintre electrod şi acesta din urmă. .compatibilitate cu o gamă largă de solvenţi apoşi şi organici.curenţi de bază mici şi stabili pe domeniul de potenţial utilizat.stabilitate în timp a activităţii grupării modificatoare faţă de compusul de analizat. . .un domeniu larg de linearitate a răspunsului. .Caracteristicile unui electrod chimic modificat ideal pentru aplicaţii analitice: -stabilitate mecanică şi chimică atât ale electrodului de bază cât şi ale grupării modificatoare. .

G. Bartlett. 1991 . P.PROPRIETATILE MEDIATORILOR FOLOSITI IN CONSTRUCTIA BIOSENSORILOR CPotentialul formal apropiat de al biomoleculei. Whitaker. N. Tebbutt. l6 (2). Progress in Reaction Kinetics. posibil in domeniul potentialului optim Si independent de pH. Celectrochimie reversibila CReactie rapida cu enzima redox Cstoichiometrie a reactiei cu transfer de electroni bine definita (1 sau 2 electroni) CStabili atit in stare oxidata cit si in cea redusa CSa nu se autooxideze CSuficient de solubili pentru a permite un mecanism de transfer (mediatori difuzionali) sau CSolubilitate mica in mediul inconjurator (mediatori imobilizati) P. "Kinetic Aspects Of The Use Of Modified Electrodes And Mediators In Bioelectrochemistry". R.

Ralph Buzz Adams (1924 – 2002) Hidrofilizarea suprafetei de electrod realizata prin pretratarea oxidativa a suprafetei CPE Electrod PC picurator .

De ce pasta de carbune? Ø Domeniu de potential de lucru extins Ø Valori mai scazute ale curentului de fond si ale zgomotului Fmodificarea chimica simplu de efectuat Fieftina Fsuprafata electrodului usor reinnoibila Fposibilitatea fabricarii usoare de ultramicroelectrozi .

Iijima. MWNT S. Iijima. 56 (1991) – MWNT S. Nature 354.Pasta de carbune Structura grafitului Nanotuburi de Carbon -straturi cilindrice de grafit bi-dimensional formate din hexagoane de atomi de carbon SWNT Grupari functionale chinonice care pot fi prezente pe suprafata carbonului. 603 (1993) – SWNT . Nature 363. Ichihashi. T.

Au pe grafit •Depunerea electrochimica a Pt. ≈200-300 mV b) Folosirea altor materiale de electrod pentru oxidarea H2O2 Ni SnO2 TiO2 F Stabilizeaza raspunsul fata de oxidarea H2O2 Micsoreaza suprapotentialul pentru oxidare al H2O2 .DIFFERITE POSIBILITATI DE SCADERE A SUPRAPOTENTIALULUI a) depunerea unor metale nobile pe suprafata Pt sau Pd/Au pe suprafata electrozilor de carbon electrozilor de carbon •Electrozi de carbon platinizati •Depunere sub vid a Pd. Rh pe carbon Micsoreaza potentialul cu aprox.

ex.(mediatori).metalo-ftalocianinele e) folosirea electrozilor modificati cu peroxidaza . FEROCENUL d)folosirea unor electro-catalizatori ex.DIFFERITE POSIBILITATI DE SCADERE A SUPRAPOTENTIALULUI c)Inlocuirea oxigenului O2 cu un alt acceptor de e.

Electrozii chimic modificati bazati pe enzime Combina trei etape selective Øenzima Ømediatorul ØPotentialul aplicat Imobilizarea atit a enzimei redox cit si a mediatorului pe/in suprafata de electrod Adaugarea doar a substratului UN SENSOR “REAGENTLESS” .

aceasta constă în măsurarea curenţilor de electroliză în timpul baleajului ciclic al potenţialului electrodului de lucru faţă de un electrod de referinţă nepolarizabil. Electrochemical Methods. L.Voltametrie ciclică • Voltametria ciclică reprezintă o tehnică electrochimică fundamentală. Bard. Faulkner. 2000. Principial. J. R. A. care operează la curent nul. Fundamentals and Applications. . în timp ce curentul de electroliză se scurge spre un contra-electrod. Wiley Interscience Publications.

Celula electrochimica Cconstructie: -sticla pyrex .dimensiune variabila functie de volumul utilizat 2550 cm3 . heliu) Electrozi: Indicator (de lucru): metale nobile sau materiale carbonice Referinta (Ag/AgCl) Auxiliar (Pt) . in cazul folosirii enzimelor volumul celulei este de 1cm3 -Orificiu barbotare gaz inert (ex. argon. azot.

. USA) Masuratorile electroanalitice sunt realizate cu potetiostate controlate prin intermediul unui calculator incluzand un software adecvat. .Instrumentatie (BAS inc.

.Tehnici electroanalitice de interogare a suprafetei de electrod Voltametria ciclica – informatii electroanalitice Voltamograma ciclica redand parametrii de pic importanti Parametrii importanti ai unei voltamograme ciclice sunt picurile de potential Ep si picurile de curenti ip.

Parametrii care caracterizează voltamograma ciclică a unui proces redox reversibil • separarea dintre potenţialele corespunzatoare picurilor anodice si catodice (Epa . .059/n (mV) • Prin experiente de voltametrie ciclica se poate determina valoarea potentialului formal de oxido-reducere(Ef) pentru un cuplu redox reversibil : Ef=(Epa+Epc)/2 • raportul curenţilor de pic (ipa/ipc) este egal cu 1 pentru toate vitezele de baleaj. ipa/ipc=1 • funcţia curentului de pic creşte liniar cu rădăcina pătrată a v (viteza de baleaj) – pentru un proces limitat de difuziune.Epc) este egală cu 0.059/n (mV) pentru toate vitezele de baleaj unde n este numărul electronilor echivalenţi transferaţi în timpul procesului redox: ∆E=Epa-Epc=0.

(viteza de scanare)1/2 Un proces cvasi-reversibil este caracterizat de o ΔEp > 58/n mV. . valoarea crescand cu cresterea n.Dependenta picurilor de curenti si de potential de viteza de baleaj poate fi redata prin graficul ip vs.

Transferul de electroni din cadrul biosensorilor Generatia a doua .

Conf.Chem.Int. 2004 .Transferul mediat de electroni intre o enzima redox si un electrod (pentru o reactie de oxidare) 3rd Rom. on Anal.

Cei mai folositi mediatori ferrocenul si derivatii acestuia S P Oxidaseox Oxidasered Medred Medox electrode e- Biosensorul va opera la potentialul formal redox al mediatorului MECHANISMUL DE REACTIE β-D-Glucoza + E-FAD (Goxox) E-FADH2 + 2Fe (Cp)2 R+ E-FADH2 + gluconic acid (Goxred) E-FAD + 2Fe (Cp)2 R + 2H+ 220mV vs Ag /AgCl 2Fe (Cp)2 R 2 Fe(Cp) R+ + 2e- .

Voltamograma ciclica pentru hidroxi-ferocen proces redox cu transfer de un electron conform schemei: .

.

In figura se prezinta voltamogramele ciclice ale sistemului in prezenta unor concentratii crescatoare de glucoza.5 mmol dm-3 glucoza. a) fara glucoza. c) 2. Datele au fost inregistrate la nivelul unui electrod de carbune sticlos. b) 0.5 mmol dm-3 glucoza. .2Fc FAD glucoza 2Fc2+ FADH2 gluconolactona volti Schema medierii in mediu omogen a reactiei de oxidare a glucoz oxidazei prin intermediul ferocenului.

DEHIDROGENAZE NAD+-dependente S NAD+ MEDred P NADH MEDox .

Dehidrogenazele NAD+ dependente reprezinta unele din putinele enzime care transfera direct electronii prin intermediul moleculei de cofactor (NADH) (!)Problema: regenerarea cofactorului in urma transferului de electroni Realizata prin folosirea mediatorilor.fara degradarea cofactorului .

MEDIATORI SELECTIVI FOLOSITI PENTRU MICSORAREA SUPRAPOTENTIALULUI DE OXIDARE A NADH-ului O functionalitate de baza utilizata ca mediator parafenilendiimina – prezinta o sarcina electrica R.0 = + 200 mV vs SCE este destul de mare .N N + R R ++ prezinta viteze mari de reactie cu NAD(P)H nNu este stabila redox nGreu de imobilizat nE0'pH 7.

OXIDAREA ELECTROCHIMICA A NADH-ului LA SUPRAFATA UNUI ELECTROD CHIMIC MODIFICAT 0’ Para-fenilendiimina prezentand sarcina + domeniul optim de potentiale ≈ 0 and -100 mV vs SCE ++ viteza de reactie mare cu NAD(P)H Interferente minime .

e un proces mult mai complicat .Mediatorii incarcati pozitiv par a fi utili (necesari) ØEi prezinta viteze mari de reactie cu NADH ØNu conduc la reactii secundare ØConduc la molecule de NAD+ enzimatic active ØSe formeaza un complex cu transfer de sarcina intre NADH si mediator ØCeea ce pare a fi o singura etapa cu transfer de H.

MEDIATORI FOLOSITI PENTRU SCADEREA SUPRAPOTENTIALULUI DE OXIDARE A NADH-ului • MEDIATORI ORGANICI (neselectivi) • MEDIATORI SELECTIVI • NOI MEDIATORI ARTIFICIALI • PROTEINELE REDOX – MEDIATORI NATURALI .

MEDIATORI ORGANICI .I.neselectivi (structurile de baza pentru multi mediatori) NMP+ = N-metilfenazinium TCNQ = tetracianochinodimetanide .

(H+)) Øsarcina (ex. k) CU ENZIMA ØE0' (potentialul formal) log k ~ ∆E0' (in acord cu teoria lui Marcus) ∆E0' = (E0'mediator – E0'enzima) Ønatura mediatorului (acceptor de 1e. centrul activ al glucoz oxidazei este incarcat negativ) Ødimensiunea (mediatorul trebuie sa se potriveasca la dimensiunile si structura centrului activ) .sau de 2e.PARAMETERII CARE DETERMINA VITEZA DE REACTIE A MEDIATORULUI (constanta de viteza de ordinul II.

Cu) ambele pot utiliza mediatori care transfera 1 si 2 e.OXIDAZELE SI DEHIDROGENAZELE CU COFACTORI LEGATI (FAD.(ne-acceptori de protoni si acceptori de protoni) = = = > transmiterea de 2 e.de la cofactorul legat redus spre mediator poate decurge sevential Dehidrogenazele NAD(P)+ dependente (oxidarea NAD(P)H-ului) In cazul lor functioneaza numai acceptorii de 2 e.(si proton) care prezinta viteze mari de reactie = = = > ceea ce sustine ideea unei etape cu transfer a unui H.de la NAD(P)H la molecula acceptoare PEROXIDAZELE functioneaza “orice" agent reducator (donor de e-) . PQQ. FMN..

MEDIATORI CHIMICI UTILIZATI IN BIOELECTROCHIMIE aceptori/donori 1 evs aceptori/donori 2 e--H+ .

si 2 e- acceptori/donori de 1 e- acceptori/donori 2 e--H+ +E°’ nu variaza cu pH-ul ionii H+ nu participa +nu exista intermediari radicalici reactie redox stabila -(!)viteze de reactie mici cu NADH -viteze de reactie moderate cu peroxidazele -E°’ variaza cu pH-ul participa 1-2 ioni de H+ -prezinta intermediari radicalici reactie redox instabila + viteze de reactie mari cu NADH + viteze de reactie mari cu peroxidazele .Diferente intre mediatorii acceptori/donori de 1 e.

Generatia a III-a de biosensori PEROXIDAZELE PQQ-DEHIDROGENAZELE .

flavocitocromul c552 . FAD .celobioz dehidrogenaza .lactat dehidrogenaza . boabe de soia Peroxidaze din fungii Arthromyces ramosus cloroperoxidaze Peroxidaze din drojdii citocrom c peroxidaze ENZIME CU COFACTORI micsti CHINOHEMOPROTEINE FLAVOHEMOPROTEINE chinohemoproteine.flavocitocromul b2 .sulfit oxidaza . tutun.fructoz dehidrogenaza . PQQ .alcool dehidrogenaza PQQ sau FAD Hemul Hemul Microperoxidaze Plante Bacterii Ciuperci Tesuturi animale flavohemoproteine.PEROXIDAZE Peroxidaze din plante HRP.

.

.

EXEMPLE DE ENZIME IMPLICATE ÎN BIOELECTROCATALIZĂ PEROXIDAZA LACAZA CELOBIOZ DEHIDROGENAZA .

.Chem.. Doklady Phys.Yaropolov et al. 249 (1980) 1077 . au demonstrat capacitatea HRP de a cataliza reacţia de electro-reducere H2O2 HRP H2O2 + 2H+ + 2e2H2O POD-ale prezinta activitate catalitică oxidând un număr mare de: Øpolifenoli şi Øpoliamine aromatice A.I.Fîn 1980 Yaropolov şi colab..

Peroxidazele ≈ 40 enzime enzime din clasa oxido-reductazelor care contin feriprotoporfirina drept cofactor Cofactor Ü hemul - - OOC CH H2C H3C N Fe N N N COO H2C CH2 CH3 H2C C H H3C CH3 C CH 2 H Feriprotoporfirina IX .

k1. SH2 =substrat donor de electroni (sau mediatorul). SH* =radical liber care este produsul reactiei de oxidare a substratului.PEROXIDAZELE ≈ 40 enzime HRP=este enzima nativa in stare ferica (Fe3+). compusul I si II=intermediari de reactie in stare oxidata. k2 si k3=constatele de viteza ale reactiei. P+ reprezinta un radical cationic localizat pe inelul porfirinic sau pe catena polipeptidica .

P •)+ SH2 → compus II (FeIV=O)+ SH* k3 Compus –II (Fe =O)+ SH2 → HRP (Fe3+) + SH* + H2O IV .MECANISMUL DE RE-REDUCERE A PEROXIDAZEI (revenire la starea nativa) POATE FI REALIZAT PRIN INTERMEDIUL ELECTROZILOR (DET) SI/SAU AL MEDIATORILOR (MET) ks Compus I + 2e. Ag/AgCl ks. m 2 SH* + 2 e.+ 2 H+ k1 2 SH2 (MET) (e) HRP (Fe ) + H2O2 IV + 3+ compus I (FeIV=O.01 V vs.+ 2H+ HRP (Fe3+) + H2O (DET) (d) Eappl (detectia H2O2) = 0. P+•)+ H2O (a) (b) (c) k2 Compus I (Fe =O.

30 (1993) 315 Potentialul aplicat pentru detectia H2O2 Eappl.Ciclul reactiei bioelectrocatalitice de reducere a H2O2 catalizata de HRP si de inactivare a acesteia H2 O2 2e- forma nativa uzual neselectiv compusul – II 1 e- H2 O compusul – I compousul – III (forma inactiva) exces de H2O2) selectiv Enzima schimba direct electroni cu electrodul (electrodul substituie substratele donoare de electroni din ciclul obisnuit de reactie al HRP). Biotechnol.0. J. E. = 0. •Curenti de baza mici •Oxigenul molecular nu este redus •Interferente minime Electrodul ca donor de e 1 e- - . Csoregi si colab.01 V fata de Ag/AgCl la pH = 7.

*ELECTROCHIMIC NU SE POATE FACE DIFERENTA INTRE COMPUSUL I SI II .MECANISMUL TRANSFERULUI DIRECT DE ELECTRONI uzual neselectiv 2H+ P+ reprezinta un radical cationic localizat pe inelul porfirinic sau pe catena polipeptidica compusul I si II=intermediari de reactie in stare oxidata.

.MECANISMUL TRANSFERULUI DIRECT DE ELECTRONI reactie electrochimca (b) HO 2 2 POD nativa k1 HO 2 ks 2e- electrod 0.0 mV / Ag/AgCl HO 2 reactie chimica (a) Cmp I 2H + experimental. observandu-se numai reactiile (a si b) redate schematic mai sus ks = viteza transferului de electroni dintre RDE si formele oxidate ale enzimei (avand unitatile s-1).

P+•)+ H2O k2 IV + Compus I (Fe =O.MECANISMUL TRANSFERULUI MEDIAT DE ELECTRONI HRP (Fe3+) + H2O2 compus I (FeIV=O.fenilendiamina p-aminofenolul NH2 OH NH2 I3- Fe(CN)64- Mred si Mox sunt formele reduse si respectiv oxidate ale mediatorului . P •)+ SH2 → compus II (FeIV=O)+ SH* k3 IV Compus –II (Fe =O)+ SH2 → HRP (Fe3+) + SH* + H2O (a) (b) (c) Compusi donori de electroni NH2 OH anilina NH2 OH NH2 OH fenolul OH NH2 o-fenilendiamina NH2 o-aminofenolul catecolul OH OH p.

MECANISMUL TRANSFERULUI MEDIAT DE ELECTRONI Mediatorul (SH2) transporta electronii intre enzima si electrod. . Donorul oxidat enzimatic (SH•) este redus de catre electrod.

BIOSENSORI BAZATI PE ADN PENTRU DETECTIA AGENTILOR TOXICI .

acizii nucleici (ADN sau ARN) au fost din ce in ce mai utilizati in recunoasterea si monitorizarea multor compusi de importanta analitica (poluanti. in principal: stabilitatii mari si variabilitatii foarte mari a secventelor de acizi nucleici. medicamente anticancer. secvente patogene de acizi nucleici etc.) datorita.In ultimii ani. . substante toxice.

Guanina (G).Structura ADN-ului vADN-ul consta din: compozitia chimica Capat 5’ terminal 4 baze azotate: Adenina (A). si Citozina (C) Un rest de zahar (deoxiriboza) Grupare fosfat Scheletul deoxiriboza-fosfat Legǎturi de hidrogen Capat 3’terminal A T Capat 3’terminal G purine pirimidine C Capat 5’ terminal Baze purinice: A.G Baze pirimidinice: C. Timina (T). T .

Structura ADN-ului: dublu helix ului (complementar) ADN-ul prezinta o structura de elice dublu catenare cnstand din doua catene polinucleotidice care “merg” ele in directii opuse si care sunt mentinute impreuna prin legaturile de hidrogen dintre baze. capatul 5’ capatul 3’ Dublul helix al ADN este constant datorită orientării bazelor spre interior şi a legăturilor de hidrogen dintre ele .

Interactiile dintre bazele existente de-a lungul axei dublu elice Continutul. (cu cit continutul in G si C este mai mare cu atit molecula este mai stabilacresterea constantei de asociere) Specificitatea ADN-ului este data de capacitatea nucleotidelor de a forma numai anumite perechi A-T si C-G . dimensiunea si ordinea bazelor.Stabilitatea ADN-ului este data de Legaturile de hidrogen dintre bazele pereche care apar la intervale regulate de-a lugul axei ADN-ului.

alaturi de complementaritatea perechilor de baze. au permis cercetatorilor sa realizeze o varietate de metode. Aceste caracteristici structurale.Structura ADN-ului: dublu helix (complementar) Bazele sunt bine legate una deasupra alteia in asa fel incat santurile se intind pe intreaga suprafata a helixului. . de la simple la elegante pentru a determina cantitatea de ADN continuta intr-o anumita proba.

Adriamicina. Proteine: tirozina… Proteine: tirozina… .Coloranti: Bromura de etidiu Coloranti: Medicamente: Daunomicina. Antraciclina … Poluanti: Proflavina. Poluanti: Proflavina... Medicamente: Daunomicina. Cloramfenicolul . Adriamicina.

I. Pividori et al. Biosensors & Bioelectronics 15 (2000) 291. ..Proprietati ale ADN-ului: reactia de hibridizare ADN-ul hibridizează prin împerecherea bazelor azotate Recunoasterea intre secvente complementare este dependenta de formarea unor legaturi de hidrogen stabile intre cele 2 catene. M.

. hidrfob si de hidrogen. in timp ce legaturile Ag:Ac apar la nivelul unor centre specifice Diferenta majora fata de reactia Ac-Ag – unde apar interactii de tip ionic.In cardrul reactiei de hibridizare legaturile de hidrogen apar la intervale regulate de lungul structurii ADN-ului.

plante.TEHNOLOGIA GENOSENSORILOR ARE APLICATII FUNDAMENTALE in INTELEGEREA BAZEI MOLECULARE A VIETII PRACTICE In MAPAREA GENETICA-ANALIZA SECVENTELOR DE GENE-la diferite organisme domeniu care contribuie la: Evidentierea mutatiilor genetice cu rol in .identificarea unor agenti patogeni (bacterii. tesuturi umane. apa. virusuri) Elucidarea organizarii genomului uman . etc) Modificarea genetica a diferitelor organisme Realizarea unor noi medicamente . alimente.identificarea unor gene asociate unor posibile boli (de inima.identificarea unor organisme modificate genetic . animale.stabilirea unor diagnosticari prenatale . etc) Elaborarea unor diagnosticari clinice timpurii si a unor terapii bazate pe modificarea genelor asociate diferitelor boli ereditare sau nu Detectia prezentei organismelor patogene/ infectioase in diferite medii (aer. cancer.sol.

.Detectia agentilor patogeni din alimente. 108 bacterii. mediu si de interes medical Agentii patogeni responsabili pentru diferite maladii sau boli precum bacteriile si virusurile. Numarul de specii bacteriene din lume este estimat a fi mai mare ca 1000 de milioane. numarul de specii bacteriene fiind de peste 10.000. sunt detectabili datorita secventei lor unice a ADN-ului 21 de familii de virusuri ce infecteazǎ oamenii infecteazǎ Intr-un gram de sol se gasesc approx.

Reactia de hibridizare este Eficienta Specifica are loc in prezenta unui amestec foarte diferit de molecule de ADN necomplementare E. Talanta 56 (2002) 809-819 . Palecek.Principiul care sta la baza functionarii unui Genosensor Secveta “genei tinta” (cADN-ul sau ADN-ul de detectat) este indentificata prin intermediul unei “gene receptoare” (ssDNA) care impreuna formeaza un hibrid dublu catenar (dsDNA).

Adenina Inozina.Semnalul de oxidare al bazelor din ADN Guanina. Adenina .

.

.

Inozina este un analog electro-inactiv al guaninei. . care se poate lega de citozina prin doua legaturi de hidrogen.

lead electrod screen-printed .

Adaugarea substratului enzimatic pentru Masurarea Electrochimica Tub magnetic .

.Determinarea secventelor specifice de ADN asigura baza detectiei pentru o mare varietate de infectii si boli ereditare.

In functionarea biosensorilor bazati pe ADN trebuiesc indeplinite doua criterii importante: -Sensibilitate mare in detectia unei secvente de nucleotide -Specificitate mare: incluzind detectia unei sinure neimperechere intre baze. sau o singura mutatie a unei baze .

IN PRACTICA sunt necesare metode de punere in evidenta a diferentelor dintre o gena salbatica si una mutanta. precum si a mutatiilor genetice la nivelul unei singure baze azotate. Gena sălbatică –A–T–T–C–G–A–C–T–G–T–A–C–G– –T–A–A–G–C–T–G–A–C–A–T–G–C– Tranziţie (AT este înlocuită cu GC) –A–T–T–C–G–G–C–T–G–T–A–C–G– –T–A–A–G–C–C–G–A–C–A–T–G–C– Transversie (AT este înlocuită cu TA) –A–T–T–C–G–T–C–T–G–T–A–C–G– –T–A–A–G–C–A–G–A–C–A–T–G–C– Inserţie (GC este inserată) –A–T–T–C–G–A–G–C–T–G–T–A–C–G– –T–A–A–G–C–T–C–G–A–C–A–T–G–C– Deleţie (AT este eliminată) – A – T – T – C – G –– C – T – G – T – A – C – G – – T – A – A – G – C –– G – A – C – A – T – G – C – Mutatii posibile la nivelul unei singure baze azotate “single point mutation” Detectia electrochimica a reactiei de hibridizare a permis identificarea a unei singure necomplementaritati la nivelul bazelor azotate .

Enteritidis • Helicobacter pylori • Mycobacterium avium paratuberculosis (MAP) • Virusuri • Virusul viral de diaree bovina • Adenovirusurile (HAdV 40/41) • Virusul gripei aviare . coli O157:H7 • Salmonella Typhimurium. si S.Patogeni de interes • Bacterii • Bacillus anthracis • E.

. B si C care sunt grupati in functie de diferentele in matricea lor de proteine.Virusul gripal care apartine familiei orto-mixovirusurilor este o cauza majora a infectiei respiratorii. Tipul A cauzeaza gripa aviara. tipurile B si C sunt cauzele epidemiilor umane. Acest virus are diferite tipuri de antigeni ca A.