Prof. Valmir F.

Juliano

QUI624
INTRODUÇÃO AOS MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS

Classificação dos métodos analíticos CLÁSSICOS E INSTRUMENTAIS Chamados de métodos de via úmida Baseados em propriedades físicas (químicas em alguns casos )

Gravimetria

Volumetria

Eletroanalítico

Cromatográfico

Espectrométrico

Propriedades elétricas

Propriedades ópticas

Propriedades mistas*

Separação: físico*Separação: interações físico-químicas.

Identificação/quantificação Identificação/quantificação: propriedades ópticas ou elétricas.

Cromatografia
Histórico Mikhail (Michael, Mikhael) Semenovich Tswett (1903), botânico russo: Separação de misturas de pigmentos vegetais em colunas recheadas com adsorventes sólidos e éter de solventes variados.
petróleo mistura de pigmentos CaCO3

pigmentos separados

1906 Cromatografia = chroma [cor] + graphe [escrever] (grego)

e específicos efeitos de afinidade e solubilidade.Princípio Básico Cromatografia é um método físico-químico de físicoseparação de misturas. dipolar. apolar. . através de curvas analíticas. ‡ A separação depende da interação dos componentes da mistura com a fase móvel e com a fase estacionária. ‡ A interação dos componentes da mistura com estas duas fases é influenciada por diferentes forças intermoleculares.Cromatografia Definição . incluindo iônica. identificação e quantificação de seus componentes. ‡ A identificação se dá mediante a comparação da interação de padrões com as fases estacionárias. ‡ A quantificação é feita também pela comparação com padrões de concentrações conhecidas.

Cromatografia Classificação das técnicas cromatográficas ‡ De acordo com o sistema cromatográfico ‡ Em Coluna ‡ Cromatografia Líquida ‡ Cromatografia Gasosa ‡ Cromatografia Supercrítica ‡ Planar ‡ Centrífuga (Chromatotron®) ‡ Cromatografia em Camada Delgada (CCD) ‡ Cromatografia em Papel (CP) .

Cromatografia Classificação das técnicas cromatográficas ‡ De acordo com a fase móvel ‡ Utilização de Gás ‡ Cromatografia Gasosa (CG) ‡ Cromatografia Gasosa de Alta Resolução (CGAR) ‡ Utilização de Líquido ‡ Cromatografia Líquida Clássica (CLC) ‡ Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) ‡ Utilização de Gás Pressurizado ‡ Cromatografia Supercrítica (CSC) .

Cromatografia Classificação das técnicas cromatográficas ‡ De acordo com a Fase Estacionária ‡ Líquida ‡ Sólida ‡ Quimicamente Ligadas ‡ De acordo com o modo de separação ‡ ‡ ‡ ‡ Por Adsorção Por Partição Por Troca Iônica Por Afinidade .

Cromatografia Classificação das técnicas cromatográficas Técnica Planar Coluna FM Líquido Gás Líquido FE Líq Sól Líq Sól Líq Sól Troca Iônica Afinidade Fase Ligada Exclusão Tipo de cromatocromato.CP CCD CGL CGS grafia CLL CLS CTI CB CLFL CE .

Fase estacionária Analitos .Cromatografia Analogia O processo cromatográfico pode ser comparado a um grupo de abelhas e moscas sobrevoando uma certa região. Ao passarem por uma flor. espera-se algum efeito sobre as esperamoscas e abelhas.

Cromatografia Analogia Para uma mesma mistura. a simples troca da fase estacionária pode ser suficiente para alterar completamente a ordem de eluição de componentes da mistura. Fase estacionária Analitos .

Cromatografia
Princípio Básico Separação de misturas por interação diferencial dos seus componentes com uma FASE ESTACIONÁRIA (líquido ou sólido) e uma FASE MÓVEL (líquido ou gás).

Cromatografia
Cromatografia em papel - CP
A mais simples de todas. Pode-se até fazer em casa! PodeFase estacionária líquida suportada na celulose.

Fase móvel

Separação

A cromatografia em papel (CP) é uma técnica de partição, utiliza dois líquidos (líquido(líquido-líquido) sendo um fixado em um suporte sólido (papel de filtro). Um bom exemplo é a separação da tinta verde. Com o processo de cromatografia é possível verificar que a cor verde é uma mistura de tintura azul e amarela.

Cromatografia
Cromatografia em papel - CP
A mais simples de todas. Pode-se até fazer em casa! Pode-

Desenvolvida por Consden, Gordon e Martin em 1944, é bem simples e utiliza pequena quantidade de amostra. Aplica-se na separação e identificação de compostos polares hidrossolúveis.

estacionárias tratadas pode ocorrer também por partição ou troca iônica. largamente utilizada na dédaca de 1960. iônica. principalmente. fundamentado. Cromatografia . mas começou a ser Shraiber.CCD Teve início em 1938 com os trabalhos de Izailov e Shraiber.Cromatografia de Camada Delgada . O processo de separação está 1960. no fenômeno de adsorção. Entretanto com fases adsorção.

Cromatografia de Camada Delgada .CCD Termos e parâmetros técnicos Cromatografia ¨Smancha Rf ! ¨Ssolvente s c a Rfa ! s b Rfb ! s c Rfc ! s b a .

CCD Cromatografia FASES ESTACIONÁRIAS Sílica (SiO2) Alumina (Al2O3) Celulose Poliamida Ativação de 10 min a 105 oC Ativação de 30 a 60 min de 105 a 110 oC .Cromatografia de Camada Delgada .

Comparação com valores de Rf tabelados .Cromatografia de Camada Delgada .CCD Cromatografia ANÁLISE QUALITATIVA .Comparação com padrão eluído em conjunto .Extração e aplicação de métodos instrumentais .

eluir em outros solventes Amostra A B Após Eluição .Cromatografia de Camada Delgada .CCD Cromatografia Conclusões: Amostra não contém a espécie B Amostra pode conter a espécie A Para se certificar da presença. presença.

Cromatografia de Camada Delgada .CCD Cromatografia Cromatografia Bi-dimensional Bi- Solvente 1 Solvente 2 .

. Pode substituir pequenas colunas e HPLC.Cromatografia Cromatografia planar Chromatotron é uma cromatografia de camada fina preparativa acelerada centrifugamente.

Cromatografia em Coluna Cromatografia .

Cromatografia em Coluna Cromatografia PROCESSOS DE SEPARAÇÃO Exclusão Partição Adsorção Afinidade Troca Iônica .

Cromatografia em Coluna Cromatografia ADSORÇÃO .Fase Móvel Líq.Fase Estacionária Sólida Processos de Adsorção/Dessorção Ligações de hidrogênio. . Forças de Van der Waals . ou Gás Líq.

Cromatografia em Coluna Cromatografia Diferença entre Absorção e Adsorção Absorção Adsorção .

Cromatografia em Coluna Cromatografia ADSORÇÃO Fase Estacionária Sólida: Sólida: Polar Aumento da Atividade -CO2H > -OH > -NH2 > -SH > -CHO > -C=O > -CO2R > -OCH3 > -CH=CHCH=CH- .

Cromatografia em Coluna A função das fases móveis na cromatografia por adsorção tem sentido amplo: a) Função solvente b) Função eluente ‡ Solubilizar os componentes ‡ Ter baixo ponto de ebulição ‡ Conduzir os componentes da mistura pela coluna ‡ Remover ou dessorver estes componentes do adsorvente (FE) Cromatografia SOLVENTES: Polaridade em Ordem Crescente Hexano < Éter de Petróleo < Ciclohexano < Tetracloreto de Carbono < Benzeno < Tolueno < Diclorometano < Clorofórmio < Éter Etílico < Acetato de Etila < Acetona < Etanol < Metanol < Ácido Acético .

etc.Cromatografia em Coluna Cromatografia ADSORÇÃO Usos: a) Laboratórios de química orgânica separar e purificar reagentes e materiais obtidos em síntese. b) Laboratórios de produtos naturais escala preparativa e analítica. . c) Laboratórios de análises clínicas separação de esteróides de urina ou de sangue.

Cromatografia em Coluna Cromatografia PARTIÇÃO Fase Móvel Gasosa Fase Estacionária Líquida Processos de Solubilidade O processo de partição é intrafacial e a volta de cada componente para a fase móvel depende da sua volatilidade. volatilidade .

Cromatografia em Coluna Cromatografia PARTIÇÃO Fase Móvel Líquida Fase Estacionária Líquida Processos de Solubilidade O processo de partição é intrafacial e a volta de cada componente para a fase móvel depende da sua solubilidade. solubilidade .

Cromatografia TROCA IÔNICA Fase Móvel Líquida Fase Estacionária Sólida Processos de Troca Iônica Adsorção reversível e diferencial dos íons da fase móvel pelo grupo trocador da matriz .Cromatografia em Coluna Por volta de 1935 começaram a ser fabricadas resinas de troca iônica orgânicas. passando a constituir um meio químico de extraordinário valor em processos analíticos. muito eficientes.

Cromatografia em Coluna Cromatografia TROCA IÔNICA Fluxo da FM FE altamente carregada Maior Interação ‡ Íons de alta carga ‡ Íons de menor tamanho A diferença de afinidade entre os íons da FM pode ser controlada por pH e força iônica Resinas Catiônicas e Aniônicas .

Cromatografia em Coluna Cromatografia O ajuste do pH proporciona a separação das duas proteínas .

.Cromatografia em Coluna Cromatografia EXCLUSÃO Fase Móvel Líquida Fase Estacionária em Gel Enquanto as partículas menores penetram nas cavidades. as maiores vão sendo eluídas contornando as estruturas moleculares da FE.

Cromatografia em Coluna Cromatografia EXCLUSÃO A propriedade que distingue a cromatografia de exclusão. . de outros tipos de cromatografia é que o recheio (FE) é um gel não carregado constituído de macromoléculas que têm ligações cruzadas. mas que neles são insolúveis. com afinidade pelos solventes.Determinação de Massa Molar .Separação de polímeros e proteínas . introduzida por volta de 1960.Separação de tamanhos específicos .

. -Baixo teor de íons: íons: Grupos carregados interferem no processo de separação.Cromatografia em Coluna Cromatografia EXCLUSÃO Não pode haver uma interação química entre a matriz e o soluto. -Inércia Química: Química: -Estabilidade: Estabilidade: Características desejáveis para os Géis O gel deve suportar uso contínuo quanto mantido em condições brandas de temperatura e pH.

Cromatografia em Coluna Cromatografia EXCLUSÃO Fluxo da FM Tipos de Géis Dextrano (Sephadex) Poliacrilamida Ágar e Agarose .

Cromatografia em Coluna Cromatografia AFINIDADE Fase Móvel Líquida Fase Estacionária Sólida Propriedades Biológicas e Funcionais .

mas com grande importância na CLAE FASE MÓVEL FASE ESTACIONÁRIA .Cromatografia Teoria Básica SOLUTO Sem importância na CG.

Cromatografia Teoria Básica Coluna cromatográfica série de estágios independentes onde acontece o cromatográfica: equilíbrio entre o analito dissolvido (sorvido) na fase estacionária e na fase móvel: Ocorre um ´quase-equilíbrioµ entre o analito sorvido na FE e dissolvido na FM. KC ! ? A A FE ? A A FM Afinidade pela FE [A]FE MENOR RETENÇÃO !!! Volatilidade [A]FM KC = Constante de Distribuição [A]FE = concentração do analito na FE [A]FM = concentração do analito na FM .

a FE e a FM: O número de pratos teóricos de uma coluna (N) pode ser calculado por: Cada ´estágioµ de equilíbrio é chamado de PRATO TEÓRICO tR wb N Coluna mais eficiente .Cromatografia Quantificação da eficiência Supondo a coluna cromatográfica como uma série de estágios separados onde ocorre o equilíbrio entre o analito.

435 0.549 0.32 0.32 0.25 0.156 0.32 0.25 0.53 0.426 0.500 N 370370 192308 150000 131579 102041 68966 70423 43924 3643 4000 Empacotadas.00 5.294 0.00 10% 5% H 0.683 0.00 1.Cromatografia Quantificação da eficiência ALTURA EQUIVALENTE A UM PRATO TEÓRICO (H) ´Tamanhoµ de cada estágio de equilíbrio (L = comprimento da coluna) Capilares.25 0.50 1. mas como L para capilares é MUITO maior tipicamente elas são mais eficientes .53 2.081 0.10 0. L = 30 m dc = diâmetro da coluna em mm df = espessura da fase estacionária em Qm Valores típicos de H e N: dC 0.00 5.16 2.32 0.32 0.200 0.16 df 0.228 0. L = 2 m Valores de H para colunas capilares e empacotadas são próximos.

Cromatografia Cromatografia em fase gasosa Fase estacionária Detecção Fase móvel Separação .

Cromatografia Cromatografia em fase gasosa Injetor: submetido à temperatura controlada Fase móvel: gás inerte Detector: submetido à temperatura controlada Coluna: contendo a fase estacionária está submetida à temperaturas controladas .

Cromatografia Gasosa Aplicabilidade Quais misturas podem ser separadas por CG ? para uma substância qualquer poder ser ´arrastadaµ por um fluxo de um gás ela deve dissolver-se. . Misturas cujos constituintes sejam VOLÁTEIS (=´evaporáveisµ) DE FORMA GERAL: CG é aplicável para separação e análise de misturas cujos constituintes tenham PONTOS DE EBULIÇÃO de até 300oC e que sejam termicamente estáveis. pelo menos parcialmente. nesse gás.

nem com a fase estacionária ou superfícies do instrumento.Cromatografia Gasosa Requisitos .Gás de arraste (FM) INERTE: Não deve reagir com a amostra. Impurezas típicas em gases e seus efeitos: H2O. PURO: Deve ser isento de impurezas que possam degradar a fase estacionária. O2 hidrocarbonetos oxida / hidrolisa algumas FE incompatíveis com DCE ruído no sinal de DIC .

0) PUREZA COMPATÍVEL COM DETECTOR: Cada detector demanda um gás de arraste específico para melhor funcionamento. H2 N2 (SS). Seleção de Gases de Arraste em Função do Detector: DCT DIC DCE He .0) C = 99. Ar + 5% CH4 .999 % (5.995 % (4.Gás de arraste (FM) CUSTO: Gases de altíssima pureza podem ser muito caros.Cromatografia Gasosa Requisitos . H2 N 2 .9999 % (6. CUSTO A = 99.5) C A B B = 99.

Cromatografia Gasosa Injetor Os dispositivos para injeção (INJETORES ou VAPORIZADORES) devem prover meios de introdução INSTANTÂNEA da amostra na coluna cromatográfica t = 0 Injeção instantânea: t = x t = 0 Injeção lenta: t = x .

Alimentação de gás de arraste) 3 .Cromatografia Gasosa Injetor ´on columnµ 1 2 1 .Septo (silicone) 3 2 .Bloco metálico aquecido 4 .Ponta da coluna cromatográfica 4 .

2 . 3 .Ponta da agulha da microsseringa é introduzida no início da coluna. 1 2 3 .Cromatografia Gasosa Injetor ´on columnµ 1 .Amostra injetada e vaporizada instantaneamente no início da coluna.´Plugµ de vapor de amostra forçado pelo gás de arraste a fluir pela coluna.

2 mm (1/4µ) capilar ˆ = 0..Cromatografia Gasosa Parâmetros de injeção TEMPERATURA DO INJETOR: Deve ser suficientemente elevada para que a amostra vaporize-se imediatamente. mas sem decomposição.... 3 QL Amostras Gasosas 0.1 mL . Regra Geral: Tinj = 50oC acima da temperatura de ebulição do Geral componente menos volátil. 20 QL 0. Sólidos: Sólidos convencionalmente se dissolve em um solvente adequado e injeta-se a solução COLUNA empacotada ˆ = 3... VOLUME INJETADO: Depende do tipo de coluna e do estado físico da amostra.. 100 QL .2 QL . 50 mL 1 QL .01 QL ..25 mm Amostras Líquidas 0.

5 QL e 10 QL êmbolo agulha (inox 316) Microsseringa de 10 Q L: corpo (pirex) corpo agulha Microsseringa de 1 Q L (seção ampliada): guia êmbolo (fio de aço soldado ao guia) .Cromatografia Gasosa Microsseringas para injeção LÍQUIDOS: Capacidades típicas: 1 QL.

5 mm L = 5 m a 100 m Paredes internas recobertas com um filme fino (fração de Qm) de FE líquida ou sólida .Cromatografia Gasosa Colunas EMPACOTADA ˆ = 3 a 6 mm L = 0.1 a 0.5 m a 5 m Recheada com sólido pulverizado (FE sólida ou FE líquida depositada sobre as partículas do recheio) CAPILAR ˆ = 0.

Estrutura química do analito p0 = f Temperatura da coluna Temperatura da coluna Pressão de vapor Velocidade de migração ANALITO ELUI MAIS RAPIDAMENTE (MENOR RETENÇÃO MENOR RETENÇÃO) . o tempo que um analito demora para percorrer a coluna depende de sua PRESSÃO DE VAPOR (p0).Cromatografia Gasosa Temperatura da coluna Além da interação com a FE.

Cromatografia Gasosa Temperatura da coluna AUMENTO DA TEMPERATURA DA COLUNA CONTROLE CONFIÁVEL DA TEMPERATURA DA COLUNA É ESSENCIAL PARA OBTER BOA SEPARAÇÃO EM CG .

Componentes mais voláteis não são separados .Componentes menos voláteis demoram a eluir. saindo como picos mal definidos .Cromatografia Gasosa Programação linear de temperatura Misturas complexas (constituintes com volatilidades muito diferentes) separadas ISOTERMICAMENTE: TCOL BAIXA: TCOL ALTA: .Componentes mais voláteis são separados .Componentes menos voláteis eluem mais rapidamente .

Tempo Isotérmico Inicial tFIM .Temperatura Inicial TFIM .Tempo Final do Programa R .Velocidade de Aquecimento .Cromatografia Gasosa Programação linear de temperatura A temperatura do forno pode ser variada linearmente durante a separação: separação: TEMPERATURA TFIM R TINI tINI TEMPO tFIM ConsegueConsegue-se boa separação dos componentes da amostra em menor tempo TINI .Temperatura Final tINI .

Cromatografia Gasosa Programação linear de temperatura a) Isotérmico a 45 ºC. c) programado de 30 ºC a 180 ºC . b) isotérmico a 145 °C.

viscosidade vazão DERIVA (´DRIFTµ) NA LINHA DE BASE: Devido ao aumento de volatilização de FE líquida .Cromatografia Gasosa Programação linear de temperatura Possíveis problemas associados à PLT: VARIAÇÕES DE VAZÃO DO GÁS DE ARRASTE: A viscosidade de um gás aumenta com a temperatura.

FE Seletiva: separação adequada dos constituintes da amostra FE pouco Seletiva: má resolução mesmo com coluna de boa eficiência .. apolar..Cromatografia Gasosa Fase Estacionária REGRA GERAL: a FE deve ter características tanto quanto possível GERAL: próximas das dos solutos a serem separados (polar.) FE SELETIVA (ideal): Deve interagir diferencialmente com os componentes da amostra. aromático .

pares de elétrons.Cromatografia Gasosa Fase estacionária sólida ‡ O fenômeno físico-químico responsável pela interação analito + FE sólida é a ADSORÇÃO A adsorção ocorre na interface entre o gás de arraste e a FE sólida ‡ Sólidos com grandes áreas superficiais (partículas finas...) . poros) ADSORÇÃO ‡ Solutos polares ‡ Sólidos com grande número de sítios ativos (hidroxilas.

Cromatografia Gasosa Fase estacionária líquida ‡ O fenômeno físico-químico responsável pela interação analito + FE líquida é a ABSORÇÃO A absorção ocorre no interior do filme de FE líquida (fenômeno INTRAfacial) INTRAfacial) ‡ Filmes espessos de FE líquida ‡ Grande superfície líquida exposta ao gás de arraste ‡ Interação forte entre a FE líquida e o analito (grande solubilidade) ABSORÇÃO .

FÁRMACOS . muitos fármacos apenas um dos isômeros óticos têm atividade farmacológica.Cromatografia Gasosa Fase estacionária quirais ‡ As propriedades físico-químicas dos isômeros óticos são MUITO SIMILARES FE convencionais não interagem diferencialmente com os isômeros óticos. sintético = muitas vezes são misturas racêmicas). óticos PRODUTOS BIOLÓGICOS .Distinção entre produtos de origem sintética e natural (natural = normalmente substâncias oticamente puras.Em .

2. Boa estabilidade e reprodutibilidade. quando da passagem de substâncias que não o gás de arraste. 6. Não destrutivo. Tempo de resposta curto e independente da vazão. . 4. Características ideais: ideais 1. 8. Faixa de temperatura desde a ambiente até pelo menos 400 ºC. 5. gerando sinal eluído. 3. Alta confiabilidade e facilidade de uso. 7. Resposta linear para solutos que se estenda por várias ordens de grandeza. Alta sensibilidade: 10-8 a 10-15 g de soluto/s. Similaridade de resposta para todos os solutos.Cromatografia Gasosa Detectores Dispositivos que examinam continuamente o material eluído.

Cromatografia Gasosa Detectores REGISTRO DE SINAL ANALÓGICO Registradores XY DIGITAL Integradores Computadores Gráfico Sinal x Tempo = CROMATOGRAMA Idealmente: cada substância separada aparece como um PICO no cromatograma. .

SELETIVOS: ESPECÍFICOS: Detectam substâncias que possuam determinado elemento ou grupo funcional em suas estruturas .Cromatografia Gasosa Detectores DCT DCE DNP Geram sinal para qualquer substância eluída. UNIVERSAIS: Detectam apenas substâncias com determinada propriedade físico-química.

.Funcionamento DETECTOR POR CONDUTIVIDADE TÉRMICA (DCT OU TCD): Variação da condutividade térmica do gás de arraste. Os eluatos queimados na chama H2 + ar passam por uma superfície de silicato de rubídio onde se formam íons de moléculas com N e P. DETECTOR TERMOIÔNICOS (DNP OU NPD): Modificação do DIC.Cromatografia Gasosa Detectores . DETECTOR POR IONIZAÇÃO EM CHAMA (DIC OU FID): Íons gerados durante a queima dos eluatos em uma chama de H2 + ar. DETECTOR POR CAPTURA DE ELÉTRONS (DCE OU ECD): Supressão de corrente causada pela absorção de elétrons por eluatos altamente eletrofílicos.

O2. H2O. Não responde a gases nobres. CX4. (104) DETECTOR TERMOIÔNICO (DNP OU NPD): Específico Específico. DETECTOR POR IONIZAÇÃO EM CHAMA (DIC OU FID): DETECTOR POR CAPTURA DE ELÉTRONS (DCE OU ECD): Seletivo.1 a 1 pg (P) e 0.105) . SiX4 (X=halogênio). NO2. CO2. N2O. CS2.01 a 1 pg com linearidade até ng. CO. Universal.4 a 10 pg (N) com linearidade até ng. Sensibilidade: 0. Sensibilidade: 0. Seletivo Responde muito bem a halogenetos orgânicos. Quase-universal. Quase-universal Detecta qualquer substância que contenha ligações C-H. H2.Cromatografia Gasosa Detectores ² Limites de detecção DETECTOR POR CONDUTIVIDADE TÉRMICA (DCT OU TCD): Universal Observa-se para qualquer substância eluída.4 a 1 ng com linearidade até dezenas de Qg (104). N2. Sensibilidade: 10 a 100 pg com linearidade até mg (107 ² 108). nitrilas. NH3. aldeídos conjugados. (103 . NO. Sensibilidade: 0. Responde a compostos orgânicos com N e P. nitratos e organometálicos.

mesmo que complexo. no espectrômetro de massa.Cromatografia Gasosa Detectores ² Espectrometria de massas CG-EM (GC-MS): Universal / Seletivo / Específico Um dos Específico. Observa-se para qualquer substância eluída um sinal. Detecção TIC Universal Similar a DCT SIM Seletivo Maior Sensibilidade . detectores mais poderosos para a cromatografia gasosa é o espectrômetro de massas. É seletivo ou específico quando monitora-se um fragmento de determinada razão m/z.

Cromatograma de íons totais: TIM ou TIC Em cada posição do cromatograma tem-se um espectro de massa.Cromatografia Gasosa Detectores ² Espectrometria de massas CG-EM (GC-MS): Universal / Seletivo / Específico Específico. CONTAGENS CONTAGENS MASSA / CARGA TEMPO .

Cromatografia Gasosa Detectores ² Espectrometria de massas CG-EM (GC-MS): Universal / Seletivo / Específico Específico. Oferece a vantagem de registrar somente o sinal do constituinte de interesse. demais CONTAGENS MASSA / CARGA CONTAGENS TEMPO . sendo ´cegoµ para os demais. Cromatograma de íons selecionados: SIM Em cada posição do cromatograma tem-se o sinal somente da m/z selecionada.

. Câmara de Ionização CG EM Coluna Capilar Vácuo Separador Molecular O gás de arraste leve (He) difunde mais rapidamente que o analito e tende a ser drenado para o vácuo. Interface Capilar Direta Com colunas capilares a vazão baixa de gás de arraste pode ser drenada pelo sistema de vácuo.Cromatografia Gasosa Detectores ² Espectrometria de massas CG-EM (GC-MS): Interface CG-EM CG-EM.

tM SINAL tR = Tempo de Retenção (tempo decorrido entre a injeção e o ápice do pico cromatográfico) tM = Tempo de Retenção do Composto Não-Retido (tempo mínimo para um composto que não interaja com a FE atravesse a coluna) tR· = Tempo de Retenção Ajustado (tempo médio que as moléculas do analito passam sorvidas na FE) tM TEMPO .Cromatografia Gasosa Análise qualitativa O parâmetro diretamente mensurável de retenção de um analito é o TEMPO DE RETENÇÃO AJUSTADO. tR·: tR tR ¶ = tR .

3.25 mm x 0.25 Qm Detector FID: 250 ºC Injetor com divisão de fluxo 1:25: 250 ºC Volume injetado: 1 QL Mistura de benzeno. Como se explica esta ordem de eluição? 1. A n-propanona elui primeiro devido à sua maior volatilidade. n-propanona.Cromatografia Gasosa Análise qualitativa Coluna HP-Innowax (PEG ² altamente polar): 30 m x 0. nn-propanol. n-butanol. O benzeno em segundo devido sua natureza apolar (menor I). a volatilidade se torna o principal parâmetro que define a ordem de eluição. 2. Para os demais compostos. . isobutanol e nn-pentanol. cujas diferenças de polaridade não são elevadas.

Cromatografia Gasosa Análise quantitativa O parâmetro diretamente relacionado à quantidade de analito é: ‡ Altura da banda cromatográfica: não recomendado. SINAL Área Altura TEMPO . pois a banda necessita ser perfeitamente simétrica. ‡ Área da banda cromatográfica.

Cromatografia Gasosa Análise quantitativa amostra Área Concentração tempo .

05 S 0.95 S MASSA .Cromatografia Gasosa Análise quantitativa A partir de certo ponto o sinal não aumenta mais linearmente ÁREA O fim da zona de linearidade pode ser detectado quando a razão (Área / Massa) diverge em mais de 5 % da inclinação da reta na região linear: ÁREA / MASSA MASSA 1.

Cromatografia Gasosa
Análise quantitativa
Área Concentração Adicionada
tempo

concentração na amostra amostra

Cromatografia Líquida
Cromatografia em fase líquida

Cromatografia Líquida - CLAE
Aplicabilidade
Quais misturas podem ser separadas por CLAE ?
para uma substância qualquer poder ser ´arrastadaµ por um líquido ela deve dissolver-se nesse líquido.

Líquidos e sólidos, iônicos ou covalentes com massa molar de 32 até 4000000.

DE FORMA GERAL: CL é aplicável para separação e análise de misturas cujos constituintes sejam solúveis na FM. Não há limitação de volatilidade ou de estabilidade térmica. térmica.

Cromatografia Líquida Aumento de polaridade Insolúvel em água Apolar Solúvel em água Iônico Tipos e Aplicações da Cromatografia Líquida Massa molecular 102 Polar não iônico Partição Partição em fase reversa Partição em fase normal Adsorção 103 Troca iônica 104 Permeação em gel 105 Exclusão Filtração em gel 106 .

Cromatografia Líquida Componentes típicos .CLAE .

Cromatografia Líquida Esquema de um equipamento para CLAE .

1 a 10 mL/min 4 ² Controle e reprodutibilidade de fluxo de 0.5% ou melhor 5 ² Componentes resistentes à corrosão Bomba recíproca (também são chamadas de bombas de pistão ou de diafragma) .Velocidades de fluxo de 0.Cromatografia Líquida Requisitos dos sistemas de bombeamento 1 ² Geração de pressões até 6.000 psi 2 ² Saída com ausência de pulsos 3.

5 a 5 QL .Cromatografia Líquida Sistemas de injeção de amostras Suportam pressões de até 7.000 psi Volumes típicos: 5 a 500 QL Microamostragem: 0.

a razão entre os solventes é variada de modo programado. de forma contínua ou em passos. ‡ Eluição isocrática: isocrática: ‡ Quando a separação é feita utilizando um único solvente de composição constante. . ‡ Eluição com gradiente: gradiente A eluição com gradiente produz efeitos similares aos produzidos pela programação de temperatura na CG. ‡ São utilizados dois ou três sistemas de solventes que diferem bastante entre si em polaridade.Cromatografia Líquida Fase móvel para CLAE Solvente puros ou misturas de solventes de acordo com a polaridade requerida na separação. ‡ Depois que a eluição começa.

Cromatografia Líquida Eluição com gradiente Coluna C18. fase reversa Detector fluorescência: excit. 5 Qm. 334 nm ² emis. 425 nm .

No entanto. embora tubos de vidro com paredes resistentes sejam encontrados ocasionalmente. diferindo entre si no tamanho e na fase estacionária. . Existem comercialmente centenas de colunas empacotadas. estes últimos são restritos a pressões mais baixas do que 600 psi.Cromatografia Líquida Colunas para CLAE As colunas geralmente são construídas de aço inox. Preços variam de 200 a 500 dólares.

Cromatografia Líquida Colunas para CLAE ‡Remoção de material particulado Pré-coluna ‡Contaminantes do solvente ‡Contaminantes da amostra ‡Saturar a FM com a FE Aumenta a vida útil da coluna COLUNAS TÍPICAS ‡Material aço inox Material: ‡Comprimento 10 a 30 cm Comprimento: ‡Diâmetro 4 a 10 mm Diâmetro: ‡FE Partículas de 5 a 10 Qm FE: ‡Eficiência 40 mil a 60 mil Eficiência: pratos/metro .

dipropil-ftalato dipropil8.anisol 3.dibutil-ftalato dibutil7.dipentil-ftalato dipentil6.0.4 cm d.000 pratos/metro FM: 4.Cromatografia Líquida Separação isocrática de alta velocidade Coluna de alta velocidade e alta eficiência . .dietil-ftalato dietil- .dioctil-ftalato dioctil5.acetato de benzila 4.i.1% EtAc em n-Hexano 1² p-xileno 2.FE: spherisorb 3 Qm 100.4 cm de comprimento .

As partículas são constituídas dos mesmos materiais do recobrimento pelicular pelicular. com diâmetros típicos da ordem de 30 a 40 Qm. recoberto com uma camada fina e porosa de: ‡ Sílica ‡ Alumina ‡ Resina de poliestireno-divinil-benzeno ‡ Resina trocadora de íons ‡ Partícula porosa porosa: ‡ Consiste de micropartículas porosas com diâmetros de 3 a 10 Qm.Cromatografia Líquida Fase estacionária para CLAE Basicamente são dois tipos de FE: ‡ Pelicular: ‡ Consiste de leitos de polímero ou vidro não-poroso. . esférico.

Tempo de resposta curto e independente da vazão. .Não destrutivo. 4. 8. Características ideais ideais: 1. fluorescência. 3.Cromatografia Líquida Detectores As características desejáveis para os detectores para CLAE não são diferentes daquelas para CG.Volume interno mínimo e compatível com a vazão e com a pressão.Alta sensibilidade: 10-8 a 10-15 g de soluto/s. etc).Alta confiabilidade e facilidade de uso.Similaridade de resposta para todos os solutos. 2. 6. densidade ou constante dielétrica).Resposta linear para solutos que se estenda por várias ordens de grandeza.Boa estabilidade e reprodutibilidade. ‡ Propriedades do soluto (absorbância. 5. 7. Existem dois tipos de detectores: ‡ Propriedades universais (índice de refração.

Cromatografia Líquida Detectores ‡ Absorbância ‡ UV/Vis ² S: 10-9 g/mL ² FL: 105 ‡ IV ‡ Fluorescência ² S: 10-9 a 10-12 g/mL ² FL: 103 ‡ Índice de refração (universal) ² S: 10-7 g/mL ² FL: 104 .

Eletroquímicos: Embora não sejam tão explorados quanto os detectores ópticos. ‡ Amperométricos ‡ Coulométricos ‡ Condutométricos ² S: 10-8 g/mL ² FL: 104 ‡ Polarográficos ² S: 10-12 g/mL ² FL: 106 .Cromatografia Líquida Detectores ‡ Eletroquímicos: existem vários tipos disponíveis atualmente. eles apresentam algumas vantagens como alta sensibilidade. simplicidade e ampla aplicabilidade.

Cromatografia Líquida Detectores ‡ Espectrometria de massa . Interface CL-EM .universal ‡ Assim como na CG-EM. o acoplamento de um espectrômetro de massa potencializa a técnica de separação e quantificação ‡ Um grande problema é o descompasso entre os volumes relativamente grandes de solventes na CL e os requisitos de vácuo na EM.

Cromatografia Líquida Detectores ‡ Espectrometria de massa CONTAGENS TIC SIM CONTAGENS CONTAGENS MASSA / CARGA CONTAGENS MASSA / CARGA TEMPO TEMPO .

. a FM líquida da CLAE interage tanto quanto a FE com os componentes da amostra. onde a FM se comporta como um gás ideal e não contribui para o processo de separação.Cromatografia Líquida Tipos de CLAE Ao contrário da CG. Isto torna o desenvolvimento dos métodos em CLAE um tanto mais complexo que na CG.

água) normal: FM apolar (ex. . reversa Fase normal: FE de natureza fortemente polar (ex. hidrocarbonetos) reversa: FM polar (ex.Cromatografia Líquida Tipos de CLAE ‡ PARTIÇÃO líquido-líquido e fase ligada. hexano ou éter isopropílico) O componente menos polar é eluído primeiro por ser o mais solúvel na fase móvel. Fase reversa: FE de natureza apolar (ex. metanol ou acetonitrila) O componente mais polar aparece primeiro e o aumento da polaridade da fase móvel aumenta o tempo de eluição. suporte do empacotamento Adsorção e ligação química Dois tipos podem ser distinguidos: Fase normal e Fase reversa. A diferença entre PARTIÇÃO: elas consiste em como a FE é mantida nas partículas do química. água.

Cromatografia Líquida Tipos de CLAE ‡ É provável que ¾ de toda a CLAE esteja baseada na fase reversa ligada. onde o grupo R do siloxano nesses recobrimentos é uma cadeia C8 (n-octil) ou C18 (n-octadecil) octil) octadecil) .

corantes industriais Pesticidas. esteróides. narcóticos Ácidos de bílis. analgésicos Aminoácidos. lipídios Adoçantes artificiais. estrógenos .Cromatografia Líquida Campo Farmacêutico Bioquímico Produtos alimentícios Produtos químicos Poluentes Química forense Clínica médica Tipos de CLAE Misturas típicas Antibióticos. álcool no sangue. herbicidas. aflatoxinas. extratos de urina. propelentes. metabólitos de drogas. surfactantes. carboidratos. antioxidantes. venenos. sedativos. PCB (bifenilas policloradas) Drogas tóxicas. fenóis. proteínas. aditivos Aromáticos condensados.

clássica da CL introduzida no início do século 20. EXCLUSÃO: gel. FE gel Um material polimérico. tem-se a cromatografia de EXCLUSÃO DE ÍONS. FE sílica ou alumina É a forma ADSORÇÃO: alumina.Cromatografia Líquida Tipos de CLAE ‡ ADSORÇÃO líquido-sólido. ‡ TROCA IÔNICA líquido-sólido. ÍONS . ‡ EXCLUSÃO líquido-gel. são capazes de promover a separação de acordo com os tamanhos das moléculas EXCLUSÃO DE TAMANHO. com muitas ligações cruzadas. Sofreu adaptações e tornou-se o mais importante dos métodos de HPLC. FE resina com capacidade IÔNICA: de troca iônica iônica. Se o TAMANHO material reticulado for uma resina de troca iônica. hidrofóbicos ou hidrofílicos.

independentemente do tipo de detector utilizado. . A área sob a banda cromatográfica de duas substâncias diferentes dependerá da resposta do detector para aquele tipo de substância. a área ou altura aumentam com o aumento da concentração.Cromatografia Para refletir e responder: Duas substâncias diferentes com a mesma concentração apresentarão a mesma área sob suas bandas cromatográficas? Para um mesmo analito.

Cromatografia Para refletir e responder: A CG pode ser usada indistintamente para qualquer tipo de analito? A CL é útil quando a CG não pode ser usada. Quais são os casos em que isto ocorre? .

FIM .