Crystallographic Studies on Recombinant Human Stem Cell Factor ­ 141

17 November, 2008

Ogan Gurel Prof. Wayne A. Hendrickson

Crystallization Experiments
The full­length extra­cellular form of SCF is very soluble and after preliminary  screening trials, no crystals were obtained.  Screening with the 141 amino acid­ long truncated form was more successful, however crystals that were ultimately  of the orthorhombic form were quickly obtained.  When these crystals were first  observed, their complexity and uniqueness were not completely appreciated.  As  it turns out, the conditions for crystallization are actually quite specific and  furthermore a number of crystal types may appear within the same droplet.  The  sensitivity to conditions makes it difficult to systematically evaluate the  multiplicity of crystal types, while this multiplicity complicates the subsequent  diffraction analysis.  Tables 1 & 2 summarize these results.

Photo # 1: Photo # 2:

Orthorhombic crystals (long & block) Hexagonal crystals

2

Table 1.  rhSCF­141 Crystallization Conditions Crystal Type ORTHORHOMBIC Initial crystallization  droplet
14.5 % PEG 400 12.5M  CaCl2

Equilibrium reservoir &  temperature
29% PEG 400 0.25 M CaCl2 100mM HEPES pH 7.5

Types A1, A2, & B

50mM HEPES pH 7.5 50mM NaCl 5mM NaAcetate 5mg/ml rhSCF­141

T = 22°C

HEXAGONAL

0.29M Na.K phosphate               pH 9.0

2.0 M Na/K phosphate

Type C

0.29% PEG 400 57mM NaCl 5.7mM NaAcetate 5.7mg/ml rhSCF­141

T = 22°C

3

4

Table 2.  Crystallization parameters for the  Diffraction Experiments Orthorhombic form Parameter pH dependence Discussion
Crystals grow best (single & clean faces)  when equilibrated to a reservoir at pH 7.5.  Crystals become poorly formed at pH 7.3 to  7.4 and do not grow at below pH 7.3.  However, the crystals are optimally stabilized  at a slightly lower pH of7.2 to 7.3. The optimum temperature is 22°C. Experiments that were done at 20 °C yielded  poorly formed crystals while those done in  the cold room 4 °C resulted in  microcrystalline spherulites. Calcium seems to be required for the  orthorhombic (not the hexagonal) crystals.  Substitution with Mg or Zn resulted in phase  separation / precipitation and heavy  precipitation respectively. Strongly inhibited crystallization at all  concentrations (0.1% ­ 1%). Crystallization with MOPS or TRIS buffers at  the equivalent or slightly different pH ranges  resulted in poorly formed crystals.  With TRIS  the long forms (A1) seemed to predominate. The crystals grow in 4 to 5 days in the  presence of a heavy precipitate. See picture 1.  Either a "long form" (mostly  type A1) or a "block form" (mostly type A2 &  B). Moderately birefringent (biaxial), which the  block form being slightly stronger. Long form:  0.3 x 0.15 x 0.15 mm Block form:  0.35 x 0.25 x 0.25 mm

Temperature dependence

Divalent cation dependence

β­octyl glucoside (BOG) Different buffers

Growth characteristics Crystal morphology

Birefringence Crystal dimensions (average)

5

Stabilization Initial experiments were made difficult by the relative radiation sensitivity of  these orthorhombic SCF crystals.  The crystals would last less than 48 hours in  the x­ray beam with a useful life of just one day.  To improve the crystal lifetimes,  stabilization conditions were screened which substantially increased the useful  beam time to over 100 hours.  In addition, stabilization and careful drying also  yielded some improvements in the maximum diffraction limits.  The stabilization  conditions are outlined below: Table 3. Stabilization  conditions
30% PEG 400 0.25M CaCl2 100 mM HEPES pH 7.2 100 mM NaCl

Crystals are placed overnight in stabilization vials and then mounted with the  stabilization buffer serving as the mother liquor. Diffraction limits Initial experiments seemed to present confusing results in that some  orthorhombic crystals seemed to diffract well, while others diffracted quite  poorly.  The differences in diffraction quality did not seem to correlate with  crystal size and it became apparent that we were potentially dealing with a  number of crystal types.  Although, these types have not been completely  defined, their putative diffraction limits (AFC5 rotating anode, 50kV,  100mA) are  listed below:

6

Table 4: Diffraction limits for  the orthorhombic crystals Crystal Type Consistent  diffraction  limit 3.8 3.1 2.8 Some spots seen to:

A1 A2 B

3.7 2.9 2.7

The hexagonal crystals do not seem to diffract well (only to about 6 Angstroms or  so).

Diffraction Photographs
Photo # 1:

Type B (?) still (relatively wet crystal) small angle precession, 0.3 mm collim/Ni filter, F=75mm. Type A2 still 0.2 degrees, 2.8 hours, 0.5 mm collim/Ni filter, F=75mm Type A1 precession photo 7 degrees, 16 hours, 0.5 mm collim/Ni filter., F=75mm

Photo # 2: 

Photo # 3:

7

Crystal Parameters
Precession photographs (screened & unscreened) on the orthorhombic crystals  show the following features: Table 5: Reciprocal space features of the  orthorhombic crystals Symmetry Systematic absences Reciprocal space angles mm symmetry in all major zones (both  0 level and upper levels) odd absences along all three axes  indicative of a 21 screw. All axes are orthogonal.

8

These features point to space group P212121.  Crystal form B has not been fully  characterized, but is certainly orthorhombic with at least two screw axes. Table 6. Crystal Parameters Crystal  type A1 A2 B C Space  group P212121 P212121 P21212?
hexagonal by  external  morphology

a (Å) (88.2* 89.2** 88.1* 81.9 N.A.

b (Å) 84.4* 84.4** 83.4* 62.5 N.A.

c (Å) 73.1* ) 73.7** 72.7* 54.0 ? N.A.

Volume (Å3) 554,849 534166 276412 N.A.

n   (# in  solvent  au). content n=2 n=4 n=2 n=4 n=1 n=2 N.A. 73% 46% 72% 43% 73% 45% N.A.

* by precession ** by area detector refinement Judging from the robustness of the crystals and the quality of diffraction ­­ its  limits and water background) there are most likely 4 molecules per asymmetric  unit in the orthorhombic A form.  

9

Native Data Collection
Data were collected on orthorhombic form A1 using the AFC6 rotating anode 

source (50kV, 100mA) and a Hamlin multiwire area detector (one detector  configured at F = 560 mm).   Data collection began about 1.5 days after initial x­ ray irradation and the total actual data collection time took about 24 hours using  4 orientations (500 frames each at 45 sec/frame).  Unfortunately, the data  collection program went into an unexplained loop and the collection had to be  interrupted and resumed.  The later batches appeared to be affected by radiation  damage.  A total of 15269 observations were recorded with 5540 independent  Table 7.  Data collection statistics by resolution shell. Dmin 4.37 4.24 4.11 4.00 3.90 3.80 Rfac 0.114 0.111 0.134 0.133 0.187 0.197 Rcum 0.077 0.079 0.081 0.083 0.085 0.087 Intensity  >3σ 70.4 70.1 63.7 60.0 49.4 40.6

reflections.  A quick analysis of the data shows that it falls off rapidly at around 4  Angstroms resolution ­­ a conclusion which is supported by the data below:

The data seems to be relatively strong out the 4 Angstroms, and it is hoped that  crystal form A2 will yield consistent data out to 3.1 Angstroms, especially if data  collection can be quickly started and count times increased to 60 sec/frame.

10

Conclusions & further work
The basic elements are in place to begin moving towards solving the phase  problem.  The basic strategy is as follows: 1.  Shift crystallization equilibrium towards A2 through seeding.  Grow crystals in quantity. 2.  Continue to search through extant crystals for type B. 3.  Collect 3.1 Angstrom native data on A2. 4.  Evaluate improvement in diffraction on A2 with synchrotron  radiation. 5.  Screen for heavy atom derivatives on A2 6.  Begin Se­methionine crystallizations A2

11

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful