ORIGINALES

Análisis de mutaciones en los genes BRCA1 y BRCA2 en pacientes con cáncer de mama y ovario del norte de Portugal y Galicia
F. Duarte*, J. F. Cameselle-Teijeiro*, **, R. Soares*, C. Seixas*, M. E. Cortizo-Torres, J. Pérez-Villanueva** y F. C. Schmitt*
* Instituto de Patología e Inmunología Molecular. Universidad do Porto (IPATIMUP). Porto. Portugal. ** Departamento de Anatomía Patológica. Hospital Xeral de Vigo. Centro de Salud Lavadores. Vigo.

Objetivo. Detectar mutaciones en los genes BRCA1 y BRCA2 mediante la prueba de truncamiento de proteínas (protein truncation test, PTT) en una población del norte de Portugal y Galicia con cáncer de mama y ovario. Diseño. Estudio prospectivo. Localización. Pacientes del norte de Portugal y Galicia con historia familiar de cáncer de mama y/u ovario. Pacientes. Se analizaron en el IPATIMUP 76 mujeres con historia familiar de cáncer de mama de acuerdo con los criterios del BCLC (Breast Cancer Linkage Consortium). Resultados principales. Se identificaron cinco casos (6,5%) con alteraciones de la secuencia normal de los genes BRCA1 y BRCA2, siendo tres de estas mutaciones en el gen BRCA1 y las otras dos en el gen BRCA2. De las tres mutaciones encontradas en el gen BRCA1, dos son mutaciones de novo. Las alteraciones detectadas en la secuencia normal del gen BRCA2 son mutaciones descritas por primera vez para la población en estudio, de acuerdo con la información obtenida a través de la base de datos del BCIC (Breast Cancer Information Core). Conclusiones. Este estudio permitió identificar por primera vez en la población del norte de Portugal y Galicia individuos portadores de mutaciones en los genes de susceptibilidad para el cáncer de mama BRCA1 y BRCA2. PALABRAS CLAVE: cáncer de mama y/u ovario, cáncer hereditario, genes BRCA1 y BRCA2, prueba de truncamiento de proteínas, protein truncation test (PTT), diagnóstico.
Duarte F, Camesell-Teijeiro JF, Soares R, Seixas C, Cortizo-Torres ME, Pérez-Villanueva J, Schmitt FC. Análisis de mutaciones en los genes BRCA1 y BRCA2 en pacientes con cáncer de mama y ovario del norte de Portugal y Galicia. Rev Clin Esp 2002; 202(5):259-63.

Analysis of mutations in genes BRCA1 and BRCA2 among patients with breast and ovarian cancer in northern Portugal and Galicia
Objective. To detect mutations in the BRCA1 and BRCA2 genes by means of the protein truncation test (PTT) in a population in northern Portugal and Galicia with breast and ovarian cancer. Design. Prospective study. Setting. Patients in northern Portugal and Galicia with family history of breast and/or ovarian cancer. Patients. A total of 76 women with family history of breast cancer according to the BCLC criteria (Breast Cancer Linkage Consortium) were studied at IPATIMUP. Main results. Five cases (6.5%) with changes in the normal sequence in genes BRCA1 and BRCA2 were identified; three of these mutations occurred in the gene BRCA1 and the other two in the gene BRCA2. Two out of the three mutations found in the gene BRCA1 were «de novo mutations». Changes detected in the normal sequence in the gene BRCA2 were mutations reported for the first time among the study population, according to the information obtained through the BCIC dabatase (Breast Cancer Information Core). Conclusions. This was the first study in detecting individuals carrying mutations in the susceptibility breast cancer genes BRCA1 and BRCA2 among the population of northern Portugal and Galicia. KEY WORDS: breast cancer, ovarian cancer, inherited cancer, BRCA1 and BRCA2 genes, protein truncation test (PTT), diagnosis.

Introducción El cáncer de mama es una enfermedad compleja y heterogénea resultante de una desregulación genética. Una de las alteraciones genéticas más frecuentes es la mutación de uno o más genes supresores de tumores. Estos genes pueden tener diferentes modos de actuación, promoviendo con su alteración tanto
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Correspondencia: C. Schmitt. IPATIMUP. Rúa Roberto Frias, s/n. 4200 Porto (Portugal). Correo electrónico: fernando.schmitt@ipatimup.pt Aceptado para su publicación el 6 de julio de 2001.

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una susceptibilidad celular a los daños en el ADN como una alteración en los mecanismos de reparación de ese mismo ADN. Uno de los principales factores de riesgo para el cáncer de mama es la existencia de historia familiar. En este contexto, esencialmente en familias con alto riesgo, los genes supresores tumorales más importantes son el BRCA1 y el BRCA2 1,2. Las mutaciones de estos genes son responsables de la gran mayoría de los casos de cáncer de mama hereditario (90%) 2-8, los cuales corresponden al 5%-10% de todos los casos de cáncer de mama 9. El gen BRCA1 fue localizado en el brazo largo del cromosoma 17 en 1990 10 y clonado en 1994 11. Este gen está constituido por 5.592 nucleótidos, distribuidos por 24 exones, que codifican una proteína de 1.863 aminoácidos. Aunque todavía no se conoce totalmente la función de esta proteína, existen fuertes evidencias de que se trata de una nucleoproteína que forma un complejo con otras proteínas implicadas en el mantenimiento de la integridad del genoma, fundamentalmente mediante la reparación de errores en la doble cadena de ADN 12,13. El gen BRCA2 fue identificado en el cromosoma 13 en 1994 14 y clonado en 1995 2. Se trata de un gen compuesto por 27 exones que codifican una fosfoproteína nuclear de 3.418 aminoácidos que, a semejanza del BRCA1, interactúa con varias proteínas incluyendo a la proteína RAD51 y por tanto implicada en la reparación de la doble cadena de ADN 13. Aunque la función de este gen todavía no está totalmente aclarada, existen datos experimentales que sugieren la importancia de esta proteína en la regulación de la expresión génica 15. En ambos genes la pérdida de función de la proteína produce una aumento de los errores del genoma, lo que puede conducir a la aparición del cáncer. Los portadores de mutación en estos genes tienen un riesgo superior a la población en general de desarrollar cáncer de mama y/u ovarios hasta los 70 años. Así, los individuos portadores de mutación en BRCA1 presentan riesgos acumulados del 85% y 63% de desarrollar cáncer de mama y ovario, respectivamente, mientras que los individuos portadores de mutaciones en BRCA2 tiene riesgos del 86% y 27% de desarrollar cáncer de mama y ovario, respectivamente. Estos valores están elevados significativamente cuando se comparan con el riesgo del 12% para el cáncer de mama en la población en general. Además de la susceptibilidad para el cáncer de mama y/u ovario, los individuos portadores de mutaciones germinales en estos genes son todavía más susceptibles de desarrollar cáncer de colon y de próstata 16. Adicionalmente, los portadores de mutaciones en BRCA2 tienen un riesgo aumentado para el cáncer de páncreas 17, melanoma ocular 18 y cáncer de mama masculino. Las mutaciones en el BRCA1 y en el BRCA2 se encuentran distribuidas por todo el gen. Se ha descrito cerca de 460 mutaciones germinales diferentes en el gen BRCA1 y cerca de 200 para el gen BRCA2 (Breast Cancer Information Core). 260

La mayoría de estas mutaciones (80%) originan un codón de parada (stop) que lleva a la síntesis de una proteína truncada. Dentro de las diferentes técnicas utilizadas para el rastreo de mutaciones, la técnica de la prueba de truncamiento de proteínas (protein truncation test, PTT) es probablemente la más utilizada, pues además de permitir el análisis de un fragmento grande de ADN (cerca de 1.000 pb), es una técnica adecuada para la identificación de mutaciones que producen una proteína truncada 19. La prevalencia de mutaciones específicas para los genes BRCA1 y BRCA2 ha sido descrita ya en algunas áreas geográficas; sin embargo, en la población ibérica no existe ninguna información relativa al análisis de mutaciones en ambos genes, habiéndose publicado solamente un estudio en el que se analizó una serie de 36 pacientes con cáncer de mama y/u ovario de la zona norte de Portugal 20. De acuerdo con estudios de genética de poblaciones se ha demostrado que el norte de Portugal y Galicia son muy semejantes genéticamente 21. Por ello, el objetivo de este trabajo ha sido detectar mutaciones en los genes BRCA1 y BRCA2 en pacientes del norte de Portugal y Galicia con cáncer de mama y/u ovario. Material y método Pacientes
Se estudiaron en el IPATIMUP (Instituto de Patología e Inmunología Molecular de la Universidad de Oporto, Portugal) 76 pacientes diagnosticadas de cáncer de mama y/u ovario que presentaban los criterios clínicos de sospecha para cáncer hereditario de acuerdo con el Breast Cancer Linkage Consortium 22: paciente con tres o más parientes en primero o segundo grado afectados, con independencia de la edad del diagnóstico, o pacientes con menos de tres parientes afectados y: a) diagnóstico de cáncer de mama en menores de 45 años; b) detección de una mutación genética en un miembro de la familia; c) existencia de varios familiares diagnosticados de cáncer de ovario y uno o más miembros del mismo lado de la familia diagnosticados de cáncer de mama, independientemente de la edad; d) múltiples cánceres primarios de mama o cáncer de mama bilateral, o e) se trata de un cáncer de mama masculino o existe un diagnóstico de cáncer de mama masculino en la familia. En una de las familias en que se detectó mutación se analizaron ocho familiares directos, de los cuales siete no presentaban enfermedad.

Detección de mutaciones PTT: protein truncation test/prueba de truncamiento de proteinas
El ADN fue extraído de sangre periférica total con el método de fenol-cloroformo. Después de la extracción del ADN se amplificaron por reacción en cadena de la polimerasa (PCR), todo el exón 11 de BRCA1 y de los exones 10 y 11 de BRCA2 y seguidamente se estudió por PTT 23 la secuencia peptídica codificada. En resumen, los productos amplificados fueron transcritos y traducidos en proteína, utilizando un lisado de reticulocitos de conejo (kit TnT® Quick Coupled Trascription/Translation Systems, Promega) y ARNt biotinilado (TranscendTM tRNA System, Promega). Seguidamente los péptidos generados in vitro fueron sepa-

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rados por SDS-PAGE en gel de acrilamida al 15% (BIORAD 30% Acrylamide/Bis solution) y la electroforesis fue efectuada en los primeros 30 minutos a 60 V y en los restantes 45 minutos a 200 V. La visualización de las proteínas tras la reacción con estreptavidina-HRP (DAKO) se efectuó utilizando o ECL™ Western blotting detection reagents (ECL™ Amersham Pharmacia Biotech) seguida de exposición en película radiográfica (Hyperfilm, Amersham Pharmacia Biotech) y detección quimioluminiscente.

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Análisis de los fragmentos
Un segundo método utilizado para la detección de mutaciones fue el análisis de los fragmentos para detección de pequeñas deleciones o inserciones (DSDI, detection of small deletions and insertions) de acuerdo con lo propuesto por Papelard et al 24 que analiza los exones 11, 12, 13, 18, 20 y 21 del BRCA1. El BRCA2 fue analizado enteramente con el método CSGE (conformation-sensitive gel electrophoresis) de acuerdo con lo propuesto por Ganguly et al 25. Para ambos métodos de análisis de mutaciones se utilizaron controles positivos procedentes del Laboratorio de Genética de la Universidad de Leiden, Holanda.

Fig. 1. Carcinoma de mama con mutación en el exón 11 del gen BRCA1. 1: control negativo. 2: caso con mutación (madre). 3: caso con mutación (hija). La flecha indica la proteína truncada derivada del alelo mutado.

Secuenciación
En los casos en los que se detectó una proteína anómala, se precedió al análisis de la secuencia que originó la proteína truncada por secuenciación automática. Previamente a la secuenciación, los fragmentos a analizar fueron purificados a través de columnas de purificación MicrospinS.200 HR (Amersham Pharmacia Biotech). En seguida se procedió a la reacción de secuenciación utilizando primers de secuenciación para la región a amplificar juntamente con el respectivo kit (Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction KitPerkin Elmer). Los productos de reacción de secuenciación se corrieron en gel de poliacrilamida al 6% (FMC, USA) conteniendo 6 moldm –3 de urea y TBE 1X en el secuenciador automático ABI 377 DNA Sequencer (Perkin Elmer Applied Biosystems). Los resultados fueron analizados con el programa ABI PRISM 377-18 Data Collection, versión 1.1.

se detectaron en el exón 10. Una de ellas pertenece a un caso de carcinoma de ovario, debiéndose esta alteración a una sustitución en el nucleótido 1.381 de una adenina por una timina (1381A[T]) llevando a la formación de un codón de parada prematuro en el códon 385 (Lys 385). La segunda mutación se identificó en un caso de carcinoma de mama, en el que se verificó la existencia de la deleción de una adenina en el nucleótido 2042 (2042 del A) que llevó a la formación de un codón de parada 613. De las tres mutaciones encontradas para el gen BRCA1, dos son mutaciones de novo. Las dos mutaciones detectadas para el gen BRCA2 son mutaciones descritas por primera vez para la población en estudio, de acuerdo con la información obtenida a través de la base de datos del Breast Cancer Information Core. Discusión Desde que se clonaron los genes de susceptibilidad para el cáncer de mama BRCA1 y BRCA2 se hizo posible realizar pruebas genéticas para la identificación de individuos con riesgo elevado de desarrollar cáncer de mama y ovario. Muchas de las mutaciones encontradas en estos genes se encuentran en más de una familia del mismo origen étnico. La presentación de mutaciones recurrentes en estos dos genes puede ser explicada por la existencia de ances450 480

Resultados Las técnicas utilizadas para la detección de mutaciones permitieron identificar cinco casos (6,5%) con alteración de la secuencia normal de los genes BRCA1 y BRCA2, siendo tres de estas mutaciones en el gen BRCA1 y dos en el gen BRCA2. Una de las mutaciones detectadas en el exón 11 del gen BRCA1 pertenece a una enferma con fuerte historia familiar, de la cual se estudiaron ocho miembros más de la familia, habiéndose encontrado en los ocho familiares cuatro individuos con la misma mutación. El análisis referido se efectuó por PTT (fig. 1). De las restantes mutaciones el gen BRCA1 otra se detectó también en el exón 11 en un caso de carcinoma de ovario por PTT y por análisis de fragmentos. Mediante secuenciación directa se identificó una deleción de 4 bp (3444 del AAAT), que dio origen a una proteína truncada (fig. 2). La tercera mutación en BRCA1 se detectó por análisis de fragmentos en un caso de carcinoma ductal infiltrante de mama. Esta alteración se debió a una deleción de un nucleótido de timina en el intrón 18 (INV18-80 del T). Las dos mutaciones encontradas en el gen BRCA2 se identificaron por análisis de fragmentos y ambas

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Fig. 2. Carcinoma de ovario con mutación en el exón 11 del gen BRCA1. A: deleción de cuatro nucleótidos observada por análisis de fragmentos. Secuenciación demostrando la deleción. La flecha indica la presencia de un pico extra originado por el alelo mutado.

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tros comunes en un área geográfica determinada 23. Para el norte de Portugal y Galicia no existen estudios sistemáticos sobre las mutaciones tanto del gen BRCA1 como el gen BRCA2. En el presente trabajo se analizaron 76 casos de cáncer de mama y/u ovario con historia familiar, habiéndose encontrado tres mutaciones distintas en el gen BRCA1 y dos mutaciones en el gen BRCA2. De las tres mutaciones encontradas en el gen BRCA1 dos son mutaciones de novo, esto es, mutaciones que no habían sido descritas previamente en el Breast Cancer Information Core. Una de estas mutaciones se encontró en el exón 11 originando una proteína truncada. La referida mutación se detectó tanto por PTT como por análisis de fragmentos. La enferma con carcinoma seroso papilar de ovario, portadora de esta mutación germinal tiene una historia familiar con dos casos de cáncer de ovario y un caso de cáncer de mama, estando así dentro de los criterios establecidos por el Breast Cancer Linkage Consortium para el cáncer hereditario asociado al gen BRCA1. La segunda alteración se detectó solamente por análisis de fragmentos en un caso con carcinoma ductal infiltrante de mama. La mutación encontrada es una deleción de un nucleótido en el intrón 18, región no codificante del gen BRCA1, pudiendo tratarse de un polimorfismo del gen y no estar relacionado con la enfermedad. Sin embargo, dado que esta mutación está a 80 bp de la región codificante, la posibilidad de la mutación de generar un sitio de procesamiento alternativo no debe ser ignorada. La tercera mutación en el gen BRCA1 se encontró en el exón 11, por PTT en una enferma con una fuerte historia familiar con cinco casos de cáncer de mama. En el gen BRCA2 se identificaron dos mutaciones: una en el exón 10 en una enferma con cáncer de ovario menor de 45 años y con una historia familiar de dos casos de cáncer de mama, y otra enferma con carcinoma de mama bilateral y con tres casos de cáncer de mama en la familia. Dado que las mutaciones en BRCA1 y BRCA2 se encuentran distribuidas por todo el gen, se han descrito numerosos métodos para el análisis de las mutaciones. Ni la prueba de la proteína truncada ni el análisis de fragmentos en sus múltiples variedades permiten detectar todas las alteraciones del BRCA1 y BRCA2, por lo que es necesario secuenciar todos los fragmentos generados por PCR para descartar totalmente la presencia de mutaciones de estos genes. La técnica de PTT utilizada en el presente estudio aporta información sobre una región codificante de cerca del 60% de la proteína, correspondiente al exón 11 del BRCA y a los exones 10 y 11 del BRCA2. Este método identifica mutaciones que originan proteínas truncadas, que son las más frecuentes tanto en el gen BRCA1 como BRCA2. La técnica del análisis de fragmentos utilizada en este estudio fue concebida para un patrón de mutaciones encontrado en la población holandesa, obteniendo información sobre los exones 11, 12, 13, 18, 20 y 21 del gen BRCA1. Para el gen BRCA2, a través de la técnica CSGE, fueron analizadas la mayor parte de las secuencias intrónicas y todas las exónicas, 262

las únicas alteraciones no analizadas son los reordenamientos grandes, como grandes inserciones y deleciones. Aunque el análisis de fragmentos no había sido adaptado específicamente para el patrón de mutaciones de la población en estudio, esta técnica permitió identificar cuatro de las mutaciones encontradas en la serie evaluada. En algunas poblaciones ha sido establecido ya un patrón de mutaciones 26,27 que permiten la detección de estas alteraciones con unos costes razonables, Este estudio constituye el primer abordaje para el análisis de mutaciones en la población galaico-portuguesa. La identificación de mutaciones en los genes BRCA1 y BRCA2 es relevante para ayudar a decidir las mejores estrategias terapéuticas y prevenir nuevos tumores primarios de mama o de ovario en enfermas portadoras de alteraciones de los genes de susceptibilidad. Por otra parte, la identificación de mutaciones en familiares de enfermos permite identificar individuos con riesgo elevado, que deben entrar en programas de consejo genético y elegir la opción que ellas deseen.
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