Microbiología Ambiental UAM

J. L Sanz

2. MÉTODOS EN MICROBIOLOGIA I. AISLAMIENTO Y CULTIVO DE MICROORGANISMOS. Principios de la nutrición microbiana y medios de cultivo. Factores nutricionales. Medios de cultivo. Factores físico-químicos. Esterilización. Agentes antimicrobianos físicos: Calor, Radiaciones, Filtración. Agentes antimicrobianos químicos. Aislamiento. Medios sólidos, líquidos y selectivos. Cuantificacion de microorganismos: Recuento de viables, Recuento de totales. PRINCIPIOS DE NUTRICIÓN MICROBIANA y MEDIOS DE CULTIVO Para crecer los microorganismos en el laboratorio se emplean medios de cultivo. Estos deben de poseer todas los nutrientes necesarios a las concentraciones adecuadas para permitir el crecimiento del microorganismo en cuestión. La materia viva está compuesta por: - C, O, N, H, P, S, K, Na, Ca, Mg (98%) - Cl, Fe, Mn, Co, Cu, Mo y Zn, por lo que todos estos elementos deben estar disponibles para el microorganismo. Repasar forma de aportar los principales macronutrientes (C, O, N, P, S). Definiciones: Medio sintético o definido: compuesto por nutrientes químicamente definidos. Medio complejo o indefinido: contiene ingredientes de composición desconocida (v.g.: extracto de levaduras). Prototrofía: capacidad para sintetizar todos los compuestos orgánicos que se necesitan a partir de la principal fuente de carbono. Auxotrofía: incapacidad de sintetizar algún compuesto (v.g.: vitaminas). Además, hay que tener en cuenta tanto los aspectos cualitativos como cuantitativos. Sólo existe relación lineal entre Velocidad de crecimiento y concentración de nutrientes a valores muy bajos de esta (Ver también tema 8). Factores ambientales Para el desarrollo de un microorganismo además de los requerimientos nutricionales, existen un gran número de factores ambientales que influyen sobre el crecimiento, supervivencia y actividades metabólicas de los microorganismos. • pH Debe ser adecuado y mantenerse durante todo el período de crecimiento. La fermentación de carbohidratos libera ác. orgánicos al medio, con la consiguiente acidificación y detención del crecimiento. La utilización de proteínas libera NH4+ al medio produciendo su alcalinización. • Temperatura Determina la velocidad de crecimiento y puede también ser determinante sobre el tipo de microorganismos que ocupan un ecosistema. La velocidad de una reacción química es función de la temperatura, y sigue la Ley de Arrhenius:

log10 V =

- AH +C 2.303RT

Para microorganismos, sólo hay una relación lineal en un margen de temperaturas, descendiendo bruscamente tanto por debajo como, muy especialmente, por encima. Ver concepto de temperatura máxima, óptima y mínima de crecimiento. Organismos hipertermófilos (t>75° C), termófilos (t>55°C), mesófilos (20<t<45°C) y psicrófilos o criófilos (t<10°C).

Definiciones: o Esterilización: destrucción completa de toda forma de vida microbiana. Todo el material utilizado para aislar y cultivar microorganismos debe de encontrarse estéril. radicales y agua oxigenada). Calor El calor es el principal agente físico de esterilización y. o anaerobias facultativas: utilizan O2 si está presente. 15 lb/pulg2) lo que corresponde a 121°C. o bactericida: agente que mata a las bacterias o bacteriostático: agente que inhibe el desarrollo de las bacterias Agentes antimicrobianos físicos 1.1 Kg/cm2. esto es libre de todo organismo vivo. Para vidrio se emplean 2 horas a 160°C. .aerodúricas o aerotolerantes: toleran el O2. Otros factores: • Potencial redox • Radiación electromagnética • CO2 • Presencia de agua líquida • Presión atmosférica. Se emplea un horno Pasteur. El calor con vapor a saturación y presión es el agente más utilizado y confiable para esterilizar. cuando sea posible. Pueden ser: . Se utiliza cuando no es conveniente que el vapor esté en contacto con el material a esterilizar. Existen diferentes procedimientos prácticos para aplicar el calor. . El tiempo requerido para esterilizar está inversamente relacionado con la temperatura de trabajo.Microbiología Ambiental UAM • J. Microaerófilas: prefieren concentraciones bajas (2% ). ESTERILIZACIÓN. • El desarrollo de los microorganismos (cómo de cualquier ser vivo) se rige por dos principios: . Se utiliza el autoclave. La alta temperatura combinada con la humedad es el método más efectivo para destruir microorganismos. Los más utilizados en el laboratorio son: • Calor húmedo: vapor a presión. pero pueden crecer en su ausencia o anaerobias: no pueden utilizar O2. o Muerte: pérdida irreversible de su capacidad de reproducirse. debe ser el método de elección. L Sanz Oxígeno De acuerdo a su respuesta frente al O2 las bacterias se clasifican como: o aerobias: dependen del O2.Ley de la Tolerancia de Shelford.Ley del Mínimo de Liebig (1840).estrictas: el O2 es tóxico . divididos en dos categorías: calor húmedo y calor seco. Toxicidad del oxígeno y de los subproducto del metabolismo oxidativo (radical superóxido. Las esporas necesitan normalmente temperaturas superiores a 100°C durante largos periodos de tiempo. Las formas vegetativas de la mayor parte de las bacterias mueren en 5-10'a 60-70°C. Suele operarse a 1 atm de sobrepresión (1. • Calor seco: esterilización con aire caliente. hidrostática y osmótica.

Ca(OCl)2): en la industria y hogar. 4. hipocloritos (NaOCl. utensilios de laboratorio. Son depresores de la tensión superficial o agentes humectantes. Su actividad es bactericida. Alteran las relaciones energéticas a nivel de interfases. utilizado en la limpieza de las heridas. enzimáticas. Alcoholes y fenoles. La mayoría de los metales pesados. Acción: yodación de restos de tirosina y agentes oxidantes muy enérgicos. La filtración también se utiliza para limpiar aire. Sólo los microorganismos que están sobre la superficie se encuentran expuestos a la radiación y pueden ser destruidos. Los más utilizados son el óxido de etileno y el formaldehido. Halógenos El I como desinfectante de la piel. y el Cl para las aguas son los mejores agentes desinfectantes. Peróxido de hidrógeno. Ag y Cu son tóxicos para los microorganismos. es decir a separarlo del resto de las poblaciones con las que coexiste en la naturaleza.Cloro y derivados. 3. . Cultivo puro o axénico: el que contiene una sola clase de microorganismo. Difíciles de aplicar. Para trabajar con un microorganismo en condiciones definidas en el laboratorio es necesario primero proceder a su aislamiento. El alcohol etílico a concentraciones del 50-90% es efectivo contra cél.Microbiología Ambiental UAM J. Al igual que los halógenos actúa como agente oxidante. Los rayos X y rayos Gamma son muy penetrantes y letales. Principales grupos de agentes antimicrobianos quimicos 1. . por lo que pueden utilizarse para esterilizar materiales de gran grosor o volumen. AISLAMIENTO Cultivo: poblaciones bacterianas con millones de individuos. 2. Mercuriales orgánicos: mercurocromo. Detergentes. 6. Muy útiles para esterilizar objetos de plástico sensibles al calor (jeringas). reduciendo la tensión superficial. actuando incluso contra esporas. 5. Desinfectante de la piel. especialmente Hg. L Sanz 2. Los alcoholes superiores son más efectivos. vegetativas pero ineficaz contra esporas bacterianas. Acción: desnaturalizan las proteínas. Radiaciones (esterilización fría) • Luz ultravioleta. áreas cerradas. Gases (Agentes alquilantes). Filtración Aplicable a materiales termolábiles (suero. disuelven los lípidos. etc. . Actualmente se emplean los denominados filtros moleculares o filtros de membrana. Agentes que modifican los grupos funcionales: metales pesados. sol.Yodo. • Radiaciones ionizantes. Acción: Forman mercáptidos con grupos -SH de residuos de cisteína. En disolución al 3% es un antiséptico inocuo pero muy débil. Cultivo mixto: el que contiene varios microorganismos creciendo juntos. Cl2: purificar agua potable. cloraminas. 3. además. vitaminas). El metanol es menos germicida y. agentes deshidratantes. tóxico.

. Ventajas) o líquidos. Se emplean cuando el organismo que quiere aislarse se encuentra en forma minoritaria. . Separación e inmovilización de organismos de forma individualizada en un medio nutritivo sólido. Los métodos de aislamiento microscópicos tienen poca (o nula) utilidad en Microbiología. Recuento de totales. • Medios selectivos.Directo mediante microscopio (cámaras de recuento de Newbaver). • Medios líquidos Solo utilizable para aislar la especie predominante en un cultivo mixto. Pueden utilizarse para: o enriquecer: medios líquidos que tienden a seleccionar los organismos de tasa de crecimiento más elevada entre todos aquellos que pueden hacerlo bajo las condiciones impuestas o aislar directamente: medios sólidos que permiten aislar colonias. . Método de la dilución límite.Microbiología Ambiental UAM J. Método: diluciones consecutivas de la muestra. Se utiliza un colorímetro (Repasar la ley de LamberBeer: A= bC. • Medida del número de células: . Suelen llevar un inhibidor que impide el desarrollo de los demás microorganismos.Contador electrónico de partículas (contador de Coulter) Medida de la masa celular. o log Ii/It = k*C). Es el método más utilizado. Se utiliza una técnica similar al aislamiento en placa: diluciones seriadas y siembra en placas (30-300 bacterias/placa).Peso seco • . Cada individuo al multiplicarse origina una colonia. L Sanz Para el aislamiento se de organismos utilizan medios sólidos (agar. • Medios sólidos: siembra (extensión o vertido) en placa. CUANTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS • • Recuento de viables. Medios que favorecen el crecimiento de un microorganismo específico.Turbidimetría (densidad óptica).