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Ingenieria genetica en plantas.

Jose Antonio Fernandez Perez Instituto de Desarrollo Regional. Universidad de Castilla-La Mancha. Albacete

Objetivos

La disponibilidad de sistemas eficientes de transformacion en especies cultivadas ha permitido la aplicacion de estas tecnicas a la mejora. En el momento presente mas de 50 especies de plantas cultivadas pueden ser transformadas por ingenieria genetica (cuadro 1). Esta cifra incluye muchas dicotiledoneas importantes y un numero creciente de monocotiledoneas como el arroz, el maiz y el trigo. Inicialmente la investigacion se ha dirigido a aquellos caracteres directamente relacionados con los problemas agricolas como son el control de insectos, malas hierbas y enfermedades de los cultivos. Los progresos han sido rapidos y ciertos genes que controlan estos caracteres ya han sido introducidos con exito en bastantes especies cultivadas. Lineas manipuladas geneticamente de soja, algodon, arroz, maiz, colza, remolacha azucarera, tomate y alfalfa han entrado en el mercado a partir del an~o 1993 (cuadro 2). La investigacion en la manipulacion

genetica de otros caracteres como tolerancia al estres, eficiencia fotosintetica, asimilacion de nitrogeno y composicion de las proteinas de semilla esta menos avanzada, debido a las dificultades intrinsecas de los sistemas fisiologicos y geneticos implicados. Otras nuevas lineas de investigacion estan dando resultados espectaculares, como la regulacion de la maduracion del fruto, la produccion de formas androesteriles, y el uso de las plantas transgenicas como fabricas de moleculas valiosas, como por ejemplo, anticuerpos funcionales humanos.

a) Resistencia a insectos.

Los mayores progresos en la obtencion de plantas transgenicas resistentes a insectos han sido conseguidos a partir de la proteina insecticida de Bacillus thuringensis. La mayor parte de las cepas de B. thuringensis son toxicas para larvas de lepidopteros, aunque algunas lo son para larvas de coleopteros o dipteros. Su toxicidad radica en una proteina grande (toxina Bt), la cual no es toxica para los insectos beneficiosos, otros animales u hombres. El modo de accion de esta proteina parece implicar al nivel de disrupcion del transporte ionico de membranas. Mediante mutagenesis dirigida se ha conseguido mejorar unas 100 veces la eficacia de la proteina Bt en tabaco, partiendo de la hipotesis de que la secuencia adaptada de un procarionte Gram-positivo podria no ser la mas adecuada para su expresion en el genoma eucariotico de la planta. Otras moleculas con actividad insecticida provienen del reino vegetal. Son los inhibidores de enzimas (inhibidores de proteasas, e inhibidores de alfa-amilasas), lectinas, y proteinas similares a las lectinas (arcelina). El primer gen de origen vegetal transferido con exito a otra especie vegetal fue el inhibidor de tripsina del guisante forrajero en tabaco. Esta proteina es eficaz contra varias plagas de campo y de almacen que incluyen lepidopteros,

coleopteros y ortopteros, y se ha transferido con exito a tomate y patata. Los inhibidores proteicos de alfa-amilasas, abundantes en las semillas de muchas plantas, parecen proteger del ataque de algunos insectos, pero estan aun en una fase temprana de su estudio. Lo mismo ocurre con las lectinas y proteinas similares. Ultimamente se viene ensayando el cruzamiento entre plantas transgenicas portadoras de distintos genes insecticidas (p. ejem. inhibidor de tripsina x lectina) con el fin de comprobar el efecto combinado de ambos agentes en las plantas de la descendencia. Aunque los efectos de los agentes insecticidas no son sinergicos, los resultados parecen ser alentadores.

b) Control de malas hierbas.

La manipulacion genetica de la tolerancia a herbicidas representa una alternativa para conferir selectividad y aumentar la seguridad de los cultivos frente a tales compuestos. La investigacion se ha centrado prioritariamente en aquellos herbicidas con alta actividad, baja toxicidad, escasa movilidad en los suelos, biodegradacion rapida y amplio espectro de accion. En la manipulacion genetica de la

tolerancia a herbicidas se han adoptado tres estrategias: (i) alterar el nivel de expresion del enzima diana para el herbicida, (ii) alterar el lugar de accion de herbicida (iii) incorporar un gen que detoxifique al herbicida. Las fuentes de genes de resistencia a herbicidas son principalmente bacterias (spp. de los generos Rhizobium, Escherichia, Chlamydomonas, Aerobacter, Salmonella, Streptomyces ), cloroplastos (de la sp. Amaranthus hybridus ), levaduras, y mutantes celulares de plantas (tabaco, petunia, zanahoria, Arabidopsis thaliana, Corydalis sempervirens).

c) Resistencia a enfermedades.

Se ha conseguido resistencia significativa al virus del mosaico del tabaco (VMT) en plantas transgenicas mediante la expresion del gen de la proteina de la cubierta del virus, en un proceso que se ha denominado Rproteccion mediada por la proteina de la cubiertaS. Este abordaje produce resultados similares en tomate, tabaco y patata contra un amplio espectro de patogenos como el virus del mosaico de la alfalfa, el virus del mosaico del pepino, y los virus X e Y de la patata. El mecanismo de proteccion parece implicar la interferencia del producto del gen con las particulas virales desnudas antes de la traduccion y replicacion del virus. Plantas transgenicas que portan el gen de la proteina de la cubierta del VMT han sido evaluadas en invernaderos y campos de pruebas, habiendo mostrado alta resistencia a la infeccion virica. Otro metodo de proteccion es la introduccion de copias de DNA-c del llamado ARN satelite en plantas cultivadas. Este ARN satelite esta presente en los cultivos de virus y determina un decrecimiento importante en la infectividad de estos. En las plantas transgenicas el ARN satelite se replica cuando el virus infecta, aminorando los efectos del virus. Abordajes similares se basan en la interferencia con la replicacion del virus por parte de moleculas defectuosas de ARN provenientes de formas delecionadas del propio virus, o empleando la tecnologia del ARN antisentido con genes de la capsida del virus. A partir del ARNm se obtiene el DNA-c correspondiente, cuya transcripcion produce copias de mensajero complementarias al ARNm de partida. Estas moleculas complementarias se aparean base a base formando una doble helice de ARN, lo que impide la traduccion del ARNm. Plantas de tabaco transformadas con la secuencia de un gen no-estructural del VMT (posiblemente un componente del complejo de la replicasa) muestran una

resistencia total al virus, incluso al concentraciones de viriones muy altas. No se ha detectado el producto genico y se desconoce si la resistencia es debida a la proteina o a su acido nucleico.

Otro abordaje encaminado a conferir resistencias a virus se basa en el empleo de moleculas hibridas de ARN, consistentes en secuencias cataliticas del ARN satelite con actividad endonucleasica ligados a secuencias de ARN antisentido, llamadas ribozimas. Recientemente se descubierto que plantas transgenicas de tabaco que expresan ribozimas contra el virus del mosaico del tabaco muestran cierta resistencia a la infeccion. El uso de ribozimas en la proteccion vegetal se encuentra aun en sus comienzos y requiere mucho mas esfuerzo investigador para descubrir sus posibilidades.

Tambien se ha avanzado en la obtencion de plantas transgenicas resistentes a bacterias y hongos. Por ejemplo, en tabaco se obtuvieron plantas que expresan un gen de quitinasa de la alubia y que son resistentes al hongo Rhizoctonia solani, y plantas transgenicas que incorporan un gen de tionina de cebada que les confiere resistencia a varios patogenos, entre ellos a las especies Pseudomonas syringae y P. tabaci. Tambien se han obtenido plantas transgenicas de tabaco

resistentes a P. syringae mediante insercion de un gen quimerico que detoxifica a la toxina del patogeno, la tabtoxina, construido a partir del gen de resistencia de la propia bacteria.

Desde que se comprobo que la expresion constitutiva en plantas transgenicas de genes que codifican una quitinasa y una proteina inactivadora de ribosomas conferia proteccion parcial contra ataques de hongos, un largo repertorio de genes ha sido identificado para su posterior manipulacion. Ademas, estan apareciendo estrategias para la manipulacion de defensas multigenicas, tales como la deposicion de lignina y la sintesis de antibioticos del tipo de las fitoalexinas. Esto se realiza mediante: (i) la sobre-expresion de genes que codifican pasos en las rutas metabolicas que determinan la tasa de produccion; (ii) la modificacion de los factores de transcripcion o de otros genes reguladores, y; (iii) la creacion de nuevas fitoalexinas por medio de la transferencia interespecifica de genes biosinteticos.

d) Tolerancia al estres ambiental.

Se ha trabajado intensivamente para tratar de transferir las abundantes resistencias al estres presentes en especies silvestres a las cultivadas, tanto por tecnicas tradicionales como por ingenieria genetica. Sin embargo, se requiere mayor conocimiento de las bases fisiologicas, bioquimicas y geneticas de las respuestas de las plantas al ambiente para progresar significativamente en este area. Pese a ello, han sido identificados genes inducidos por calor, frio, salinidad y metales pesados. Queda por determinar el papel de estos genes en la proteccion real de la planta frente al estres. Una perspectiva interesante en la manipulacion genetica de las resistencias a la sequedad y a la salinidad es la acumulacion de osmoprotectores, compuestos organicos que incrementan la concentracion de solutos (y en consecuencia el contenido en agua) en la celula, sin interferir con

sus procesos metabolicos. Existen varios candidatos en plantas superiores, tales como la prolina, el pinitol, el betadimetilsulfoniopropionato, la glicina betaina, la prolina betaina, y la alanina betaina. La manipulacion de genes implicados en el metabolismo de estos compuestos, de modo que se provoque una acumulacion de osmoprotectores en la planta, esta recibiendo la atencion de varios grupos de investigacion.

Se han obtenido plantas transgenicas de nabo y tabaco, portadoras de un gen de origen humano que codifica una proteina pequen~a capaz de unirse a metales pesados, la metalotioneina, secuestrandolos y disminuyendo su toxicidad. Estas proteinas estan presentes en vertebrados y en hongos. Las plantas transgenicas muestran tolerancia a niveles toxicos de Cd y esta se hereda de forma estable. Otros intentos de producir plantas tolerantes a los metales a traves de seleccion de cultivos in vitro no han tenido gran exito. Aunque se obtienen lineas celulares resistentes a Al, Hg, Zn, Cd, y otros metales, solo en unos pocos casos el nuevo caracter se ha expresado de forma estable en plantas regeneradas de tales celulas. Por otra parte, los ecotipos tolerantes a altas concentraciones de iones toxicos, encontrados en zonas mineras y susceptibles de ser utilizadas en programas de mejora, muestran una tasa de crecimiento muy baja. Por ello, parece que la ingenieria genetica puede ser la tecnica mas adecuada para conseguir plantas con este tipo de resistencias.

e) Produccion de formas androesteriles.

Se han encontrado dos genes de ribonucleasa que selectivamente destruyen el linaje de celulas tapetales durante el desarrollo de las anteras. Una ribonucleasa procede de Aspergillus oryzae y la otra de Bacillus amyloliquefaciens (llamada Barnasa). Tras la construccion de genes quimericos de ambas ribonucleasas, que son expresados especificamente en las anteras, se han obtenido plantas transgenicas de tabaco y colza. La expresion de estos genes afecta a la produccion de polen funcional y viable, obteniendose plantas androesteriles. Este gen nuclear es dominante y su expresion en la antera destruye selectivamente la capa de celulas tapetales que rodea al saco de polen. La capacidad de los genes de ribonucleasas como inductores de esterilidad masculina proporciona una nueva estrategia para la produccion de hibridos. Acoplando el gen quimerico a un gen dominante de resistencia a herbicida pueden disen~arse sistemas de mejora encaminados a seleccionar poblaciones uniformes de plantas androesteriles. En plantas cultivadas en las que el fruto no es la parte almacenada (por ejemplo, lechuga, zanahoria, col), la plantas androesteriles pueden cruzarse con cualquier linea polinizadora para producir semillas hibridas. Por el contrario, en otros cultivos como el tomate, trigo, arroz o maiz sera necesario restaurar completamente la fertilidad masculina en la descendencia. La tecnologia del ARN antisentido y la existencia del barstar, una proteina inhibidora de la barnasa, pueden hacer posible el desarrollo de estrategias para la restauracion de la fertilidad masculina.

f) Maduracion del fruto.

La manipulacion del metabolismo de las plantas con el fin obtener incrementos en la produccion de algunos compuestos (p. ejem.

carbohidratos, proteinas), o el control de la sintesis de otros, tiene aplicaciones en diversas areas tales como el desarrollo de productos alimenticios mas nutritivos y menos costosos. El etileno (C2H4)

controla la maduracion del fruto. La expresion de un ARN antisentido del enzima regulador de la sintesis de etileno, la 1-aminociclopropano1-carboxilato sintetasa, inhibe la maduracion del fruto en plantas de tomate. La administracion de etileno o propileno exogenos elimina el efecto inhibitorio. Genes que codifican otros enzimas implicados en

el proceso de maduracion del fruto, como la poligalacturonasa, que participa en la degradacion de componentes de la pared celular, han sido manipulados e introducidos en plantas de tomate con el fin de estudiar sus efectos sobre la textura del fruto. Estos abordajes permiten obtener variedades transgenicas donde el proceso de maduracion sea uniforme y facilmente controlable, paliando las perdidas debidas a la sobre-maduracion producida durante el transporte o las deficiencias en la refrigeracion de frutas y verduras.

El potencial de la tecnologia antisentido en la asignacion de funciones a las secuencias genicas es enorme. La generacion de plantas en las que la produccion de etileno este inhibida, ofrece la oportunidad de evaluar el papel del gas en la regulacion de muchos procesos del desarrollo vegetal, tales como la senescencia de la hoja, abscision, maduracion y respuesta a patogenos; y abre la posibilidad de realizar manipulacion genetica para mejorar la calidad, el tiempo de almacenamiento y el valor nutricional de muchas plantas y productos vegetales.

g) Composicion de acidos grasos.

Muchos cultivos producen semillas oleaginosas cuya composicion en acidos grasos no es la ideal para el uso al que se destinan. La aplicacion de los metodos tradicionales de mejora, reforzados con la mutagenesis quimica, ha permitido la obtencion de nuevas variedades con alteraciones en la composicion de acidos grasos de la semilla, en bastante especies. Son ejemplos destacables las nuevas variedades de colza bajas en acido euricico y las reducciones en los niveles de acidos grasos poli-insaturados en soja, girasol y lino (linaza). La mayor parte de la variacion genetica en la composicion de acidos grasos en semilla parece implicar la presencia de un alelo de un gen que rompe el metabolismo normal de acidos grasos y conduce a la acumulacion de productos intermedios en los lipidos de la semilla. Sin embargo, parece probable que dadas las limitaciones geneticas de este abordaje, muchos otros cambios deseables en la composicion de acidos grasos podrian requerir la aplicacion directa de los metodos de ingenieria genetica. Existen dificultades como por ejemplo las lagunas en el conocimiento de la bioquimica y la regulacion del metabolismo de los lipidos (que se van enmendando con los estudios exhaustivos en Arabidopsis thaliana ), y el hecho de que muchas enzimas claves estan ligadas a membrana, por lo que los intentos dirigidos a su solubilizacion y purificacion no han tenido exito.

Se estan disen~ado varias estrategias encaminadas a modificar la composicion en acidos grasos de semillas oleaginosas, basadas los progresos en el conocimiento de la bioquimica y genetica de la sintesis de los lipidos. A partir de los mutantes actualmente disponibles en Arabidopsis se puede profundizar en el conocimiento de que genes, entre los actualmente disponibles provenientes de E. coli y de mamiferos, juegan un papel mas importante en el metabolismo de los acidos grasos, de cara a su aislamiento, clonaje e incorporacion al

genoma de las plantas cultivadas. Aunque la sintesis de acilgliceridos participa de rutas relativamente complejas, el conocimiento de su bioquimica y, en particular, los analisis con mutantes pueden ser de gran utilidad en el disen~o de alteraciones del metabolismo lipidico con fines de mejora.

h) Proteinas de semilla.

Las semillas de cereales y legumbres proveen a la poblacion humana del 70 por ciento de su requerimiento proteico en la dieta. Sin embargo, sus deficiencias en aminoacidos esenciales no hacen posible una dieta equilibrada basada en estos cultivos, por lo que esta debe ser suplementada con aminoacidos de otras fuentes. Se manejan varias estrategias con el objetivo de resolver las deficiencias nutricionales de las semillas: (i) insertar aminoacidos adicionales en las proteinas ya existentes, o bien sustituirlos por otros mas deseables, (ii) introducir proteinas completamente nuevas muy enriquecidas en aminoacidos especificos, (iii) transferir genes que codifiquen proteinas de reserva conocidas a sistemas pobres en proteinas, y (iv) proveer de copias adicionales de genes en sistemas ya productores. Las expectativas en este area son moderadamente optimistas, estando la polemica en la conveniencia de variar el patron de aminoacidos de un cultivo, o bien satisfacer las necesidades proteicas y caloricas combinando diferentes cultivos hasta alcanzar los balances dieteticos adecuados.

Por el momento la mayor parte de los estudios realizados con genes de proteinas de semillas en plantas transgenicas han tenido como finalidad la identificacion de las regiones que confieren especificidad tisular y control temporal a los genes, las secuencias consenso especificas de semilla, las secuencias enhancer y los factores nucleares de union (binding); concentrandose en genes de proteinas de reserva de leguminosas y cereales. Asi, se han obtenido plantas de tabaco y petunia con genes de conglicininas (proteina de soja), vicilinas (Pisum sativum), leguminas (P. sativum, Vicia faba, Helianthus annus), gluteninas y hordeinas, de las cuales se ha extraido valiosa informacion sobre el control de la expresion de los genes implicados.

Un perspectiva distinta es la produccion de peptidos de interes comercial en las semillas de plantas. Factores de liberacion hormonal del sistema endocrino de mamiferos, peptidos con funciones cardiovasculares o de otro tipo, peptidos con efectos opiaceos, peptidos con funciones defensivas en insectos y otros animales, anticuerpos funcionales humanos, entre otros, tienen usos importantes en sanidad, agricultura e industria. A partir de un gen quimerico de albumina proveniente de Arabidopsis thaliana transferido a la misma especie y a Brassica napus, se ha podido obtener leuencefalina tras un pequen~o tratamiento con tripsina. Por contra, la produccion de peptidos en semillas de plantas transgenicas debe competir con las biotecnologias fermentativas, por el momento mas desarrolladas.

i) Otros metabolitos de interes alimentario, quimico y farmaceutico.

El incremento de la cantidad de azucares, presentes en ciertos organos o tejidos, es un objetivo deseable en la mejora de la calidad de frutas, hortalizas y cereales. Se estan realizando esfuerzos para aumentar la cantidad de sacarosa de la patata, de fructanos en la achicoria y de amilopectina en el trigo mediante tecnologia antisentido. Tambien se estan desarrollando variedades de tomate con alto contenido en solidos y alta viscosidad en el fruto, consecuencia de la acumulacion de pectina. La introduccion del gen de una proteina de sabor dulce, llamada monelina, es util en la obtencion de nuevas variedades de tomate y lechuga con mejor sabor.

Las plantas son una fuente tradicional de materiales monomericos y polimericos, p. ej. azucares, acidos grasos, almidones, celulosas, caucho y ceras. En la busqueda de nuevos materiales biologicos renovables la ingenieria genetica de plantas puede jugar un importante papel. La composicion del almidon en patatas, maiz y trigo tambien esta siendo modificada con el fin de que pueda ser utilizado en la industria papelera o en la fabricacion de plasticos biodegradables. La presencia y expresion del gen de manitol- deshidrogenasa de E. coli incrementa la concentracion de manitol en plantas transgenicas de tabaco. La introduccion del gen bacteriano de la clodextrin-glucosil transferasa en la patata produce niveles bajos, pero detectables, de ciclodextrinas en tuberculos. Recientemente se han obtenido plantas transgenicas que expresan acetoacetil-CoA sintetasa y acetoacetil-CoA reductasa que cataliza dos pasos en la produccion de poli-beta-hidroxibutirato, un polimero termoplastico biodegradable. Tambien se esta ensayando la expresion de esterasas de plantas tropicales en cultivos de zonas templadas como soja y colza, los cuales podrian producir acidos grasos de 12 carbonos.

Se ha conseguido la produccion correcta de inmunoglobulinas gamma y kappa, y el ensamblaje de anticuerpos funcionales de forma muy eficiente en hojas de plantas de tabaco, obtenidas a partir del cruce entre plantas transgenicas que expresaban el gen de una sola cadena de inmunoglubina. El ensamblaje de subunidades mediante cruzamiento sexual puede ser un metodo de aplicacion general para la expresion de multimeros heterologos en plantas. Ya que grandes moleculas como las proteinas multimericas no atraviesan las paredes celulares vegetales, la union mediante anticuerpos de pequen~as moleculas organicas (toxinas, herbicidas, hormonas, quelatos organicos, por ejemplo) que son permeables en la pared celular, podria ser un buen metodo para retener estas moleculas en la plantas. La acumulacion de anticuerpos funcionales puede proporcionar nuevas opciones para la recuperacion de muchos contaminantes y otras moleculas organicas de significacion biologica. La produccion de compuestos farmaceuticos como encefalinas en soja y seroalbumina humana en patata, permite prever que otras proteinas como neuropeptidos, factores de coagulacion sanguinea y hormonas del crecimiento puedan ser producidas en semillas y en otros organos de la planta de forma rentable. Los virus bacterianos podrian ser vectores de alto nivel de expresion debido a su elevado numero de copias.

j) Color en plantas ornamentales.

Los pigmentos florales son productos de la ruta biosintetica de los flavonoides. Mediante la tecnologia del ARN antisentido en el gen de la chalcona- sintetasa se ha podido manipular la pigmentacion floral en

plantas transgenicas de Petunia. Algunos transformantes han mostrado variaciones en el patron de formacion de pigmentos (sectores, anillos, etc.). Las aplicaciones de estas tecnicas en la produccion de nuevas variedades de plantas ornamentales son evidentes.

k) Fijacion del Nitrogeno.

El crecimiento de los cultivos agricolas depende del enorme aporte de nitrogeno utilizable, bien suministrado en forma mecanica como amonio, urea o nitratos, o bien producido naturalmente en el suelo mediante la reduccion microbiana del nitrogeno atmosferico. Este aporte natural se consigue mediante estrechas asociaciones entre las plantas y los microorganismos fijadores del nitrogeno. Entre las plantas cultivadas solo las leguminosas tienen esa capacidad, por asociacion simbiotica en sus raices con especies de Rhizobium. Los campos de manipulacion genetica se centran en: (i) la ampliacion del espectro de huespedes de Rhizobium a cereales y forrajeras, (ii) la proteccion de la nitrogenasa frente al oxigeno, y (iii) el uso de cloroplastos como posible organulo diana donde transferir los genes de fijacion del nitrogeno. La dificultad en la consecucion de estos objetivos no debe ser subestimada, y pese a que el alto coste de produccion de los fertilizantes esta estimulando la investigacion en estas areas, es probable que aun pase algo de tiempo hasta ver sus resultados en agricultura. Por el momento ya se han obtenido cepas recombinantes de Rhizobium mas eficientes como fijadoras de nitrogeno que son inoculadas en algunas leguminosas.

l) Incremento de la eficacia fotosintetica.

El valor ultimo de las plantas esta en su capacidad para convertir la energia solar en reservas quimicas almacenables, a traves del proceso de la fotosintesis. Las estrategias para incrementar su eficiencia de utilizacion de la energia solar sin dos: (i) la modificacion de los genes que codifican las subunidades de la Ribulosa Bifosfato Carboxilasa, con el fin de producir un enzima que proporcione una fijacion mas eficiente del CO2, y (ii) el intercambio de varios componentes de fotosistemas entre plantas diferentes, con el fin de optimizar el transporte de electrones. El numero y la complejidad de las reacciones fotosinteticas, pese a hacer muy excitante su manipulacion genetica, probablemente retrasara su aplicacion practica. Se han obtenido plantas transgenicas de tabaco y tomate que incorporan un gen quimerico del fitocromo tipo I (que normalmente solo se acumula durante la noche), cuya presencia provoca cambios morfologicos, tales como enanismo, follaje verde oscuro, hojas mas pequen~as y mas anchas, dominancia apical reducida, altos niveles de sintesis de antocianinas en semillas, entre otras. El fenotipo segrega normalmente en la descendencia. Los cambios morfologicos inducidos por la presencia de un fitocromo tipo I en tejido en crecimiento diurno, son una primera sen~al del papel que la ingenieria genetica puede jugar en la alteracion de los procesos metabolicos fotosinteticos.

Perspectivas.

El potencial de las tecnicas de ingenieria genetica como herramientas en manos del mejorador de cultivos parece vasto. Como ejemplos de los logros ya obtenidos se pueden mencionar las variedades de pepinos, tomates y patatas resistentes a virus, las nuevas variedades de flores obtenidas por tecnicas in vitro, la transferencia de resistencias a insectos en algunas hortalizas, nuevas variedades horticolas capaces de crecer con menores cantidades de fertilizantes, Rhizobium recombinantes que mejoran la capacidad de fijacion de nitrogeno de las legumbres, e incluso plantas transgenicas de tabaco que producen anticuerpos funcionales. Los progresos obtenidos en este area durante los ultimos 8 an~os hacen pensar en un futuro cada vez mas satisfactorio (cuadro 2).

La principal limitacion en la aplicacion de la ingenieria genetica a la agricultura esta en el necesario conocimiento basico de los componentes geneticos responsables de las caracteristicas de las plantas y de los mecanismos de su regulacion y expresion. A pesar de que los metodos de introduccion y expresion de genes exogenos en plantas se han perfeccionado mucho en diez an~os, los ingenieros geneticos de plantas carecen aun de importantes herramientas comunes en los sistemas microbianos. Las nuevas combinaciones geneticas introducidas en plantas pueden expresarse constitutivamente, hacerlo bajo el control de secuencias reguladoras en un determinado tejido u organo de la planta y/o a partir de un momento determinado del desarrollo, o bien estar regulados bajo el efecto de agentes inductores de tipo fisico (induccion por herida, calor, frio) o quimico (insecticidas, herbicidas).

Si bien desde hace varios an~os se vienen describiendo promotores especificos de tejido, e inducibles por herida, esta en sus comienzos la capacidad de regular la expresion de los transgenes mediante agentes quimicos: la induccion genica de tipo quimico. Basicamente se busca el

aislamiento de una secuencia en cis que opere como llave reguladora de un gen con el que esta naturalmente asociado, seguido de la asociacion de esta secuencia cis al gen de interes De este modo se obtiene la expresion del gen manipulado de manera similar al gen natural regulado quimicamente. Pueden distinguirse dos formas basicas de regulacion quimica de genes: (i) los sistemas endogenos, que usan sen~ales reguladoras de los propios genes de plantas en respuesta al tratamiento quimico sintetico; y (ii) los sistemas exogenos, que recaen en elementos provenientes de genes de otros reinos, asociados a compuestos quimicos que no tienen efecto en la expresion de los genes nativos de plantas. Las secuencias reguladoras de tipo endogeno son atractivas ya que pueden ser de facil manipulacion. Por ejemplo, la adicion de un elemento promotor 5U puede ser suficiente para controlar una secuencia codificante externa. Sin embargo, el uso de secuencias reguladoras endogenas implica que otros genes nativos puedan estar ligados a esas secuencias reguladoras, por lo que pueden ser inducidos al an~adir el regulador quimico.

Han sido hallados varios ejemplos de sistemas de regulacion quimica por induccion, algunos implicados en los mecanismos de resistencias de las plantas. Los compuestos de inmunizacion son agentes quimicos que inducen la respuesta del sistema de resistencia adquirida (SAR) en plantas. El SAR es un sistema de resistencia de amplio espectro que es inducido por una infeccion patogenica inicial o mediante tratamiento quimico. Los inductores quimicos pueden ser de origen natural, como el acido acetilsalicilico, o de tipo sintetico, como el acido 2,6-dicloroisonicotinico (INIA). La induccion conduce a la expresion de al menos nueve juegos de genes en tabaco, la especie mejor caracterizada. La region promotora de uno de ellos (la proteina PR, pathogenesis -related protein ) confiere expresion inducible de tipo quimico a un gen testigo, que se expresa por la presencia de acido acetil-salicilico, INIA, e incluso de la proteina insecticida de Bacillus thuringensis. El interes practico de este tipo de induccion es enorme.

El tipo de caracteres que han sido introducidos en plantas transgenicas hasta la actualidad es muy limitado. Mientras que muchos de esos caracteres funcionan bien bajo expresion constitutiva, otros solo seran de utilidad si son regulados. Mientras que las bases bioquimicas y geneticas de los procesos mas complejos de las plantas son descubiertos, es probable que se vayan creando un numero creciente de transgenes utiles unicamente bajo control exogeno. El uso de sistemas de regulacion quimica, junto a los de tipo fisico y a las secuencias promotoras y/o reguladoras 5U y 3U que definen la expresion espacial y temporal de los genes, conducira al desarrollo de fenotipos mas utiles en las especies de interes agricola.

Metodos para introducir genes en plantas.

La aplicacion de las tecnicas de ingenieria genetica trasciende los conceptos de la mejora genetica tradicional al no limitarse a introducir o manipular caracteres de valor agronomico, tales como el control de insectos, malas hierbas, y enfermedades de las plantas, o la calidad de los productos agricolas. Debido a su capacidad para crear combinaciones geneticas totalmente nuevas y de manipular y dirigir su expresion temporal y espacial, la ingenieria genetica permite desarrollar plantas transgenicas cuyos productos pueden tener interes para las industrias agroalimentarias, quimicas y farmaceuticas. El uso agricola de germoplasma recombinante de elite, capaz de producir

compuestos de alto valor an~adido, puede suponer una alternativa a los usos agricolas tradicionales y traer consigo ventajas medioambientales con respecto a la sintesis quimica tradicional.

La base de la mejora genetica vegetal es la transferencia de informacion genetica entre plantas con el fin de producir los fenotipos deseados. La tecnologia del DNA recombinante permite la manipulacion directa y altamente especifica del material genetico. Las situaciones en las que las tecnicas del DNA recombinante pueden resultar mas valiosas son aquellas que implican la transferencia de genes unicos o de pequen~os grupos de genes de un organismo a otro, cuando tal transferencia no sea posible por medios tradicionales. Ademas de incorporar genes de interes provenientes de otra especie vegetal, microbiana o animal, se pueden manipular in vitro los genes propios de una especie para, por ejemplo, alterar su nivel de expresion, el momento de activacion, o modificar la especificidad tisular de sus productos con un fin determinado. Tambien es posible la inactivacion selectiva de los genes mediante la transcripcion de genes antisentido , y se esta en camino de lograr la insercion de genes de manera mas especifica con el fin de minimizar la variabilidad en la expresion genica entre los transformantes.

Las primeras plantas que expresaron genes manipulados fueron plantas de tabaco, Nicotiana tabacum, transformadas mediante vectores de A. tumefaciens. La transformacion fue confirmada por la presencia de secuencias de DNA externas en los transformantes primarios y en su progenie, y por un fenotipo de resistencia antibiotica conferida por un gen quimerico de neomicina fosfotransferasa. Estos primeros experimentos de transformacion a menudo utilizaron protoplastos como celulas

receptoras. El posterior desarrollo de metodos de transformacion basados en explantes regenerables como hojas, brotes y raices contribuyeron significativamente a la transformacion facil y rutinaria que se usa hoy en muchas especies de dicotiledoneas, mostrandose las monocotiledoneas muy reticentes a la transformacion con este sistema. Por ello, varios metodos de transformacion con DNA libre como la microinyeccion, electroporacion, y la tecnologia del disparo de particulas, han sido desarrollados con exito para la transformacion en monocotiledoneas como el maiz, trigo y arroz. En la actualidad mas de 50 especies de plantas cultivadas pueden ser manipuladas geneticamente por tecnicas moleculares. La lista incluye practicamente todas las dicotiledoneas mas importantes y esta aumentando rapidamente el numero de monocotiledoneas. En los proximos an~os se preve la puesta a punto de sistemas eficaces y rutinarios de transformacion para practicamente todos los cultivos.

Transferencia de genes mediada por Agrobacterium tumefaciens.

Los derivados del patogeno A. tumefaciens han mostrado ser vehiculos eficientes y versatiles para la introduccion de genes en plantas y celulas vegetales. Los primeros experimentos demostraron que DNA heterologo insertado en el DNA-T podia ser transferido a las plantas junto con los genes del DNA-T ya existentes. Se construyeron sistemas de transformacion eficientes eliminando los genes de la biosintesis de fitohormonas de la region del DNA-T, lo que terminaba con la capacidad de la bacteria para inducir proliferacion celular aberrante. Los modernos vectores de transformacion son capaces de replicacion en

Escherichia coli y en A. tumefaciens, tras las manipulaciones convenientes. Los avances mas recientes en la tecnologia de los vectores de Agrobacterium han implicado mejoras en la ordenacion de genes y sitios de restriccion en los plasmidos, para facilitar la construccion de nuevos vectores de expresion. Los vectores que se usan actualmente contienen regiones multilinker que pueden estar flanqueadas por un promotor y/o un sitio de adicion de poliadenilato, para hacer posible la expresion directa de las secuencias codificantes insertadas.

Basicamente se emplean dos tipos de vectores desarrollados a partir del sistema A. tumefaciens - plasmido Ti: los llamados vectores de cointegracion (sistemas cis) y los vectores binarios (sistemas trans ). En el primer caso se clona en propio segmento DNA-T en Escherichia coli (utilizando por ejemplo el plasmido pBR322). El DNA-T del plasmido aislado se abre con enzimas de restriccion adecuados, lo que permite la introduccion de segmentos del DNA extran~o que se desea transferir al genoma de la planta. Los recombinantes se vuelven a clonar en E. coli. Cuando estos plasmidos son introducidos por conjugacion en una cepa de A. tumefaciens portadora del pTi salvaje, la recombinacion homologa dentro de las celulas permite la transferencia del segmento de DNA-T que contiene el inserto a la region DNA-T del pTi completo. Incorporando un marcador de seleccion al inserto, por ejemplo el gen de resistencia a la kanamicina de E. coli, las celulas de A. tumefaciens portadoras del pTi recombinante pueden ser seleccionadas facilmente. La replicacion del pTi recombinante en A. tumefaciens, seguida de la infeccion a plantas, da lugar a la proliferacion de celulas vegetales transformadas que constituyen primero un callo, y alterando de la forma adecuada las concentraciones de fitohormonas, puede regenerarse la planta transgenica completa. El vector binario aprovecha la distincion entre funciones cis

y trans que existe en el plasmido. El vector basico es un plasmido lanzadera, capaz de replicarse en E. coli y en un amplio rango de otras bacterias (incluyendo A. tumefaciens ), que contiene los dos segmentos de 24 pb correspondientes a los limites del DNA-T. En E. coli , mediante procedimientos rutinarios de clonaje, se preparan derivados del vector que contienen inserciones de DNA (secuencia que se desea transferir a la planta) hacia la izquierda del segmento de 24 pb de la derecha. Estos plasmidos recombinantes son trasferidos directamente a celulas de A. tumefaciens de una cepa portadora del pTi de tipo salvaje (o mejor aun, de un pTi defectuoso al que se haya eliminado las secuencias de 25 pb o del segmento DNA-T completo). Los plasmidos recombinantes son capaces de replicarse en el nuevo hospedador, el cual le proporciona en trans las funciones vir requeridas para la insercion del DNA en el genoma de la planta. Las celulas vegetales que son posteriormente infectadas por estas bacterias recombinantes contienen copias integradas del DNA-T salvaje, del DNA-T recombinante o de ambos. En el caso de haber empleado el pTi defectuoso unicamente son trasferidos los DNA-T recombinantes lo que supone una ventaja. Si se asocia al DNA-T recombinante un gen marcador y una secuencia de regulacion de la transcripcion que sea activa en la planta (por ejemplo, la region 3U del gen nos ) puede expresarse el producto genico funcional correspondiente en la planta transgenica.

Agrobacterium constituye un excelente sistema de introduccion de genes en celulas vegetales, ya que: (i) el DNA puede ser introducido en todos los tejidos de la planta, lo que solventa la necesidad de protoplastos; y (ii) la integracion del DNA-T es un proceso relativamente preciso. La region de DNA a ser transferida esta definida por las secuencias flanqueantes. Ocasionalmente se producen reordenaciones, pero en la mayor parte de los casos la region se inserta intacta en el genoma de la planta. La estabilidad de la expresion de la mayoria de los genes que se

introducen via Agrobacterium es excelente. Los DNA-T integrados muestran mapas geneticos consistentes y segregaciones adecuadas. Los caracteres introducidos han mostrado ser estables durante muchas generaciones de cruzamientos en plantas manipuladas por estas tecnicas. Esta estabilidad es critica de cara a la comercializacion de plantas transgenicas. La lista de especies que pueden ser transformadas por Agrobacterium se amplia dia a dia, y en el momento presente incluye a bastantes de los cultivos mas importantes, exceptuados los cereales.

Pocas monocotiledoneas parecen ser hospedadores naturales de Agrobacterium, aunque se han obtenido plantas transgenicas en esparragos con vectores Agrobacterium y se han observado tumores transformados en la batata. Cereales de grano como el arroz, maiz y trigo no han sido transformados de forma estable con Agrobacterium, a pesar de la evidencia de transferencia de T-DNA en maiz, trigo y cebada. Por ello se han realizado esfuerzos extensivos para conseguir tecnologias de transformacion alternativas en estas especies.

Vectores virales y agroinfeccion.

Los virus DNA de plantas han recibido bastante atencion como posibles vectores para la introduccion de genes en las plantas. Se ha demostrado la propagacion y expresion de genes bacterianos, seleccionables como marcadores, trasferidos a plantas por el virus del mosaico de la coliflor, CaMV. Tambien se han combinado las capacidades de los

plasmidos derivados del Ti y de los vectores virales en una tecnica llamada RagroinfeccionS: DNA virico o copias cDNA del ARN virico se introducen en plantas mediante plasmidos Ti de Agrobacterium , resultando una infeccion virico sistemica en la planta transgenica. Para la liberacion del virus no es necesario que el DNA-T se integre en el genoma de la planta. La infeccion sistemica no es prueba de integracion del DNA externo. Sin embargo, en caso de producirse la integracion, la agroinfeccion conduce a la transformacion de las celulas adyacentes a la herida y, en consecuencia, a la posible obtencion de plantas transgenicas.

Los virus ARN como el virus del mosaico del tabaco, TMV, que replican solo a traves de intermediarios DNA, pueden tambien ser utilizados como vectores en ingenieria genetica de plantas. Los vectores virales proporcionan algunas ventajas teoricas para la introduccion de genes en plantas, como son la facilidad de la infeccion, el rango de hospedadores mas amplio al de Agrobacterium, y el alto cociente entre el numero de copias y la expresion de genes insertados bajo el control de los promotores apropiados. Sin embargo existen de hecho limitaciones importantes: (i) el taman~o maximo del DNA pasajero que no afecta a la infectividad virico parece estar limitado; (ii) las infecciones virales generalmente provocan sintomas especificos de enfermedad o son letales para la planta huesped; (iii) posiblemente, la alta frecuencia de errores durante la sintesis del ARN virica puede dar lugar a la expresion incorrecta del gen introducido; y, la mas importante; (iv) el DNA externo no se transfiere necesariamente a la descendencia. De acuerdo con las evidencias disponibles, los virus no se integran en el genoma de la planta hospedadora, y no aparecen en los meristemos de la planta por lo que no se transmiten a la descendencia por via sexual. Parece muy dificil (excepto, p. ej. a traves de elementos transponibles) el uso de vectores virales para la transformacion genetica de plantas. pero tienen un buen potencial para la amplificacion genica y la infeccion sistemica en plantas individuales.

Se han propuesto otros posibles vectores para la transformacion genetica en celulas vegetales, tales como elementos transponibles, elementos mitocondriales del maiz, componentes genomicos nucleares, y viroides y virusoides, que, por el momento, no han mostrado eficiencia.

Transferencia directa de genes.

El desarrollo de estos metodos se hizo inspirandose en las tecnicas fisicas usadas en la transformacion de celulas animales en cultivo. Asi se ha conseguido la transformacion de protoplastos de plantas facilitando la entrada de DNA por precipitacion con fosfato calcico, tratamiento con PEG, electroporacion, o la combinacion de varios de estos tratamientos. Tales metodos han posibilitado la produccion de celulas transgenicas para estudios de expresion genica en sistemas que no pueden ser transformados por otras tecnicas. La aplicacion de estas tecnicas a la produccion de plantas transgenicas esta limitada por las dificultades inherentes a la regeneracion de plantas a partir de protoplastos. Ha habido considerables avances en la regeneracion de cereales, tradicionalmente uno de los grupos mas recalcitrantes. Varios laboratorios han tenido exito en la regeneracion de plantas fertiles de arroz a partir de protoplastos de embriones. Este avance fue inmediatamente seguido por la produccion de plantas transgenicas de arroz, a traves de la descarga de DNA libre en protoplastos y posterior regeneracion de la planta, primero en variedades Japonica y recientemente en una variedad Indica (la mas importante como fuente de alimento en el mundo).. En maiz se han obtenido plantas transgenicas

fertiles a traves de tecnicas de electroporacion de embriones inmaduros y de calli, tambien en lineas comerciales.

En paralelo al trabajo de transformacion de protoplastos se han realizado esfuerzos para encontrar nuevas vias de introducir DNA en celulas intactas o tejidos. La regeneracion de cereales a partir de embriones inmaduros o de explantes es relativamente una rutina. Uno de los avances mas significativos en este area ha sido la introduccion de la tecnologia de los microproyectiles de alta velocidad. En este sistema el DNA se carga sobre una superficie de pequen~as particulas de metal (0+5 a 5 micras) que son aceleradas a velocidades de uno a varios centenares de metros por segundo. Las particulas son capaces de penetrar a traves de varias capas de celulas y realizan la transformacion celular en tejidos de explantes. Se han obtenido plantas transformadas estables de tabaco y soja mediante disparo de particulas y, mas recientemente, plantas transgenicas fertiles de maiz, arroz, trigo y avena mediante bombardeo de cultivos embrionarios y de embriones cigoticos inmaduros. Gracias a la eliminacion del paso por el estado de protoplastos, el metodo del disparo tiene el potencial de permitir la transformacion directa de genotipos comerciales de cereales. Una desventaja de los sistemas de transferencia directa es la frecuente aparicion de reordenaciones y reacciones de concatenacion antes de la insercion del gen, lo que determina un patron de integracion bastante impredecible.

Protoplastos y transferencia directa de genes.

Los protoplastos incorporan eficazmente DNA del medio si se les trata con polietilenglicol (PEG) y/o electroporacion. El propio proceso de aislamiento de protoplastos probablemente induce la formacion de celulas competentes en el estado adecuado. Si se dispone de poblaciones de protoplastos que contengan celulas competentes, el DNA exogeno es integrado facilmente via recombinacion no-homologa. Tambien puede ocurrir recombinacion homologa pero a un nivel mas bajo. Cuando se transforman protoplastos capaces de regeneracion, pueden obtenerse plantas transgenicas que contienen, expresan y heredan de forma estable el gen extran~o. En cereales, solo se han aislado protoplastos competentes a partir de suspensiones embriogenicas establecidas a partir de tejidos inmaduros (escutelo, base de la hoja, antera). Los procedimientos standard de transferencia de genes con protoplastos han conducido a la regeneracion de varios cereales transgenicos (arroz, maiz). El cultivo de protoplastos aislados a partir de diferentes tejidos es util en los analisis de la expresion transitoria de un gen o de una secuencia reguladora, ya que la incorporacion del DNA a esos protoplastos no es problematica. La integracion, en caso de producirse, no tiene consecuencias, ya que los protoplastos de este origen no proliferan.

La fusion de protoplastos, mediada por varios agentes fusogenos como el PEG, es un buen metodo para la generacion de hibridos interespecificos. El DNA-T de Agrobacterium y otras secuencias de DNA puede ser transferidas de una especie a otra por medio de la fusion de protoplastos y esferoplastos. Con el desarrollo de los marcadores

adecuados, la fusion de protoplastos supone una via de control del intercambio de genes entre especies, por medio de la cotransferencia de estos con genes marcadores seleccionables derivados del vector.

Fusion de liposomas con tejidos y protoplastos.

Entre los distintos metodos para introducir DNA aislado en protoplastos y tejidos de plantas superiores, la transferencia directa de genes mediada por liposomas es uno de los mas dificiles. Si bien en un principio el metodo mostro ser eficaz, solo ha recibido una atencion muy limitada. Los problemas radican en la preparacion de los liposomas y en la encapsulacion de los plasmidos. Estos problemas quedan en parte soslayados con la reciente disponibilidad comercial de preparaciones de liposomas estables (Lipofectina), que espontaneamente se unen al DNA y median en su descarga dentro de la celula. La eficacia del metodo aumenta al combinarlo con otras tecnicas como el tratamiento con PEG o la electroporacion. La descarga de DNA y otras macromoleculas en protoplastos vegetales mediante diferentes tipos de liposomas ha sido el objetivo de muchos experimentos, habiendose conseguido en primer lugar la integracion de DNA exogeno en el genoma de maiz y de tabaco.

Los metodos de transferencia mediados por liposomas poseen algunas ventajas con respecto a la transferencia directa de DNA, como son la proteccion contra las nucleasas que proporciona la membrana y la no necesidad de un DNA transportador (carrier). Por contra, la breve sonicacion necesaria para la inclusion del DNA en los liposomas puede producir rupturas y dan~os. Pese a su dificultad, el metodo de fusion de liposomas que contienen DNA con protoplastos esta actualmente bien asentado en la produccion de plantas transgenicas de bastantes especies. Menos exitosa ha resultado la fusion de los liposomas con tejidos y celulas normales.

Disparo de particulas o Biolistica.

El bombardeo de microproyectiles presenta el mayor potencial para la transformacion de cereales. Por medio de esta tecnica se han obtenido plantas transgenicas en monocotiledoneas como maiz, arroz, trigo, avena y can~a de azucar, ademas de varias dicotiledoneas: soja, tabaco, algodon. La aceleracion de particulas pesadas (tungsteno u oro) recubiertas de DNA puede usarse para transportar genes dentro de celulas y tejidos vegetales. Las ventajas de este metodo le dan un potencial de aplicabilidad general: (i) tecnicamente es facil de manejar; (ii) un disparo puede producir multiples integraciones; (iii) las celulas pueden sobrevivir a la introduccion de una particula, e incluso de varias; (iv) los genes que recubren la particula recuperan su actividad biologica; (v) las celulas diana pueden ser de diversos tipos, tales como polen, cultivos celulares, organos y meristemos; (vi) las particulas tambien

alcanzan capas celulares mas profundas. De este modo, el metodo proporciona un sistema de descarga de DNA independiente de vectores en una gran variedad de tipos celulares. La tecnica, sin embargo, presenta algunos problemas inherentes. Ya que los eventos de expresion transitoria de genes introducidos por esta tecnica se producen con una frecuencia de 10-4, y la integracion efectiva de estos genes en el genoma de la planta lo hace con una frecuencia de 10-8, se requieren grandes numeros para alcanzar con exito una celula vegetal competente. Ello hace necesario un esfuerzo en la optimizacion de los parametros de la tecnica para mejorar la situacion. Ademas, las particulas tienen que alcanzar celulas competentes, generalmente escasas salvo en cultivos celulares embriogenicos. El bombardeo de meristemos, que ha sido exitoso en el caso de la soja, plantea muchos mas problemas en los cereales. La obtencion de cultivos embriogenicos en cereales ha abierto las puertas a la aplicacion rutinaria de esta tecnica en este tipo de plantas.

El bombardeo con microproyectiles desnudos tambien ha sido utilizado para producir heridas en las celulas y favorecer la posterior transferencia de genes mediada por A. tumefaciens, incrementandose en al menos 100 veces la obtencion de celulas recombinantes en meristemos de tabaco y girasol, respecto a las tecnicas standard.

Microinyeccion.

La microinyeccion es una de las tecnicas mas precisas para la descarga de macromoleculas dentro de compartimentos intracelulares especificos. Usando estos metodos se ha conseguido la transformacion de protoplastos de alfalfa y de tabaco, y la obtencion de clones transgenicos a partir de protoplastos y quimeras transgenicas en embriones de colza. La microinyeccion intranuclear ofrece la gran ventaja de poder transformar protoplastos individuales a altas frecuencias. Ademas, el hecho de que junto al DNA desnudo puedan inyectarse otros elementos geneticos como plastidios, mitocondrias y cromosomas hace a la microinyeccion una tecnica valiosa y versatil para la transformacion de plantas.

La microinyeccion utiliza dispositivos microcapilares y sistemas de microscopia para depositar DNA en el interior de celulas definidas, de modo que la celula inyectada pueda sobrevivir y proliferar. Como en el caso de la biolistica, la microinyeccion realmente descarga el DNA en la celula. En comparacion con la primera, la microinyeccion presenta algunas desventajas: solamente una celula recibe el DNA por cada inyeccion, y el manejo de la tecnica requiere mas pericia y mayor instrumentacion. Tambien tiene ventajas: (i) puede optimizarse la cantidad de DNA descargado; (ii) el experimentador puede decidir en que celula introduce el DNA; (iii) la descarga es precisa y predecible, incluso en el nucleo de la celula, y esta bajo control visual; (iv) pequen~as estructuras (p. ej. microesporas y pro-embriones de pocas celulas), que no estan disponibles en las grandes cantidades que necesita un experimento de bombardeo, pueden ser alcanzadas por esta tecnica; (v) unidades definidas micro-inyectadas pueden ser cultivadas en micro-cultivo; y (vi) en el caso de que puedan regenerarse proembriones cigoticos, la microinyeccion ofrece un modo de transformacion abierto a cualquier especie y variedad con reproduccion sexual. Una mayor sofisticacion del metodo consiste en la microinyeccion de

liposomas, en los que se ha depositado el DNA. La microinyeccion en celulas diferenciadas puede facilmente descargar el DNA en la vacuola, donde es degradado. Por el contrario, la microinyeccion de liposomas en la vacuola conduce a su fusion con el tonoplasto, liberandose el contenido del liposoma en el citoplasma.

Macroinyeccion.

El uso de agujas de inyeccion con un diametro mayor que el diametro celular conduce a la destruccion de aquellas celulas en las que el DNA ha sido depositado. La integracion del DNA requiere que este se desplace desde celulas adyacentes heridas, con los problemas que esto conlleva relativos al paso a traves de las paredes celulares por la macromolecula del DNA. Tras el primer experimento de inyeccion de un gen testigo en el tallo del meristemo floral de centeno, con claras evidencias de haber ocurrido la transmision sexual del caracter a la descendencia, no ha sido posible reproducir el experimento a gran escala. Es dificil comprender como el DNA pudo alcanzar las celulas esporogenicas en el experimento mencionado, teniendo no solo que transmitirse a las celulas vecinas, sino viajar a traves de muchas capas de celulas.

Fibras de carburo de silicona.

Recientemente se ha descrito un metodo de descarga de DNA mediante fibras de carburo de silicona que actuan como microagujas. Mediante una fuerte agitacion de un cultivo celular en suspension, en presencia de un medio liquido, DNA plasmidico codificando un gen testigo, y fibras de carburo de silicona, se obtiene la expresion transitoria del gen en celulas de maiz y tabaco. Es necesario elucidar los mecanismos moleculares que actuan en estas transformaciones, asi como ensayar nuevos materiales fibrosos que mejoren los resultados obtenidos.

Incubacion de DNA en tejidos o celulas.

Ha habido muchos intentos de poner en contacto directo plantulas, organos, tejidos, celulas o cultivos celulares de numerosas especies vegetales con DNA exogeno y marcadores geneticos definidos. Los tratamientos incluyen disen~os experimentales encaminados a abrir los plasmodesmos y provocar la perdida de estructuras de pared celular. Algunos tratamientos intentan asegurar una cantidad suficiente de celulas competentes. No se ha descrito ningun caso de transformacion integrativa, aunque si de tipo transitorio. Las tecnicas como esta, que tratan de pasar genes funcionales a traves de la pared celular parecen tener pocas probabilidades de exito, ya que esta es una barrera perfecta para las grandes moleculas de DNA, ademas de una trampa eficaz. Se ha logrado la trasferencia de DNA exogeno al trigo, aunque en frecuencias muy bajas, via A. tumefaciens, en cultivos de embriones sometidos a digestiones enzimaticas parciales previas a la incubacion

con la bacteria. No esta claro que el proceso sea el normal mediado por los genes vir del pTi y las secuencias de los bordes del DNA-T. Se hace necesaria una mayor evidencia experimental sobre este metodo.

Incubacion de DNA en semillas y embriones desecados.

La estrategia de este metodo se basa en dos fenomenos que aparecen en el tejido seco. El primero es el enorme gradiente de potencial hidrico que se forma entre la celula y la solucion acuosa. El segundo es la desorganizacion de las membranas celulares en bajas condiciones de agua, lo que les hace muy permeables. Utilizando embriones somaticos se facilita mucho la desecacion, al carecer estos de la cubierta y el endospermo presentes en las verdaderas semillas. En condiciones de rapida entrada de agua y de alternaciones en las membranas es posible conducir DNA plasmidico al interior de la celula desecada, atravesando la pared celular que bajo estas condiciones es relativamente porosa para el DNA. Por medio de esta tecnica se han obtenido transformantes en varias especies (alfalfa, arroz), pero falta por comprobar si se produce la integracion real del DNA en el genoma de la planta, y si esta es estable en terminos geneticos.

Transformacion del polen.

Esta perspectiva se remonta a primeros de los setenta y se basa en la posibilidad de que el DNA pueda ser recogido dentro del polen en germinacion e integrarse en el nucleo espermatico o alcanzar el cigoto con el tubo polinico. Realmente, de funcionar, seria el metodo ideal para la transferencia de genes en plantas: el supervector. La polinizacion con polen germinado en presencia de DNA en ocasiones ha producido resultados sorprendentes que podrian interpretarse como evidencias de transferencia genica. Sin embargo, nunca se ha demostrado la correspondencia entre un fenotipo observado y su correspondiente gen causal, incluso en experimentos a gran escala realizados por laboratorios experimentados. Una vez mas aparece el problema de la pared celular y de las nucleasas externas e internas, por lo que la tecnica no parece ser muy prometedora. Se ha descrito la transferencia de genes bacterianos en el trigo mediante pipeteo de las espiguillas con suspensiones de Agrobacterium como vector. Esto es factible debido que el polen de trigo, al igual que el de petunia, contiene factores difundibles (identificados como flavonol-glicosidos) que inducen la region vir del pTi. La tecnica requiere mas confirmaciones.

La ruta del tubo polinico.

Esta tecnica permitio obtener plantas transgenicas de arroz hace unos an~os. Colocando una gota de una solucion de DNA exogeno en los estigmas cortados de las flores, la solucion del DNA fluye hacia abajo a traves de la ruta del tubo polinico y entra en la celula en el saco embrionario. Se obtuvieron semillas maduras y se germinaron las plantas transgenicas. Sin embargo, no se demostro que el gen exogeno se

transmitiera a la siguiente generacion. Resulta atractiva la posibilidad de descargar DNA en el cigoto, por la via del tubo polinico, en el transcurso de la fertilizacion normal. Sin embargo, es dificil de interpretar como puede funcionar el sistema, ya que el DNA se veria atrapado por la pared celular, probablemente existan nucleasas en el tubo polinico, y no se conocen sistemas de transporte. Son necesarios mas experimentos para confirmar las posibilidades de esta tecnica.

Microlaser.

Un chorro de microlaser enfocado en el sistema de iluminacion de un microscopio puede usarse pare abrir agujeros en la pared celular y en la membrana plasmatica. Se esperaba que la incubacion de celulas perforadas con volumenes de DNA podria servir de base a un metodo de transformacion sin vectores. No hay datos concluyentes acerca de la eficacia de este metodo, que tendria como competidores a los ya eficaces bombardeo de particulas y microinyeccion.

Electroforesis en tejidos.

Se intenta transmitir DNA mediante electroforesis, a traves de meristemos de semillas de cebada en germinacion. Existen datos esperanzadores, pero sin certezas sobre los mismos.

Sonicacion.

La sonicacion es un metodo nuevo de transferencia de genes en protoplastos y celulas intactas. El mayor efecto de la sonicacion se cree que sea debido a la cavitacion acustica, particularmente a bajas energias acusticas. Debido a este fenomeno se producen burbujas que crecen hasta que implotan, y con rapidas oscilaciones en el taman~o de las burbujas. Los efectos quimicos de este proceso pasan por la formacion de radicales libres, dan~os en la pared celular, alteraciones en la permeabilidad de la membrana, aberraciones cromosomicas menores, y cambios de tipo fisiologico. Mediante sonicacion se ha introducido de manera eficiente DNA plasmidico en protoplastos de remolacha y tabaco, lograndose expresion transitoria de un gen testigo. Aunque no se conoce el mecanismo de permeabilizacion acustica, el hecho de que pueda ser utilizada en protoplastos, celulas en suspension y fragmentos de tejido, junto a la sencillez del equipo necesario, hacen que esta tecnica pueda tener potencial en el futuro.

Bibliografia recomendada.

ABEL, P.P., R.S. NELSON, B. DE, N. HOFFMANN, S.G. ROGERS. R.T. FRALEY & R.N. BEACHY. Delay of Disease Development in Transgenic Plants that Express the Tobacco Mosaic Virus Coat Protein Gene. Science 232: 738743. 1986.

ANZAI, H., K. YONEYAMA & I. YAMAGUCHI. Transgenic Tobacco Resistant to a Bacterial Disease by Detoxification of a Pathogenic Toxin. Molecular and General Genetics 219: 492-494. 1989.

ARNTZEN, C.J. Regulation of Transgenic Plants. Science 257: 1327. 1992.

BARTON, K.A. & W.J. BRILL. Prospects in Plant Genetic Engineering. Science 219: 671-676. 1983.

BECK, C.I. Biotechnology in the Food Industry. An Invisible Revolution is Taking Place. Bio/technology 11: 895-902. 1993.

BENFEY, P.N. & N.-H. CHUA. Regulated Genes in Transgenic Plants. Science 244: 174-181. 1989.

BIDNEY, D., C.SEELONGE, J. MARTICH, HUFFMAN.

M. BURRUS, L. SIMS & G.

Microproyectile Bombardment of Plant Tissues Increases Transformation Frequency by Agrobacterium tumefaciens. Plant Molecular Biology 18: 301-313. 1992.

BORLAUG, N.E. Contributions of Conventional Plant Breeding to Food Production. Science 219: 689-693. 1983.

CARMONA, M.J., A. MOLINA, J.A. FERNANDEZ, J.J. LOPEZ-FANDO & F. GARCIAOLMEDO. Expression of the Alpha-Thionin Gene from Barley Confers Enhanced Resistance to Bacterial Pathogens. The Plant Journal 3: 457462. 1993.

CHILTON, M.D. Plant Genetic Engineering: Progress and Promise. Journal of Agricultural and Food Chemistry 36: 3-5. 1988.

De GREEF, W. R. DELON, M. De BLOCK, J. LEEMANS & J. BOTTERMAN. Evaluation of Herbicide Resistance in Transgenic Crops under Field Conditions. Bio/technology 7: 61-64. 1989.

De HAAN, P., J.J.L. GIELEN, M. PRINS, I.G. WIJKAMP, A. Van SCHEPEN, D.

PETERS, M.Q.J.M. Van GRINSVEN & R. GOLDBACH. Characterization of RNAMediated Resistance to Tomato Spotted Wilt Virus in Transgenic Tobacco Plants. Bio/technology 10: 1133-1137. 1992.

DUHALLUIN, K., E. BONNE, M. BOSSUT, M. De BEUCKELEER & J. LEEMANS. Transgenic Maize Plants by Tissue Electroporation. The Plant Cell 4: 1495-1505. 1992.

FINK, G.R. The State of Plant Molecular Biology: is there a Second Chance for Ag Schools?. Cell 56: 141-142. 1989.

FRALEY, R. Sustaining the Food Supply. Bio/technology 10: 40-43.1992.

GARCIA-OLMEDO,

F.,

G.

SALCEDO,

SANCHEZ-MONGE,

C.

HERNANDEZ-LUCAS, M.J. CARMONA, JJ. LOPEZ-FANDO, J.A. FERNANDEZ, L. GOMEZ, J. ROYO, F. GARCIAMAROTO, A. CASTAGNARO & P. CARBONERO. Trypsin/Alpha-amylase Inhibitors and Thionins: Possible Defence Proteins from Barley. In: P.R. SHEWRY (ed.). Barley: Genetics, Biochemistry, Molecular Biology and Biotechnology. Biotechnology in Agriculture No. 5. World Services to Agriculture, CAB International, Wallingford. pp. 335-350. 1992.

GASSER, C.S. & R.T. FRALEY. Genetically Engineering Plants for Crop Improvement. Science 244: 1293-1299. 1989.

GVBEL, E. & H. LVRZ. Genetic Manipulation of Cereals. Oxford Surveys of Plant Molecular & Cell Biology 5: 1-22. 1988.

GOLDBERG, R.B. Plants: Novel Developmental Processes. Science 240: 1460-1467. 1988.

GOLEMBOSKI, D.B., G.P. LOMONOSSOFF & M. ZAITLIN. Plants Transformed with a Tobacco Mosaic Virus Nonstructural Gene Sequence are Resistant to the Virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 6311-6315. 1990.

GOTSCH, N. & P. RIEDER. Future Importance of Biotechnology in Arable Farming. Trends in Biotechnology 7: 29-43. 1989.

HAMILTON, A.J. G.W. LYCETT & D. GRIERSON. Antisense Gene that Inhibits Synthesis of the Hormone Ethylene in Transgenic Plants. Nature 346: 284-287. 1990.

HARDING, K. & E.C. COCKING. The Interaction Between E. coli Spheroplasts and Plant Protoplasts: a Proposed Procedure to Deliver Foreign Genes into Plant Cells. Protoplasma 130: 153-161. 1986.

HESS, D., K. DRESSLER & R. NIMMRICHTER. Transformation Experiments by Pipetting Agrobacterium into the Spikelets of Wheat (Triticum aestivum L.). Plant Science 72: 233-244. 1990.

HIATT, A. R. CAFFERKEY & K. BOWDISH. Production of Antibodies in Transgenic Plants. Nature 342: 76-78. 1989.

HOOYKAAS, P.J.J. & R.A. SCHILPEROORT. Genetic

Agrobacterium

and Plant

Engineering. Plant Molecular Biology 19: 15-38. 1992.

HOWARD, E., V. CITOVSKY & P. ZAMBRYSKY. The T-Complex of Agrobacterium tumefaciens. In: C.J. LAMB & D.G. GRIERSON (eds.). Plant Gene Transfer. Wiley & Liss, New York. pp. 1-11. 1990.

JOERSBO, M. & JANNE BRUNSTEDT. Sonication: a New Method for Gene Transfer to Plants. Physiologia Plantarum 85: 230-234. 1992.

KAEPPLER, H.F., W. GU, D.A. SOMERS, H.W. RINES & A.F. COCKBURN. Silicon Carbide Fiber-Mediated DNA Delivery into Plant Cells. Plant Cell Reports 9: 415-418. 1990.

KLEE, H.J., M.B. HAYFORD, K.A. KRETZMER, G.F. BARRY & G.M. KISHORE. Control of Ethylene Synthesis by Expression of a Bacterial Enzyme in Transgenic Tomato Plants. The Plant Cell 3: 1187-1193. 1991.

KREBBERS, E. & J. VANDEKERCKHOVE. Production of Peptides in Plant Seeds.

Trends in Biotechnology 8: 1-3. 1990.

KURECZKA, J.E. Genetic Engineering and Hybridization of Wheat. Cereal Foods World 37: 640. 1992.

LAMB, C.J., J.A. RYALS, E.R. WARD & R.A. DIXON. Emerging Strategies for Enhancing Crop Resistance to Microbial Pathogens. 1436-1445. 1992. Bio/technology 10:

LEEMANS, J. Ti to Tomato, Tomato to Marquet. Bio/Technology 11:S22.1993.

MARIANI, C., M. DE BEUCKLEER, J. TRUETTNER, J. LEEMANS & R.B. GOLDBERG. Induction of Male Sterility in Plants by a Chimaeric Ribonuclease Gene. Nature 347:737-741. 1991.

MCBRIDE, K.E. & K.R. SUMMERFELT. Improved Binary Vectors for Agrobacterium-mediated Plant Transformation. Plant Molecular Biology 14: 269-276. 1990.

McCUE, K.F. & A.D. HANSON. Drought and Salt Tolerance: Towards Understanding and Application. Trends in Biotechnology 8: 358-362. 1990.

MOONEY,

P.A.,

P.B.

GOODWIN,

E.S.DENNIS

&

D.J.

LLEWELLYN.

Agrobacterium

tumefaciens-Gene Transfer into Wheat Tissues. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 25: 209-218. 1991.

MORIKAWA, H. & Y. YAMADA. Capillary Microinjection into Protoplasts and Intranuclear Localization of Injected Materials. Plant Cell Physiol. 26: 229-236. 1985.

OELLER, P.W., L. MIN-WONG, L.P. TAYLOR, D.A. PIKE & A. THEOLOGIS. Reversible Inhibition of Tomato Fruit Senescence by Antisense RNA. Science 254: 437-439. 1991.

PEN~ARRUBIA, L., M. AGUILAR, L. MARGOSSIAN & R. L. FISCHER. An Antisense Gene Stimulates Ethylene Hormone Production during Tomato Fruit Ripening. The Plant Cell 4: 681-687. 1992.

PERLAK, F.J., R. W. DEATON, T.A. ARMSTRONG, R.L. FUCHS, S.R. SIMS, J.T. GREENPLATE & D.A. FISCHHOFF. Insect Resistant Cotton Plants. Bio/technology 8: 939-943. 1990.

PERLAK, F.J., R.L. FUCHS, D.A. DEAN, S.L. MCPHERSON & D.A. FISCHHOFF. Modification of the Coding Sequence Enhances Plant Expression of Insect Control Protein Genes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 3324-3328. 1991.

PERLAK, F.J., T.B. STONE, Y.M. MUSKOPF, L.J. PETERSEN, G.B. PARKER, S.A.

MACPHERSON, J. WYMAN, S. LOVE, G. REED, D. BIEVER & D. A. FISCHHOFF. Genetically Improved Potatoes: Protection from Damage by Colorado Potato Beetles. Plant Molecular Biology 22: 313-321. 1993.

PETIT, A., L.A. MARTIN, M. LARRIBE, J. BREVET & J. TEMPE. Diversity of T-DNA Functions Encoding Plant Cell Proliferation in Agrobacterium Pathogenic Plasmids. In: C.J. LAMB & D.G. GRIERSON (eds.). Plant Gene Transfer. Wiley & Liss, New York. pp. 13-20. 1990.

POTRYKUS, I. Gene Transfer to Cereals: an Assessment. Bio/technology 8: 535-542. 1990.

SCHELL, J.S. Transgenic Plants as Tools to Study the Molecular Organization of Plant Genes. Science 7: 1176-1182. 1987.

SENARATNA, T., B. D. MCKERSIE, K.J. KASHA & J.D. PROCUNIER. Direct DNA Uptake during the Imbibition of Dry Cells. Plant Science 79: 223-228. 1991.

SHEEHY, R.E., M. KRAMER & W. HIATT. Reduction of Polygalacturonase Activity in Tomato Fruit by Antisense RNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 8805-8809. 1988.

SIJMONS, P.C., B.M.M. DEKKER, B. SHRAMMEIJER, T.C. VERWOERD, P.J.M. Van der ELZEN & A. HOEKEMA. Production of Correctly Processed Human Serum

Albumin in Transgenic Plants. Bio/technology 8: 217-221. 1990.

SIMMONDS, N.W. Plant Breeding: the State of Art. En: Genetic Engineering of Plants. An Agricultural Perspective. T. KOSUGE, & C.P. MEREDITH (eds.). Plenum, New York. 1983.

SOMERS, D.A., H.W. RINES, W. GU, H.F. KAEPPLER & W.R. BUSHNELL. Fertile, Transgenic Oat Plants. Bio/technology 10: 1589-1594. 1992.

SPORLEIN, B. & H.-U. KOOP. Lipofectin: Direct Gene Transfer to Higher Plants using Cationic Liposomes. Theoretical and Applied Genetics 83: 1-5. 1991.

Van WORDRAGEN, M.F. & H.J.M. DONS. Agrobacterium tumefaciensMediated Transformation of Recalcitrant Crops. Plant Molecular Biology Reporter 10: 12-36. 1992.

VANDEKERCKHOVE, J., BOTTERMAN, M.

J. Van DAMME,

M.Van LIJSEBETTENS, J.

De BLOCK, M. VANDEWIELE, A. De CLERCQ, J. LEEMANS, M. Van MONTAGU & E. KREBBERS. Enkephalins Produced in Transgenic Plants using Modified 2S Seed Storage Proteins. Bio/technology 7: 929-932. 1989.

VASIL, I.K. Transgenic Cereals Becoming a Reality. Bio/technology 8: 797. 1990.

Von WETTSTEIN, D. Perspectives for the Genetic Engineering of Plants for Agriculture, Horticulture and Industry. Plant Molecular Biology 13: 313-317. 1989.

WARD, E.R., J.A. RYALS & B.J. MIFLIN. Chemical Regulation of Transgene Expression in Plants. Plant Molecular Biology 22: 361-366. 1993.

WEEKS, J. T., O.D. ANDERSON & A.E. BLECHL. Rapid Production of Multiple Independent Lines of Fertile Transgenic Wheat (Triticum aestivum). Plant Physiology 102: 1077-1084. 1993.

WEISING, K., J. SCHELL & G. KAHL. Foreign Genes in Plants: Transfer, Structure, Expression, and Applications. Annual Review of Genetics 22: 421-477. 1988.

WEYMANN, K., K. URBAN, D.M. ELLIS, R. NOVITZKY, E. DUNDER, S. JAYNE & G. PACE. Isolation of Transgenic Progeny of Maize by Embryo Rescue under Selective Conditions. In Vitro Cell. Dev. Biol. 29P: 33-37. 1993.

WILMINK, A. & J.J.M. DONS Selective Agents and Marker Genes for Use in Transformation of Monocotyledonous Plants. Plant Molecular Biology Reporter 11: 165-185. 1993.

WORRELL, A.C., J.M. BRUNEAU, K. SYMMERFELT, M. BOERSIG & T.A. VOELKER.

Expression of a Maize Sucrose Phosphate Synthase in Tomato Alters Leaf Carbohydrate Partitioning. The Plant Cell 3: 1121-1130. 1991.

WU, R., E. KEMMERER & D. MCLROY. Transformation and Regeneration of Important Crop Plants: Rice as the Model System for Monocots. In:J.P.GUSTAFSON (ed.) Gene Manipulation in Plant Improvement II. Plenum, New York. pp. 251-260. 1990.

Cuadro 1. Especies en las que se han obtenido plantas transgenicas.

Tomate Algodon Fresa Frambuesas Patata Apio Crisantemo Pepino Clavel Colza Can~a de azucar Lechuga Guisante Rabano Batata Lino Zanahoria Ipomoea Alfalfa Loto Coliflor Melon Soja Remolacha Tabaco Rosa Manzano

Maiz Papaya Arandano Vid Centeno Kiwi Petunia Alamo Esparrago Regaliz Arabidopsis Nogal Repollo Dedalera Berenjena Picea blanca Achicoria Canola Peral Arroz Brocoli Cafeto Mostaza Girasol Trigo comun Avena Kalanchve Petunia Mijo Pasto elefante Raygrass Sorgo T. monococcum Triticale Tritordeo Cebada

Cuadro 2. Biotecnologia de valor comercial en agricultura y alimentos.

Producto,Alimento / Beneficio / Tecnologia / Participantes

COLZA, MAIZ, SORGO / Produccion de hibridos sin contaminacion por autofecundacion y sin castracion masculina, incluso en plantas con androceo y gineceo proximos / Expresion de un gen que destruye las celulas productoras de polen; un segundo gen se utiliza para restaurar la fertilidad / Plant Genetic System N.V. y Universidad de California (en Los Angeles)

COLZA (aceite) / Composicion de laurato y esterato mas elevada /Manipulado geneticamente con proteina transportadora 12:0-acil thioesterasa a partir de formas silvestres / Calgene

COLZA (aceite) / Alto contenido en aceite hidrogenado para margarina / Ingenieria Genetica. / Calgene

COLZA / Resistencia al herbicida Sencor / Fusion celular / Institute for Biotechnology, Bayer

COLZA (aceite) / Aceite de freir a alta temperatura, bajo en grasa saturada (oleico alto, palmitico bajo) / Mejora clasica, cultivo de anteras, y muestreo por RFLP / DNA Plant Technol. DuPont, AgrigeneticsMycogen.

CUCURBITACEAS / Resistencia a virus, hongos y bacterias / Resistencia genetica / Asgrow Seed Co.

ESPARRAGOS / Semillas de esparrago que no requieren escardado. / Cultivo de tejidos de la parte masculina / Washington State University, otros

FRAMBUESAS / Incrementar el tiempo posible de transporte / Control del etileno por ingenieria genetica / Agritope

FRESAS / Resistencia a la congelacion; permite la produccion temprana / La deleccion de un gen de Pseudomonas syringae reduce la formacion de cristales en plantas rociadas con la bacteria / DNA Plant Technology, AGS, UC Berkeley

FRESAS / Incremento en los niveles de acido elagico, un agente anticancer que inhibe carbohidratos aromaticos policiclicos, nitrosaminas, aflatoxina y aminas aromaticas / Se prepara la insercion del gen clonado del acido elagico / USDA-ARS

GIRASOL, COLZA / Alteracion en la composicion de acidos grasos y aceite mas nutritivo con menor contenido en grasa saturada / Por aplicacion de tecnologia Allelix recientemente adquirida / Pioneer HiBred

GIRASOL (aceite) / Aceite con alto grado de mono-insaturaciones / Mejora clasica, Investigacion en prog. transferencia genetica. / SVO (Lubrizol), Mycogen, Calgene

LECHUGA (Iceberg enana) / Cogollos de lechuga de taman~o racion / Mutagenesis con EtilMetano-Sulfonato en variedades de floracion temprana seguido de retrocruzamiento con Iceberg / USDA-Salinas, CA (desarrollador), Salina Food & Safeway Store (tests), Empresas de semillas implicadas

LECHUGA, Lepidopteros

TOMATE

(posteriormente

MAIZ,

ARROZ,

TRIGO)

Los

son infectados y muertos selectivamente, previniendo dan~os en los cultivos. / Pulverizacion de productos insecticidas de origen viral / Crop Genetics para la produccion; DuPont para la distribucion y comercializacion

MAIZ / Resistencia a insectos (Coleopteros y Lepidopteros) / Insertar genes de Bacillus thuringensis en el maiz / Biotechnica Int.,DeKalb Genetics Corp., Monsanto Co. USDA, y Pioneer HiBred

MAIZ / Reducir el dan~o producido por el taladro del maiz / Incide, un bioinsecticida disen~ado geneticamente, usado para tratar las semillas antes de la siembra / Crop Genetics

MANZANAS (Golden Delicious, Greensleeves) / Resistencia a insectos / Insercion de un gen de resistencia a insectos de origen bacteriano / U.C. Davis & Plant Research Laboratory

MELON (Euromelon) / Tiempo de venta mas largo. Fruto de alta calidad, maduracion segun demanda / Insercion de un gen antisense para (pMEL1) que codifica el enzima ultimo de la sintesis del etileno / Francia, Reino Unido, Espan~a, Grecia; proyecto conjunto

PALMA (datil, aceite, palmito) / Cultivos mas facil de establecer y mas sanos. / Micropropagacion / ESCAgenetics (mitad de los 80)

PATATA / Verdaderas semillas de patata / Tecnologia para producir semillas a partir de la flor de la patata / Potato Center, Lima, Peru, Escagenetics Corp.

PATATA (mejicana) / Resistencia a virus. / Genes de la capsida introducidos en la patata / Monsanto, ISAAA & CINVESTAV

PATATA / Plantas libres de virus con un incremento notable de la produccion / Cultivo de tejidos. / NPI y Plant Genetics durante los 80; otros en la actualidad

PATATA / Patatas fritas con menos grasa / Introduccion de un gen de produccion de almidon proveniente de E. coli; las patatas geneticamente alteradas tienen del 30-60% mas almidon y menos humedad; absorben menos aceite al freirse / Monsanto, Michigan State U. University of Idaho

PATATA / Resistencia a nematodos parasitos Resistencia a enfermedades./ No descrito. Fusion de protoplastos de patata cultivada y tomate silvestre / Mycogen, Monsanto Kirin Brewery Co. Ltd.

PATATA / Resistencia de las semillas a los virus X e Y de la patata / Microtuberculos a partir de biorreactores / Calgene, Inc.; Kirin Brewery Co. Ltd., MOGEN

PATATA, TOMATE (y ALGODON) / Resistencia a plagas de Coleopteros y Lepidopteros; reduccion de tratamientos quimicos. / Expresion de genes derivados de B. t. para una endotoxina que interrumpe el transporte ionico de membrana en el digestivo del insecto / Monsanto, Ciba-Geigy

Plant Genetic Systems, N.V. Mas de 18 empresas trabajan con genes B.t.

PATATA /Sabor mas dulce. / nsercion de un gen antisense que bloquea la ADP-glucosa pirofosforilasa por lo que la sacarosa no se convierte en almidon. / Institute of Genetics (Berlin)

PLATANOS / Plantas provenientes de cultivos de tejidos libres de virus y nematodos / Cultivo de tejidos / Oglesby Plant Laboratories, Oscar Arias Labs

PLATANOS / Deteccion temprana del hongo Singatoka (rayado negro) como parte de un control integrado de plagas / Tecnologia disponible para los kits de deteccion / No descrito

SOJA / Bajo contenido en acido palmitico (3,5% contra el 10% normal) / Fueron cruzadas dos lineas de soja con genes distintivos / Iowa State Univ. Purdue Univ. USDA-ARS

SOJA/LEGUMBRES / Incrementar la productividad con una aplicacion limitada de fertilizantes / El uso de lineas mejoradas de Rhizobium en el suelo para incrementar la fijacion del nitrogeno. / Biotechnica Int. (hasta principios de los 90)

SOJA / Resistencia a Glifosato / Insercion del gen de la 5Uenolpiruvilsikimato-3U-fosfato sintetasa / Calgene, Monsanto, Agricetus

SOJA / Mayor contenido en metionina, la proteina es completa para la

alimentacion avicola y en el Tercer Mundo / Insercion de un gen que enriquece en Met. de la nuez del Brasil / Plant Cell Research (Ferruzzi & Univ. of Hawai);Pioneer HiBred

TOMATES,

PATATAS,

PEPINOS,

MELONES,

etc.

Resistencia

enfermedades virales; incremento de rendimientos con menos tratamientos quimicos / Expresion de genes que producen proteinas de cubierta viral / Monsanto, Washington Univ., Asgrow Seed Co., y otras empresas

TOMATES / Maduracion lenta de tomates que se mantienen verdes, firmes y sin sabor hasta que se les expone a etileno exogeno / Expresion del ARN antisense para la ACC sintetasa que bloquea la produccion de etileno / Plant Gene Expression Center, U.S.D.A.; muchas empresas implicadas

TOMATES / Alto contenido en solidos y alta viscosidad (pectina); menor tiempo de coccion para productos enlatados (pasta, salsa de tomate, etc.) / Expresion de nuevos genes, mejora tradicional, variacion somaclonal, y analisis por RFLP / DNA Plant Technology, Calgene, Campbell Soup, Monsanto, ESCAgenetics

TOMATES / Ablandamiento lento de los tomates los cuales pueden permanecer firmes mas tiempo durante el transporte o el almacenamiento / Expresion de ARN antisense para la poligalacturonasa que de otro modo podria degradar la pectina / Calgene, para poner en el mercado en 1993 bajo el nombre TFlavr-Savr

TOMATE / Resistencia a la putrefaccion tras almacenamiento. Periodo de maduracion mas largo Resistencia a las heladas. / Los tomates producen

el enzima quitinasa que los protege contra los hongos. Un enzima, no descrito Insercion de genes de bacterias del suelo Insercion del gen de un pez / DNA Plant Technologies, DNA Plant Tech., Monsanto, DNA Plant Tech.

TOMATE / Maduracion de los tomates Rcon interruptorS continua tras el almacenamiento sin etileno / Variacion somaclonal / DNA Plant Tech.

TOMATE / Control del grado de ablandamiento, color y sabor. / Reordenacion o duplicacion de los genes existentes / ICI (Hunt-Wesson)

TOMATE, LECHUGA / Sabor mas dulce. / Transferencia de un gen de monellina / UC, Berkeley

TRIGO / Alto contenido en amilopectina / Trabajando en la insercion de antisense / Ciba-Geigy via Sogetal

TRIGO / Resistencia al herbicida glutofinato / Insercion del gen de la fosfinotricin acetiltransferasa / U. Florida, Monsanto