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UNIVERSIDAD NACIONA EXPERIMENTAL FRANCISCO DE MIRANDA PROGRAMA DE CIENCIAS VETERINARIAS UNIDAD CURRICULAR: NUTRICIO ANIMAL PROFESORA; M.V.

TERANA ZABALA • PRACTICAS DE LABORATORIO

PRACTICAS DE LABORATORIO: Rumiantes 1. Generalidades del trabajo en el laboratorio y seguridad. 2. Obtención de núcleo proteínas e identificación de purinas. 3. Identificación de sustancias antinutritivas. 4. Cuantificación de Ácidos Grasos Volátiles totales. PRACTICAS DE LABORATORIO: Monogástricos 1. Generalidades del trabajo en el laboratorio y seguridad. 2. Actividad enzimática. 3. Identificación de sustancias antinutritivas. 4. Extracción de lípidos en tejidos biológicos. CONTENIDO DE LAS PRÁCTICAS DE LABORATORIO PRACTICA : Generalidades del trabajo en el laboratorio y seguridad. INTRODUCCIÓN La incorporación de los estudiantes al laboratorio tiene como objetivo fundamental la comprobación de procesos tratados en el desarrollo de las conferencias, así como, la adquisición de nuevos hábitos de conducta, habilidades y destrezas, que le permitirán enfrentar con una mayor preparación, situaciones que se le presentaran en su vida profesional. Por ello, el objetivo de esta practica antes de iniciar los trabajos prácticos propiamente dichos, es el de poseer un mínimo de conocimiento, equipos y cristalería de uso más común, así como las medidas de control y de protección e higiene que de deben observarse en el laboratorio. Al trabajar en el laboratorio se hace imprescindible tomar ciertas precauciones para evitar los accidentes que en su inmensa mayoría son causados por la no observancia de las reglamentaciones establecidas.

En general el experimentador debe ser extremadamente cuidadoso, estar atento al trabajo que realiza, dominar la técnica a desarrollar, el funcionamiento manipulación de los equipos y las propiedades de los reactivos que se utiliza y ante de cualquier duda no obrar por su cuenta sin previa consulta al instructor que lo atiende. Es conveniente señalar que: a) Los líquidos inflamables no se deben calentar directamente con la llama sino mediante baños de agua, aceite, arena, etc. Estos líquidos deben mantenerse lejos de los demás. b) Los recipientes en los que puedan haber productos con desprendimiento gaseoso no se deberán cerrar herméticamente, pues debido a la presión interior explotaría. c) Al trabajar con vacío se usan vasijas de paredes redondas y consistentes. d) Los tubos de ensayo no se deben calentar por el fondo sino por la parte superior del líquido, deben estar inclinados y no apuntar al operador o a los que lo rodean. e) Nunca se deben gustar los productos químicos pues pueden ser causas de envenenamiento. f) Nunca se deben pipetear ácidos o bases fuertes sin emplear pipetas con peras extracción. g) Para percibir olores no es necesario poner el rostro sobre el tubo; para que el olor llegue al olfato basta agitar un poco el aire con las manos. h) Al trabajar con sustancias venenosas, la limpieza de las manos, del sitio de trabajo y el material debe ser esmerada. i) Los gases dañinos se trabajaran en la campana de extracción de gases. j) No debe abrirse nunca el paso de gas del quemador sin colocar antes el fósforo encendido a la boca del mismo. La observación de estas reglas le proporciona al alumno los hábitos de seguridad y disciplina que le serán de inestimable valor no solo en el laboratorio sino en cualquier sitio. Por otra parte durante el desarrollo de los diferentes trabajos prácticos en este laboratorio podremos observar que en el mismo se usan una gran variedad de equipos, utensilios, cristalería y otros accesorios. Los materiales y utensilios de laboratorio constituyen un heterogéneo grupo de objetos cuyo estudio es difícil de sistematizar. No obstante, en el ánimo de hacer mas comprensible el estudio de los mismos, le ofrecemos la siguiente clasificación.

Para verter volumétricos

Pipetas Buretas

Para contener De vidrio Tubos de ensayos Beakers Erlemeyer Balones Agitadores Placas de petri Morteros Embudos

Matraces Probetas

De usos varios

Porcelana

Crisoles Espátulas Morteros

Miscelánea

Gradillas Soportes universales Trípodes Malla con amianto Papel de filtro Tapones de goma Quemadores Hisopos

Los equipos más usados son: fotocolorímetro, las centrifugas y los pHmetros. Los principios físicos de estos equipos han sido estudiados en la asignatura de Biofísica y deben ser repasados. Muy usadas en nuestras prácticas son el manejo de la pipeta, la centrifugación y las técnicas de volumetría. En el desarrollo de esta práctica efectuaremos algunos ejercicios relacionados con estas técnicas. Materiales Necesarios Varios ejemplares de los materiales y utensilios dados en la introducción. Pipetas de todas las graduaciones. Tubos de ensayos Agua destilada Acido tricloroacético al 10 % Suero sanguíneo Disolución de carbonato de sodio 0,1N Disolución de indicador de pH ( solución alcohólica de fenolftaleína). Disolución de HCl 0,1 N.

Desarrollo de la parte experimental. Ensayo # 1 . Empleo de Pipetas Al comenzar a trabajar se debe endulzar la pipeta con pequeñas porciones del líquido a pipetear, las cuales se desecharán. Las pipetas se llenan succionando con la boca y mediante una pera de goma cuando se trabaja con líquidos volátiles, venenosos o cáusticos hasta que el nivel del líquido está por encima del aforo, se seca la punta con un papel de filtro y luego se enrasa dejando que el mismo descienda lentamente para evitar errores de escurrimiento. La punta de la pipeta se aproxima a la pared del recipiente que ha de recibir su contenido para que el líquido retenido en la misma fluya. No se debe sacudir ni soplar la pipeta para tratar de expulsar todo todo el líquido contenido en la misma.Cuando se descarga en un recipiente que ya contiene líquido, la punta de la pipeta no debe entrar en contacto con el mismo.

El instructor debe indicar la forma adecuada de tomar la pipeta. Al trabajar con disoluciones de una misma sustancia y distinta concentración se puede usar la misma pipeta, en estos casos no es necesario lavar la pipeta con agua destilada al pasar de una solución a otra, además se debe comenzar pipeteando por la más diluída siguiendo en orden creciente de concentración. Utilizando la pipeta adecuada pipetear las cantidades siguientes de H2O destilada. a) 5,2 mL d) 2,75 mL b) 0,1mL e) 1,0mL c) 3,5mL f) 0,3mL.

Ensayo # 2. Centrifugación Es nuestro propósito dar algunos principios de operación de la centrífuga y sus posibilidades en la forma más breve posible. Nosotros estamos familiarizados con el fenómeno de la sedimentación: si es un líquido hay suspendidas partículas relativamente pesadas, al cabo de un tiempo se puede notar que estas partículas se acumulan en el fondo del recipiente. El peso de una partícula depende de dos factores: su masa y la aceleración de la gravedad. Si quisiéramos hacer más rápido el proceso de sedimentación, sólo necesitaríamos aumentar la aceleración de la gravedad, que es precisamente lo que se hace cuando giramos rápidamente nuestra disolución. Este incremento de la aceleración de la gravedad produce un aumento del peso real de las partículas, por tanto su más rápida sedimentación. La fórmula que mide el campo gravitacional creado por una centrífuga es: G= (rpm)2. R/g. 104 1rpm= 0,104720 rad/s 0,104720 rad/s= 6,283200 rad/min. Donde G es el número de veces que el campo gravitacional de la tierra aumenta rpm es la velocidad de la centrífuga R es el radio de rotación en cm. Una centrífuga corriente de laboratorio es capaz de desarrollar de 3 000 a 5 000 rpm y su único propósito es separar por sedimentación partículas realmente grandes. Ej.: células, paredes celulares, bacterias de una suspensión. Pero también es posible diseñar centrífugas que alcancen valores también es posible diseñar centrífugas que alcancen valores superiores a

5 000 rpm y crear campos gravitacionales de 100 000 G o más. Estas se llaman ultracentrífugas y con los campos gravitacionales alcanzados se pueden sedimentar partículas tan pequeñas como moléculas de proteínas, ácidos nucleicos, etc. Una precaución general en el uso de todo tipo de centrífuga es que los tubos deben estar muy bien balanceados, ya que como hemos dicho, las altas velocidades que se obtienen producen grandes aumentos del peso del material que estamos centrifugando, una diferencia de un gramo va a significar una diferencia de más de 1 kilo cuando lo hagamos girar a 3 000 revoluciones. Tenemos que tener en cuenta que la velocidad que empleamos debe estar en proporción al peso del material que queremos centrifugar, de este mismo factor va a depender el tiempo que necesitemos. A continuación realice las siguientes operaciones: 1. 2. 3. 4. Pipetear 4 mL de ácido tricloroacético al 10 % y verterlos en un tubo de centrífuga. Añadir agitando constantemente 2 ml de suero sanguíneo. Dejar en reposo durante 5 minutos. Centrifugar durante 5 minutos a 3 000 rpm.

Ensayo # 3. Aplicación de la volumetría Uno de los métodos más generales, teniendo en cuenta el grado de aplicación en los laboratorios, es la volumetría. El campo de aplicación de este método abarca las reacciones de neutralización, red-ox, precipitación y formación de complejos entre otros. De nuestros estudios en Química General sabemos que las reacciones químicas se verifican de forma tal, que reaccionan números de equivalentes iguales de las sustancias en cuestión.Esto conduce a la ley fundamentadle la volumetría que a los efectos prácticos la formulamos como sigue: V1 . N1 = V2 . N2 C( X/Z ) . V = C (X/Z) . V En la cual existen tres variantes conocidas en el desarrollo del trabajo y la cuarta se determina experimentalmente con la ayuda de cualquier artificio que regularmente es un indicador escogido según la naturaleza de la reacción. El instrumental utilizado consta de beakers, pipetas, frascos volumétricos y buretas fundamentalmente. Ejemplo: En la determinación de la concentración exacta de un HCl podemos utilizar una disolución patrón ( concentración exactamente conocida ) de carbonato de sodio, sal que produce una

hidrólisis básica , empleando un indicador ácido-base con zona de viraje ácida o básica en dependencia de la colocación de los reactivos en el Erlenmeyer y la bureta, de esta forma conocemos V1 N1 , V2 lo hallamos por el volumen que marca la bureta una vez establecido el cambio del indicador y N2 normal del HCl mediante despeje. A continuación realice las siguientes operaciones: 1. Pipetear (por duplicado) 25 mL de la disolución patrón 0,1000 N de carbonato de sodio , agregándole en dos erlenmeyers de 250 mL de capacidad 2. Agregue 2 gotas del indicador a cada erlenmeyer. 3. Proceda al llenado y enrase de la bureta con HCl. 4. Valore agregando lentamente el HCl sobre la disolución de carbonato de sodio, agitando constantemente hasta el cambio de coloración del indicador, (siga las instrucciones del instructor en este proceso. 5. Lea el volumen en cada determinación, En estos dos proceso se han realizado con el cuidado requerido, la diferencia no excede de 0,1 mL. Sustituya los datos en la fórmula dada y calcule la concentración del HCl. Conclusiones Los aspectos fundamentales que el alumno debe concluir son: A. El uso adecuado de la pipeta. B. La técnica de la centrifugación C. La metodología del trabajo en el laboratorio de Bioquímica FACTORES QUE AFECTAN LA ACTIVIDAD ENZIMATICA INTRODUCCION Según pudimos observar en el tema correspondiente al estudio de las enzimas y las vitaminas, son las enzimas importantes compuestos de estructura protéica con actividad catalítica que participan destacadamente en todo el metabolismo, donde tienen función de catalizadores. Es decir las enzimas actúan como catalizadores en las reacciones que ocurren en la materia viva, rigiendo las reacciones bioquímicas y determinando, en gran medida, la existencia del metabolismo. Vimos que las enzimas tienen estructura protéica y por tanto, las propiedades de las proteínas eran extensivas a estos compuestos. Presentan estructura primaria, secundaria y terciaria, son posibles de desnaturalizar y su acción se ve modificada por la temperatura, el pH y otros factores ya señalados. Es importante asistir a esta práctica con los conceptos antes mencionados bien claros. En primer lugar del mecanismo de acción de las enzimas y además del efecto de la temperatura,

el pH, la concentración y de los activadores e inhibidores, pues son necesarios para la comprensión de los aspectos relacionados con esta práctica; por ello debe revisarse en el texto todo lo antes señalado. Reactivos Necesarios: • • • • • Extracto enzimático (papas o rábano) Buffer 2, 6, 7 y 10 Agua destilada Peróxido de hidrógeno 3% Solución de hidroquinona 0,5 %

Si se encuba un extracto enzimático que contenga peroxidaza con hidroquinona y peróxido de hidrógeno en un tubo de ensayo, al cabo de cierto tiempo pude observarse la formación de un compuesto coloreado. La hidroquinona (que es el sustrato de la reacción) resulta oxidada a un compuesto de tipo quinónico de color rojizo producto de la reacción. La intensidad de la coloración es proporcional a la cantidad de producto formado, por lo cual es un índice de la velocidad de la reacción. Preparación del extracto enzimático: Se trituran en un mortero 5 gr. De papas, se trasladan a una probeta con ayuda de agua destilada de manera que no queden residuos en el mortero y se sigue agregando agua hasta completar 40 mL, se deja en reposo durante 10 min. Para la extracción de la enzima y luego se centrifuga o se filtra. El filtrado claro se usa como extracto enzimático.

Experimento # 1: Influencia del pH en la actividad enzimática. Disponga 4 tubos de ensayo numerados en la gradilla y añada cada una de las soluciones como se indica en el siguiente cuadro: Tubos ( mL ) Extracto enzimático Buffer 2, 6. 7 y 10 Agua destilada Agua oxigenada Sal de hidroquinona 1 1 1 1 1 1 2 1 1 1 1 1 3 1 1 1 1 1 4 1 1 1 1 1

Hecho esto se espera de 30 a 40 min. Y se comparan las coloraciones obtenidas con ello se puede determinar el pH óptimo.

Experimento # 2: Influencia de la concentración de la enzima en la velocidad de la reacción. Disponga 5 tubos de ensayo en una gradilla. Agregue 2 mL de agua destilada a cada tubo a partir del # 2 ( el 1 no lleva agua ). Al tubo 1 se le agregan 2 mL del extracto enzimático. Al 2 se le agrega 1 mL del extracto enzimático, se mezcla y de este se pasa 1 mL al tubo # 3. Del tubo # 3 se pasa 1 mL al tubo 4 , se mezcla y se pasa 1 mL al tubo # 5. Después de mezclado se extrae 1 mL de este último tubo y se desecha. Las concentraciones de enzimas obtenidas en cada tubo son las siguientes: Tubo CONCENTRACION 1 C 2 1/3 3 1/9 4 1/27 5 1/81

Luego se añade a cada tubo 1 mL de agua oxigenada y 1 mL de solución de hidroquinona. Observe la coloración obtenida en cada tubo. Experimento # 3: Influencia de la temperatura en la actividad enzimática. Se dispone de dos tubos de ensayo en una gradilla y a cada uno se le añade 1 mL de extracto enzimático. El tubo # 1 se mantiene a la temperatura ambiente. El tubo # 2 se calienta 5 min. En baño de maría a ebullición: a continuación se enfría bajo el chorro de agua de la pila y se lleva nuevamente a la gradilla. A continuación se le agrega a cada uno las soluciones según indica el siguiente esquema:

Sol. Agua oxigenada Sol de hidroquinona

Tubo # 1 ( al ambiente ) 1 mL 1

Tubo # 2 (Calentado ) 1mL 1

Transcurridos 30 min se observan las coloraciones en cada tubo. Explique los resultados.