Charvolin Eléonore Epinette Sébastien Erny Cécile Farcy Solenne Fleury Carinne Guichoux Erwan

DESS Gestion de la Biodiversité Méthodologies d’Etude et Valorisation des Ressources Génétiques 2002/2003

Les nouveaux outils d’investigation du génome : base d’une meilleure connaissance du Paludisme ?

Dans le cadre de ce mémoire, nous tenons à remercier M. A. SARR pour la bibliographie et les contacts fournis. Nous adressons également tous nos remerciements à Mme G. MILON qui nous a consacré beaucoup de temps et qui nous a grandement aidé par ses explications, l’apport de publications complémentaires et par l’organisation d’une rencontre avec d’autres chercheurs de l’Institut Pasteur. Nous exprimons d’ailleurs toute notre gratitude à Messieurs J-Y. COPPEE, P. DAVID, E. BISCHOFF et E. YERAMIAN qui ont pris le temps de nous présenter une partie de leur travaux, de nous expliquer toute la partie méthodologique du séquençage et de nous faire visiter les locaux de la nouvelle plate-forme de génomique de l’Institut Pasteur. Nous sommes aussi reconnaissants à M. M. TIBAYRENC pour avoir accepté de s’entretenir avec nous lors de son passage à l’Institut Pasteur. Nous sommes grés à l’équipe pédagogique pour son soutien, et plus particulièrement à M. T. ROBERT et Mme M. MASSELOT qui nous ont mis des articles supplémentaires à disposition. Enfin, merci aux six autres étudiants de la promotion 2002/03 du DESS Gestion de la Biodiversité pour l’organisation et le partage du matériel informatique qui ont permis de réaliser ce mémoire dans de bonnes conditions.

SOMMAIRE
INTRODUCTION I. Présentation de la maladie II. Historique III. Epidémiologie 1. Mesure épidémiologique - l’index splénique 2. Transmissibilité de la malaria et changements climatiques 3. MOZ (Zones Potentielles d'Occurrence de la Malaria) IV. Les symptômes V. Dépistage 1. La prophylaxie 2. Les luttes anti-vectorielles 3. Les médicaments A. Historique B. Les traitements actuels  Chloroquine  Doxycycline  Proguanil  Malarone  Méfloquine  Artémisines  Halofantrine  Atébrine - Maloprim – Fansidar C. Les vaccins PRESENTATION BREVE DES TROIS PARTENAIRES DE CE COMPLEXE PARASITAIRE I. Présentation des espèces 1. Biologie et répartition des espèces en cause 2. Biologie des espèces A. Plasmodium B. Anophèle  Comportement  Cycle de développement II. Relatons au sein de la triade Plasmodium - Anophèle - Homme 1. Immunité chez l’Homme 2. Génétique des populations A.Plasmodium B.Anophèle

Le protéome II. La résistance à la chloroquine A. Le séquençage d’Anopheles gambiae et de Plasmodium falciparum 1. L’outil technologique : une révolution pour les programmes génomes B. Les nouveaux outils moléculaires et le séquençage  Construction d’une banque de clone  Les cartes physiques et génétiques  Récapitulation des outils moléculaires dans l’approche « séquençage aléatoire global » 5. La résistance d’Anopheles gambiae aux insecticides SEQUENCAGE DU PLASMODIUM ET D’ANOPHELE I. Antigènes de surface du sporozoïte 3. Structure du gène var D. Les acteurs du réseau international D. Variation allélique des déterminants antigéniques II. L’après séquençage : identification des gènes 7. 1ère résultats obtenus avec cette première méthode F. Généralités sur le séquençage de l’ADN 1. Séquençage d’Anopheles gambiae A. Plasmodium 1. Le gène Pf11-1 : son rôle dans la rupture des GR et dans l’émergence des gamètes 6. Liaison avec ICAM-1 4.Construction des banques d’ADN . Lancement du programme B. Intérêt du programme Génome Anopheles C. Quelques exemples d’organismes séquencés 6. Les gènes impliqués 5. La réponse immunitaire de A. gambiae au contact de P. Variants PfEMP1 B. falciparum 2. Histoire du séquençage à grande échelle A. Séquençage à grande échelle : 1ère approche 4.Séquençage et résultats obtenus .Choix de la souche . Les différentes stratégies possibles C.EXPLORATION DU POLYMORPHISME GENETIQUE DES PARTENAIRES DE CETTE TRIADE AVANT LE PROJET DE SEQUENCAGE I. Anopheles 1. Le séquençage par la technique « Shotgun » . Molécules PfEMP1 C. Généralités 2. Principe de base du séquençage 3. Début du séquençage E. Définition 2. La CQR B. Invasion sous forme mérozoïte et les protéines associées A.

Les différentes expériences de moustiques transgéniques 3. Les conséquences possibles d’introduction de moustiques transgéniques POLEMIQUES LIEES AU SEQUENCAGE LIMITES DE LA SCIENCE POUR LUTTER CONTRE LE PALUDISME PERSPECTIVES DANS LA LUTTE CONTRE LE PALUDISME . Intérêt du séquençage de Plasmodium falciparum D. Et après… III. Les méthodes utilisées A. Et ensuite… 2. Utilisation de la transgénèse 2. Les limites des moustiques transgéniques 6. Interrogation et intégration des bases de données 3. Utilisation de virus et de bactéries B. Mise à disposition des données 1. Les résultats G. Les puces à l’aide des études du Transcriptome et du Protéome 3. Exemple de la banque de données de Plasmodium falciparum : PlasmoDB APPLICATIONS DIRECTES DU SEQUENCAGE I. Les banques nucléiques 4. Les problèmes rencontrés. Méthodologie 2. Les puces à ADN 1. Les moustiques transgéniques 1. Séquençage de Plasmodium falciparum A. Définition de la banque de données 2. Utilisation de moustiques stériles C. Séquençage et assemblage  Annotation  Résultats et perspectives  Principales difficultés rencontrées G. Historique du programme Génome Malaria B. Etudes sur les éléments transposables 5. Actions sur le système immunitaire d’Anophèles gambiae 4. Les acteurs et les financements C. Puces à ADN et paludisme : un exemple d’étude II. finition et vérification de la séquence F. Séquençage et assemblage E.

INTRODUCTION .

Présentation de la maladie La malaria est à l’heure actuelle la maladie la plus répandue dans le monde. dont seulement 60 seraient . Cette espèce est surtout présente en Afrique de l’Ouest. révèlent la perception que l’homme a eue de cette affection au cours de son histoire : • • • Malaria venant de « mal aria » : air vicié Paludisme. 380 espèces distinctes ont été recensées. « Miasme morbide ». il s’agit de moustiques du genre Anopheles. notamment au XIXe siècle Cette maladie parasitaire implique trois vecteurs distincts. incluant certaines zones tempérées. il est important de savoir que son cycle s’effectue en plusieurs étapes. néanmoins afin de comprendre les niveaux d’intervention des médicaments. réparties entre le moustique (reproduction sexuée) et l’homme (reproduction asexuée). Sa répartition est mondiale mais de façon inégale et sporadique.I.int). Tout d’abord un parasite unicellulaire du genre Plasmodium. il est surtout fréquent en Afrique. Présent sur l’ensemble des continents. insecticides. • Plasmodium malariae Cette espèce n’est pas mortelle dans la majorité des cas mais peut provoquer des rechutes jusqu’à 20 ans après la primo-infection. Le cycle du Plasmodium sera détaillé ultérieurement. du nom du chercheur l’ayant identifié. Actuellement quatre types de parasites différents ont été identifiés : • • Plasmodium vivax Plasmodium falciparum Présent partout dans le monde. Quant au vecteur du Plasmodium. tirant son origine de « palus » : marais. responsable de la majorité des cas mortels. http://www. D’autres noms plus fréquemment utilisés. • Plasmodium ovale Il n’est pas fortement mortel et provoque des rechutes 4 ou 5 ans après la primoinfection. C’est le plus pathogène de tous les parasites.who. C’est une affection parasitaire due à un protozoaire. un vecteur de transmission l’Anophèle et un hôte unique l’homme(Encyclopedia Universalis. « fièvre des marais ». encore appelé « Hématozoaire de Laveran ». Actuellement.

la seconde porte un seau d’eau glacée symbolisant les frissons et la dernière un diadème de fer porté au rouge. C’est également lors de ces repas de sang que l’homme est contaminé par un Anophèle porteur du parasite. l’homme n’est pas toujours la cible de ses repas de sang. c’est la femelle Anophèle qui pique lorsqu’elle a besoin d’un repas de sang avant de pondre ses œufs.int). même les plus anciennes. Il est important de noter que toutes les espèces d’Anophèles ne présentent pas des mœurs et comportements identiques. ce qui signifie que les stratégies de prévention. symbolisant enfin les fièvres de la maladie. L’espèce la plus connue et la mieux étudiée est Anopheles gambiae. ainsi que les traitements mis en place.who.susceptibles de transmettre le parasite. Dans cette « littérature médicale chinoise » datant du IIIème siècle avant Jésus-Christ. semblent dater de l’antiquité chinoise. par absorption des parasites présents dans le sang d’hommes impaludés. Néanmoins. Dans l’Egypte ancienne. plus connue sous le nom de « canon de la médecine chinoise ». ne seront pas les mêmes pour tous les vecteurs (http://www. C’est la plus répandue en Afrique (http://www. l’auteur symbolise la maladie sous la forme d’un dragon à trois têtes représentant chacune l’un des accès lacustres : la première tient un marteau symbolisant les maux de tête. En effet. les syndromes de la malaria étaient déjà présents. Il évoque alors le rôle du moustique et . http://www. 1999 .org).asnom. L’origine de la maladie pourrait alors correspondre à celle de l’origine de l’homme en Afrique. d'après le Ching Nei.int). Poser et al. associant des cas de splénomégalie à d’importes fièvres. il est difficile de l’affirmer. Historique D’après les récits de nombreuses civilisations et les écrits rapportés de différentes périodes. la malaria apparaît également : elle est notamment décrite dans les papyrus d’Ebers datant de 1550 avant Jésus-Christ. 1999 . si de nombreuses hypothèses évoquent la présence de cette maladie déjà chez l’homme préhistorique. il semblerait que la malaria ait été présente dans la plupart des grandes civilisations humaines.who.. Comme chez la plupart des moustiques. suivant ensuite par co-évolution ses migrations vers l’Europe et l’Asie (Bischoff. De ce fait. Les premières traces écrites évoquant les symptômes de la malaria. écrits légendaires de l’Empereur Huang Ti (l'Empereur Jaune). II. C’est à ce moment que l’infection du moustique a lieu.

Cette propagation du parasite semble liée à deux évènements majeurs : le réchauffement climatique de la planète entre les Vème et XIIème siècles. il l’associe déjà aux moustiques et aux eaux stagnantes. http://www. médecin jésuite. mentionnent l’association de fièvre. 1999 . Vitelleschi. de contractures et de cas de splénomégalie. La découverte de l’écorce de cinchona par Don Franscisco Lopez de Canizare en 1630 constitue un véritable bouleversement face à l’impuissance des hommes contre la maladie. dans le bassin méditerranéen. Dans ces écrits trouvant leurs origines dans les Vedas. Durant cette époque. les recherches sont ralenties en Europe à cause de l’influence du clergé. En effet. de nombreux écrits retracent des vagues de malaria ayant ravagé les populations locales. Aucune trace n’est laissée par les recherches de la médecine arabe.snof. c’est dans l'Ayurveda (« Ayus » vie. Parallèlement.. notamment le Susruta Samhita ( l'un des plus anciens traités de science médicale connus ). Du Moyen Age à la Renaissance. le Bhela Samhita et le Charaka Samhita (ouvrage de médecine). Traité de médecine datant de 1600 avant Jésus-Christ. mais aussi de certaines légendes comme celle d’Empédocle Agripante. attribuées par la colère de Shiva (Bischoff. plusieurs textes font références aux symptômes de la maladie. ces écrits sont confirmés par des hiéroglyphes découverts dans le temple de Dendara où d’importantes fièvres auraient touchées les populations à la suite des crues du Nil (Bischoff. « Veda » connaissance . Poser et al. utilisée par de nombreuses tribus amérindiennes. Il apparaît clairement que si l’homme ne connaît pas encore la maladie à cette époque. mais aussi suite au défrichement suscité par le développement agricole en Europe. Dès 1640. en Grèce. ce breuvage semble présenter des vertus curatives face aux fièvres intermittentes touchant de nombreuses populations coloniales. les papyrus d’Edwin Smith. qui délivra Sélinas de la maladie en asséchant les marais en 550 av Jésus-Christ.des eaux stagnantes dans la contamination de la maladie. La malaria est alors décrite à travers des accès de fièvres tierces et quartes. le terme de « mauvais air » aborde déjà le rôle du vent dans la dissémination de l’infection. Enfin.org). 1999 ). fait alors importer l’écorce du Pérou en Espagne. 1999 . très peu d’écrits au sujet de la maladie sont apparus. C’est le cas des écrits de Cicéron ou de Lucrèce. en sachant que la malaria progresse alors dans le monde. Sur le continent indien. la plus avancée dans le monde durant cette période. Enfin. envahissant le nord de l’Europe et la Russie. Cette substance alors appelée « poudre de princesse » ou « poudre des Jésuites » va être couramment . De même. la science de la vie) que la malaria est abordée.

découvre l’agent du paludisme.asnom. le nom de Plasmodium est alors évoqué pour la première fois. les travaux de Laveran ne sont que le début de l’identification des différents acteurs de la maladie. Il en conclut alors que les corps protoplasmiques observés sont bien des êtres vivants. il constate alors que ces pigments constituent des masses protoplasmiques. Golgi. Roux et Chamberlain dès son retour en France. En observant les granules noirs sur des tissus de patients morts du paludisme. Malgré tout. On montrera plus tard que ces deux espèces sont respectivement Plasmodium vivax et Plasmodium malariae.org). Tout d’abord contesté par la communauté scientifique.utilisée dès 1712 comme moyen curatif puis comme premier moyen de dépistage de la malaria (Bischoff.org). médecin militaire français basé à Constantine en Algérie. http://www. http://www. 1999). il assiste à un processus d’exflagellation de gamétocytes mâles. Confirmés par les travaux de Marchiafava et Celli. provoquées par les moustiques provenant des marais. Leurs travaux permettent également d’identifier un troisième .1999 . qui constate également des anomalies cérébrales sur les patients infectés. Ces travaux sont confirmés par ceux de Etienne Bailly en 1825. Il parle du « poison des marais ». Repris par de nombreux chercheurs. 1999 . Ces travaux sont alors reconnus et acceptés. inoculé sous forme de « mauvaise humeur dans le sang » par les moustiques. il présente ces observations à Pasteur. en 1886 révèle que les fièvres tierces et quartes sont provoquées par des espèces distinctes. Poursuivant les travaux débutés sur les corps protoplasmiques présents dans les globules rouges de patients infectés. Il décrit alors des pigmentations noires au niveau de la rate et du cerveau de certains patients morts de ces fièvres. Néanmoins. Les premières connaissances scientifiques concernant les causes de la maladie n’apparaissent qu’à partir de 1717 à travers les travaux de Lancini. localisées dans les globules rouges (Bischoff.asnom. ce n’est qu’en 1880 qu’Alphonse Laveran. Le parasite sera observé en 1847 pour la première fois par Heinrich Meckel Von Hemsbach. il faut attendre 1831 pour que le lien entre ces pigmentations et les fièvres palustres soit vraiment établi. lui permettant de recevoir le prix Nobel en 1907 (Bischoff.

malgré leurs contacts avec des patients infectés. nommé Plasmodium falciparum en 1894 par Welch. http://www. Les différents acteurs de la maladie identifiés. que le parasite ne peut être transmis que par une seule espèce : l’Anophèle. En effet. La dernière espèce. Les étapes suivantes des recherches ont concerné l’étude du vecteur de la maladie. Plasmodium ovale.parasite. 1999 . la bataille pour l’éradication de la malaria est alors engagée. associant études . révélant ainsi leur contamination par le parasite à partir de sang humain infecté. ils montrent que la destruction des lieux de ponte réduit nettement la morbidité palustre. Une fois ce problème résolu. il montrera que la transformation des oocystes en sporozoïtes (cf. cycle dans la partie II) se fait au niveau des glandes salivaires du moustique. On assiste à de vastes campagnes de prévention. il montre que des oiseaux sains sont impaludés par des moustiques infectés. Enfin. Grassi fait des expériences similaires afin d’identifier le vecteur responsable de la maladie. il ne fallut alors que deux mois pour identifier parfaitement le cycle entier des deux parasites Plasmodium vivax et Plasmodium falciparum. Il reçut le prix Nobel en 1902 pour ses recherches. dont le but est de montrer que le moustique joue un rôle important dans la transmission du parasite. Parallèlement. sera décrite en 1922 par Stephen. Il constate alors la présence de cellules pigmentées dans l’estomac du moustique. Parallèlement. Ces premières recherches effectuées sur des moustiques de type Culex restent infructueuses. médecin anglais de l’armée des Indes. menés en 1897. Parallèlement. Pour cela. Clarac et Bouet montrent à travers leurs recherches sur le paludisme à Madagascar que la fréquence et la gravité de la maladie sont proportionnelles à la dispersion et à la pullulation des Anophèles dans les zones de contamination. Enfin. il fait se nourrir des moustiques sur des patients impaludés puis les dissèquent à différents jours après l’incubation. concluant alors que les moustiques jouent bien le rôle de vecteur entre le parasite et l’homme dans la transmission de la maladie. C’est le cas des travaux de Ross. sachant que ce vecteur n’effectue ses repas de sang que pour assurer sa procréation (Bischoff. La nomenclature concernant les différents stades de développement du parasite sera publiée en 1900 par Schaundinn. Il faudra attendre 1898 pour découvrir. aucun développement parasitaire n’est observé chez ce moustique.org). par hasard.asnom.

Fig. Fig. http://www. essentiellement dans les zones tropicales d’Asie.int). coordonnées par le « service de santé coloniale ».who. lors de sa fondation en 1948. 2). campagnes d’assèchement et de traitements préventifs (cf. 2002 . fig. notamment dans les territoires coloniaux. 1 : Campagne de traitement du paludisme dans une colonie française III. fig.. puis par l’OMS (Organisation Mondiale pour la Santé). d’Amérique du Sud et surtout d’Afrique où 90% des cas sont recensés (Greenwood et al.épidémiologiques. 2 : Evolution du paludisme au cours des 600 dernières années . Epidémiologie La malaria est largement répandue dans le monde (cf.1).

Les continents sont inégalement affectés par le paludisme. Plasmodium malariae étant présent dans presque toutes les régions où le Plasmodium ovale est rare hors du continent africain même si quelques cas parasite est endémique. mais on constate néanmoins des cas d’infection.5 milliards. on parle de paludisme d’importation ou de paludisme d’aéroport. En effet. Plasmodium vivax dans le sous-continent indien et en Amérique Centrale. On estime également que 300 à 500 millions de personnes sont contaminées annuellement. Le paludisme provoque entre 1 et 3 millions de morts chaque année dont la moitié sont des enfants. en particulier au sud du Sahara. en Nouvelle-Guinée et à Haïti. En effet. 1 à 2 millions en Amérique du Sud et moins de 500 000 cas en Europe. Il est difficile d’estimer avec précision la proportion des populations touchées par l’affection.oms.).Le paludisme sévit dans la plupart des régions tropicales du monde.oms. avec environ 94 millions de cas cliniques. les personnes souvent en contact de l’Anophèle développent des résistances naturelles au parasite. ont été recensés dans d’autres régions. En Europe ou en Amérique du nord. On estime cependant que le nombre de personnes exposées à la malaria est proche de 2. avec une prédominance de : • • • • Plasmodium falciparum en Afrique. devenant alors porteurs asymptotiques de l’infection.who. Actuellement on estime qu’une centaine de pays sont concernés par la malaria. dont 270 millions seraient déjà infectées. La malaria d’aéroport est particulièrement . Les autres populations. dont 95% furent contractés dans la zone sub-saharienne en Afrique.int) On constate enfin une répartition inégale entre des zones de fort endémisme et des zones d’endémisme plus faible. http://www. ne la possèdent pas (http://www.int. contre 5 à 10 millions en Asie du Sud-Est. La malaria est donc bien la première cause de mortalité infectieuse dans le monde (http://www. Il est à souligner que les risques sont nettement moins élevés de contracter le paludisme dans les grandes villes ou les cités qu'en zone rurale. sachant que celles-ci sont souvent pauvres et isolées. Le passage de personnes impaludées de l’une de ces zones de fort endémisme vers une zone épargnée par la maladie provoque alors d’importantes épidémies. mais aussi parce que le paludisme n’est pas toujours identifié.org. En 1999 en France environ 7000 cas cliniques ont été recensés. ces zones sont vierges de toute épidémie. moins exposées. L'Afrique est la plus touchée.

l’index splénique (http://www. deux approches peuvent être comparées. la rate augmente de taille de façon importante et devient palpable sous le rebord costal du coté gauche. A chaque accès palustre. facile à utiliser et permettant d’estimer de la façon la plus fiable possible. C’est le cas de l’index splénique. http://www. 1995 . les risques de mortalité sont plus importants (http://www. et même s’il est moins fiable que des études microscopiques. 3 : Mesure de l’index splénique année. C’est à la puberté que l’Homme dispose d’une immunité suffisante pour résister à l’infection même si les accès palustres sont observables tout au long de sa vie.int). Cette méthode est rapide et non coûteuse.dangereuse car en général elle n’est pas suspectée. le nombre de personnes contaminées. notamment chez les enfants de 5 à 15 ans. ce qui n’est pas le cas en temps normal.. le diagnostic et le traitement sont souvent longs à établir.obs) .medias. Mesure épidémiologique . 1. Cet indicateur est souvent utilisé dans les zones les moins accessibles. Leur index splénique augmente rapidement pour atteindre un maximum entre l’âge de 2 et 5 ans. il permet de mesurer l’épidémiologie des zones les plus reculées et ainsi d’adapter les interventions de prévention. 2.org) Pour étudier les limites et l’intensité d’une épidémie dans une zone donnée. les variations de la taille de la rate.who. De ce fait. La seconde est un indicateur. Transmissibilité de la malaria et changements climatiques (Martin et al. fig 3). il constate que le paludisme se déclare lorsque les défenses immunitaires de l’organisme diminuent. Farinaud montre grâce à cet indice que 96% des enfants sont parasités avant la fin de leur première Fig.asnom. le patient ne s’étant pas rendu dans les régions où la maladie est endémique. Enfin. Ce diagnostic est instantané. Elle consiste à estimer la situation paludique en mesurant par palpations (cf. En effet. puis se stabilise. La première est une étude quantitative estimant précisément le nombre de personnes atteintes.

Elle montre la distribution potentielle moyenne du paludisme sur une année. Afrique du sud et de l’ouest). elles ne doivent pas détruire des lieux existants en étant trop fortes ou en transformant des flaques en ruisseaux. La température modifie aussi les capacités de reproduction des Anophèles. et 15°-16°C pour les autres espèces. elles allongent la vie des moustiques et accroissent la fréquence des repas sanguins pris par les femelles.1 et 0. ainsi qu'entre les pontes successives (cf. on constate qu’elle affecte la survie du parasite au cours de son cycle sexué effectué dans l'Anophèle. sites de ponte. l’humidité et les précipitations. Ces températures réduisent également le cycle de vie aquatique des moustiques de 20 à 7 jours. là où le climat est inadapté (blanc=0). Afrique de l’est).La zone de transmissibilité de la malaria est contrôlée par des facteurs climatiques tels que la température. En effet. Optimales entre 22° à 30°C. Dans les zones où le climat est propice au paludisme (rouge=1). et diminuent le délai entre l'émergence et la ponte.9. les adultes Anopheles ont un taux . Enfin. par conséquent. fig. jusqu'à un repas par 48 heures. la transmission est soit continue mais faible (e. voir impossible si celle-ci descend en dessous de 19°C pour Plasmodium falciparum. 4 : Influence du climat sur le répartition du palusime en Afrique Quant aux précipitations. Il en est de même pour les régions subissant régulièrement des périodes de sécheresses. En effet. Dans le cas de la température.g. 4) Fig. (Elle ne reflète pas. Dans les aires comprises entre 0. pas la distribution actuelle de la maladie. le paludisme est épidémique ou absent. si elles permettent la colonisation de nouveaux lieux de reproduction. ces facteurs régulent la biologie du développement des moustiques et des parasites. le cycle est d'autant plus long que la température est basse. De plus. la maladie est endémique. Au contraire. soit cyclique suivant les saisons (e. mettant en danger les larves et les œufs. les moyens de lutte mis en œuvre ne sont pas pris en compte).g. Se développant le plus rapidement entre 27° et 31°C (entre 8 et 20 jours selon les espèces). elles constituent un facteur important dans la sélection des Cette carte est une représentation théorique basée sur les données climatiques à long-terme.

Dans ces zones. 1995 . la situation de la malaria ne s'est pas améliorée depuis les années 60. c’est-à-dire dans les régions où les conditions climatiques provoquent un développement périodique ou occasionnel des parasites et des vecteurs. MOZ (Zones Potentielles d'Occurrence de la Malaria) (Martin et al. et les femmes enceintes. la plupart des décès dus à la malaria touchent les bébés et enfants de moins de cinq ans. les migrations.obs) S'appuyant sur des concepts physiques et biologiques.de survie plus élevé et une activité supérieure si l’humidité de l'air ambiant est à environ 50 ou 60 % d'humidité relative. qui n'ont pas encore développé d'immunité. les modifications biogéographiques telles que la déforestation. De nombreux facteurs sont pris en compte comme : . Les populations indigènes développent une forme d'immunité qui les protège d'une mortalité élevée. les conditions climatiques sont favorables au vecteur et au parasite toute l'année. Ceci peut s'expliquer par l'adaptation des vecteurs aux nouvelles conditions environnementales. Malgré les campagnes internationales d'éradication et de contrôle. des événements climatiques exceptionnels peuvent être suivis d'épidémies. 3. ce modèle a été mis en place afin d'étudier la sensibilité de la transmission de la malaria face aux perturbations climatiques.. Un changement climatique global est donc susceptible de modifier encore sa géographie. aux résistances croissantes aux pesticides ainsi que la résistance des parasites aux médicaments anti-paludéens. Les campagnes d'éradication.medias. Lorsque la malaria est saisonnière. Des facteurs tels que l'instabilité politique. ce qui y rend virtuellement impossible l'éradication de la maladie. Le taux d'infection reste élevé même avec une faible population de moustiques. Cependant la prévision de l'extension géographique et de l'intensité de la malaria est difficile à définir car sa relation avec le climat est assez complexe. alors les populations indigènes n'ont pas le temps d'acquérir une immunité. Les changements climatiques passés ont fortement affecté la distribution de la malaria. Dans les zones où la malaria est permanente. Il n'y a pas de fluctuations significatives d'une année à l'autre même si des variations saisonnières sont possibles. et le développement socio-économique peuvent également accentuer les problèmes rencontrer dans l’endiguement de la maladie. en connaissant les conditions optimales de survie et de développement à la fois du parasite et du vecteur. Les groupes à risque sont moins bien définis et les taux de mortalité en cas d'épidémie peuvent être très élevés. http://www.

IV. http://www.• • • L’indice d’humidité (une valeur critique moyenne de 0. les effets de la dormance des parasites ou de l'estivation / l'hibernation des la prise en considération de la distribution biogéographique des parasites et la ré-évaluation de l'évaporation potentielle qui semble surestimée dans les moustiques. saisonnière sur des zones auparavant exemptes de malaria favoriserait les épidémies. Au plan géographique. ainsi que la carte de l’OMS en 1990. Les symptômes (Encyclopedia Universalis.org) Les premiers symptômes apparaissent de quelques semaines à plusieurs mois après la contamination. causant une mortalité accrue et une morbidité élevée dans des populations non préparées ou non immunisées. Afin d’améliorer ce modèle.7 a été retenue. la malaria pourrait gagner les pays tempérés de Les zones saisonnières de malaria s'étendent de 16 à 55 %. Russie). Cette latence correspond à la durée d’incubation nécessaire à la formation des schizontes intra-globulaires (cf. Enfin. cycle du Plasmodium). . des vecteurs paludéens. Cette expansion l'hémisphère Nord. température et de précipitation). calculs actuels. Amérique du Nord.asnom. il faudrait coupler MOZ à des modèles épidémiologiques pour inclure la dimension humaine de la malaria. la longévité des moustiques. Asie. correspond aux habitats les plus sec des moustiques.(Europe. elle Le climat de contrôle (on utilise les moyennes mensuelles actuelles de L’utilisation des cartes de répartition du moustique avant son éradication. les versions futures de MOZ devront prendre en compte : • • • • • le temps de maturité des parasites. Les simulations effectuées avec cinq scénarios de changements climatiques montrent une différence significative de celle obtenue avec le climat actuel: • • • L’aire de transmission potentielle de la malaria s'accroît de 7 à 28 %. comme la savane). • Les zones permanentes pourraient se réduire.

des urines colorées de noir par la présence d’hémoglobine. consistant en un état infectieux fébrile de type grippal ou typhoïdique. caractérisés par ce cycle typique « Frisson. Ces accès de paludisme durent en général quelques heures et se déroulent en 3 phases. de vomissements et de toux. par opposition à la « tierce bénigne » de Plasmodium . Véritable encéphalopathie comateuse. suite à l’éclatement des hématies. La rate augmente alors de volume et une anémie s’installe. Ces fièvres importantes peuvent à elles seules provoquer des convulsions et un coma des patients. Dans ce cas. Au bout de plusieurs jours. Non traités. C’est Plasmodium falciparum qui est responsable des formes les plus graves. de douleurs musculaires. les accès se renouvellent sous forme « tierces » ou « quartes » selon les espèces parasitaires. Il est souvent difficile de diagnostiquer la maladie à ce stade à partir des symptômes observés. • « accès pernicieux palustres ». ils sont également accompagnés de maux de têtes. le malade semble guéri. Ces accès palustres. les patients ont le teint gris. Après plusieurs accès. Elle est provoquée par les globules rouges infectés qui se fixent sur les parois des vaisseaux sanguins. • « fièvre bilieuse hémoglobinurique ». sauf si un cas de malaria est suspecté (zone endémique. voyage). la plus grave. Parfois. correspondant en une destruction massive des globules rouges. sueurs » est souvent dû à la multiplication du parasite et à l’éclatement des globules rouges dans le sang. on constate que la fièvre tombe mais la guérison n’est qu’apparente et des rechutes menacent à tout instant. suivis de pics de fièvres atteignant 41°C et accompagnés de sueurs profuses laissant le malade épuisé. une fièvre importante. Cette hémolyse aiguë peut aboutir à une obstruction rénale. « tierce maligne ». est appelée également « neuropaludisme ». pouvant les conduire à la mort. C’est alors qu’apparaissent les grands accès fébriles intermittents caractéristiques de la maladie. même en l’absence de tout traitement spécifique. Tout d’abord de grands frissons avec froid intense et tremblements généralisés.Les premières manifestations cliniques du paludisme sont souvent très banales. provoquant : • vivax. cette forme. bloquant l’irrigation du cerveau dans les cas mortels. Les reins se bloquent alors. fièvre. pouvant provoquer la mort par urémie.

La prophylaxie . Dépistage Le meilleur moyen de combattre la maladie est de réaliser un dépistage rapide et précis du parasite afin d’adapter un traitement efficace. La morphologie des schizontes. Ces recherches avant tout doivent impérativement qui ferait s’effectuer disparaître traitement transitoirement les hématozoaires. ci-contre). on constate assez fréquemment des cas plus sévères comme le décès des mères. Néanmoins. retardant le diagnostique et donc le traitement. Dans les régions de plus faible endémisme où l’immunisation des populations est moins importante. Grâce à ce kit. permet alors de faire le diagnostique de paludisme et d’en déterminer la variété (cf. Marchoux montre que ces accès rénaux sont accentués par l’ingestion récurrente de quinine.En 1900. Il montre également que l’arrêt du traitement à base de quinine permet de faire disparaître la maladie. Il existe un nouveau kit pour diagnostiquer le paludisme. ce kit n'est pas adapté au diagnostic des autres espèces de Plasmodium. à l’intérieur des globules rouges. accentuant la dégradation des globules rouges. conçu pour les voyageurs dans des zones très reculées. ou du fœtus ou un taux de mortalité infantile élevé. le diagnostic du paludisme à Plasmodium falciparum peut être effectué sur-le-champ. sans équipement supplémentaire. fig. 1. V. Pour les femmes enceintes. entraînant des complications ainsi qu’un mauvais développement du bébé. Le diagnostic de la malaria s’effectue en laboratoire et repose sur la recherche des hématozoaires dans le sang des personnes présentant un accès fébrile. l’infection par le Plasmodium a énormément de conséquences pour le développement du fœtus.

que ce soit les luttes anti-vectorielles comme les insecticides ou l’absorption de médicaments anti-paludéens.La prophylaxie correspond aux différents traitements de lutte menés contre le parasite. 2002 . 2.gov. fig. drainées.asnom. 5 : Capture des Anophèles Fig.org .rph.org.au/labs/haem/malaria) De 1903 à la Seconde Guerre Mondiale.oms. Vogel. http://www. cette lutte consistait à : • • • • • • • 5 et 7) • Pulvériser les murs d’habitations d’insecticides (cf.wa. pour chaque site de ponte découvert Fig. 2002 . 6) Assécher les mares et les marais Combler les fossés Mettre en place des ouvrages de drainage Epandre du mazout afin d’asphyxier les larves sur les eaux superficielles non Introduire des poissons se nourrissant des larves Etablir des « brigades du service d’hygiène » infligeant des contraventions Utiliser des moustiquaires ou autres protections face aux moustiques (cf. Les luttes anti-vectorielles (Greenwood et al.. 6 : Pulvérisation d’insecticide . http://www. fig. http://www.

un nouvel insecticide est utilisé : le DDT. Ce composé organochloré.Fig. surtout pour ces zones où la pauvreté est importante et ou les premiers cas de résistance des moustiques à cet insecticide apparaissent (1956). notamment les zones urbaines. Si cet insecticide a constitué une étape décisive quant à l’éradication des Anophèles dans certaines zones. A présent. Les insecticides constituent néanmoins un bon moyen de prévention. utilisé comme insecticide au pouvoir rémanent. etc. les haies. Dès l’apparition de la seconde guerre mondiale. est pulvérisé dans les domiciles. notamment avec des pyréthroïdes Sur des moustiquaires imprégnées de deltaméthrine ou de perméthrine Par pulvérisation dans les habitats et zones habitables Par épandage sur les sites de reproduction Par diffuseurs électriques dans les habitats Si ces méthodes d’éradication semblent porter leurs fruits comme le montrent les études menées au Burkina-Faso (révélant alors une chute du taux de mortalité des enfants de moins de . il apparaît rapidement que son coût est très élevé. 7 : Moustiquaire de protection Ce combat assez sévère contre les moustiques a également permis de limiter en Afrique le développement de la fièvre jaune. notamment lors des campagnes de prévention menées par le WHO (World Health Organisation) dans les années 60. Ils sont appliqués de différentes manières : • • • • • Sur des filets ou toiles imprégnés. le DDT est interdit car estimé trop toxique.

J. la moindre infection par le parasite inflige des conséquences beaucoup plus sévères.wa. 3. En 1820. était utilisée comme remède contre les fièvres par les indigènes. en donnant de la quinine en prise quotidienne comme traitement préventif (cf.asnom. Ils alertent alors la communauté scientifique que ces utilisations répétées de moustiquaires et autres systèmes de protections anti-vectorielles limitent à court terme les cas d’infection mais provoquent en contrepartie une perte de l’immunité naturelle de ces populations. d’autres avis comme celui de David Modiano (Université de Rome) sont beaucoup plus mitigés.5 ans de 15% à 25%). 8 : Formules chimique de la quinine . notamment pour le traitement des accès graves (Ridley. si celle-ci n’est pas associée à d’autres modes de protection tels que les traitements médicamenteux prophylactiques (Vogel. la quinine sera le seul médicament utilisé largement et de manière efficace. fig. le docteur Maillot l’utilise alors comme traitement face au taux de mortalité importants causés par la malaria. Historique L’écorce de cinchona. Cette théorie semble effectivement se confirmer d’après de récentes analyses sanguines effectuées au Kenya et en Gambie où le taux d’anticorps des populations protégées par ce type de moustiquaires est nettement plus faible que ceux de personnes non protégées. parviennent à en isoler le principe actif.org).rph. Se pose alors le problème de l’efficacité de ce type de prévention à long terme. 2002). Lors de la conquête en Algérie. 8) Fig. http://www. Il est également l’initiateur de la chimio-prophylaxie. 2002 . De ce fait. Les médicaments A. rapportée au XVIIe siècle du Pérou. Parmi les quatre principaux alcaloïdes découverts. les chimistes français.Pelletier et J. Caventou.gov. http://www.au/labs/haem/malaria .

Chez certains sujets. Malheureusement. font partie de la première catégorie des schizonticides. la prise d'associations médicamenteuses telles que chloroquine + Fansidar n'est pas recommandée à cause des effets secondaires signalés. en Indonésie. globule rouge • La quinine et la majorité les antipaludéens de synthèse. http://www. de plus en plus de souches deviennent résistantes à la chloroquine. B. ce qui a favorisé une très large utilisation. la quinine présente des effets secondaires indésirables lorsqu’elle est utilisée de façon prolongée. 9) Or. Les gaméticides sont par exemple les amino-8-quinoléines.rph. Encyclopedia Universalis . 2002 .wa. ainsi que Plasmodium vivax en Papouasie-Nouvelle-Guinée.org . http://www. on peut alors constater un développement d'hémolyse intravasculaire massive aiguë et d’hémoglobinurie (comme la fièvre bilieuse hémoglobinurique). où la chloroquine n’a plus aucune efficacité. De plus.au/labs/haem/malaria) Il existe deux types de traitements : • Les schizonticides qui inhibent la prolifération des schizontes à l’intérieur du Les gaméticides qui agissent sur les formes sexuées. .gov. même si quelques productions de quinquina sont développées en Inde. son prix est très bas. De plus. Actuellement. elle agit sur l’ensemble des formes de paludisme et provoque peu d'effets secondaires si son dosage est adapté. Utilisée dès les années 40. C’est le cas de Plasmodium falciparum en Asie du Sud-Est. en Thaïlande ainsi qu’en Inde (cf.  Chloroquine C'est une 4-amino-quinoléine très efficace pour le traitement et la prophylaxie. notamment les animo-4quinoléines.Il faudra néanmoins attendre 1930 pour que les premiers antipaludéens de synthèse soient mis en place tout d’abord pour soutenir la production de quinine. Les traitements actuels (Ridley. fig.asnom. mais surtout afin de s’affranchir de la seule production sud-américaine. la quinine est donc seulement utilisée dans le cadre du traitement du paludisme grave à Plasmodium falciparum.

9 : Le Paludisme et la chloroquine La chloroquine est toujours utilisée.au/labs/haem/malaria . notamment en Afrique occidentale où elle reste efficace. à la différence de nombreux autres composés. Afin d’être plus efficace. Ridley. inhibant la croissante du parasite. elle est considérée comme étant un médicament sans danger pour les femmes enceintes. son utilisation chez les enfants de moins de huit ans.gov. Ce traitement devant être commencé 2 jours avant le voyage et continuer quatre semaines après avoir quitté la région impaludée. est de 100 mg. les femmes enceintes et qui allaitent est proscrite. Le dosage journalier. . est souvent associé à d’autres molécules antipaludiques. De même. Cependant. pour un adulte. comme la diminution d'efficacité des pilules contraceptives ou l’apparition de brûlures graves par le soleil chez certaines personnes.Fig. cet antibiotique.wa.rph. 2002 ) C’est probablement le meilleur médicament pour la prophylaxie antipaludique dans les régions à très haut risque comme l'Asie du Sud-Est. La doxycycline a également quelques effets secondaires.  La doxycycline (http://www.

dès 1992 en Australie dans d’autres traitements que celui contre la malaria. d’autant plus efficace contre le parasite. l'apparition d'une résistance à grande échelle. Malgré tout la méfloquine (Lariam) est encore utilisée en prophylaxie antipaludique car sa longue demi-vie permet l’utilisation d’une dose unique par semaine. Son association avec le proguanil produit un effet synergique. ce dérivé proche de la quinine est une quinoline-méthanol (cf. Le traitement complet est conditionné dans une boite de 12 comprimés à prendre pendant les trois jours que dure le traitement. Cette combinaison a fait l'objet de quelques essais cliniques et a été trouvée efficace à 95%. mais il faut souligner que le proguanil est un antifolate. Proguanil Créé en 1946. La seule restriction est que ce médicament coûte très cher. ainsi que d’effets secondaires graves comme des syndromes aigus du cerveau. le malarone est une combinaison du proguanil et d' atovaquone. ont réduit considérablement son utilisation. 10). C’est un antagoniste du folate. même pour les formes résistantes de Plasmodium falciparum. et nécessite donc une certaine prudence. Très efficace contre les cas de paludisme résistant lorsqu'il fut introduit. Pour les adultes la dose est de 250 mg par semaine et la prise doit . Utilisé.  Malarone Crée en 1998.  Méfloquine (Lariam) Utilisé dès 1971. Il a été signalé que la combinaison est sans effets indésirables. fig. ce médicament est toujours utilisé en prophylaxie dans certains pays. Son rôle est de détruire les parasites du paludisme en se fixant à l'enzyme dihydrofolate réductase de manière très comparable à la pyriméthamine. il est devenu disponible pour la prophylaxie fin 1998. constitué d’une chaîne biguanide reliée à un noyau chlorophényl. En Australie.

Autorisés en Asie du Sud-Est. à cause de leur courte demi-vie. Néanmoins. l’artémisinine a permis le développement de plusieurs composés dont les plus utilisés actuellement sont l'artésunate. Fig 10 : Formule de la méfloquine  Artémisinines Synthétisées à partir d'extraits de plantes utilisées comme remèdes en Chine. De ce fait. de limiter les cas de résistance et d’améliorer.  Halofantrine (Halfan) Développé dans les années 80. De plus. ces composés pourraient être une solution dans le traitement contre les formes résistantes de Plasmodium falciparum notamment. leurs utilisations ne sont plus recommandées. en ont limité l’utilisation. De ce fait. ce composé phénanthrènes-méthanols est un antipaludique efficace mais sa courte demi-vie (1 à 2 jours) ne lui permet pas d’être utilisé en prophylaxie. imposant des traitements sur 5 à 7 jours. l’apparition de souches résistantes et les inquiétudes liées à certains effets secondaires. Fansidar (sulphadoxine et pyriméthamine) Ces médicaments largement utilisés ces dernières années subissent actuellement de nombreux cas de résistance. l'artéméther et l’artéether. comme des troubles neuropsychiatriques. . Ce médicament est d’ailleurs contre-indiqué chez la femme enceinte et n'est pas conseillé chez la femme qui allaite. Actuellement.  Atébrine (Mépacrine) Maloprim(dapsone et pyriméthanine). Artemisia annua. ils ne le sont pas encore dans le « monde occidental » y compris en Australie. par synergie. l’efficacité contre le Plasmodium. ainsi que certains effets secondaires lourds. des associations avec d’autres médicaments sont envisagés (exemple la méfloquine) afin de diminuer la durée du traitement. Ces médicaments sont des gaméticides. les résultats obtenus sont assez mitigés.commencer une semaine avant l'arrivée dans la région impaludée.

Néanmoins. Ce fut le cas notamment avec le DDT car son application dans les habitations devait être réitérée tous les 6 mois. de nombreuses populations ont préféré utiliser des prophylactiques tels que des insecticides plutôt que des médicaments. C’est le cas au Togo où cet index a diminué de 50%. • Résistance à la chloroquine Prophylaxies : chloroquine + proguanil La chloroquine avec du proguanil donne une protection contre le Plasmodium falciparum.plus faibles dans les régions d'Asie et dans le reste de l'Amérique Multi-resistances importantes en Asie. variable en Afrique et en Amérique Tableau 1 : Utilisation d’antipaludiques en fonction des régions du monde L’utilisation de ces chimio-prophylactiques de synthèse a permis de faire diminuer de manière significative l’index splénique dans de nombreux pays.Zone • Caractéristiques Risques généralement faibles et saisonniers Risques limités dans les zones urbaines Plasmodium falciparum est absent ou sensible à la chloroquine Faibles risques dans la plupart des régions. . Risques : • .élevés dans la plupart des régions en Afrique et dans le bassin Amazonien C Pays du Groupe 3 • Résistance à la chloroquine élevée Prophylaxies 1er choix : méfloquine 2e choix : doxycycline 3e choix : chloroquine+ proguanil . ainsi que le taux de mortalité. tandis que la prise de chimio-prophylactiques s’effectue de façon hebdomadaire. La chloroquine seule protége Traitements A Pays du Groupe 1 • Prophylaxies : chloroquine • • B Pays du Groupe 2 • contre le Plasmodium vivax.

tableau 1) Malgré tout. De plus. • Des produits répulsifs : Appliqués sur les parties du corps exposées. ce qui n’est pas utile le reste de la journée.wa. La moustiquaire peut être imprégnée à domicile avant le voyage(http://www. Ce traitement est alors adapté à la zone de transit.rph. Ridley. ces produits peuvent être néfastes. 2002). femme enceinte). les plus utilisés sont le "Muskol" ou le "RID" dont le principe actif. origine.gov. Même si ces médicaments ne garantissent pas une protection absolue contre l’infection du parasite. évitant ainsi tout risque d'absorption par la peau. à la durée du séjour ainsi qu’à la personne recevant le traitement (âge.gov. Ils doivent également être imprégnés d’insecticides. Les vaccins (Richie et al.au/labs/haem/malaria .. 2002) .rph. ces produits peuvent être appliqué sur les vêtements. C.au/labs/haem/malaria . cette protection chimique n’est que complémentaire des moyens de protection contre les piqûres du moustique lui-même (http://www. le DEET (N. dosé à 15% est le mieux adapté. Il est donc recommandé de les imprégner de répulsif ou d’insecticide. Au-delà. infligeant d’importants effets secondaires. En effet. • Moustiquaires : Les moustiquaires sont indispensables dans les zones impaludés ainsi que les fins grillages protégeant les fenêtres. puis glissés sous le matelas en vérifiant l’absence de déchirures. Vogel. certains moustiques peuvent piquer à travers les vêtements. ils permettent de limiter les risques (cf. 2002 ).Pour les voyageurs. il est recommandé de porter dès la tombée du jour des vêtements couvrant complètement les membres inférieurs et supérieurs. notamment par la Perméthrine.N-diéthyl-méta-toluamide ). notamment chez les enfants où le contact direct avec la peau est déconseillé. il serait extrêmement dangereux de partir dans des zones de forte endémie sans prendre de traitement préventif.wa. Se protéger activement des piqûres de moustiques repose sur : • Les vêtements : Sachant que les femelles moustiques commencent à piquer à la tombée de la nuit.

Hemingway et al. néanmoins toutes ces barrières semblent rendre sa fabrication assez difficile.. forme parasitaire la plus mortelle.. combien de vaccins faudra-t-il mettre en place pour les combattre ? Enfin. on constate parallèlement que le parasite a développé de nouveaux antigènes. voyageurs. ces problèmes de résistance se développent actuellement en Afrique. néanmoins à aucun moment celui-ci n’est complètement éradiqué et ce redéveloppe dans l’organisme assez rapidement. ces vaccins devront être adaptés aux populations à risque (enfants. Le but d’un vaccin serait donc d’obtenir une action plus active. il existe actuellement 4 parasites différents responsables de la maladie chez l’homme. Cette prise de conscience face au risque que représente la malaria dans le monde. provoquant une recrudescence de la maladie et une augmentation du taux de mortalité. notamment depuis l’apparition de cas de résistance chez Plasmodium falciparum. relance actuellement de façon plus dynamique les programmes de recherche pour l’éradication de la maladie.Sachant que la malaria touche essentiellement des zones peu accessibles et dont les situations économiques et politiques sont souvent instables. Particulièrement importants en Asie du Sud-Est. lors de ces accès palustres. on constate chez les populations des régions endémiques du paludisme que les attaques du système immunitaire provoque une diminution du nombre de parasite. Ces résistances sont prises très au sérieux par la communauté internationale. De plus. chacun portant des antigènes spécifiques. Plusieurs problèmes interviennent lors de la création du vaccin. si depuis plusieurs années on annonce la création imminente d’un vaccin antipaludique. Faudra-t-il là encore différents types de vaccins ? A l’heure actuelle. femmes enceintes). Le premier est que le Plasmodium passe au cours de sa vie par de nombreux stades de développement. De plus. la difficulté d’accéder aux traitements a rapidement suscité l’intérêt face à l’élaboration d’un vaccin. évitant ainsi le développement de ce type d’infection chronique. chez le parasite et le vecteur (Greenwood et al. Déclencher une réponse immunitaire adaptée semble donc difficile. . son élaboration est beaucoup plus complexe que prévu. 2002). 2002 . Le problème le plus important rencontré à l’heure actuelle pour ces traitements prophylactiques est l’apparition répétée et parfois généralisée de résistances. Cependant. provoquant ainsi une infection chronique.

mais aussi les interactions entre les trois organismes. parue durant ces dernières années : l’Homo sapiens en février 2002. l’Anopheles gambiae et le Plasmodium falciparum en octobre 2002. ces recherches permettront peut-être de mieux comprendre les mécanismes de résistance du moustique et du parasite. les mécanismes de régulations… Le but est d’établir de nouveaux traitements ou insecticides capables de contrecarrer l’évolution de la maladie. Un autre axe de recherche également en cours est celui du moustique transgénique où la modification de certaines protéines empêcherait le bon déroulement de le développement du Plasmodium. .Ces recherches sont essentiellement axées sur l’analyse des séquences des trois acteurs. L’objectif de ces recherches est de mieux comprendre la chaîne de transmission du parasite. Enfin.

PRESENTATION BREVE DES TROIS PARTENAIRES DE CE COMPLEXE PARASITAIRE .

Les trois premières sont des espèces strictement inféodées à l'homme.. 1.I. 1999). Biologie des espèces : A. …). x400 Au sein du genre Plasmodium. . 4 espèces sont anthropophiles : Plasmodium vivax. Plasmodium vivax. Il prédomine dans les régions humides et marécageuses. et Plasmodium malariae.Plasmodium Classification taxonomique : Règne des protistes Embranchement des Apicomplexa (sporozoaires) Classe des Haemosporidea Ordre des Haemosporida Famille des Plasmodidae Genre Plasmodium Oocyste de P. 1). Plasmodium ovale. 1995). falciparum. Plasmodium falciparum. 2. principalement Plasmodium falciparum. PRESENTATION DES ESPECES Le paludisme est provoqué par un protozoaire parasite du sang. tandis que Plasmodium malariae peut avoir comme hôte occasionnel le singe (cf. tableau 1 et fig. exclusivement transmis par un moustique femelle d’Anophèle.. Un fort polymorphisme intra et interspécifique a permis à l’Anophèle de développer de fortes capacités d’adaptation aux contraintes environnementales (insecticides. le Plasmodium acquiert une résistance croissante aux médicaments anti-paludisme (Manguin et al. Biologie et répartition des espèces en cause : Entre 50 et 60 espèces d’Anophèles sont connues pour véhiculer les 4 espèces différentes de parasites à l’origine de la maladie chez l’Homme : Plasmodium falciparum (le plus virulent). Plasmodium ovale. de même. et Plasmodium malariae (Martin et al.

2 fois la (20% des taille normale érythrocytes infectés sont ovales) Erythrocytes de Erythrocytes Erythrocytes préférence immatures immatures Nombre de mérozoites dans le schizonte 12-24 Moyenne: 16 Plasmodium vivax 6-14 Moyenne: 8 Plasmodium ovale Normale Normale (érythrocytes infectés en faucille) Erythrocytes sénescents 6-12 Moyenne: 8 (souvent arrangé en rosette) Plasmodium malariae Pas de préférence 6-32 Moyenne: 20-24 Plasmodium falciparum Espèces Tableau 1 : Caractéristiques des 4 espèces de Plasmodium anthropophiles .) 48 heures (approx. en moyenne 43-45 49-50 heures 72 heures Tous: Trophozoïtes Schizontes quelques Gamétocytes (Quelques sporozoites mais ne restent pas longtemps à ce stade.5 .25 .Espèces Plasmodium vivax Marron doré Plasmodium ovale Marron foncé Plasmodium malariae Marron foncé Plasmodium falciparum Noir Pigment du parasite Longueur du cycle asexué 41-47 heures.5 Taille des normale fois la taille érythrocytes Taille maximale normale entre 1.1.) Stades dans la circulation sanguine Tous: Trophozoïtes Schizontes Gamétocytes Tous: Trophozoites Schizontes Gamétocytes Sporozoïtes Gamétocytes (Les autres stades se développent dans des organes internes) Plus grande que la normale Taille maximale Plus grande que la entre 1.

fig. 1: Les stades de développement chez les 4 espèces de Plasmodium anthropophiles (*Ring = Sporozoïte) Cycle de développement du parasite : (cf. formes infestantes contenues dans les glandes salivaires du moustique. ils s’installent dans les cellules . un Anophèle femelle infecté inocule à un être humain des formes primitives de Plasmodium : des sporozoïtes. Une fois à destination.Fig. 2) • Chez l’homme : Par une piqûre. Ces sporozoïtes passent dans le sang puis migrent vers le foie via les canaux sanguins en moins de 30 minutes.

com/principales/fichiers/pm-inf-palugraves. Le gamète mâle subit un processus d'exflagellation à la suite duquel les gamètes femelles sont fécondés. (http://rph.univ-angers.shtml http://www. A ce stade.gov. et s’y multiplient.du parenchyme hépatique. (http://rph.shtml http://www. cycles schizogoniques. Le développement et la multiplication des sporozoïtes repoussent le noyau en périphérie de la cellule pour finalement constituer une masse multinucléée appelée schizonte ou corps bleu.html http://www.fr/service_serveur/invite/anofel/polycopie /palu. Cette brève phase diploïde s’achève par une division meïotique et est suivie par plusieurs milliers de mitoses (sporogonie) qui conduisent au développement de sporozoïtes. les hépatocytes.com/principales/fichiers/pm-inf-palugraves. Chez le . des gamétocytes apparaissent.wa. Après plusieurs Le cycle sexué (ou sporogonique) : Les gamètes mâles et femelles circulent dans le sang et sont absorbés par un Anophèle femelle lors d’un repas sanguin. les parasites se développent sous forme sexuée ou asexuée. Ce stade permettant notamment la maturation des sporozoïtes s’appelle schizogonie pré-érythrocytaire (Il est à noter qu’il n’existe pas de cycle continu dans le foie dans le cas de Plasmodium falciparum). La cellule éclate. Cela explique les accès de reviviscence tardifs. Dans les hématies.html http://www. libérant ainsi les mérozoïtes qui pénètrent alors les hématies par endocytose pour poursuivre leur développement. L'éclatement de l'oocyste libère ces éléments mobiles et haploïdes dans l’hémolymphe. plusieurs milliers de jeunes parasites appelés mérozoïtes se trouvent dans une cellule hépatique. Après 12 jours environ.gov. Il en résulte un oeuf appelé oocinète. celui-ci s'implante sous la paroi stomacale en formant l'oocyste.medinfos.med. Les sporozoïtes gagnent les glandes salivaires du moustique d'où ils pourront être injectés avec la salive lors d'une prochaine piqûre.med.pdf ) • Chez l’Anophèle : vont parasiter une nouvelle hématie et poursuivre leur cycle intra-érythrocytaire. Les gamétocytes parviennent dans l’estomac du moustique où ils se transforment en gamètes.wa.au/labs/haem/malaria/France/fhistory. Plasmodium vivax et Plasmodium ovale restent quiescents dans les hépatocytes pendant un temps génétiquement déterminé.pdf ) Cycle asexué : Les mérozoïtes présents dans les hématies se développent puis sont libérés.au/labs/haem/malaria/France/fhistory.univ-angers.fr/service_serveur/invite/anofel/polycopie /palu.medinfos.

De plus. Fig. (http://rph.moustique.med. Le cycle est stoppé pour Plasmodium vivax. suivant la température extérieure et les espèces en cause.html http://www..com/principales/fichiers/pm-inf-palugraves.medinfos. et en dessous de 19°C pour Plasmodium falciparum.shtml http://www. Anophèle Classification taxonomique : Embranchement des Arthropodes Classe des Insecta Ordre des Diptera Sous-ordre des Nematocères Famille des Culicidae Sous-famille des Culicinae . la température maximale que les Plasmodium peuvent supporter est estimée à 32°C (Martin et al.fr/service_serveur/invite/anofel/polycopie/palu. 2 : Cycle de vie du Plasmodium B. 1995).pdf ) La durée du cycle de développement des Plasmodium est considérablement réduite lorsque la température est comprise entre 27 et 31°C. Plasmodium ovale et Plasmodium malariae en dessous de 15°C. l'ensemble de ce cycle se déroule en 10 à 40 jours.gov.univ-angers.wa.au/labs/haem/malaria/France/fhistory.

Or. Ensuite. Celles-ci ont un taux de fécondité plus élevé que les autres (Okanda et al. A chaque ponte. La femelle est hématophage pour pouvoir assurer sa fonction de reproduction. cela nécessite d’acquérir. Ainsi. une forme concentrée d’énergie. les quelques microgrammes de sang qu’elle ingère à chaque piqûre (pouvant représenter jusqu’à trois fois son poids !) constituent une source concentrée de nutriments essentiels pour la maturation des œufs. Elle dispose d'organes sensoriels très puissants. capables de détecter les odeurs corporelles. le gaz carbonique. Les individus ne s’accouplent en général qu’une seule fois.Genre des Anopheles Anopheles gambiae  Comportement : La sélection sexuelle des femelles se fait sur la base d’un critère de taille. la chaleur et la transpiration émis par son hôte . elle suit donc ces stimuli jusqu'à la localisation de l'hôte (Budiansky. au travers de sa substance nutritive.. En effet les mâles préfèrent les grosses femelles. 2002). la femelle stocke précieusement le sperme dans des spermathèques. elle dépose des centaines d’œufs. Tête d’Anophèle femelle . 2002). Elle ne pique que le soir et la nuit se repérant grâce aux odeurs émises par ses proies.

2002). com. Une tendance générale apparaît cependant. les premiers vivent quelques jours alors que les femelles peuvent perdurer plusieurs semaines. ils sont en général munis de flotteurs latéraux.La présence d’eau stagnante est nécessaire pour la ponte. etc. Ceci est lié à un des stades de développement du moustique. larve et nymphe) et une phase aérienne (adulte). pers. La dispersion des individus diffère selon leur sexe. pneus. c’est-à-dire entre 23 et 30°C et avec une humidité relative de l’air de 70 à 80%. l'Anophèle femelle prend un repas de sang humain ou animal pour permettre la maturité de ses oeufs et cherche un gîte favorable pour la ponte. Les moustiques utilisent un mode actif ou passif de dispersion. 1995). La répartition des Anophèles est par conséquent très difficilement contrôlable (Tibayrenc. La dispersion passive est réalisée grâce à l’utilisation des courants aériens et des avions. En effet.). Elle est relativement faible pour les mâles. Cependant cette restriction n’est pas véritablement contraignante puisque la source d’eau peut prendre des formes très diverses : mares. et plus importante pour les femelles. Dans des conditions optimales de température. Les oeufs sont pondus isolément à la surface de l'eau . Stade aquatique : Après l'accouplement. En effet. Les moustiques peuvent être assimilés à du « plancton aérien ». La dispersion active est variable selon les espèces et leur âge. (Budiansky. trous remplis d’eau dans des arbres. flaques. Le choix du gîte diffère selon les espèces suivant qu'il s'agisse d'eau courante ou 38 . boîtes de conserves..  Cycle de développement du vecteur : Le cycle de vie de l’Anophèle est divisé en deux stades : une phase aquatique (oeuf. L’espérance de vie est un paramètre très fluctuant d’une espèce à une autre et d’une saison à une autre (elle rallonge en hiver lorsqu’il y a diapause) suivant la température et l’humidité relative de l’air. en moyenne les mâles vivent moins longuement que les femelles. l’espérance de vie du moustique s’allonge et le nombre de repas augmente jusqu’à un repas par 48 heures (Martin et al. c’est une condition sine qua non pour que les larves survivent puisqu’elles se nourrissent de micro-organismes aquatiques.

L'accouplement a généralement lieu dans les 24 à 48 heures suivant 1'éclosion imaginale. Après s'être gorgée de sang. ensoleillée ou ombragée possédant ou non la qualité biologique permettant le développement ultérieur des larves. L'éclosion de ses oeufs libère des larves qui passent par plusieurs phases de développement à la suite desquelles elles muent. dont les spermatozoïdes sont extraits progressivement pour féconder la totalité des oeufs qu'elle produit. La durée de développement larvaire est de une à trois semaines. Le temps qui s'écoule entre le repas de sang et la ponte des oeufs (150 à 300 oeufs) s'appelle cycle gonotrophique. Sous de bonnes conditions de température et de nourriture. 39 . elle quitte l'habitation au crépuscule pour aller chercher un gîte aquatique adapté à la ponte.stagnante. l'incubation des oeufs dure 2 à 3 jours. Stade aérien : Après l'éclosion. douce ou saumâtre. elle ne dépasse pas 8 à 10 jours. Celui-ci se dégage progressivement. Les prédateurs et les mouvements de l'eau ou de l'air concourent à une forte mortalité à ce stade. Elle s'envole alors. le moustique reste quelques instants à la surface de l'eau. Cette évolution est d'autant plus rapide que la température est plus proche de l'optimum 25-30°C et que la nourriture est plus abondante. A la fin de son évolution. les larves se transforment en nymphes dont la durée de vie est très courte (1 à 2 jours). la température et l'humidité relative. la femelle est obligée de se nourrir de sang pour assurer la maturation de ses oeufs. et au besoin se dévorent entre elles. l'Anophèle femelle va se mettre au repos pour digérer. Sous les conditions favorables de température (18 à 20°C). aliment riche en protéines et en nutriments nécessaires à la production et au développement des oeufs. Lorsqu’elle est gravide. pour chercher sa nourriture. Beaucoup de moustiques meurent à ce moment. A la quatrième mue. Après l'accouplement. le plus difficile consistant à sortir ses longues pattes. il se nourrit uniquement du suc des végétaux. La durée de ce cycle varie de 2 à 5 jours selon les espèces. la moindre agitation de 1'eau entraînant leur noyade. la nymphe se positionne sous la surface de l'eau et une fente apparaît sur la face supérieure du céphalothorax d'où émerge l'insecte adulte (qui s’est développé à l’intérieur de la nymphe). loin de son gîte. Elles se nourrissent de nombreux micro-organismes animaux et végétaux. le temps nécessaire au durcissement de sa cuticule et en particulier de ses ailes. Elle peut à ce stade utiliser le vent comme mode de dispersion. Il reste proche de son gîte pendant environ 2 jours. Elle stocke le sperme dans un organe appelé spermathèque. La femelle ne s'accouple qu'une fois dans sa vie. et quelque soit son sexe.

Dans ce dernier cas. si le paludisme est périodique. Un moustique non-infecté peut être contaminé lorsqu'il pique un hôte porteur de parasites pathogènes . les sporozoïtes manipulent les moustiques en induisant une augmentation du nombre de repas sanguins provoquant ainsi une mort prématurée du moustique. le parasite cherche lui à augmenter son taux de transmission (maximum atteint pour un nombre de piqûres infini). le taux de mortalité du moustique s’accroît d’environ 30%. Au contraire. L’origine récente des populations de Plasmodium falciparum est un facteur expliquant sa virulence (Rich et al. il y a un conflit d’intérêt entre les deux protagonistes : là où le moustique cherche à maximiser son taux de fécondité (maximum atteint pour un nombre de piqûres N). ces parasites se développent ensuite dans le corps de l'insecte jusqu'à infection complète.. Les sujets développant les formes graves sont par conséquent les enfants en bas âge et les personnes transplantées. ou bien il peut être continu (transmission de 8 à 12 mois).II. pers. En présence du Plasmodium sous la forme de sporozoïtes. Au contraire. com. les populations locales n’ont pas le temps de développer ce type de protection (Martin et al. En règle générale.. à son tour. L’évolution de la virulence allant dans le sens du parasite. ils doivent avoir le temps de se développer par conséquent ils réduisent le taux de piqûres et la fécondité du moustique afin d’allonger l’espérance de vie de celui-ci (Koella. on note que la co-évolution hôte-parasite conduit à une baisse de la virulence du parasite qui doit conserver son hôte en vie le plus longtemps possible pour maximiser sa fitness. Cette règle n’est pas valable pour les relations parasite-vecteur. 1998). Le taux d’infection est élevé et peut être maintenu par une population réduite de 40 . infecter ses futurs hôtes. lorsque les oocystes sont présent. les populations indigènes présentent alors des formes d’immunité qui prévient l’augmentation du taux de mortalité. Le moustique peut alors. 1.). Immunité chez l’homme : Deux cas sont à dissocier : le paludisme peut être saisonnier (transmission pendant 1 à 7 mois au cours de l’année) dans les régions où les conditions climatiques ne permettent qu’un développement épisodique des parasites et des vecteurs. En effet. Relations au sein de la triade Plasmodium-Anophèle-Homme : Les parasites pathogènes sont transmis à l'hôte par la salive ou le stylet des moustiques infectés. 1995).

En effet. Génétique des populations : 41 .. est caractéristique de l’anémie falciforme ou drépanocytose. Une transmission congénitale qui n’est possible que si la mère n’est pas immunisée. et une transmission transfusionnelle dite « du toxicomane » qui est grave puisque les trophozoïtes (stades de développement au sein de l’hématie) transmis sont directement infectant. 2002). traduite par l’existence d’hématies en forme de faucilles. pers. . la drépanocytose persiste car elle confère un avantage sélectif contre le paludisme. 1995). la mutation S de l’hémoglobine confère à la molécule. la propriété de polymériser en longue fibre et de modifier la forme et la plasticité du globule rouge.medinfos. ce qui explique en partie le fait que la maladie soit potentiellement impossible à éradiquer dans les zones où elle perdure tout au long de l’année (Martin et al.shtml) 2. Cette maladie de l’hémoglobine du sang est génétique. En dépit de sa gravité.com/principales/fichiers/pm-inf-palugraves. com. Le parasite ne survit que très difficilement dans ces conditions (Rihet.la présence d'hémoglobine F ( qui protège le nouveau-né pendant les premières semaines de la vie) chez l'adulte: la thalassémie . Il existe deux modes de transmission exceptionnels. Il est toutefois à noter qu’une relative protection vis-à-vis du paludisme peut être engendrée par 4 facteurs entraînant des circonstances défavorables pour le Plasmodium : la présence d'hémoglobine S fréquente en Afrique de l’ouest. L’être humain développe une immunité toujours relative à une espèce de Plasmodium donnée. Il n’existe a priori pas d’immunité naturelle contre le paludisme. elle permet uniquement de limiter les effets pathogènes des Plasmodium.moustique.un régime exclusivement lacté déficient en acide para aminobenzoïque . Elle est incomplète et fluctuante. monogénique et autosomale récessive.une malnutrition protéique. Cela indiquerait donc qu’un vaccin est peut être conceptuellement impossible à fabriquer puisque les vaccins ne font que copier la nature (Tibayrenc. Cette hémoglobine anormale.). en condition d’hypoxie (diminution de la quantité d’oxygène contenue dans le sang suite à l’altération de l’hémoglobine). (http://www.

1998 . Cependant. 1998).. il existe une théorie (« malarial Eve ») montrant qu’elles descendent d’une souche ancestrale unique.. En estimant le taux de substitution des nucléotides. l’expansion de son aire de répartition a été stoppée par les glaciations du Pleistocène. il peut être avancé que cette souche serait apparue il y a 24 500 à 57 500 années (Hughes et al.) dans les espèces constituant la triade . De plus. densité. 1998). etc. La dispersion à partir d’une souche unique peut s’expliquer par une forte sélection naturelle qui justifie une colonisation rapide des populations de Plasmodium falciparum par un seul génotype haploïde. Rich et al. Plasmodium falciparum s’est répandu récemment à la surface de globe à partir d’une petite population confinée) ou bien d’une dispersion à partir d’une souche unique favorisée par la sélection naturelle qui a récemment remplacée toutes les autres (Rich et al. Du fait des conditions de température nécessaires au développement du Plasmodium. Cette dispersion rapide a pu être favorisée par 3 facteurs : des changements de comportements humains et. cette hypothèse corrobore les données paléontologiques de Plasmodium falciparum (Rich et al.. Il est à noter que le fait que Plasmodium falciparum ait un fort degré de polymorphisme n’est pas incompatible avec une éventuelle structure clonale de la population. 1998). Cette origine récente peut être la conséquence d’une explosion démographique (i. plus précisément le développement des sociétés agricoles (favorisant ainsi la déforestation et l’irrigation) des changements génétiques qui ont renforcés les affinités au sein de l’association hôteparasite-vecteur des changements démographiques (migration. Il 42 . Plasmodium Concernant l’origine des populations de Plasmodium aujourd’hui réparties dans le monde. la colonisation au-delà de l’Afrique tropicale n’a sans doute eu lieu que plus tard (Rich et al. Dans le cas de l’explosion démographique : Plasmodium falciparum est resté localisé dans une aire géographique très restreinte pendant longtemps.e. avant de se disperser rapidement il y a peu de temps dans les populations humaines. en particulier l’expansion de Plasmodium falciparum en réponse aux divers évènements de spéciation anthropophile d’Anophèles. 1998). Les conditions climatiques favorables seraient apparues il y a 6 000 ans.A...

De plus. 1997). une population de Nouvelle-Guinée présente un taux non-négligeable d’autofécondation. cette situation conduit bien à une propagation clonale du Plasmodium. un individu portant un génotype différent du sien et donc de se reproduire avec un tel individu. dans le moustique. certains « polymorphismes persistants » n’ont été maintenus qu’à certains loci de Plasmodium falciparum : cela appui le fait que la recombinaison interlocus ait été un facteur important d’évolution. Au contraire. Milon. La longueur des branches et les valeurs de bootstrap confirme une importante distance génétique. il existe des polymorphismes persistants maintenus au cours de l’évolution. ce qui présuppose l’existence d’une co-évolution entre le parasite et son vecteur et/ou son hôte qui a permis de conserver certaines formes (G. Les formes infestantes des hommes étant haploïdes. L’arbre phylogénétique ci-dessous (cf. le parasite se propagerait de façon asexuée dans certaines circonstances. pers. 3) rend compte de l’éloignement de Plasmodium falciparum par rapport aux 3 autres groupements qui se détachent nettement. Par exemple. Néanmoins cela sous-entend que les populations de Plasmodium falciparum seraient clonales en dépit du stade sexué obligatoire du cycle de vie du parasite (Rich et al. Dans ce cas. les populations évolueraient dans des conditions proches de la panmixie (Tibayrenc. bien que l’existence de forts déséquilibres de liaison soit également en faveur de la théorie « malarial Eve » selon laquelle Plasmodium falciparum aurait comme origine un génotype unique (suite à un récent goulot d’étranglement). 1999 . 1998).. com. Cependant.. différentes observations la contredisent. Abderrazak et al. La réalité biologique se situe certainement entre ces deux points de vue. Fig.a en effet été montré que ces deux caractéristiques sont conciliables : Trypanosoma et Leishmania présentent cette particularité. Par conséquent. fig.. 3 : Arbre phylogénétique de neuf espèces de Plasmodium (Waters et al. Tibayrenc. 1998 . dans les zones à fort potentiel de transmission. 1993) 43 . La cause de cette particularité réside probablement dans un taux de transmission faible entraînant une probabilité réduite pour le parasite de rencontrer..). 1999). Tout d’abord. certains arguments s’opposent à l’hypothèse de la « malarial Eve » (Hughes et al.

Il s’ensuit une co-évolution expliquant en partie l’efficacité du pathogène qui est. 2002 . Cela a permis l’émergence de moustiques strictement inféodés à l’homme. P.Arbre réalisé selon la méthode de « neighbor-joining ».s. Les niveaux de bootstrap (sur 1000) sont indiqués en soulignés pour chaque branche interne. 2002). Le vecteur le plus important dans l’Afrique sub-saharienne est le moustique Anopheles gambiae sensus stricto (s. liée à l’efficacité du vecteur (d’où une augmentation massive des taux d’inoculation) (Budiansky. d’exophiles zoophiles ils sont devenus endophiles anthropophiles. et P.) qui comprend en réalité cinq formes géographiques distinctes et isolées génétiquement (identifiées par des inversions au niveau des chromosomes paracentriques). La longueur des branches est donnée en nombre de substitutions / 100 nucléotides. Coluzzi. en fait.Anophèle L’augmentation de la population humaine ainsi que la colonisation de nouveaux espaces a rendu la spécialisation du moustique intéressante par rapport à sa fitness. Il appartient à un complexe d’espèces -autrefois indifférenciées. malariae.lui aussi 44 . vivax) B. falciparum. Les taxons les plus anthropophiles ont donc subit des changements de comportements. (Les parasites de l’Homme : P.

Budiansky. deux loci microsatellites proche du centromère du chromosome X présentent des différences significatives entre les formes M et S au Mali. Anopheles parensis et Anopheles vaneedeni) (Manguin et al. l’analyse de 45 . 1999 . Anopheles confusus. Il n’existe pas d’isolement génétique entre les différentes populations malgré un isolement géographique. On distingue également des différences concernant leur spécialisation alimentaire : certains comme Anopheles gambiae se concentrent presque exclusivement sur les humains tandis que d’autres comme Anopheles quadriannulatus sont plutôt inféodés aux animaux. tableau 2).. 1999 . 2002). Anopheles fuscivenosus et Anopheles. se restreignent montrant ainsi un processus de spéciation en direct.s. De plus. les flux de gènes entre deux formes « moléculaires » d’ Anopheles gambiae s. 1999). Budiansky. possède une grande variabilité morphologique et biologique et son aire de répartition est très vaste mais ne représente néanmoins qu’une seule espèce et non un complexe.s. De plus. 2002). Des études ont montré que les populations. Il existe deux formes nommées M et S. Par exemple. ces espèces présentent un isolement reproductif très marqué. Au niveau spécifique. appartient à un groupe nommé Anopheles funestus. d’Anopheles melas. d’Anopheles merus et d’Anopheles bwambae. d’Anopheles quadriannulatus A et B. un autre vecteur majeur en Afrique. du Belize. Les espèces appartenant à ce complexe sont morphologiquement indiscernables mais présentent des caractéristiques génétiques et éco-éthologiques qui leur sont propres et qui se reflètent dans leurs capacités à transmettre ou non le paludisme.. par exemple entre les populations d’Anopheles arabiensis du Sénégal et celles des îles de l’Océan Indien (Manguin et al. une forte différenciation génétique entre certaines populations est également observable. Ce groupe est structuré comme suit : quatre espèces apparentées (Anopheles brucei. Au contraire. En effet. d’Anophèles présentent une forte variabilité génétique. constitué d’Anopheles arabiensis. Aujourd’hui. comme les espèces (cf.appelé Anopheles gambiae. un vecteur important en Amérique latine.. du Guatemala au Honduras et au Salvador mais il n’a cependant jamais été échantillonné du Nicaragua au Panama (Manguin et al. De même Anopheles funestus s. Anopheles darlingi.. Des différences d’ordre moléculaire entre les deux formes ont été montrées. rivulorum) et un sous-groupe comprenant lui-même quatre espèces (Anopheles aruni. sa répartition s’étend de la Colombie au nord-est de l’Argentine et au sud du Mexique. Anophele funestus.

funestus An. farauti. pseudopunctipennis An. La forme S est localisée en Afrique tropicale et se reproduit dans des mares dépendantes des pluies tandis que la forme M se trouve uniquement en Afrique de l’ouest et se reproduit préférentiellement dans les sources d’eau anthropiques comme. et An. darlingi et An. An. darlingi. An. An. An. An. albimanus. gambiae s. quadrimaculatus. l’Homme est directement responsable de la spéciation et. Fleury. dirus (vecteurs principaux) An. Localité Ethiopie Afrique Iles de l’Océan Indien Asie du sud-est Asie Amérique latine Amérique centrale Etat du Chiapas. créée par des phénomènes d’anthropisation du milieu.la séquence de l’intron I (en amont de la mutation kdr) a révélé que les formes en Afrique de l’ouest diffèrent constamment à ce niveau d’un nucléotide (Torre et al. An. Par conséquent. arabiensis (vecteurs principaux). darlingi An. 1999 . An. darlingi An. Torre et al. de l’extension de la période de transmission du paludisme au-delà de la saison des pluies (Budiansky. lui permettant ainsi d’éviter la compétition intraspécifique.. les canaux d’irrigation. tellessarus. An.. minimus. Elles semblent être pour le moment d’ordre comportemental et géographique. Par suite. sinensis.s. stephensi. 2002). des barrières reproductives se mettent en place entre les deux formes. arabiensis An.. free-borni Tableau 2: Répartition des Anophèles dans le monde (Manguin et al. 2002). La forme M a donc colonisé une niche écologique relativement récente. Dans ce cas. albimanus An.. Mexique Belize Amérique Espèce An. par exemple. quadriannulatus A et B (endémique) An. 2003) 46 . An. albimanus. 2002 . pseudopunctipennis. indirectement. la forme M tire avantage des installations humaines et allonge ainsi son cycle de reproduction. minimus An. An. An.

EXPLORATION DU POLYMORPHISME GENETIQUE DES PARTENAIRES DE CETTE TRIADE AVANT LE PROJET DE SEQUENCAGE 47 .

. Les scientifiques ont réussi à prouver que des mutations sur des zones adhésives de cette protéine diminuaient considérablement le taux d’infection des cellules hôtes par le sporozoïte. qui sont les seules cellules où l’on trouve des sporozoïtes chez l’homme. Alors le parasite exporte des polypeptides à la surface de l'érythrocyte.I. Il est possible que les sporozoïtes aient besoin de traverser toutes ces cellules pour activer un mécanisme de pénétration. Tout le long de leur cycle asexué. 2001). Moins de 100 sporozoïtes sont suffisants pour infecter un hôte potentiel. conférée par la protéine transmembranaire TRAP (cf. La capacité qu’ont les sporozoïtes de Plasmodium à envahir des cellules (qu’elles soient chez le moustique ou chez l’homme) repose sur leur propriété de "glisse" sur les substrats solides. excepté une petite période extracellulaire. ils se développent dans les érythrocytes où ils sont protégés de la plupart des mécanismes du système immunitaire. les sporozoïtes traversent le cytosol de nombreuses cellules avant d’envahir l’hépatocyte et de former une vacuole spécifique. leur Tallon d'Achille. ou bien pour trouver la meilleure cellule cible possible. 48 . et il semble évident que le Plasmodium s’est rendu maître dans l’art de pénétrer les hépatocytes. Plasmodium 1. afin de mieux s’y développer (Mota et al. Les antigènes de surface du sporozoïte Le sporozoïte correspond au stade d’infection de Plasmodium falciparum. Contrairement aux autres parasites qui s’entourent d’une membrane vacuolaire pour pénétrer les cellules. stimulant la production d'anticorps spécifiques qui se lient à l'érythrocyte infecté. En fait. se diviser et se transmettre. 2. 1). présent dans les glandes salivaires du moustique qui transmet le paludisme : Anopheles gambiae. dans le but de coloniser. Les parasites Plasmodium vont dans la circulation sanguine où ils infectent les érythrocytes pour grandir et se diviser. appelée vacuole parasitaire. le sporozoïte créé une brèche dans la membrane plasmidique de l’hépatocyte avant de la réparer rapidement. varient au niveau de leur surface de contact avec l'hôte par nécessité. où ils vont pouvoir se développer et se répliquer vers le stade suivant. Généralités Les parasites qui prolifèrent dans des niches écologiques restreintes comme l'espèce Plasmodium. fig.

On peut noter la présence importante de ce motif (106 exemplaires) sur toute la surface du sporozoïte. Ces modules adhésifs de la protéine TRAP ne sont donc pas impliqués dans la motilité du sporozoïte mais dans le mécanisme d’infection. du type NANP (Asparagine-AlanineAsparagine-Proline). Ces protéines ne sont présentes qu’à ce stade du développement et on ne les trouve pas lors des stades de développement dans le sang. Les scientifiques ont séquencé le gène codant pour cette protéine : il ne possède aucun intron et n’est présent qu’en un exemplaire dans le génome. où ils interagissent directement avec les protéines de surface de la cellule cible. dans les zones endémiques.. appelées circumsporozoïtes. présente des propriétés immunologique considérable. C’est d’ailleurs sur cette zone (NANP)3 que la réponse immunitaire naturelle agit. en 4 exemplaires. de même que de nombreux médicaments et vaccins potentiels. 2002). D’un point de vue structural.. Ces polypeptides sont impliqués notamment dans les interactions initiales entre le sporozoïte et la membrane hépatocytaire. le gène est constitué de séquences répétées en son centre. Cette protéine est constituée de 412 acides aminés. 2). On retrouve les épitopes immunodominants à l’intérieur de 3 de ces séquences (cf.mais n’affectait pas la propriété de glisse énoncée plus haut (Matuschewski et al. Les protéines CS de toutes les espèces de Plasmodium possèdent une séquence signal spécifique à l’extrémité N et une séquence hydrophobe en position C-terminal. fig. 1985). Fig. 49 . 1 : invasion d’une cellule par un sporozoïte Les sporozoïtes matures possèdent sur leur membrane des protéines bien spécifiques. et du type NVDP (Asparagine-Valine-Acide Aspartique-Proline). ou protéines CS (Nussenzweig et al. présentes en 37 exemplaires. et possède un épitope immunodominant dans 3 régions de la molécule.

le point critique du succès de l'invasion est la flexibilité du parasite pour s'attacher et envahir les érythrocytes. Pour Plasmodium falciparum. 50 . Pour contrer cela. 3. le mérozoïte se positionne pour entrer dans l'érythrocyte.. limitant par la même occasion le développement des syndromes du paludisme. 2 : Structure de la protéine CS chez Plasmodium Les séquences répétées sont soumises à des pressions évolutives plus importantes que le reste du gène. Les protéines de la surface du mérozoïte. Plasmodium falciparum change rapidement ces séquences répétées.. en utilisant des voies alternatives qui impliquent des récepteurs distincts. Après l'attachement à sa cible. Un vaccin visant les sporozoïtes aiderait le système immunitaire de l’homme à se débarrasser du parasite injecté par le moustique et ainsi empêcherait le cycle du Plasmodium de se terminer. 1985). En effet. Les érythrocytes humains démontrent une remarquable diversité par rapport aux molécules de surface qu'ils expriment. il a été observé (Cowman et al.Fig. pour se rendre moins facilement détectable par les systèmes immunitaires (Nussenzweig et al. 2002) que Plasmodium falciparum est capable d'envahir des érythrocytes qui sont antigéniquement différents. sont considéré comme vitales pour l'invasion dans l'érythrocyte. Invasion sous forme mérozoïte et les protéines associées L'invasion des érythrocytes par la forme mérozoïte de Plasmodium falciparum est l'un des processus majeurs aboutissant à la pathogénicité. à cause de la réponse immunitaire des hôtes parasités. ainsi que les organelles associées a l'extrémité apicale.

il a été découvert un gène codant pour un protéine riche en acide glutamique (GLURP)(Borre et al. appelées Merozoite Surface Proteins (MSPs) possèdent une ancre glycosylphosphatidylinositol (GPI) attachée à une queue COOH-terminale (Cowman et al. Sur les cinq MSPs préalablement identifiées et possédant cette ancre GPI. Ces domaines EGF-like sont particulièrement importants car ils pourraient avoir un rôle dans les interactions protéines/protéines (par analogie avec d'autres domaines EGF-like) et parce qu'ils sont clairement la cible des réponses immunitaires de l'hôte. 3 : Modèle d’invasion des érythrocytes par les merozoites 51 ... il existe d'autres clusters dont on peut penser qu'ils sont impliqués dans des fonctions similaires. fig... quatre ont un ou deux domaines ressemblant au COOH terminal des Epidermal Growth Factors (EGF). sur le chromosome 10.1991) et l'antigène S (Cowman et al. A côté des gènes codant pour MSP-3 et MSP-6. Fig. 2001). 2002). 1985). Autour de ces gènes.. 2002). Ces protéines de surface du mérozoïte. 3)(Cowman et al. Celles-ci mettent probablement en jeu des anticorps inhibiteurs d'invasion (Black et al.Le processus d'immunité de l'hôte enclenche la formation d'anticorps directement dirigés contre les protéines de surface et qui doivent bloquer l'invasion (cf. En effet. il a été découvert que la molécule MSP-1 est une partie d’un complexe non covalent contenant deux autres molécules : MSP-6 et MSP-7 dont les gènes résident dans des clusters. De multiples protéines sont probablement impliquées dans ces liaisons hôte-envahisseur.

Fig. 4 : Structure de PfEMP1 C. B. 4). Variants PfEMP1 Les nouveaux variants apparaissant dans les infections chroniques de malaria sont toujours distincts. de ceux des parents.A. PfEMP1 ayant un poids moléculaire de 200000 à 350000 Mr (cf. 1995). au niveau de leurs antigènes. 1992)... Ces modifications entraînent l'adhésion de ces derniers aux capillaires. dispersés sur tous les chromosomes. Une petite proportion de Plasmodium falciparum change les polypeptides de surface à chaque nouvelle vague d’envahissement de l’hôte. variant au niveau de leur antigénicité et exprimées à la surface de l'érythrocyte (Baruch et al.Molécules PfEMP1 Les érythrocytes humains infectés par Plasmodium falciparum acquièrent des propriétés adhésives qui sont un important facteur de la pathogénicité de la malaria. fig. dans le but de permettre l'expansion de nouveaux variants quand les premiers parasites sont reconnus et sélectionnés par le système immunitaire. Les réarrangements génétiques fréquents chez les gènes var sont supposés être responsables des variations de l'ADN 52 . Structure du gène var Ces variants sont codés par une famille de gènes : var. Cette réponse sérologique variante de l'hôte reflète un élément fondamental du parasitisme : la variation antigénique (Roberts et al. Cette famille de gènes est estimée contenir 50 à 150 membres. La séquestration des érythrocytes infectés au niveau d'organes importants serait corrélée avec le développement de syndromes importants de la malaria. L’adhérence de ces cellules se fait par une famille de protéines : Plasmodium falciparum érythrocyte membrane protein 1. Ces protéines PfEMP1 sont hautement polymorphes.

en effet. au stade trophozoïte et schizonte. Certains récepteurs de l’hôte se lient aux protéines du parasite. Deux domaines distincts ont été identifiés chez PfEMP1 : le domaine DBL (Duffy Binding Like) et la région riche en cystéine CIDR (cysteine-rich interdomain region) qui se lie au CD36... Un gène var fait 10 à 12 kb ce qui veut donc dire qu’environ 6% du génome contiendrait des informations pour ces gènes. les gènes var présentent des structures communes. un seul érythrocyte infecté n’exprime qu’un ou quelques variants du gène var. Des analyses histologiques post mortem d’individus morts de malaria cérébrale ont montré une implication importante de la molécule ICAM-1 (Newbold et al. Il existe cinq groupes de domaines DBL : α. La plupart des gènes sont localisés en région subtélomériques. Fisher et al. 1989) et la molécule ICAM1 (Berendt et al. dans les deux orientations possibles. δ et ε. Ces gènes subtélomériques sont exprimés . Le screening de banques de YAC via des sondes reconnaissant l’exon II. La région codante est composée de deux exons dans lesquels sont conservés spatiallement des motifs de séquences. De plus. Cependant. Liaison avec ICAM-1 Les érythrocytes se lient donc aux capillaires.. Le domaine DBL se lie différemment selon la séquence primaire... L’expression des gènes var est contrôlée différentiellement. différents variants du gène sont exprimés. dont CD36 (Barnwell et al. dans une population de parasites. L’organisation génomique commune des gènes var exprimés suggère qu’elle joue un rôle important dans la variation des phénotypes adhésifs et antigéniques (Hernandez-Rivas et al. Su et al. Le domaine amino-terminal est toujours un 53 . la transcription se fait au stade précoce du cycle intra érythrocytaire mais l’apparition du produit du gène se fait avec un délai. a permis la détection des gènes var dans les régions subtélomériques de la plupart des chromosomes de Plasmodium falciparum. 1997 . β. 1997). 1989). que les érythrocytes infectés in vivo par Plasmodium falciparum..dans les différentes lignées de parasites. Ils sont tous en simple copie et situés juste à côté de la séquence répétée télomérique rep20. 1992). D. et le second exon code pour un segment terminal cytoplasmique chargé négativement et conservé chez les gènes var. conservé. région hautement recombinante. Il a été montré chez les singes Saimiri.. Ces changements sont accompagnés de modifications des gènes var (Roberts et al. Le premier exon code pour deux à quatre domaines DBL ( Duffy Binding Like). Les molécules PfEMP1 contiennent entre deux et sept domaines DBL et un ou deux domaines CIDR. 1995). et les érythrocytes humains infectés in vitro modifient spontanément leurs formes antigéniques et leurs modalités d’adhérence. 1997 . Malgré leur diversité. γ.

ci-contre) a été pendant des dizaines d’années le moyen de lutte le plus efficace pour enrayer le nombre de morts dus au paludisme. l’ordre et le nombre de domaines DBL n’est pas conservé entre les PfEMP1(cf. Ses avantages étaient multiples : c’était un médicament efficace. fig. fig. La CQR La chloroquine (cf. En revanche. Les protéines recombinantes ne contenant que DBLβ ou C2 ne se lient pas à ICAM-1 (Smith et al. 54 . Le domaine DBL1α est toujours suivi par un domaine CIDR1 et cet arrangement de domaines en tandem a été proposé pour former la structure conservée des molécules PfEMP1. à partir du second domaine DBL.5)(Smith et al. facile à administrer. 4 La résistance à la chloroquine chez Plasmodium falciparum A.DBL de type α :DBL1α.. 2000). Fig. 2000). les effets secondaires étaient limités et le coût de fabrication demeurait raisonnable. 5 : Organisation des différents domaines DBL et CIDR de PfEMP1 La liaison PfEMP1/ICAM-1 a été confirmée : un complexe de domaines DBLβ et C2 est requis pour la liaison avec ICAM-1.

la méfloquine. 2002). qui est le site d’action de la plupart des médicaments anti-paludiques. Les gènes impliqués Sur les quatre espèces de parasites vecteurs de la malaria. PfCRT a pu être localisé sur le chromosome 7 . de CQR (Wellems. car certains croisements donnaient des souches présentant une CQR intermédiaire (cf. 2000). il semble altérer la sensibilité aux autres médicaments anti-paludiques (comme la quinine. le gène PfCRT a été identifié comme étant un gène fortement impliqué dans cette CQR. seul Plasmodium ovale ne présente pas. B. près de la frontière thaïlandaise (Harinasuta et al. la mutation K76T. il crée des changements physiologiques importants comme la modification du gradient des ion H+. les scientifiques ont croisé des souches de Plasmodium d’Indochine présentant une CQR avec des souches du Honduras sensibles à la chloroquine (Rosario. pour le moment. De même.La résistance à la chloroquine (CQR pour ChloroQuine Resistance) est apparue pour la première fois en Asie du Sud-Est. influençant ainsi l’accumulation du médicament et la 55 . 6) Récemment. on trouve 7 ou 8 points de mutations sur ce gène quand on compare les allèles dits sensibles et les allèles résistants. fig. Quand PfCRT est sous sa forme mutée. il mesure 36 kb pour un total de 13 exons. 1981) : ils ont pu démontrer que la CQR était due à des mutations impliquant différents gènes. Depuis. 1962). Dans la vacuole digestive. on a pu observer que les allèles PfCRT-mutants conféraient un phénotype CQR aux souches testées (Bir Singh Sidhu et al. notamment dans le traitement des enfants.. 1976 . elle s’est repartie dans presque toutes les zones où le paludisme est présent (elle a atteint le continent africain en 1970). et qui est localisée sur la membrane de la vacuole digestive. Ce gène code pour une protéine contenant 10 domaines transmenbranaires (Fidock et al. donc du pH.. Mais il semblerait que certaines aient plus d’influence que d’autres. Grâce au clonage positionnel. et pose aujourd’hui un réel problème dans la lutte contre cette maladie. Padua . Quand on croise des souches résistantes avec un panel des souches sensibles du monde entier. qui correspond à une simple substitution Lys76  Thr semble très impliquée dans la CQR. que l’on sait essentielle au mécanisme d’infection. l’artemisine) par des effets directs (impliquant des interactions médicaments-protéines) et des effets indirects sur les processus physiologiques de Plasmodium. dans les années 1950.. Pour mieux comprendre le mécanisme de cette résistance. Ainsi. 2002). tout comme la mutation A220S (Ala220  Ser). De manière générale.

Le problème est cependant que les souches de Plasmodium sont assez difficiles à manipuler in vitro : elles nécessitent une étude préalable de leur génome et du déséquilibre de liaison pour comprendre les loci sélectionnés sous la pression des médicaments. 2002). un analogue de la chloroquine. 1996). Cette forte interaction entre la CQR et le gène PfCRT a permis de mettre au point de nouveaux médicaments expérimentaux comme l’amodiaquine. il faut noter que la mutation du gène PfCRT associée à la CQR n’est pas présente chez Plasmodium vivax. 56 . Une connaissance plus précise de la séquence des gènes (et de leur structure) permettraient sans aucun doute de mieux comprendre le rôle précis des mutations ponctuelles sur PfCRT dans la réponse aux médicaments. 2002). Cependant.formation du complexe avec l’hème (Bir Singh Sidhu et al. ces mutations semblent responsables de la perte d’efficacité du verapamil.. utilisé pour contrer la résistance à la chloroquine. Fig 6 : Dynamique de la résistance à la chloroquine Il est probable que les mutations du gène PfCRT affecte l’efficacité du médicament en altérant son passage au travers de la membrane de la vacuole digestive. qui s’avère relativement efficace sur les souches présentant un niveau élevé de CQR (Olliaro et al. alors que ce dernier peut présenter une certaine résistance à la chloroquine (Wellems.. en agissant au niveau de l’hème. De même.

Dès lors que la résistance à la chloroquine est apparue. Il mesure 30 kb et permet la synthèse d’un polypeptide riche en acide glutamique. comme pfmdr1.. 1997). qui code pour une glycoprotéine-P. l’OMS a pu mieux informer et a rapidement conseillé les populations des traitements conciliant plusieurs antipaludiques. on a pu la suivre sur la 57 . Grâce à toutes ces données. 1042D et 1246Y). 5. de la même manière que pour identifier PfCRT. Pour cela. La protéine correspondante a pu être localisée au microscope électronique à balayage dans les granules du cytoplasme des gamétocytes. 1989). Là encore. il lui faut s’extraire des érythrocytes qu’il a infectés pour libérer le plus de gamètes possible. 2000).Les scientifiques ont découvert d’autres gènes importants. les scientifiques ont utilisé un médicament de remplacement : la sulfadoxine-pyrimethamine (SP). Le gène Pf11-1 : son rôle dans la rupture des GR et dans l’émergence des gamètes L’une des priorités du parasite est de se développer afin de se multiplier le plus rapidement possible dans son hôte.. la SP reste plus longtemps dans les sujets traités. Ensuite. près de la vacuole digestive. afin de limiter les résistances développées par Plasmodium. 2002). contre 8 ou 9 pour la chloroquine. Ils ont ainsi réussi à identifier un gène responsable de l’éclatement du globule rouge et de l’émergence des gamètes dans l’hôte. Il apparaît donc essentiel de mieux connaître également l’histoire phylogénétique de Plasmodium. la sensibilité à la chloroquine diminue de près de 50% (Reed et al. In vitro. localisée elle aussi dans la vacuole digestive (Foote et al. Enfin. ce qui augmente les pressions de sélection liées à la résistance. la mutation 1042D est assez courante dans les souches sud-américaines de Plasmodium mais nul part ailleurs (Su et al.. une résistance est apparue mais en 4 fois moins de temps que pour la chloroquine. Cette phase du cycle de vie de Plasmodium est très étudiée par les scientifiques qui y voient un éventuel point faible qu’ils pourraient utiliser à des fins thérapeutiques.. On voit bien là toute la complexité d’identifier des gènes universellement impliqués dans la résistance aux médicaments. Si ce gène subit 3 mutations précises (désignées 1034C. nommé Pf11-1 code pour une protéine spécifique du gamétocyte. Chose importante. Ce gène. Plusieurs explications à cela : seules 4 mutations du gène cible dhfr sont nécessaires pour obtenir une résistance. la CQR pourrait être liée à d’autres gènes que Pfcrt (Hastings et al. Il a pu être isolé sur des souches mutantes.

II. De nombreuses mesures ont été prises pour tenter de contenir cette maladie et il apparaît aujourd’hui indispensable de bien connaître la mécanisme d’interaction entre le Plasmodium et l’Anophèle. est essentiellement transmis à l’homme grâce au transport du moustique Anopheles gambiae. Plasmodium falciparum subit de fortes pertes à deux niveaux différents : quand les gamétocytes se transforment en oocinètes et quand les sporozoïtes envahissent les glandes salivaires. La progression du développement du parasite 58 . La protéine Msa1. est codée par un gène de 1018 codons. Cependant cette hypothèse doit être confirmée car chez d’autres espèces de Plasmodium avec des génomes aussi riches en A-T. Grâce à l’étude du polymorphisme allélique de ces gènes. En revanche. démontrant ainsi son rôle essentiel dans la rupture de ces derniers . falciparum Plasmodium falciparum. Variation allélique des déterminants antigéniques Le génome de Plasmodium falciparum est caractérisé par un haut niveau de polymorphisme des déterminants antigéniques. ce n’est pas forcément le cas (Rich et al. les scientifiques ont pu mieux comprendre la variabilité importante de ces déterminants. directement liée à la forte sélection de la réponse immunitaire de l’homme. Ainsi. Elles ont divergé il y a environ 35 millions d’années (d’après les alignement de séquence) : cependant. 2002) diminuerait le nombre de substitutions homologues. gambiae au contact de P. 1998). par exemple. le parasite responsable du paludisme. qui sont neutres. qui irait plutôt dans le sens d’une origine commune beaucoup plus récente. comme par exemple pour les gènes qui encodent les protéines de surface du mérozoïte (Msa1 et 2) et du sporozoïte (Csp). 6. comme une hausse de la mortalité. et comprend 2 familles (MAD20 et Wellcome). une fécondité plus faible et une modification du comportement alimentaire de la femelle. La réponse immunitaire de A. il semblerait que le fort taux de bases A et T (82%) du génome du Plasmodium falciparum (Volkman.membrane lésée des globules rouges. L’infection par Plasmodium a des effets physiologiques et comportementaux sur le moustique. Anopheles 1.. on trouve un taux de substitutions homologues quasi nul.

defensin et GNBP) semblent avoir une importance considérable dans la réponse immunitaire du moustique durant le développement du stade sporozoïte de Plasmodium falciparum (Tahar et al. les scientifiques ont pu suivre l’évolution au cours de l’infection de l’activité de ces 3 gènes. 1996). 1997 .. Grâce à la technique de la PCR en temps réel. et qu’ils s’activent transcriptionellement après une infection (Dimopoulos et al. NOS serait plus en relation avec les stades sporogoniques qui seraient capables de limiter son activité dans l’intestin moyen du moustique.. Richman et al. De même. ICHIT) appartiennent au motif de reconnaissance du récepteur (Janeway.. 3 (NOS. IGALE20. Parmi ces 9 gènes. 2000).. 1998). 2002). 1997 . Les gènes impliqués et connus à l’heure actuelle sont au nombre de 9 : . 1989) . les protéines du circumsporozoïte (CS) et les thrombospondin-related adhesion proteins (TRAP) qui sont synthétisées après que les parasite ait atteint les glandes salivaires de son hôte.2 gènes (ISPL5 et Sp22D) codent pour des sérines protéases probablement impliquées dans des réactions en cascade . Il semble probable que de nombreux gènes soient impliqués dans cette réaction. où il pourrait jouer un rôle dans la synthèse de motifs d’adhésion aux substances du parasite.2 autres gènes (SpilA et AglMcr14) codent pour un inhibiteur des sérines protéases ..3-glucan-binding protein. l’activité du gène GNBP augmente dans cette même zone. Il est bon de noter qu’on ne retrouve pas les mêmes gènes impliqués quand Anopheles est infecté par d’autres espèces de Plasmodium. pourrait être impliqué dans la reconnaissance des gamétocytes dans le sang. Oduol et al.les 2 derniers sont la defensin qui code pour un peptide anti-microbien et NOS (nitric oxyde synthase) qui à un rôle de barrière dans l’infection. Les scientifiques se sont donc concentrés sur la réponse immunitaire du moustique qui semble être mise en cause dans ces pertes.. et dans le remodelage des tissus au cours de son développement (Dimopoulos et al. Connaître et comprendre les réponses de ces gènes à la suite d’une infection par Plasmodium falciparum sont essentielles afin de mieux apprécier la compétence vectorielle du moustique et ainsi mieux lutter contre le fléau de la malaria (Dimopoulos et al. Le gène defensin. dont l’activité se trouve augmentée après infection dans les corps gras (source importante de réponse immunitaire chez les insectes).dans le moustique peut être suivie par le taux de transcription des protéines de surface de Plasmodium. 59 .3 (GNBP : β1.

et l’éradication de la maladie dans certaines zones ont provoqué l’arrêt de la campagne de la lutte 60 .Les scientifiques ont également recherché des QTLs (Quantitative Trait Loci) qui pourraient être impliqués dans l’encapsulation des parasites par le moustique. localisés sur le chromosome 2) et un QTL mineur (Pen2. localisé sur le chromosome 3) (cf. a la capacité de tuer le parasite dans son intestin moyen en l’entourant d’une capsule riche en mélanine. La résistance d’Anopheles gambiae aux insecticides L’introduction du DDT pour contrôler le moustique vecteur du paludisme. qui provoquerait la sécrétion de ces capsules de mélanines (Zheng et al. 7 : Les 3 QTLs (marqués ∗ ) impliqués dans l’encapsulation du parasite par le moustique Ces gènes seraient corrélés avec la réponse du moustique due à la présence du parasite dans son intestin moyen. en effet. en tant que réaction de défense. 2.. les biologistes ont pu détecter 2 QTL majeurs (Pen1 et Pen3. La compréhension de tels mécanismes au niveau génétique pourrait permettre de trouver de nouveaux moyens de lutte. Fig. 1997). Ainsi. L’Anopheles. fig. 7).

Cependant. De même. les scientifiques utilisent de plus en plus la technique des puces à ADN et la biologie moléculaire pour définir les mécanismes qui permettent à Anopheles gambiae de résister à l’infection par le Plasmodium falciparum (Hemingway et al. grâce à cette cartographie de QTLs. Par exemple. qui semblent responsables de la résistance métabolique aux insecticides. Il est relativement aisé pour les scientifiques de détecter les phénotypes résistants chez ces insectes. car Anopheles gambiae présente de multiples types de résistance au DDT et aux pyréthroïdes. dans les conditions normales. la notion d’éradication fut délaissée au profit de l’idée d’un contrôle de la malaria. Les biologistes ont fait ainsi des analyses du génome du moustique.par l’OMS dans les années 1960.. 61 . Ainsi. on ne connaît pas bien à l’heure actuelle les mécanismes moléculaires directement responsables de cette résistance aux insecticides. ils ne savent pas encore si tous les membres de ces familles de gènes sont impliqués dans la résistance (Ranson et al. peuvent considérablement influencer la résistance du moustique aux traitements. quand ils survivent à une dose d’insecticide qui. La résistance aux insecticides peut également résulter de changements dans les molécules en interaction directe avec le DDT par exemple. et dans les acétylcholinesterases. Quelques temps plus tard. toute la régulation moléculaire de cette résistance est mal comprise.. glutathiones transférases et cytochromes P450 . Enfin. 2002). 2002). à l’heure actuelle. notamment sur 3 familles de supergènes . selon les régions du globe où le paludisme sévit (Hemingway et al. 2002).. Mieux comprendre ces mécanismes au niveau génétique permettra sûrement une lutte plus efficace contre la maladie. où agissent les insecticides les plus utilisés.carboxylesterases. auraient du les tuer.. En effet. principalement à cause de la nouvelle résistance des moustiques aux insecticides du type DDT. on peut définir les gènes de régulations qui contrôlent l’expression des glutathiones transférases. des mutations dans les canaux Na+. Cependant. les chercheurs ont pu découvrir grâce à une analyse de QTLs qu’une région du chromosome polytène d’Anopheles gambiae portait le régulateur de l’expression du gène codant pour P450. qui s’avère être un énorme problème dans la lutte contre la maladie.

SEQUENCAGE DU PLASMODIUM ET D’ANOPHELE

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I. Généralités sur le séquençage de l’ADN
1. Définition Le séquençage consiste à déterminer la succession de nucléotides d’ADN, de préciser l’ordre des bases azotées et de donner des informations sur les gènes (Le maxidico, éditions de la connaissance, 1996). 2. Principe de base du séquençage Le principe utilisé repose sur la méthode de Sanger qui consiste à synthétiser toutes les copies partielles intermédiaires possibles de la molécule d’ADN. Cette synthèse est réalisée à l’aide d’un composé chimique fluorescent qui provoque l’interruption au hasard, mais systématique de cette synthèse à la suite de l’un des 4 nucléotides A, T, G ou C. On fait donc en parallèle 4 séries de copies. Dans chaque série, toutes les copies sont interrompues derrière un seul type de nucléotide. La dernière étape consiste à séparer les copies selon leur taille par une migration éléctrophorétique sur gel poreux. Ces gels permettent de séparer deux intermédiaires consécutifs qui ont une différence de taille d’un seul nucléotide. Il devient alors facile de reconstituer la succession de nucléotides tout au long de la séquence(cf. fig. 1).

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Fig. 1 : METHODE DE SANGER (Bernot, 2001)

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3. Ce n’est que récemment. et à la nécessité de les localiser sur le génome dans une perspective de clonage positionnel (localisation de gènes responsables de maladies génétiques). Le séquençage à grande échelle : 1ère approche La reconnaissance de l’ADN comme support de l’information génétique a donné naissance à de nombreux projets de séquençage total de génomes. 4. de les localiser dans le génome et surtout de connaître leur fonction (génomique fonctionnelle). Un tel rêve est longtemps resté inaccessible pour des raisons technologiques et financières. au Japon. en France. 65 . Les ambitions des différents programmes sont variables car l’aspect financier reste le moteur de ce genre d’entreprise. Le but de ces programmes est de pouvoir identifier les gènes. un nouveau plan de 5 ans est redéfini. Le but est de connaître l’enchaînement complet des bases nucléotidiques de la molécule d’ADN d’un organisme ce qui théoriquement donne accès à toute l’information nécessaire à la vie. d’améliorer les performances du séquençage automatique. En 1993. les objectifs à atteindre dont les principaux étaient d’établir des cartes génétiques et physiques précises du génome humain. Ce genre de programme Génome s’est par la suite multiplié dans de nombreux pays et principalement en Angleterre. Historique du séquençage Le programme Genome humain est né en 1990 sous la tutelle du DOE (Department of Energy) et du NIH (National Institutes of Health). en Allemagne et en Chine. afin d’affiner les buts à atteindre en fonction des réalisations déjà accomplies et un nouvel objectif voit le jour : identifier le plus grand nombre de gènes possible. Ces programmes Génome ont également amplifié la concurrence entre le secteur public. Généthon par exemple en France. Centre d’étude du polymorphisme humain ou CEPH. L’incorporation de cet objectif supplémentaire était due aux succès remportés par les programmes de séquençage intensif d’ADN complémentaire (ADNc). Sanger Center aux USA). avec la mise en place des programmes Génome. qui a ainsi multiplié les grands centres de recherche (Genoscope. de séquencer le génome d’espèces modèles afin d’évaluer les difficultés de cette opération et de mettre au point les outils informatiques permettant de traiter. que des génomes entiers ont pu être totalement décryptés. archiver et communiquer l’ensemble des données ainsi produites. dans un plan de 5 ans. Il définissait.

L’informatique joue un rôle essentiel dans les recherches sur les génomes car ces dernières fournissent une grande quantité d’informations très complexes. de leur archivage et de leur distribution. Ils ont donc débloqué des moyens considérables pour créer des centres de recherches très compétitifs (TIGR.et le secteur privé (en particulier les firmes pharmaceutiques) attiré par les alléchantes retombées financières promises par ces recherches. Celera ou Incyte). L’outil technologique : une révolution pour les programmes Génome Le séquençage à grande échelle n’aurait jamais vu le jour sans le développement incroyable des techniques d’informatique et de robotique de ces dernières années. Les séquenceurs automatiques réalisent deux opérations : la lecture de la séquence et son assemblage. Pour reconstituer la séquence initiale. Les molécules d’ADN à séquencer étant beaucoup trop longues. les lectures doivent en effet être ordonnées les unes par rapport aux autres par la mise en évidence de recouvrements (extrémités chevauchantes). Ces centres de recherche ont reçu la dénomination de Genome Center. de leur exploitation. Au début des programmes Génome. l’essentiel de la séquence était obtenue manuellement. En effet. c’est-à-dire des régions terminales présentant un enchaînement nucléotidique identique (aux erreurs de séquençage prés). Mais au fil du temps et des avancées de la robotique. Par recouvrements successifs de l’ensemble des contigs. on obtient une séquence unique appelée séquence consensus. ceux-ci sont équipés d’un système optique qui balaye le bas du gel d’électrophorèse. La bioinformatique permet aux grands centres de recherches de mettre les résultats obtenus à la disposition de toute la communauté scientifique par l’intermédiaire d’un serveur qui peut ainsi accéder facilement et rapidement à une base de données. Ainsi. Le signal obtenu est interprété par un programme informatique qui reconstitue la séquence originale du fragment d’ADN analysé. Une « contig » désigne deux ou plusieurs fragments chevauchants. ils peuvent déterminer l’enchaînement de 500 à 1 000 nucléotides. L’outil informatique entre en jeu lors de l’acquisition automatique des données. A. Les taches répétitives de la technique du séquençage intensif ont engendré la mise au point de robots et de machines toujours plus puissantes et plus rapides. il est nécessaire de réaliser des lectures redondantes qu’il faut ensuite raccorder les unes aux autres. Outre des erreurs ponctuelles (délétion ou substitution de 66 . L’assemblage est la dernière étape et c’est ici qu’intervient la bioinformatique. les séquenceurs automatiques et les robots ont remplacé de plus en plus l’être humain représentant un gain de temps considérable.

de l’Europe et du Canada). De plus. des erreurs dans l’ordre des sous-séquences restent possibles. B. En raison de cette taille et de la complexité des génomes. C. La rentabilité est donc optimale et les erreurs susceptibles d’être introduites par une intervention humaine minimisées (précision augmentée). Chaque fragment est inséré dans un vecteur qui est propagé dans une cellule hôte afin d’être maintenu et répliqué.base). chaque région étant allouée à un laboratoire qui aura pour tâche de la séquencer. comme les séquences répétées. Tout d’abord. Un vecteur contient l’ensemble des séquences permettant son maintien et sa ségrégation dans un micro-organisme. De multiples laboratoires pourront donc obtenir le mérite d’avoir pris part au séquençage d’un organisme. sont plus délicates à séquencer et l’obtention d’une séquence couvrant entièrement le génome est très coûteuse. Les stratégies Deux stratégies sont apparues comme étant bien adaptées à un séquençage de grande ampleur. leur étude débute toujours par la digestion de la molécule d’ADN par des enzymes de restriction. C’est pour ces raisons que l’on qualifie de « brouillon » (ou Working Draft) certains génomes en voie d’achèvement de séquençage. Cette stratégie a permis d’obtenir la séquence complète de génomes bactériens (TIGR) mais aussi la séquence de Drosophila melanogaster (Celera avec l’aide de l’Université de Berkeley. certaines portions de l’ADN. Pour citer quelques exemples de cette avancée technologique. Le taux d’erreurs peut approcher les 1%. le génome peut être découpé en régions. La seconde option consiste à séquencer le génome presque entièrement dans les Genome Centers où toutes les étapes sont réalisées sur une grande échelle de production. Les nouveaux outils moléculaires à la base du séquençage  Construction d’une banque de clones Les génomes des organismes vivants ont des tailles considérables allant d’une centaine de millions à plusieurs milliards de nucléotides. La culture de ces cellules. Les fragments obtenus après digestion sont ensuite clonés dans des constructions moléculaires ou vecteurs de clonage. le Genomatron du Whitehead Institute/Massachussets Institute of Technology (WI/MIT) effectue et analyse simultanément 150 000 PCR et les machines du Généthon sont capables d’effectuer 16 Southern Blot automatiquement. permettent de produire des quantités quasi67 . et la purification ultérieure du vecteur.

fig. les chromosomes artificiels de bactéries ou BAC.illimitées de fragments d’ADN clonés. 2001) Toutes les banques d’ADN génomique constituent un véritable « conservatoire » de la collection des fragments génomiques de toutes les espèces dont le génome est séquencé ou doit être séquencé. Ces banques dites « de référence » peuvent ensuite être dupliquées et distribuées à de nombreux laboratoires. En effet. les chromosomes artificiels dérivés du phage P1 ou PAC ou encore les chromosomes artificiels de levure ou YAC. Ces banques facilitent l’identification des fragments clonés qui sont plus aisément manipulables qu’une longue molécule d’ADN. Le choix du vecteur de clonage se fait en fonction du fragment d’ADN qui sera inséré.2 : Construction d’une banque d’ADN (Bernot. les cosmides. chaque vecteur peut recevoir une quantité limitée de nucléotides : jusqu’à 45Kb pour les cosmides. Fig. 2). Il existe de nombreux vecteurs de clonage comme les plasmides bactériens. ce qui peut être très utile pour le partage du travail de séquençage entre plusieurs équipes de chercheurs. de 68 . L’ensemble des cellules représente la banque d’ADN génomique (cf.

3) seront les vecteurs de clonage utilisés préférentiellement (en ce qui concerne les génomes eucaryotes très longs). Les YAC présentent quelques inconvénients : les fragments insérés subissent parfois des réarrangements (insertions. chimérismes. les YAC (cf. La carte physique est l’ordonnancement de fragments clonés chevauchants reconstituant la molécule d’ADN de départ. Une fois la banque 69 . délétions). l’ensemble minimal de fragments assurant la couverture complète du génome à séquencer est déterminé à partir de cette carte.  Les cartes physiques et génétiques Le passage par une carte physique précise est obligatoire pour le séquençage intégral d’un « gros » génome.100 à 200Kb pour les BAC et environ 1Mb pour les YAC. Pour les programmes Genome impliquant de grands fragments. En effet. 2001). les distances correspondent à des mesures absolues (en paire de bases) matérialisant les distances physiques mesurables le long des chromosomes. Dans une carte physique. fig. 3 : Clonage dans des vecteurs YAC (Bernot. Fig. L’établissement de cette carte physique passe par la construction d’une banque d’ADN représentative du génome comme décrite auparavant. et ils ne peuvent pas être considérés comme absolument représentatifs de la région dont ils dérivent.

que la position par rapport au chromosome dont il dérive soit déterminée ( principalement par la technique FISH ou Fluorescent In Situ Hybridization qui consiste à marquer le fragment et à l’hybrider à l’ensemble des chromosomes). il faut ordonner chaque clone. par hybridation ou encore par l’utilisation de STS (Sequence-Tagged Site). 4 : Cartographie par empreinte de restriction Le STS est une courte séquence représentée de façon unique dans le génome et facilement amplifiable par PCR. Fig. 4). Ainsi. L’ordonnancement est complexe car il suppose que chaque clone soit individuellement identifié. Il s’agit donc d’un marqueur de choix pour la cartographie physique.formée. Sur cette figure. on peut voir la carte de restriction de plusieurs individus (A) et leur comparaison sur la base de leur chevauchement (B). fig. 2 clones se chevauchant présenteront des empreintes de restriction proches et une sonde dérivée de l’un des clones s’hybridera sur l’autre (cf. il est établi à partir de données de recouvrement entre clones pris deux à deux par l’étude de leurs empreintes de restriction. L’ordonnancement des clones en fonction de la taille du génome étudié Pour les petits génomes. ainsi que sa position par rapport aux autres clones de la banque. La cartographie par STS consiste à faire un criblage de la banque de clones par PCR et d’identifier les clones présentant un même STS permettant la construction de groupes de 70 .

ou par un contenu commun en marqueur. permet d’intégrer la carte physique à la carte génétique.L’approche génome entier n’a été rendue possible qu’avec l’avènement du système de clonage en YAC et sa capacité à intégrer de longs fragments d’ADN. Une fois établies. La voie top-down se sert des données des cartes de liaison. 5). Ces cartes génétiques sont construites à partir de marqueurs correspondant le plus souvent à des courts fragments d’ADN (marqueurs) définissant chacun un locus unique.L’approche chromosome spécifique consiste à séparer les chromosomes par électrophorèse et à ordonner les clones recouvrant chaque chromosome à l’aide des techniques présentées ci-dessus. sous forme d’amorces oligonucléotidiques qui le définissent. dans ce dernier cas. Concernant les grands génomes. Les marqueurs ordonnés sur ces cartes sont utilisés pour identifier les clones qui les contiennent et qui sont cartographiés physiquement. Ces clones sont identifiés par criblage de banque. Ce système présente le gros avantage d’être facilement transposable d’un laboratoire à l’autre puisqu’il peut être archivé ou communiqué par moyens informatiques. Le STS n’a pas de fonction biologique en tant que tel mais certains d’entre eux correspondent à des EST (séquences codantes) ou à des marqueurs microsatellites ce qui. . par hybridation réciproque. . 71 . La voie bottom-up utilise des données de recouvrement local pouvant être détectées par comparaison des profils de restriction. on distingue deux stratégies. Ceci permet d’identifier des groupes de chevauchements qui dans certains cas peuvent se rejoindre assurant ainsi une couverture croissante du génome (cf.chevauchements. L’ordonnancement des clones par cette approche est obtenu par 2 voies complémentaires qualifiées de top-down et bottom-up. Ces deux stratégies aboutissent à 2 cartes physiques différentes : une carte globale et des cartes chromosome-spécifique. fig. Ces cartes indiquent les positions relatives des marqueurs les uns par rapport aux autres par l’analyse de leur ségrégation au cours des générations. Ils permettent d’uniformiser et d’intégrer les résultats d’autres laboratoires. elles servent de référence pour localiser tout autre marqueur ou gène dans le génome.

2001) 72 . par marche avec des oligonucléotides spécifiques. 6). En effet. mais plus s’accroît la redondance. à partir d’un certain seuil. Fig. fig. Plus le nombre de clones séquencés augmente. plus le recouvrement de la région s’étend. 5 : Construction de cartes physiques : la voie top-down est représentée par les fléches descendantes et la voie bottom-up par les fléches ascendantes. 6 : Séquençage dirigé réalisé pour combler les éventuelles lacunes (Bernot. Les cercles pleins sont des marqueurs localisées sur une carte de liaison (Bernot.Fig. PCR ou production de délétions (cf. Chaque clone est ensuite sous-cloné en fragments de petite taille dans un nouveau vecteur et un premier ensemble de séquences est obtenu sur un échantillon pris au hasard de ces sous-clones (shotgun). 2001) Le séquençage La carte physique permet de choisir un ensemble minimal de clones d’ADN génomique de grande taille recouvrant la région à séquencer. il devient plus économique de combler les lacunes par séquençage dirigé qui peut être mené par sous-clonage.

ou par séquençage direct 73 . fig. La première phase implique la création de banques d’ADN complet de l’organisme comme vu précédemment. Enfin. Le séquençage spécifique des dernières lacunes est obtenu par PCR. on créée une sonde de son extrémité qui servira à son tour de marqueur pour cribler la banque (cf. 2001)  Récapitulation des outils nécessaires dans la technique du « Séquençage aléatoire global » La technique « Shotgun sequencing » comporte plusieurs étapes. Ce marqueur permet la réalisation d’un criblage de la banque de clone pour identifier les clones le possédant. 7 : Technique de marche sur le chromosome (Bernot. on peut envisager la technique de marche sur le chromosome débutant par la définition d’un marqueur génétique. Après isolement d’un clone présentant un fragment avec la séquence du marqueur au début de sa séquence. La seconde phase consiste à utiliser des machines de séquençage à vitesse rapide pour séquencer des petits fragments échantillonnés au hasard dans l’ensemble du génome.Pour séquencer une région précise du génome. à partir de nouvelles banques. 7). les fragments séquencés sont assemblés (ordonnés) en contigs sur la base de leurs chevauchements par l’application d’algorithmes mathématiques sophistiqués. Fig.

du génome. La séquence de nombreux autres pathogènes ont rapidement été publiées par la suite comme des espèces du genre Chlamydia. et la présence de régions intergéniques parfois très vastes. 5. et par la possibilité de reconnaître relativement aisément les phases ouvertes de lecture. Chez les procaryotes. Le premier génome entièrement séquencé d’un être vivant a été publié en 1995 par le TIGR. La priorité a essentiellement concerné les pathogènes de l’Homme. Il s’agit de Haemophilus influenzae. Cette technique nécessite un très important et très complexe effort informatique pour l’assemblage final des séquences. puisque le génome de levure Saccharomyces cerevisiae est le premier à avoir été séquencé en octobre 1996 . Deux caractéristiques compliquent cette identification chez les eucaryotes que sont le découpage en introns et exons. de signaux d’épissage et la composition en bases. les promoteurs et les terminaisons des gènes. ce fut au tour d’Arabidopsis thaliana. Une similarité entre une séquence génomique et une séquence d’ADNc 74 . L’après séquençage : l’identification des gènes Le problème crucial de l’analyse de séquences génomiques est l’identification des séquences codantes. Certains logiciels architecturés en réseau neuronal intègrent ces paramètres afin d’optimiser la probabilité de reconnaître un gène. bactérie responsable des bronchites et des otites chez l’Homme. Mais ce type de logiciel est encore loin d’être infaillible et un autre moyen de savoir si une séquence est codante est de la comparer aux bases de données d’ADNc. Puis. puisque la moitié de nos maladies est d’origine bactérienne. Quelques exemples d’organismes séquencés Le séquençage de génome s’est d’abord orienté vers les procaryotes pathogènes car la taille du génome des procaryotes est beaucoup plus faible que celle des eucaryotes. cette identification est grandement facilitée par la quasi-absence de séquences non codantes. ne sont pas restées des inconnues au plan génétique très longtemps. L’identification des unités transcriptionnelles reste possible grâce à des outils informatiques capables d’identifier un gène sur plusieurs critères : la présence d’une phase ouverte de lecture. Mycoplasma ou encore Mycobacterium. Les espèces eucaryotes modèles. 6. c’est-à-dire les organismes présentant plusieurs caractéristiques intéressantes du point de vue expérimental. Caenorhabditis elegans et Drosophila melanogaster de nous faire part de leurs secrets.

L’analyse protéomique ne permet pas de détecter des mutations ponctuelles. La protéomique est donc d’une première importance et elle permet de vérifier qu’une séquence prédite comme étant codante est effectivement traduite et présente parmi les protéines de l’organisme. 75 . Cette approche n’est cependant pas totalement fiable et une confirmation expérimentale est à réaliser. a permis le lancement d’un programme Genome d’envergure. des délétions mineures et des insertions. Toutefois. II. La fonction de la protéine produite par un gène donné peut être proposée à partir de son éventuelle homologie de séquence avec un autre gène dont la fonction est connue. le niveau d’expression des protéines n’est pas prédictible à partir du niveau d’expression des ARNm et les ARNm peuvent présenter une grande diversité. Les intérêts de l’analyse du protéome par rapport à ceux de l’analyse du génome et du transcriptome sont les suivantes : un même génome peut donner naissance à beaucoup de protéomes différents. les techniques actuelles ne permettent pas d’étudier précisément les protéines. Le Protéome Ce terme désigne l’ensemble des protéines exprimées par une cellule ou un tissu à un instant donné. les protéines faiblement exprimées sont difficilement détectables. 7. Les interactions protéiques peuvent dans une certaine mesure être prédites en comparant l’organisation du génome entre diverses espèces. Le séquençage d’Anopheles gambiae et de Plasmodium falciparum L’apport de nouveaux outils techniques et la multiplication des échecs des différents traitements médicaux. le moustique Anopheles gambiae (vecteur) et Homo sapiens. Il est également difficile de prédire à partir d’ADN ou d’ADNc. les protéines peuvent être traduites à partir de différents codons d’initiation et son fréquemment modifiées après traduction. Effectivement on ne possède pas d’enzymes capables d’amplifier les protéines. en raison de l’utilisation de promoteurs distincts ou d’épissages alternatifs. De plus. dans quelles conditions un gène est transcrit et traduit c’est-à-dire à quel stade de développement et dans quel tissu.permet de conclure que cette séquence est transcrite. consistant à séquencer l’ensemble des génomes des partenaires de la triade intervenant dans le paludisme soit : Plasmodium falciparum (parasite).

B. Des relations entre les 3 acteurs de la maladie. ou encore dans sa résistance aux insecticides. Leur étude pourrait révéler des voies nouvelles pour inhiber le développement du parasite chez le 76 . Le lancement de ce programme a été décidé dans le but de fournir une masse de nouvelles informations. cette recherche ne s’est pas encore traduite par des avancées décisives dans la mise au point d’un vaccin. la plus étudiée est l’interaction entre Plasmodium et l’être humain infecté. Avec le développement des outils moléculaires et technologiques appliqués à la recherche biomédicale.pasteur.1. avec un accent particulier sur sa biologie moléculaire. mais aussi de prendre pour cible une nouvelle étape du cycle de vie de Plasmodium. http://www. BBMI. Historique L’Initiative Multilatérale de Lutte contre le Paludisme (Multilateral Initiative on Malaria) a été lancée début 1997 dans le but d’intensifier l’effort de recherche et d’y promouvoir coopérations et coordinations. les interactions entre le parasite et l’insecte restent peu explorées. Ainsi. rendront possible la progression dans la compréhension des interactions hôte/parasite et devraient à terme permettre de nouvelles approches de prévention et de traitement du paludisme. Une meilleure connaissance de l’anophèle permettrait de mieux le combattre. qui couplées à celles obtenues par le séquençage de Plasmodium falciparum. reste un travail fastidieux par les méthodes génétiques classiques. dans son attirance pour l’Homme. A cette époque. Séquençage d’Anopheles gambiae A. la plupart des études étaient centrées sur le parasite lui-même et/ou sur ses interactions avec l’hôte humain. les études génomiques qui débutaient à cette époque s’inscrivaient dans l’objectif général du contrôle de la transmission de la maladie par ce moustique (Roth. Dès son lancement. les succès les plus nets dans la lutte contre le paludisme ont correspondu au contrôle du vecteur et non du parasite. un réseau international pour le séquençage du moustique Anopheles gambiae fut mis en place en avril 2001. En effet. Or. Institut Pasteur. En revanche.fr). Intérêt du projet génome Anophèle L’identification des gènes impliqués dans l’immunité du moustique vis-à-vis des parasites du paludisme. La prise de conscience de cette réalité a conduit à de nouvelles recherches sur la biologie du vecteur. le NIH et l’OMS ont augmenté le financement de la recherche sur le paludisme.

qui s’impose comme un des moyens les plus sûrs pour lutter contre la maladie (http://www. le réseau ONSA (Brésil) et des scientifiques spécialistes du moustique Anophèle. France). Début du séquençage : Sequence Tag Connectors et premiers résultats Le premier travail d’envergure sur l’anophèle a débuté au Génoscope en 1998 en collaboration avec l’unité de biochimie et de biologie moléculaire des insectes de l’Institut Pasteur. associées à la recherche sur le terrain. Les acteurs du réseau international Ce réseau associe l’Institut Pasteur (France). D. on connaissait peu de chose sur le génome de ce moustique et seuls 250 Kb de 77 . Le but est au final de pouvoir ainsi contrôler l’exposition humaine aux moustiques anophèles. l’Institute of Molecular Biology and Biotechnology (IMBB. Celera Genomics (USA). Avant ce projet.fr). devraient aboutir au contrôle de la transmission du paludisme. Enfin. Suisse) géré par le PNUD.cns. Gréce). La banque d’ADN obtenue contenait 12 000 clones BAC représentant cinq fois le génome d’Anopheles gambiae.genscope. Allemagne). plus de 22 000 lectures d’extrémités de BAC ont été effectuées en un peu plus d’un an soit environ 15 Mb. l’European Molecular Biology Laboratory (EMBL. USA). les interactions entre le moustique et l’Homme comme l’attirance du moustique femelle pour l’être humain sont fondées sur des récepteurs olfactifs et gustatifs pour lesquels il serait intéressant de découvrir les gènes : cela pourrait permettre la mise au point de nouveaux répulsifs ou au contraire d’attractifs utilisables dans des piéges à odeurs (http://www. l’Université de Notre-Dame (USA). Ainsi. Ce réseau est placé sous le patronage du Programme spécial de recherche et de développement concernant les maladies tropicales (TDR. Ces fragments avaient déjà été clonés dans des BAC par une équipe américaine dirigée par Frank Collins à l’université Notre Dame. Le séquençage représente le moyen le plus rapide pour obtenir les informations nécessaires sur les gènes de l’anophèle et qui.fr). Celle-ci fut dupliquée aux EtatsUnis et en Europe afin que le séquençage se fasse plus rapidement.moustique et sa transmission à l’Homme. The Institute for Genomic Research (TIGR. le Centre National de Séquençage (Genoscope.pasteur.forumlabo.com). C. Le but de ce travail était de séquencer les extrémités de grands fragments d’une taille moyenne de 110 Kb de l’ensemble du génome de l’anophèle qui présente une longueur de 280 Mb. la Banque mondiale et l’OMS (http://www.

De nombreux éléments transposables ont également été repérés et de nouvelles familles de ces éléments ont pu être définies.fr). http://www. Ces séquences d’extrémités de BAC constituaient également une ressource pour le séquençage du génome entier. tout comme la distance qui les sépare (taille de l’insert dans le BAC). Premiers résultats obtenus avec cette première étude Diverses donnés génomiques furent obtenues grâce au travail réalisé au Génoscope. Plus de 1 000 régions polymorphes microsatellites constituant de remarquables marqueurs génétiques ont été repertoriés.pasteur.genoscope.fr . Ce premier travail donnait un aperçu à grande échelle du génome du moustique (http://www. Cette pauvreté en marqueurs rendait à priori difficile l’établissement de larges zones de plasmides contigus nécessaires pour des projets de cartographie à grande échelle. Après séquençage d’un premier clone.fr). Séquençage d’Anopheles gambiae  Choix de la souche 78 . Ces derniers sont utiles pour la recherche de gènes et pour l’étude de la diversité des populations naturelles (http://www. Désignées dans ce contexte sous le nom de Sequence Tag Connectors ou STC.sa séquence génomique étaient connus. elles permettent d’établir des connections à grande échelle : l’orientation respective des deux séquences d’extrémités d’une paire est en effet connue.genoscope. L’annotation des séquences lues au hasard dans le génome a révélé les séquences partielles de plus de 1 000 nouveaux gènes. Toutefois. Une raison importante qui a déterminé la mise en route de ce projet de séquençage des extrémités d’inserts d’anophèle est le petit nombre de marqueurs alors disponibles sur l’ensemble des trois chromosomes du moustique.genoscope.cns.cns. E. une autre stratégie à été adoptée par le consortium international pour le séquençage total du génome (http://www.cns. F.fr). il est possible de repérer les clones voisins les moins chevauchants en comparant la séquence du premier clone avec celles des extrémités des autres clones de la banque (voir technique de marche sur le chromosome décrite auparavant). Ces STC constituent une base de données qui peut permettre le séquençage à grande échelle sans passer par le long travail de création de contigs de clones et de cartographie de ces clones pour pouvoir les séquencer.

tous les individus de la colonie ont un arrangement chromosomique standard sans aucun polymorphisme d’inversion paracentrique typique des souches sauvages et d’autres colonies. de nombreuses banques possédant chaque classe de taille d’insert ont été effectuées.5. cette souche d’anophèle a été produite par croisement de moustiques collectés en Afrique de l’Est et d’une souche de laboratoire porteuse d’une mutation œil rose utile pour détecter les moustiques contaminants. Le séquençage a été réalisé en collaboration par Celera Genomics.cns/externe/Français/Projets/Projet_AK/AK. 79 . http://www.. 10. le Genoscope et TIGR. Les banques contenant des inserts de 2. Le principe est de séquencer des petits fragments échantillonnés au hasard dans l’ensemble du génome.cns. puis d’assembler ces lectures en « contigs » sur la base de leurs chevauchements (http://www. La taille de l’insert était strictement sélectionné.fr).genoscope. De plus.  Le séquençage et les résultats obtenus Le séquençage et l’assemblage La firme américaine Celera Genomics. principal acteur du consortium constitué en 2001 a appliqué sa stratégie du séquençage aléatoire global pour séquencer les 260 millions paires de bases de l’anophèle (Whole Genome Shotgun ou WGS). Deux banques d’ADN ont été construites. Ces dernières ont été séquencées de telle sorte que les mâles et les femelles participent de façon équitable aux données finales (Holt et al.genoscope. Pour chaque sexe. Les données obtenues ont été réunies et assemblées par des algorithmes mathématiques sophistiqués sur Compaq dans le système de Celera. 2002 . et 50Kb ont été construites à partir de 330 mâles et 430 femelles.. Le fait de partir d’une souche non pure mais d’une espèce de terrain fortement polymorphe constituait une nouveauté et une difficulté (Holt et al. 2002). Enfin.  Construction des banques d’ADN Des banques ont été réalisés dans des plasmides bactériens et dans des BAC.html). la première (ND-TAM) contenait des inserts provenant à la fois de génome de mâles et de femelles adultes et la seconde (ND-1) comprenait des fragments d’ADN d’ovaires collectés sur des femelles PEST 24 heures après le repas sanguin.La souche PEST d’Anopheles gambiae a été choisie pour ce projet de séquençage car les STC de clones appartenant à deux banques d’ADN de souche PEST étaient déjà séquencés et cartographiés physiquement sur les chromosomes.

La plus grande ossature a une longueur de 23.Les STC du Genoscope et du TIGR ont servi à jeter des ponts à grande échelle entre les contigs (cf. L’annotation contenant le plus grand nombre d’exons pour représenter chaque gène a été choisie. problèmes dans la 80 . Ces éléments transposables putatifs et les contaminants bactériens ont été repérés avant de transmettre l’annotation à GenBank. Fig.genoscope. Ces 303 grandes ossatures représentent 91% du génome et les 9% restant sont constitués de 8 000 petites ossatures soit environ 9 000 ossatures au total. 8). L’ordonnancement des ossatures sur les chromosomes d’anophèle a été effectué à l’aide d’une carte physique construite par hybridation in situ des BAC avec les chromosomes polytènes de glandes salivaires. seuls 35 étaient prédits correctement. tous les autres présentaient des erreurs (manque de codons.cns.8Mb de long. fusion de plusieurs gènes.fr). fig. Ces gènes ont été exclus lors de l’analyse du génome quand c’était nécessaire. 84% du génome a ainsi été assigné à une région chromosomique (http://www. On a ainsi pu regrouper les 19 000 contigs en 303 grandes « ossatures » (Scaffold).1Mb et le plus grand contig fait 0. 8 : Assemblage de séquences en contigs et des contigs en ossatures lors du séquençage par la méthode « shotgun » L’annotation La délimitation et la caractérisation des gènes a été entreprise par Celera et le groupe de Bioinformatique européen Ensembl en combinant la recherche par homologie et la prédiction par des algorithmes. Par cette méthode. Un passage au crible de toutes les annotations a permis de déterminer le nombre de gènes putatifs codant pour des éléments transposables et pour des contaminants bactériens (contamination des banques génomique par des bactéries de l’intestin de l’anophèle). La qualité de l’annotation générale a été vérifiée par échantillonnage au hasard de 100 annotations de gènes dont on a évalué la pertinence de leur prédiction manuellement. Sur ces 100 gènes putatifs.

et d’autres encore. qui est en outre l’objet d’études génétiques depuis près d’une centaine d’années a été un atout considérable pour caractériser les gènes. Ceux-ci se retrouvent surtout dans la région hétérochromatique. on est passé.cns.cns. L’identification de récepteurs gustatifs pourrait par ailleurs éclairer la façon dont le moustique identifie son hôte. 2002). les répétitions sont denses près des centromères et faibles au milieu des bras chromosomiques. grâce à la séquence du génome à une cinquantaine. etc. La mise au point de puces à ADN des séquences des gènes de l’anophèle permettra d’étudier plus précisément leur expression (http://www. 2002). La densité en transposons est la plus forte sur le chromosome X (Holt et al. on parle de prédiction négative-fausse (Holt et al.fr).fr). Au niveau de l’euchromatine. dont un millier sont suspects à divers titres. L’estimation du nombre de gènes « oubliés » par les automates a été faite et on a découvert environ 1 000 nouveaux gènes. ce qui pourrait refléter le style de vie plus exposé de l’anophèle. On s’est également intéressé aux gènes activés ou réprimés lors des repas de sang du moustique. De nombreux types de transposons ont été identifiés dans le génome dont les plus représentés sont les LTR. citons la découverte d’une vingtaine de nouveaux membres d’une famille de récepteurs olfactifs.). Ces gènes. les SINEs et les MITEs. et constituer ainsi des cibles pour bloquer le développement du parasite dans l’insecte. Parmi les premiers enseignements de l’exploration du génome de l’anophèle. la drosophile. pourraient intervenir dans la réponse du moustique à l’infection par Plasmodium. Résultats et perspectives Le fait de disposer de la séquence génomique d’un autre insecte diptère. Citons encore les transporteurs ABC.. on en connaissait seulement une dizaine (http://www. De 4 gènes connus. non retrouvés chez la drosophile. Dans ce cas.. Ce pourrait être un point de départ pour comprendre les signaux qui guident le moustique femelle vers l’Homme. Environ 25 000 transcrits ont été trouvés et plus de 15 000 gènes d’anophèle ont ainsi été définis. Ce sont donc environ 14 000 gènes putatifs qui sont livrés à la curiosité des spécialistes du moustique depuis mars 2002 alors qu’en 1999.genoscope. et pour concevoir des molécules attractives ou répulsives.genoscope.structure. Une autre différence avec la drosophile est le nombre plus élevé de protéases impliquées dans la réponse immunitaire innée chez les insectes. 81 . des protéines qui semblent impliquées dans la résistance aux insecticides et sur lesquels travaillent les chercheurs de l’unité de biochimie et de biologie moléculaire des insectes à l’Institut Pasteur.

En outre.. il est moins facile d’évaluer les lacunes entre les ossatures (« Interscaffold gaps »).Il reste toutefois à vérifier manuellement ces annotations automatiques et à s’engager dans des programmes de génomique fonctionnelle et de transgénèse pour établir expérimentalement le rôle de ces gènes. G. En moyenne. Ces ADNc offriront un moyen de valider l’annotation et. Et ensuite. On a ainsi pu démontrer que 8% de l’assemblage présentait des erreurs soit par une orientation incorrecte des paires de séquences soit par des erreurs dans la distance. d’ordonner et d’orienter les contigs entre eux au sein des ossatures. a permis de relier. Ils ont entrepris de séquencer les ADNc d’anophèle sur toute leur longueur. 2002). La lecture des séquences par paire. sans doute. Mais la lecture de ces séquences par paire a aussi servi à valider la fiabilité de l’assemblage par l’analyse des violations dans l’orientation et la distance des paires de séquences. La souche PEST ne serait donc pas totalement consanguine et présente un large nombre de SNP qui rend l’assemblage beaucoup plus ardu. L’assemblage a été compliqué par le degré de polymorphisme de la souche PEST issue probablement du croisement effectué pour l’obtenir. S’il est relativement facile d’estimer la taille des nombreuses lacunes entre les contigs dans les ossatures.  Les principales difficultés rencontrées Le consortium international du séquençage a du faire face à de nombreuses difficultés. ils permettront de corriger certaines erreurs locales d’assemblage. 82 . Il peut également s’agir de séquences répétées très difficile à trouver à l’aide de la stratégie utilisée (STC).. les ossatures sont séparées par des lacunes de 317Kb (Holt et al. Les recombinaisons entre les différents cytotypes d’Anopheles gambiae ont conduit à une structure en mosaïque du génome car deux haplotypes différents ont été observés dans les régions les plus variables du génome. Le séquençage n’a pu être fait entièrement car entre les ossatures il reste encore des lacunes composées de petites régions dont la couverture par des clones n’est pas assurée à cause de l’échantillonnage au hasard de ces derniers. Le Genoscope et l’Institut Pasteur poursuivent actuellement leur collaboration en vue d’améliorer la qualité et l’interprétation des données de séquence. de la corriger par endroit. aux deux extrémités d’inserts de différentes tailles.

genoscope.fr). études qui pourraient conditionner la réussite sur le terrain des diverses stratégies de lutte conçues au laboratoire.En dépit de ses imperfections. 2001). les probabilités de parvenir à la séquence complète sont faibles car les fragments du génome clonés dans Escherichia coli sont instables. la séquence disponible depuis mars 2002 constitue d’ores et déjà un formidable espoir pour la communauté des chercheurs travaillant sur le moustique et plus largement sur le paludisme.ac. quand Steve Hoffman reçoit un million de dollars pour le séquençage du génome de Plasmodium. A cette date. L’Institut Pasteur a lancé en parallèle un « grand programme horizontal de recherche autour de l’Anophèle » auquel participe 11 équipes du campus parisien associées aux équipes issues des Instituts Pasteur de Dakar et de Madagascar (http://www. Il faudra un second meeting en 1996 et la preuve par le Sanger Center de la possibilité d’assembler des séquences du génome à partir de petits clones du chromosome 1 pour que le projet soit vraiment lancé. Cette ébauche s’ajoutant aux séquences du génome de Plasmodium falciparum et du génome humain.wellcome. En effet. De nombreuses perspectives de recherche s’offrent à nous pour lutter contre le paludisme et c’est ce qui a conduit le CNRS avec le soutien du programme Pal+ du Ministère de la Recherche à lancer en avril 2002 un projet « postséquençage Anophèle ». 2. La stratégie générale est alors fixée et chaque centre de séquençage 83 . Séquençage de Plasmodium falciparum A. Parmi les axes de recherche privilégiés figurent notamment la phylogénie des Anophèles et l’analyse du polymorphisme de leurs populations naturelles. Le consortium international est formé en 1996. on dispose désormais d’informations génomiques sur les 3 partenaires de la triade. Historique du programme Genome Malaria Ce projet est né il y a une dizaine d’années de la rencontre lors d’un meeting entre David Kemp et Alister Craig qui suggérèrent que les efforts faits dans de nombreux laboratoires pour cartographier des régions particulières du génome du Plasmodium pouvaient être coordonnés et transformés en une stratégie globale de cartographie.uk).cns. Il est clair pour les protagonistes (cités ci-dessus) que des projets compétitifs ne seront pas efficaces et une stratégie de coopération est donc mise au point (http://www. ces clones sont fréquemment sujets à des délétions et à des réarrangements excluant toute construction de bonne qualité (Gardner.

Avec persévérance et grâce aux avancées techniques. 1999 .uk/en/malaria/Theparasite/pbgeno1.. La progression durant les 18 mois suivants le second meeting seront lents à cause de certaines régions du génome très riches en bases A-T engendrant des difficultés. NMRC . Ces meetings sont l’occasion de développer une ligne de conduite à suivre concernant l’utilisation des séquences préliminaires obtenues par les différents centres séquenceurs.wellcome. The Institute for Genomic Research/Naval Medical Research Institute (TIGR. the National Institute of Allergy and Infectious Diseases (qui fait partie de l’institut national américain de la santé) et le département américain de la défense. De plus.uk). B. http://www. http://www. 10. 1998 .html). 84 . Son financement provenait de la Wellcome Trust. USA) qui s’est chargé de séquencer les chromosomes 2.ac. 1999). Bowman et al. 11 et 14 et enfin l’Université de Stanford (USA) qui a séquencé le chromosome 12 (Holt et al. 2001 . l’ensemble du génome sera séquencé en 2002 et représentera un exemple de coopération internationale... Il est toutefois difficile d’évaluer le coût final du projet car les fonds provenaient de multiples sources.reçoit la responsabilité de un ou plusieurs chromosomes. the Burroughs Wellcome Fund.. Les fonds investis au départ du projet de séquençage du Plasmodium falciparum environnaient les 15 millions de dollars (Gardner. Bowman et al. 3 à 9 et 13. Il est conclu que les partenaires se réunissent deux fois par an pour partager les informations techniques et coordonner le séquençage et les activités annexes. Malgré toutes ces difficultés. 2002 . Gardner et al. le TIGR parvient à séquencer le chromosome 2 en 1998 et le Sanger suivra avec la séquence du chromosome 3 obtenue et publiée en 1999 (Gardner et al. les dons sont envoyés pour le financement des projets de séquençage en général et non un en particulier. 2002). Le financement des projets de séquençage de l’Anophèle et du parasite a été sujet à polémique et nous y reviendrons un peu plus loin dans ce rapport (Doolittle..wellcome. 1998 . Les acteurs et les financements Le consortium international formé en 1996 comprend trois centres de séquençage : The Wellcome Trust Sanger Institute (Royaume-Uni) qui a séquencé les chromosomes 1.ac.

C. Les intérêts du séquençage de Plasmodium Le développement rapide de la résistance du parasite aux nouveaux médicaments dans de nombreuses régions du monde et en particulier dans le sud-est de l’Asie a poussé les scientifiques à explorer de nouvelles pistes pouvant apporter rapidement de nouvelles cibles aux vaccins et aux médicaments (Bowman et al., 1999). Le séquençage à grande échelle du génome du parasite a alors été lancé. L’identification de nouvelles cibles est dépendante de l’extension du savoir sur la biologie du parasite. Le séquençage est la seule méthode connue actuellement nous permettant de prendre de vitesse l’extension de la résistance du parasite par l’identification de ses gènes et le développement rapide de nouveaux traitements de lutte (Gardner et al., 1998). D. Séquençage et assemblage Le génome du clone 3D7 de Plasmodium falciparum a été séquencé par séquençage aléatoire chromosome-spécifique. Cette approche a été privilégiée en raison de la technologie disponible au début du projet. En effet, une approche génome entier avait un coût trop élevé pour être choisie. De plus, aucune banque d’ADN de haute qualité n’a pu être construite dans Escherichia coli à cause de l’instabilité de ces vecteurs après l’insertion de larges séquences d’ADN. De ce fait, la stratégie de séquençage clone par clone était également exclue (Gardner et al., 2002). Cette méthode débute par la purification des 14 chromosomes du génome sur gel à champ pulsé. Il s’agit d’une électrophorèse appliquée aux fragments d’ADN de grande taille. Son principe est de soumettre les molécules d’ADN non pas à un champ électrique uniforme, mais à des champs dont l’orientation change périodiquement. 11 des 14 chromosomes ont pu être séparés par cette technique. Les trois chromosomes restants (6, 7 et 8) non séparés ont été séquencés en groupe (Bowman et al.,1999). Après séparation et purification par l’agarase, chaque chromosome est séquencé individuellement en utilisant une approche « shotgun » (Gardner, 2001). Les chromosomes sont découpés en fragments de 1 à 2Kb dans le but de construire une banque génomique et sont clonés dans des plasmides ou des vecteurs M13. L’ADN des plasmides est préparé par sélection de colonies au hasard et la fin de chaque insert est séquencé en utilisant des amorces sens (début de l’insert) et anti-sens (fin de l’insert). Un nombre conséquent de séquence est produit pour couvrir 10 fois le chromosome (http://www.tigr.org).
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Les séquences obtenues sont ensuite assemblées en contigs en utilisant Phrap (www.phrap.org) ou l’assembleur du TIGR (http://www.tigr.org). Des clones YAC, antérieurement localisés par The Wellcome Trust Malaria Génome Collaboration, sont apparus d’une aide précieuse pour ordonnancer les contigs (Gardner, 2001). La stratégie de séquençage total à partir des clones YAC a été exclue à cause de leur instabilité et de la contamination possible des sous-clones par de l’ADN de levure (Bowman et al., 1999). La méthode principale pour ordonnancer les contigs est la suivante : les liens entre contigs sont identifiés en utilisant un programme de regroupement. Celui-ci analyse tous les contigs et leurs séquences communes. Une fois les contigs regroupés en ossatures, il faut combler les lacunes encore présentes entre ces contigs mais aussi entre les ossatures ce qui n’est pas sans poser de problèmes (http://www.tigr.org). E. Les problèmes rencontrés, finition et vérification de la séquence L’assemblage de chaque chromosome a posé problème car il était impossible d’obtenir une seule contig recouvrant entièrement le chromosome du fait de la sous-représentation de certaines séquences dans la banque, de la présence de régions répétitives (riches en A-T) perturbant l’assembleur ou de la présence d’ambiguïtés. Après l’assemblage de chaque chromosome, une centaine de contigs ont été obtenues (http://www.tigr.org). La richesse du génome en nucléotides A-T a présenté de nombreuses difficultés en terme de construction de banques précises mais aussi lors du comblement de lacunes. En effet, le processus de finition a été beaucoup plus long et plus dur que prévu car des groupes de contigs (ossatures) n’ont pas pu être cartographiés à cause du manque de marqueurs microsatellites ou de sites de restriction informatifs dans ces régions riches en A-T. Le comblement des lacunes entre contigs a consisté en l’utilisation de la technique de marche sur les plasmides avec des oligonucléotides spécifiques. Les lacunes entre les ossatures sont des aires où aucun clones physiques ne permet de faire le lien entre contigs proches. Ils sont donc comblés par PCR, grâce à des amorces produites par complémentarité de la séquence des contigs flanquant ces lacunes. Les produits de la PCR sont ensuite séquencés. Pour simplifier ce processus, les ossatures sont localisées sur les chromosomes par l’utilisation de STS dérivés des YAC cartographiés et de marqueurs microsatellites. Les régions riches en A-T ont du être comblées par d’autres méthodes dont l’insertion de transposons et la construction de microbanques qui assure une plus forte couverture. Une fois la séquence terminée et les lacunes comblées, la séquence a été éditée en utilisant l’éditeur du TIGR et toutes les ambiguïtés sont
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corrigées directement par le programme ou par « re-séquençage » des régions en question. La séquence est également examinée pour vérifier que chaque région est recouverte par deux clones et que chaque base de la séquence est représentée par au moins 2 séquences de haute qualité. Les lectures provenant des YAC cartographiés ont aussi servi de confirmation à la colinéarité de l’assemblage des chromosomes (http://www.tigr.org; Gardner, 2001 ; Gardner et al., 2002). L’utilisation d’une carte de restriction de haute résolution ou carte optique de restriction couvrant entièrement le génome a servi d’ossature pour aligner et vérifier les contigs obtenues après séquençage. La cartographie optique est une technique qui a fait ses preuves pour la construction de cartes de restriction à partir de molécules d’ADN provenant d’une variété de types de clones comme les BAC, les YAC et les clones avec des petits inserts (Lai et al., 1999). L’annotation des chromosomes a débuté lorsque toutes les lacunes ont été comblées, que la structure finale du contig recouvrant l’ensemble du chromosome a été vérifiée et enfin que la séquence a été éditée. F. Résultats Les chromosomes 2 et 3 ont été respectivement séquencé en 1998 et 1999 (Gardner et al., 1998 ; Bowman et al., 1999) . La séquence finale des autres chromosomes a été publiée en 2002 bien qu’il ne s’agisse que d’une ébauche car seuls les chromosomes 1, 5, 9 et 12 sont entièrement séquencés à l’heure actuelle. Le travail de finition et de vérification est toujours en cours pour les chromosomes 4, 6, 7, 8, 10, 11, 13 et 14 (Gardner et al., 2002). Grâce au séquençage, il a été possible de mettre en évidence la variation de la taille des chromosomes d’une souche à l’autre. La région centrale reste bien conservée à l’intérieur de l’espèce mais aussi entre espèces de Plasmodium. Par contre, les régions subtélomériques peuvent être beaucoup plus larges ou beaucoup plus petites que ce qu’on pourrait attendre. Cette variation de taille est principalement le fait de délétion(s) ou d’insertion(s) de nucléotides. La région subtélomérique présente un intérêt particulier pour les chercheurs car elle arbore des familles de gènes fortement polymorphes jouant un rôle dans l’évitement de la réaction immunitaire de l’hôte. A l’intérieur du génome, 5279 gènes ont été identifiés. Seuls 40% des protéines issues de ces gènes sont semblables à des protéines répertoriées dans les bases de données. Cela signifie que 60% des protéines seraient uniques à cet organisme. Il s’agit d’un pourcentage

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Les produits de ces gènes sont vraisemblablement exportés à la surface du globule rouge infecté mais aucune fonction ne leur est attribuée pour l’instant (http://www. La plupart des voies de biosynthèse se déroulent au niveau de l’apicoplaste. Après ce projet. La fonction de ces gènes plus courts et plus nombreux reste à découvrir. Il apparaît que le Plasmodium est incapable de réaliser des biosynthèses clés comme les interconversions des acides aminés par exemple. il est devenu clair que 2 autres familles multigéniques très polymorphes sont associées aux gènes Var : les gènes Rif et Stevor. G.uk). Le succès de ce séquençage a lancé d’autres initiatives dont le séquençage d’autres espèces de Plasmodium qui pourront permettre la comparaison entre souches et entre espèces. toutes les voies métaboliques du parasite pourront être mises à jour et de nouvelles cibles pour les médicaments verront le jour. ce qui semble faible vu leur importance au sein des voies métaboliques. Bien que le génome code seulement 57 protéines. Mise à disposition des données 88 . Ainsi.ac.wellcome.ac. III. La plupart de ces gènes sont plus courts que ceux qui avaient été assimilés comme intervenant dans la cytoadhésion et les séquences d’ADN sont très variables d’une région à l’autre. Elle va permettre de progresser dans de nombreux domaines de recherche sur la malaria. au niveau pathogénicité et les variations relatives à l’invasion de l’hôte et de ses organes (http://www. on a évalué à 10% le nombre de protéines nucléaires transportées jusqu’à l’apicoplaste. Seuls 733 des 5279 gènes putatifs sont des enzymes. Et après… La valeur de l’information obtenue par le séquençage est incalculable.wellcome.uk). On pourra ainsi révéler les modifications dans les gènes intervenant au niveau immunitaire. Le projet génome a aussi recelé la présence de 59 gènes Var dont 35 en régions subtélomériques et 24 en clusters à la fin des chromosomes.élevé par rapport aux autres eucaryotes reflétant probablement à la fois la distance évolutive et la haute spécificité de la niche écologique que le parasite occupe.

anobase. 1. Chaque enregistrement (ou entrée) de la banque de données doit renfermer l’information nécessaire à son repérage dans la collection (ou clé unique). d’autres banques de données ou encore résultant d’un traitement informatique. le nom d’un gène est souvent utilisé comme identificateur mais ce nom est susceptible d’évoluer au cours du temps en fonction des corrections qui pourront affecter sa séquence.Les projets de séquençage ont fourni une immense quantité de données qui sont maintenant à disposition de tous les chercheurs. Les données sont issues d’expériences et techniques de laboratoire (dont fait partie le séquençage). 89 . Définition de la banque de données Une base de données est une collection d’objets présentant des propriétés et/ou des caractères communs et qui peut être réutilisée dans un processus de traitement. d’informations factuelles. Par exemple. En ce qui concerne les données sur l’anophèle et le Plasmodium. les références bibliographiques des publications relatives à la production de la séquence. d’échanges (collecte et diffusion) et des traitements informatiques. standards et conventions nécessaires pour répondre aux besoins de représentation des informations. Dans le standard classificatoire. des descripteurs étiquettent chacun des champs correspondant aux propriétés et caractéristiques de la séquence.org/AnoDB/) et PlasmoDB (http://www. Elle suppose donc trois étapes : la collecte de données.plasmodb. dans le cas d’une banque d’ADN et un standard structural qui a trait au contenant (format du document). La mise en forme consiste à appliquer aux données deux types de standards qui vont formater de manière semblable chacune des fiches de la banque : un standard classificatoire qui est relatif au contenu. La mise en forme des données se définie par l’ensemble des normes. L’apparition d’Internet en 1993 a étendu les possibilités de connexion à de nombreux laboratoires du monde entier. il faut respectivement consulter AnoDB (http://www. on attribue à chaque séquence un numéro d’accession qu’elle conservera d’une version à l’autre de la banque. Toutes ces données sont réunies dans des banques afin de faciliter leur exploitation. les propriétés de la séquence et la séquence proprement dite. leur mise en forme et leur diffusion.org). soit à l’information biologique. Les banques de données actuelles proposent des interfaces conviviales de saisie des informations pour la soumission des séquences. Pour lever le problème de « traçabilité » qui peut dans ce cas se poser. Les différents champs se répartissent en 4 parties distinctes : l’identité biologique de la séquence.

et ensuite avec les autres sources d’information disponibles. Il existe aussi des bases de données internationales. Les banques nucléiques Au début des années 1980. 2. d’abord entre elles. maladies génétiques pour l’OMIM 90 . c’est-à-dire la capacité à les exploiter conjointement pour répondre à une requête complexe énoncée par un biologiste qui possède sa propre problématique. Il est impossible d’organiser l’ensemble des données génomiques au sein d’une seule banque. cartographie pour le NCBI (National Center for Biotechnology Information). Le schéma conceptuel de chaque base de données est étroitement lié aux questions biologiques auxquelles la base tente de répondre. Un enjeu des Programmes Genome vise à relier l’ensemble des différents types de données expérimentales qu’ils produisent. Il est donc nécessaire de faciliter l’interopérabilité de différentes bases. 3. Les séquences nucléiques des banques de données peuvent être de 3 natures différentes : la séquence peut être fournie sous forme d’ADN. avec la découverte de la technique du séquençage de l’ADN. les premières grandes banques généralistes de séquences voient le jour. Interrogation et intégration des bases de données L’accès aux bases de données nécessite l’intervention d’un logiciel capable de lire et d’extraire l’information de la base selon les critères choisis. L’intégration de connaissance hétérogènes dans une représentation unifiée des données offre une plate-forme générique. La plupart des grands centres de recherche sur les génomes mettent à disposition de la communauté scientifique un serveur permettant de consulter les résultats disponibles dans leur base de données locales. Un des buts assignés à ce processus d’intégration consiste à rendre possible la détection de nouvelles corrélations parmi une masse de données qui n’étaient jusqu’alors pas reliées dans un même système pour l’interrogation. qui permet de formuler des requêtes globales sur l’ensemble des informations disponibles dans le système.La diffusion des données a également beaucoup évolué ces dernières années puisqu’elle est passé par l’envoi postal de bandes magnétiques puis par le CD-ROM pour arriver actuellement à l’accès à distance à travers des réseaux informatiques à haut débit. chacune privilégiant un certain type d’information : séquences pour GenBank. d’ARN ou d’ADNc.

une expertise biologique et des annotations liées aux séquences traitées ainsi que des références à d’autres bases de données. Ainsi. d’envergure internationale. Heidelberg. La principale mission des banques est de rendre publique les données issues de fonds publics et donc collectives. Il existe de nombreux programmes informatiques. ces banques souffrent de nombreux défauts car seuls les auteurs sont responsables de la qualité des séquences soumises.infobiogen. En plus des séquences. on trouve aussi une bibliographie. Cependant. La croissance de ces bases de données est quasiexponentielle. On peut aussi observer un biais d’échantillonnage qu’il soit taxonomique (inégalité dans la représentation des organismes dans les banques). ADN mitochondrial. à l’image de FASTA à l’Université de Virginie et de BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) du NCBI. Le fait que la majorité des séquences connues soit réunie en un seul ensemble de données est un élément fondamental pour la recherche de similitude avec une nouvelle séquence. 91 . sont maintenant devenues indispensables à la communauté scientifique car elles représentent la mémoire des données produites dans les laboratoires et constituent de ce fait un gisement de connaissances à explorer.fr/doc/docindex. Pour cela. avec celle de l’EMBL (Laboratoire européen de biologie moléculaire. Ces grandes banques généralistes. Des erreurs peuvent se glisser dans les séquences comme sur l’origine du fragment séquencé ou encore dues à la méthodologie employée. GenBank est l’une des plus anciennes et volumineuses des bases de séquences d’ADN. L’état des connaissances sur les séquences sont très variables car la détermination de la fonction d’une séquence exige un travail expérimental et d’analyse souvent délaissé par les grands centres de séquençage qui ne réalise que l’annotation automatisée.). des banques spécialisées se sont constituées autour de thématiques biologiques particulières comme les banques génomiques qui réunissent les séquences d’une même espèce dans le but d’enrichir les annotations pour diminuer ou lever les ambiguïtés laissées par les grandes banques publiques (http://www.html). Allemagne). etc. Devant l’hétérogénéité des séquences des banques généralistes. séquentiel (les gènes des génomes étudiés sont inégalement représentés) ou dû à une redondance des données. les séquences soumises sont de nature hétérogène (ADN nucléaire. qui permettent la recherche rapide d’alignements de nucléotides ou d’acides aminés et conduisent à mettre en évidence des homologies de séquences d’ADN ou de protéines entre organismes. un processus de double publication s’est imposé depuis 1988 : les chercheurs doivent déposer leur séquence aux banques avant de soumettre l’article associé aux revues scientifiques.(On-line Mendelian Inheritance in Man).

les questions peuvent combiner des recherches pour des gènes particuliers ayant un intérêt avec l’ARN et l’analyse des expressions des protéines. PlasmoDB peut également être utilisée pour construire des questions complexes en utilisant des opérateurs booléens. Pour les scientifiques n’ayant pas accès à Internet. les données des cartes physiques et optiques. Dans cette base de données. Le premier est le pouvoir de la base de données dévoué aux jeux de données des séquences génomiques provenant de l’habilité à former des questions relationnelles. Le second est que le but de ces questions n’est pas de trouver la « bonne réponse ». un CD-ROM a aussi été créée et donne lui aussi accès à toutes les données acquises sur le parasite. 2002). Exemple de la banque de données de Plasmodium : PlasmoDB Cette banque de données a été crée en juin 2000.4. en limitant l’analyse du génome à un faible nombre de gènes (Kissinger et al. mais de réduire les options. sont devenus le premier challenge de PlasmoDB. et des études sur les polymorphismes de population génétique et des comparaisons d’espèces croisées. Deux points clés émergent de ces questions. Comment faire face à tant d’intégration de données et quels outils peuvent être utilisés pour les analyser ? PlasmoDB est basée sur une architecture relationnelle de base de données. construite autour de relations relevant de la biologie suivant le dogme central de la biologie : « du gène à l’ARNm à la protéine ». les gènes et les protéines prédits par annotation automatisée.. Elle contient des informations de sources multiples incluant les séquences d’ADN et leurs annotations. Toutes ces données réunies permettent aux scientifiques d’y accéder et de pouvoir les intégrer à d’autres sources. 92 . et les comparaisons des séquences ADN avec des cartes génétiques. la possible redondance ou les assemblages incorrects ont été identifiés par des comparaisons de grande rigueur de chaque séquence avec le génome entier de Plasmodium falciparum. permettant aux chercheurs de composer leurs propres questions. Parce que toutes ces informations sont dans une seule base de donnée. Les problèmes liés à des données incomplètes lors de projet de séquençage et le besoin d’accompagnement pour l’utilisation en vue de l’interprétation des résultats.

APPLICATIONS DIRECTES DU SEQUENCAGE 93 .

ou sonde. que beaucoup de molécules que l'on pense impliquées dans l'invasion. fig.I. sont membres d'une famille plus larges de gènes. les milliards de bases composant ces séquences ne nous disent pas le rôle de chaque gène. Méthodologie Il est clair. sont souvent des ADN complémentaires (ADNc). ci- 94 . de nouvelle technologies sont requises telles que les puces à ADN qui sont parmi les outils les plus puissants et les plus polyvalents pour étudier la génomique. 2. L'accession au génome de Plasmodium falciparum a accéléré la compréhension du processus complexe d'invasion. Malheureusement. l'examen de la base de données de Plasmodium falciparum pour des molécules contenant des domaines EGF-like a mené à l'identification de molécules impliquées dans l'invasion de l'érythrocyte. vu la séquence complétée du génome de Plasmodium falciparum. le fonctionnement de chaque cellule. Les puces à ADN 1. Les puces à l’aide des études du Transcriptome et du Protéome Les recherches biologiques et biomédicales sont aujourd'hui en pleine transition dont les deux composantes principales sont: l'augmentation importante de données concernant le séquençage des génomes et le développement de nouvelles technologies pour l'exploiter. comment les cellules forment un organisme ou ce qui ne fonctionne pas lors d'une maladie. et le matériel à hybrider est marqué radioactivement et plus récemment avec une sonde fluorescente. L'implication spécifique de ces molécules dans les voies d'invasion. de l'ADN génomique ou provenant de banques de plasmides. L'utilisation de fluorescence ainsi que de verre comme support pour la puce ont permis une miniaturisation de la technique ainsi qu'une augmentation d'efficacité (cf. Les fragments d'ADN fixés à la surface de la puce. Celles-ci ont une localisation spécifique. Les puces d'acides nucléiques fonctionnent par hybridation d'ARN ou d'ADN en solution à des molécules d'ADN fixées sur une surface. devient plus claire. Pour tirer le meilleur parti de cette disponibilité croissante d'information concernant les séquences d'organismes. ainsi que leur importance dans l'induction de l'immunité du parasite. Par modèle. et l'hybridation est gouvernée par les lois de reconnaissance moléculaire de brins d'acides nucléiques complémentaires.

95 . 1997)... est un déterminant majeur du phénotype et de la fonction cellulaire. La collection de gènes qui est exprimée ou transcrite à partir de l'ADN génomique (ADNg). De plus. les connaissances acquises par ce type de mesures peuvent permettre la détermination des causes et conséquences de maladies. parfois appelée profil d'expression ou encore "transcriptome". 1991 . A la différence du génome. Bien qu'il soit possible de synthétiser ou déposer des fragments d'ADN de séquence inconnue. il est possible de déposer 20 000 sondes par cm2.dessous)(Fodor et al. le changement de pattern de multiples protéines peuvent fournir des indices concernant les mécanismes de régulation et les voies biochimiques. ou comment les produits de gènes peuvent avoir une action thérapeutique ou en être la cible (Lockhart et al. 2000). Aujourd'hui. Une des plus importantes applications des puces à ADN est le screening de l'expression de gènes (via le taux d'ARN messager : ARNm). Dans le contexte de la santé humaine et de la médication. le transcriptome est très dynamique et peut changer très rapidement et radicalement en réponse à des perturbations ou lors d'évènements cellulaires tels que la réplication ou la division cellulaire. la plupart des requêtes sont faites avec des sondes connues.. DeRisi et al.

On peut donc facilement imaginer que l'étude du génome. Puce à ADN et paludisme : un exemple d'étude Nous avons vu précédemment que l'on peut déposer jusqu'à 20 000 sondes par cm2.3. du transcriptome et du protéome par 96 .

due à une grande fréquence de séquences riches en nucléotides A et T à la fois dans les régions non-codantes et codantes. il faut prêter attention à la structure secondaire qui peut être la source d'une mauvaise hybridation. il est montré Figure 1. le génome de Plasmodium falciparum contient un grand nombre d'éléments de séquence peu complexes. 97 . Par exemple. un diagramme putatif des énergies de liaison calculées pour chacun des oligonucléotides (70 pb) d'un possible gène var.puce à ADN fournit une alternative pratique à l'exploration traditionnelle de Plasmodium falciparum. Par exemple. Le secret d'une bonne analyse par puce à ADN réside dans la capacité du logiciel à intégrer les données. Lorsque l'on définit la sonde de l'oligonucléotide. De plus. la présence d'une séquence peu complexe peut résulter en une hybridation non spécifique.

1 : Diagramme d’énergies de liaison d’oligonucléotides à un membre de la famille var Bozdech et al. Trophozoïte et schizonte représentent deux stades de développement distincts lors des 48 heures de vie intra-érythrocytaire. propriétés biochimiques et activité .Fig. (2003) ont choisi de comparer les stades schizonte et trophozoïte du cycle de vie asexué intra-érythrocytaire de Plasmodium falciparum. Ces stades varient 98 entre eux au niveau morphologique. ceci dans le but de caractériser les spécificités des stades du cycle de ce parasite.

Sur les 854 gènes expérimentés présentant une expression différentielle. De plus. D'autres données vont dans le sens de l'utilisation de puces pour comparer le protéome des stades sexués et asexués (Rathod et al. les trophozoites sont caractérisés par une concentration importante de ribosomes cytoplasmiques et la formation rapide d'organelles par exemple. Les résultats obtenus par puces sont confirmés par Northern Blot et mènent à l'observation de deux catégories de gènes. 18-24 heures post-invasion. les schizontes (36-42 heures) sont cactérisés par la réplication d'ADN (16-32 copies). les marquages ont été inversés. l'ADNc dérivé de schizontes a été marqué au Cy3 (vert) et l'ADNc dérivé de trophozoïtes au Cy5 (rouge). des facteurs multiples de transcription et traduction. fig. renferme une activité transcriptionnelle forte avec beaucoup d'euchromatine. Dans les trois autres expériences. 99 . 2002). Les gènes spécifiques aux stades schizonte et trophozoïte identifiés préalablement fournissent une excellente source de contrôles positifs pour des expériences avec des puces. correspondant aux gènes exprimés différentiellement entre les stades trophozoïte et schizonte. Le trophozoïte. 525 ont montré une transcription relative plus importante chez les trophozoïtes que chez les schizontes. tandis que 326 présentent une transcription plus importante chez les schizontes. 2). des enzymes de voies de biosynthèse ou cataboliques. Six hybridations indépendantes ont été effectuées (cf. Ces groupes incluent des gènes codant pour des sous-unités ribosomiques. De plus. Dans les trois premières.transcriptionnelle. En revanche. ou encore intervenant dans l'adhésion du mérozoïte et dans la machinerie d'invasion. une évaluation des homologies de gènes de ces catégories révèlent plusieurs groupes fonctionnels de gènes. Ces résultats confirment l'hypothèse d'une transcription spécifique en fonction du stade de développement.

Elle deviendra alors un outil extrêmement puissant pour les études de transcription de gènes et de relation entre les gènes selon leurs fonctions.Fig.). ceci pour la valider et la rendre fiable (David. l'intégration des données protéomiques 100 . pers. com. De plus. 2 : Comparaison Trophozoïte / Schizonte La technologie de puces à ADN est principalement utilisée aujourd'hui dans le but de confirmer les résultats obtenus avant l'arrivée de cette technique. Les données apportées par cette technique viendront compléter les informations concernant la séquence du génome de Plasmodium falciparum et d'autres pathogènes.

avec celles obtenues par puces permettront une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires de régulation et d'adaptation.

II. Les moustiques transgéniques
L’avancée des outils moléculaires pour la manipulation des insectes, comme Drosophila melanogaster, permet aux chercheurs d’appliquer ces techniques à des vecteurs de maladies comme la malaria. Les chercheurs, avec ces techniques, pourraient en théorie générer un moustique qui bloquerait le développement et la transmission du parasite de la malaria. Plusieurs axes de recherche se sont mis en place pour obtenir des stratégies qui puissent être utilisées pour contrôler le moustique vecteur de cette maladie. Toutes ces stratégies sont considérées comme des nouveaux moyens de lutte en utilisant des moustiques génétiquement modifiés. Les axes de recherche se situent sur la transgénèse chez le moustique, avec l’obtention de moustiques stériles (mâles et femelles), l’utilisation de transposons, de virus ou de symbiontes. Le séquençage du vecteur Anopheles gambiae et du parasite Plasmodium falciparum vont aider dans la découverte de gènes impliqués dans la capacité du moustique à être résistant aux parasites de la malaria ainsi que dans la manipulation de ces gènes afin de contrôler la transmission du parasite. Des avancées ont été faites dans quatre aires. Premièrement, par l’introduction de gènes étrangers dans la lignée germinale du moustique. Ensuite, par la caractérisation de promoteurs spécifiques de tissus. Des avancées ont également eu lieu dans l’identification de produits de gènes qui bloquent le développement du parasite dans le moustique. Et enfin, par la génération de moustiques transgéniques qui altèrent la transmission de la malaria. Les voies d’interaction entre le vecteur et le parasite sont à explorer cette interface est aussi importante que celle avec l’hôte humain au niveau de la transmission du parasite. La première ligne de recherche repose sur l’identification de gènes qui pourraient inhiber le développement du parasite. Une deuxième ligne de recherche est dans l’initiative de développer des mécanismes pour amener les gènes sélectionnés à être introduit dans les populations naturelles. 1. Les méthodes utilisées

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La transgénèse comprend une phase d’ingénierie moléculaire surtout basée sur l’utilisation de transposons. Elle nécessite chez les insectes la catalyse enzymatique et de nombreux essais ont été réalisés par les transposons. Depuis 1982, le seul insecte qu’il était possible de transformer était Drosophila melanogaster. En 1995, la transformation de la mouche méditerranéenne a donné beaucoup d’espoir mais il a fallu attendre des années pour créer des moustiques transgéniques et introduire un gène susceptible d’empêcher la propagation d’organismes pathogènes. En 1998, Aedes aegypti a été transformé pour un gène marqueur de la couleur de l’œil grâce aux transposons mariner et hermes. Les transposons une fois entrés dans une population peuvent se propager rapidement à travers elle. Le plus connu est l’élément P (trouvé chez la drosophile). L’idée est d’insérer à l’intérieur d’un transposon approprié, des gènes qui rendent le moustique résistant et de regarder s’ils se propagent. Les gènes de résistance peuvent être décrochés de leur transposon et donc être perdus. De plus, après qu’un transposon particulier se soit propagé dans une population, il ne peut plus être réutilisé. Le plus grand souci est que si la modification reste stable à long terme, elle peut être balayée à travers la population globale et être contreselectionnée après un certain nombre d’années. A.Utilisation de virus et de bactéries Les virus sont des parasites intracellulaires obligatoires qui utilisent l’appareillage enzymatique des cellules pour se répliquer, se multiplier et se propager dans un organisme. Ce sont des systèmes d’expression de certains de ces insectes que les chercheurs veulent utiliser pour créer des moustiques transgéniques et introduire un gène susceptible d’empêcher la propagation des virus pathogènes. Cependant, l’ADN introduit dans la cellule sous forme de plasmide ne s’incorporerait pas au génome. Deux virus sont testés, ce sont Sindbis (un alphavirus) et l’AeDNV (un parvovirus). L’utilisation de bactéries symbiotes modifiées génétiquement pour produire des molécules antiparasitaires est à l’étude.

B.Utilisation de moustiques stériles

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Une des voies possible est d’obtenir des moustiques stériles (www.inapg.inra.fr). Un gène létal pourrait être lié à un promoteur spécifique pour la femelle (type vitellogénine) et pour le mâle, une stérilisation par système génétique c’est-à-dire un gène qui induirait une stérilité mâle, pourrait être envisagée. Le lancement d’insectes portant des dominances létales ou autres mécanismes de génétique sexuelle présente d’autres challenges comme, par exemple, la nécessité de ne relâcher que des mâles pour ne pas augmenter le nombre ou la nature des piqûres par personne et par nuit. C.Utilisation de la transgénèse De nombreuses expériences sont en cours, en vue de créer un moustique transgénique capable de contrôler la malaria. Les stratégies génétiques sont basées aujourd’hui sur la modification de la capacité de développement du parasite, et non plus sur l’élimination ou la réduction de la population de vecteur. Le concept initial, en 1991, était de fabriquer des moustiques avec un phénotype altéré qui pourrait être introduit dans les populations de telle sorte que ce nouveau trait pourrait se propager et devenir dominant. C’était une stratégie qui visait le parasite par l’intermédiaire du moustique. C’est en 2000 que la première expérience d’insertion d’un gène dans le génome d’un moustique a été effectuée et réussie. L’équipe de F. Catteruccia a inséré le gène de la GFP (Green Fluorescence protein) dans le vecteur Anopheles stephensi (vecteur de la malaria en Inde) (Catteruccia et al., 2000). Ce gène a permis au moustique d’exprimer le vert quand il était excité par les ultraviolets (cf. fig. 3). Cela donne lieu à une prochaine étape qui serait d’insérer des gènes qui inhiberaient le développement du parasite.

Fig 3 : une larve d’Anopheles gambiae portant le gène de la GFP (Enserink, 2002) Le mécanisme de pénétration dans l’épithélium des glandes salivaires du moustique n’est pas clair, mais des recherches suggèrent que ce processus pourrait être spécifique,

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ch). Il a été identifié à partir d’une banque de bactériophages.La surface de la lumière de l’intestin moyen et des glandes salivaires sont reconnus par le parasite et le peptide SM1. des recherches ont permis de découvrir un peptide (nommé SM1. Fig. l’accès des ookinètes et des sporozoïtes à la surface putative du ligand est bloqué. 4) qui possède une haute affinité pour la paroi de l’intestin moyen et l’épithélium des glandes salivaires du moustique (Enserink et al. Les expériences in vitro ont indiqué que le parasite et le peptide reconnaissent le même récepteur qui est nécessaire pour pénétrer dans les deux épithéliums (intestin moyen et glandes salivaires). Jacobs-Lorena et J. Ito montrent que l’ajout d’un gène synthétique pour le peptide SM1 dans l’espèce Anopheles stephensi à presque complètement interrompu la 104 . fig.. fig. L’étape suivante était donc d’obtenir des insectes capables de s’auto-administrer le SM1 et de transmettre cette propriété à leur descendance (http://www. cf. Fig 4 : Modèle d’interférence de l’invasion du parasite par le peptide SM1. (Gosh et al. 5). Le gène qui code ce peptide de 12 acides aminés est capable de bloquer les récepteurs dans l’intestin moyen et les glandes salivaires du moustique dont le parasite a besoin pour se répliquer. 5 : le peptide SM1 bloque les ookinètes venant de l’intestin moyen (Habeck 2001) Les recherches de M.genetic.associant des intéractions ligand-récepteur. 2001). En présence d’excès de SM1. En effet. 2002) Les moustiques où ce peptide a été administré ne peuvent plus être contaminé par la malaria (cf.

et l’expression du gène chimère a été quant à elle confirmée par des analyses d’ARN messager. 2001). 105 . La découverte d’un anticorps reconnaissant les antigènes à la surface des glandes salivaires qui peuvent interférer avec l’invasion du Plasmodium dans cet organe a motivé la recherche de l’identité de cet anticorps. Habeck. Il ressort de cette expérience que la prévalence et l’intensité des sporozoïtes ainsi que la compétence du vecteur (c’est-à-dire l’habilité à transmettre les parasites à une souris saine) ont été fortement réduites dans les moustiques transgéniques en comparaison aux moustiques contrôles. Les différentes expériences de moustiques transgéniques Au niveau des nouvelles recherches sur des moustiques transgéniques pour contrôler la malaria. Ito et al. Il faut cependant noter que cette étude concernait un parasite de la malaria de rongeur et ceci dans un environnement contrôlé. Exprimer un gène parasitaire représente alors un grand pas dans le potentiel à contrôler la malaria. Les résultats trouvés montrent que ces moustiques transgéniques inhibaient la formation d’oocystes à 80%. L’intégration du fragment de gène a été confirmée par des analyses par Sourthern Blot.capacité du moustique à transmettre le Plasmodium berghei qui engendre la malaria chez la souris (Clarke. La carboxypeptidase a été utilisée car c’est une protéase abondamment présente dans la lumière de l’intestin moyen du moustique. le premier effort a été placé sur le développement de transformation génétique de l’insecte vecteur. Le dernier challenge a été d’identifier un produit de gène qui pourrait gêner le développement du parasite sans devenir nuisible pour le vecteur. 2.. en comparant des moustiques contenant les plasmides contrôlés et des moustiques sauvages. en utilisant des promoteurs qui pouvaient augmenter l’expression des exogènes dans des quantités importantes et dans un tissu spécifique. 2002 . La séquence signal cible qui est présente dans la carboxypeptidase sert déjà à sortir le peptide de la lumière de l’intestin. 2002). Le fragment d’ADN a été flanqué à un promoteur spécifique du gène de la carboxypeptidase de l’intestin pour obtenir une forte expression du peptide SM1. Cette réduction est marquée dans le développement du parasite et dans la transmission. Ils ont utilisé un Anopheles stephensi transformé avec un fragment d’ADN contenant un gène chimérique avec quatre unités de SM1 jointes par quatre acides aminés liés et attachés à la séquence signal de la carboxypeptidase et à un fragment d’épitope d’hémagluttinine (HA) (Land. 2002 . La présence de SM1 a été détectée en utilisant la microscopie à contraste différentiel avec un anticorps anti-HA.

Le CSP est l’antigène prédominant à la surface des sporozoïtes et il serait requis dans la reconnaissance et l’invasion des glandes salivaires.2% soit une moyenne de 81.9%). 2002). Celui-ci présenterait de multiples évènements d’intégration. la forte réduction de la capacité des moustiques à transmettre la malaria est possible. Dans neuf expériences. Les premiers résultats ont indiqué que l’invasion des sporozoïtes dans les glandes salivaires serait fortement inhibée dans les moustiques recombinants. Au vu de cette étude sur de nombreux résultats prometteurs. 2002). Capurro avec un anticorps monoclonal contre le circumsporozoïte de Plasmodium gallinaceum (CSP) en utilisant un virus vecteur (Capurro et al. Cet anticorps anti-CSP était donc un excellent candidat pour l’obtention de moustiques transgéniques qui seraient altérés dans leur habileté à transmettre le parasite. la formation des oocystes dans les moustiques transgéniques a été inhibée entre 77 et 99% dans les cinq expériences menées indépendamment. En se basant sur ces observations. probablement en interférant avec l’invasion des ookines de l’épithélium de l’intestin moyen (Gosh et al. Ce gène a été introduit dans le transposon Piggybac et transformé dans Anopheles stephensi. des moustiques contrôles et transgéniques ont été mis en présence de la même souris infectée au même moment et le nombre d’oocytes formés a été mesuré. Pour évaluer l’effet de l’expression du transgène (AgCP[SM1]4) dans le développement du parasite. Les premières observations faîtes n’ont pas mis en évidence que le transgène imposerait un poids significatif à la fitness du moustique.. Un autre gène a été construit en mettant le tétramère [SM1]4 sous le contrôle du promoteur de la vitellogénine et d’un peptide signal dans Anopheles stephensi (Vg[SM1]4).7 et 95. l’inhibition de la formation des oocytes varie entre 68. Il serait également possible de combiner plus d’un transgène (c’est-à-dire AgCP[SM1]4 et Vg[SM1]4) dans le même 106 .. Quand les moustiques transgéniques et non-transgéniques se sont nourrit sur la même souris infectée par Plasmodium berghei. Une autre approche a été celle de L.8 à 99. 2000). Il a été également montré que la phospholipase A2 du venin d’abeille (PLA2) inhibe fortement la formation d’oocystes. L’invasion des sporozoïtes dans les glandes salivaires est fortement inhibée dans les moustiques qui expriment cet anticorps (de l’ordre de 96.. Cet anticorps devient donc un outil potentiel pour contrôler la capacité vectorielle des anophèles. un gène contenant le promoteur de la carboxypeptidase de Anopheles gambiae et la séquence signal actionnant l’expression de PLA2 a été construit (AgCP[SM1]4).6%. La capacité vectorielle du moustique transgénique est donc sévèrement altérée.Brennan et ses collègues ont identifié un anticorps monoclonal qui reconnaît un antigène de 100 kDa à la surface des glandes salivaires d’Anopheles gambiae ( Brennan et al.

2001). Actions sur le système immunitaire d’Anopheles gambiae Andrea Crisnati et ses collègues de l’Imperial College de Londres. les chercheurs vont pouvoir affiner les recherches déjà en cours sur les éléments transposables. 107 . ils peuvent également être utilisés comme marqueurs pour faire la distinction entre deux populations de moustiques de la même espèce. 3. 4. l’obtention d’un moustique transgénique pourra se concrétiser. qui représentent 16% du génome. Un moustique transgénique qui résisterait à l’infection aurait un système immunitaire ayant le potentiel de tuer les parasites de la malaria à différents stades de leur développement. Une fois que la meilleure cible sera identifiée. En plus d’être utilisés pour introduire de nouveaux gènes dans le génome du moustique.moustique.. C’est l’équipe de Tu qui s’occupe principalement de l’étude de ces éléments (Tu et al. Etudes sur les éléments transposables Avec l’aide apportée par le séquençage du génome du moustique. les systèmes de transposons connus actuellement chez les moustiques semblent montrer une ségrégation mendélienne de l’insert transgène et donc de ne donneraient pas d’information sur la dérive génétique. il y a des études génétiques qui sont faites sur les approches de localisation et d’identification des gènes impliqués dans la réponse immunitaire. en tant que gènes qui bloquent la transmission de la maladie à l’intérieur du moustique en stoppant le cycle du parasite.. Plusieurs d’entre eux sont actuellement capable de transformer des moustiques de type Anophèles. ce qui produirait un moustique qui serait presque complètement réfractaire à la transmission du parasite. En parallèle aux études sur la réponse immunitaire du moustique. Une approche prometteuse en ce moment est la transformation d’un moustique avec des gènes liés à des transposons. 2002). Les modèles basiques de génétique des populations montrent qu’un transposon peut se propager pour se fixer si le transposon créé suffisamment de dérive génétique c’est-à-dire si le transposon est transmis à la descendance avec une probabilité supérieure aux 50% de la ségrégation mendélienne (Boëte et al. Cependant. Plusieurs gènes qui déterminent la différence entre une lignée sensible et une sélectionnée pour être réfractaire au parasite ont été localisés dans le génome du moustique. travaillent sur les manipulations génétiques qui dirigent le système immunitaire de Anopheles gambiae contre Plasmodium falciparum.

Les non-LTR et les SINEs sont des éléments transposables de l’ARN. et la troisième est le développement de méthodes efficaces pour conduire ces gènes efficaces à se fixer dans les populations naturelles de vecteurs. Les études de laboratoire peuvent dans un premier temps évaluer la stabilité. Les manipulations génétiques sur les moustiques pourraient permettre d’envisager la substitution des populations naturelles par des populations transgéniques. La première est le développement d’outils d’ingénierie génétique pour être utilisé avec les vecteurs. Il faudrait que les expériences avancent sur les gènes qui vont être utilisés dans un environnement contrôlé qui imite la nature le plus possible. Les limites des moustiques transgéniques 108 . Les deux premières ont largement été réalisées avec la transformation de lignées germinales et des constructions génétiques qui ont réduit significativement la compétence du vecteur dans les modèles expérimentaux de malaria. des courtes séquences d’éléments répétés et parsemés (SINEs) et des éléments transposables miniatures répétés et inversés (MITEs) chez Anopheles gambiae.Ces marqueurs aideraient donc à faire la différence entre les populations qui sont plus ou moins résistantes à la maladie si ces différences s’établissent sur une base génétique. Il n’y a cependant pas de progrès faits dans le développement de méthodes pour amener les gènes désirés dans les populations sauvages et spécialement pour assuré le lien entre le système qui va introduire le gène et le gène lui-même. de MITEs et de SINEs sont présents. Les MITEs sont des éléments transposables de l’ADN. ils ont découvert de nouvelles familles et les ont caractérisées. comment ils sont distribués et comment ils peuvent les utiliser comme outils génétiques. amenant des altérations dans la biologie des espèces cibles mais qui n’étaient pas prévues. les contraintes de fitness et la sécurité des modifications génétiques. Les systèmes d’introduction des gènes présentent un hasard potentiel car ils peuvent générer des phénotypes inattendus et peuvent amener à des effets écologiques nuisibles. Les transposons autonomes peuvent augmenter le taux de mutation par de multiples insertions à travers le génome. 5. L’équipe de Tu travaille sur trois types d’éléments transposables : des répétitions non terminales (non-LTR). La seconde est l’identification des gènes efficaces qui pourraient bloquer la transmission. En regardant le génome entier. Par l’utilisation de programmes informatiques. ils essaient de voir combien de non-LTR. On observe trois catégories principales de stratégies de contrôle génétique testées sur le terrain.

Cependant. Les écologistes ont besoin d’étudier le flux de gènes (en insistant sur les patterns d’accouplement et le comportement reproductif). La richesse des informations sur la dynamique écologique des populations 109 . La probabilité qu’un transgène puisse être conduit par des moustiques génétiquement modifiés dans les populations sauvages peut dépendre de la balance entre la solidité et la fidélité du mécanisme d’introduction et de la réduction de la fitness dans les populations de laboratoire. Une autre idée serait les îles Hawaï . les tailles et la structure des populations. Le succès dépendrait de la compréhension des groupes de moustiques qui participent à la reproduction et qui sont importants pour la propagation du transgène. la communauté ne peut étudier différents sites successivement. la production d’OGM avec l’intention d’être destinée à la santé humaine peut être perçue plus favorablement par le public que la production d’OGM pour la recherche agronomique et l’agriculture. Elle est couramment utilisée dans les études de dynamique des populations d’Anopheles gambiae et dans leur habilité à transmettre la maladie. 2002). La régulation de la taille des populations peut être au détriment ou bénéfique pour la stabilité et la propagation des transgènes. La nécessité d’études sur le terrain se fait de plus en plus sentir. Parce que la biologie des populations de vecteurs sur chaque site doit être étudiée de nombreuses années avant que les essais sur le terrain ne soient décidés. des études sur l’écologie des moustiques génétiquement modifiés doivent être faites (Scott et al. il y a en effet le Culex quiquefasciatus qui transmet une forme de malaria aux oiseaux. 2002). tirer un avantage de l’excellente infrastructure scientifique (qui n’existe pas dans les régions atteintes par Plasmodium falciparum). les échanges génétiques entre populations voisines et la fitness. Certains proposent des aires comme laboratoire naturel d’étude. Les effets bénéfiques des transgènes résistants introduits peuvent être annulés à cause de moustiques non transformés qui continueraient à transmettre les parasites. La résistance transgénique de Culex quiquefasciatus pourrait aider pour les tester les nombreuses inconnues écologiques et en même temps.. Il y aurait ainsi une aire au Kenya appelée « Malariasphere ». La plus grande limitation scientifique est l’importance des études écologiques et des études de génétique des populations sur des populations potentiellement cibles. les mécanismes de régulation. une gigantesque « maison verte » qui pourrait devenir un terrain de test approprié (Clarke.Pour connaître la propagation et la stabilité des transgènes introduits. et les effets phénotypiques de la colonisation. Un des thèmes les plus important est la reconnaissance des stratégies de contrôle associant les Organismes Génétiquement Modifiés (OGM) qui peuvent potentiellement provoquer de sérieuses méfiances de la part du public (Alphey et al. 2002)..

une transmission de la malaria instable et une épidémie qui ne serait pas anticipée et qui augmenterait au niveau des maladies primaires chez les adultes. Un transposon saute à l’intérieur du génome. Des études donnent des informations sur la relation entre le EIR (taux d’inoculation entomologique) et la mortalité (Scott et al. Pour promouvoir la propagation des transgènes. Cette évaluation est difficile étant donné la diversité des moustiques et des parasites et de leur évolution rapide. Quand la transmission est faible. la propagation et l’efficacité des gènes dans les populations naturelles ainsi que la réponse évolutive du parasite. Le passage du laboratoire au terrain reste quand même un obstacle avec ses incertitudes écologiques. le risque d’infection augmente avec l’EIR quand les infections concernent des personnes faibles. Au niveau des transposons. Changer les relations entre le moustique et le parasite 110 . la transmission devient saturée et l’augmentation de l’EIR n’élève pas la parasitose chez les bébés. « l’effet rebond » peut être évité.. Quand les infections sont fortes. En prenant l’exemple de la Tanzanie du Sud. 6. Parce que la malaria dans les lieux donnés est toujours transmise par plusieurs espèces de moustiques. il peut résulter de la réduction de densité du vecteur à long terme.d’Anopheles gambiae qui peuvent être obtenues par la recherche pourra être précieuse pour renseigner sur les autres efforts pour combattre la malaria en s’attaquant à ses vecteurs. Il va en effet falloir prévoir le risque d’apparition de souches de parasites encore plus agressives et sélectionnées par les barrages pour ces moustiques transgéniques. il faut analyser les effets possibles sur la santé humaine si l’application des insecticides est interrompue après le lâcher des moustiques transgéniques. 2002). Les transgènes qui réduisent la fitness de l’hôte peuvent être reliés aux mécanismes de conduite et donc être éliminé par sélection. cela requiererait que la recherche actuelle sur les moustiques transgéniques soit élargie pour inclure l’écologie évolutive de la résistance. Si c’est possible de contourner ces obstacles. Le EIR est le nombre de moustique contenant des sporozoïtes qui piquent une personne par unité de temps. D’autres obstacles potentiels pour contrôler la malaria et réduire sa prévalence dans les populations humaines sont présents. Les conséquences possibles d’introduction de moustiques transgéniques De nombreuses conséquences sont alors à envisager. si une forme ou espèce est rendue réfractaire alors les autres transmettront toujours les parasites. il existe des pièges potentiels qui doivent être pris en compte. D’une part. il peut donc perturber les autres gènes avec des résultats qui ne sont prédictibles. Parce que les infections primaires chez les adultes causent des maladies plus sévères que chez les enfants.

De tels propos nécessitent une collaboration entre écologistes et généticiens moléculaires. Certains scientifiques disent qu’il faudrait dépenser plus pour les autres approches du contrôle de la malaria. s’installeront et les remplaceront ? Le parasite pourra alors s’adapter rapidement à un autre vecteur pour continuer son cycle de vie. De nombreuses questions sont également soulevées par l’utilisation de ces moustiques génétiquement modifiés (Clarke. ainsi que le besoin de fonds financiers adéquats. est-ce que le moustique sera capable de s’accoupler aux femelles sauvages ? Quand il y a des souches multiples de malaria dans une région. une absence de la protéine pourra-t-elle bloquer la transmission sous toutes ses formes ? Le moustique modifié va-t-il développer une résistance ? Que prendre comme terrain d’essai pour que l’expérience n’échappe au contrôle des scientifiques ? Comment les gènes codant pour que les moustiques soient résistants pourront être efficaces dans les conditions naturelles ? Comment s’assurer que le moustique transgénique va complètement s’infiltrer dans la population sauvage ? Est-ce que les modifications apportées vont être stables ? Qu’elles vont être les implications de santé publique si ce schéma a seulement un succès partiel ? Devant de telles questions. légales et sociales relevant de la technologie des moustiques génétiquement modifiés.. En plus du remplacement des populations. Il faut enfin considérer les problèmes logistiques comme le traitement régulier de vastes aires de régions très pauvres. Si des gènes stériles sont utilisés pour éliminer Anopheles gambiae. quelles autres espèces. Scott et al. et les problèmes stratégiques comme l’après traitement à l’insecticide. Par exemple. les niches biologiques qui supportent la croissance d’une large population de moustiques restés intacts en favorisant donc la recolonisation. les généticiens. des stratégies génétiques pour la réduction des populations de moustiques dans des aires urbaines mériteraient considération. 2002). 2002 . Répondre aux questions précédemment citées peut prendre des années de recherche de laboratoire et de terrain. Boëte et al. Enserink. 2002 . entomologistes médicaux et experts de la santé publique se sont rencontrés trois fois pour discuter de la recherche qui pourrait être demandé s’il y avait à créer un futur sans malaria à travers le lâcher de moustiques résistants. qui seulement occasionnellement piquent les humains. Le transposon pourrait en effet donner la capacité au moustique de transmettre d’autres maladies. 111 .peut avoir des impacts écologiques inattendus.. il est urgent de développer des procédés uniformes pour s’occuper des issues éthiques. 2002 . Dans les deux dernières années.

POLEMIQUES LIEES AU SEQUENCAGE 112 .

et l’homme. le plus souvent en Afrique Subsaharienne. Mais on est également en droit de se poser la question : l’argent injecté dans ces programmes n’aurait-il pas été plus utile ailleurs. basé à Genève. car se situant en Afrique ? De même. le séquençage est essentiel. des médicaments restent à l’état de test et qu’aucune entreprise pharmaceutique n’accepte de les commercialiser. la publication de ces séquences génétiques va apporter beaucoup dans la compréhension de la maladie. Sur ces 2 exemples. Anopheles gambiae. ce qui est loin d’être le cas à l’heure actuelle. On estime à 300 millions le nombre de cas cliniques associés à cette maladie. En ce sens. L’OMS. et surtout est-ce que la connaissance de ces séquences va apporter des solutions précises et à court terme dans la lutte contre le paludisme ? N’y a-t-il pas un risque que comme pour le SIDA. La publication des 3 séquences va apporter un nombre de données considérables et il faudra beaucoup de temps et d’argent pour en extraire toutes les informations utiles.7 et 2. le MMV ne reçoit que 15 millions d’euros par an. L’une des dernières avancées dans la lutte contre ce fléau a été de séquencer les génomes des 3 organismes impliqués : Plasmodium falciparum. Les résultats sont excellents et à l’heure actuelle. 7 médicaments ont pu être mis au point tandis que 5 projets de développement sont en route.4 millions de personnes. de son parasite et cela va ouvrir des portes vers de nouveaux moyens de lutte.5 milliards d’euros d’ici 2007. à Rockville. quand dans le même temps plusieurs centaines de millions d’euros sont investies dans la recherche contre le SIDA? Le Medecines for Malaria Venture (MMV)."Un ou deux génomes n’éradiqueront pas le paludisme" (Titre emprunté à l’hebdomadaire Courrier International du 24 octobre 2002) Le paludisme tue chaque année entre 1. Certains 113 . il faudrait au bas mot 2. Et pourtant. Certes. lors d’une récente étude a calculé que pour contrôler la malaria. sous prétexte que le marché n’est pas assez rentable. l’argent investi dans la lutte contre la malaria (environ 200 millions d’euros chaque année) est-il suffisant au regard du nombre de victimes. dont 5 millions rien que de la part de Bill Gates… Ce dernier a également financé à hauteur de 50 millions d’euros un programme de recherche sur de nouveaux vaccins au Malaria Vaccine Initiative. il est clair que les pouvoirs publics sont peu mobilisés et que la recherche sur la malaria ne doit sa survie qu’aux dons. dans la biologie du moustique. travaille depuis 5 ans au développement de nouveaux médicaments.

De nombreux centres de recherches craignent que le temps de convertir les nouvelles données en vaccins efficaces soit beaucoup trop important. "Pour que la promesse du génome du parasite se réalise. il faut favoriser la confiance. antifolates. ce qui aurait accélérer le processus. à 114 . ils auraient aisément pu participer à l’analyse des données. Et même si les perspectives de nouveaux traitements sont plutôt bonnes avec notamment la fosmidomycine. qui considère que l’avenir est dans le renforcement du système immunitaire de l’homme aux antigènes de Plasmodium falciparum..1999). Certains chercheurs regrettent également qu’aucun pays en voie de développement n’ait été inclus dans un des 3 programmes de séquençage. les scientifiques travaillent sur de nouveaux médicaments issus uniquement de 3 familles : quinolines. Entre 1975 et 1996. j’en consacrerais très peu à l’étude du génome du parasite" dit Adrian Hill." D’un autre côte. En plus. car même si leurs infrastructures sont moins développées. près de 1300 médicaments ont été mis au point et seulement 3 concernaient la malaria (Trouiller et al. Et à l’heure actuelle. Un autre chercheur va même plus loin : "Si l’on dépensait plus d’argent à mettre au point les vaccins potentiels. comme les moustiquaires imprégnées d’insecticides.scientifiques voudront dès lors s’investir dans la recherche de nouveaux médicaments alors que d’autres voudront améliorer les moyens de lutte sur le terrain déjà existants. un inhibiteur de la voie synthétique des acides gras chez Plasmodium (qui est en phase expérimentale). artemisines (dont seule la dernière ne présente pas encore de résistance…). certains considèrent que la connaissance du génome est essentielle pour trouver de nouveaux points faibles chez Anopheles et chez Plasmodium et éviter de développer expérimentalement des médicaments coûteux qui n’ont aucune chance d’être commercialisés. de l’Université d’Oxford. il existe un sérieux problème de communication : "Les scientifiques des pays développés qui étudient la génomique ne travaillent généralement pas en collaboration avec les scientifiques des aires impaludées et avec les institutions locales" déclare Gerald Keusch. Ces derniers sont d’ailleurs en train de rattraper petit à petit leur retard. je crois que l’on sauverait davantage de vies. au lieu de se concentrer sur le génome. le directeur du Centre international de santé Fogarty. à Bethesda. Il y a un manque cruel de subventions et les chercheurs n’ont même pas les moyens de tester les antigènes qu’ils connaissent à ce jour. la transparence et la collaboration avec les institutions des pays dans lesquels les fruits de la recherche du paludisme et sur le génome du moustique seront utilisés". alors si l’on ajoute les retombées du séquençage… D’ailleurs certains ont un avis tranché sur le séquençage : "Si nous avions 100 millions de dollars supplémentaires à dépenser pour la recherche d’un vaccin antipaludéen. il est peu probable qu’un vaccin soit découvert dans les années à venir.

membre de la Commission sur la Macroéconomie et la Santé à l’OMS. Anne Mills. ce qui manque vraiment c’est l’argent…" 115 . déclare à ce sujet : "Pendant que les scientifiques en sciences biomédicales et que les experts en santé publique débattent des intérêts d’investir dans les génomes ou de l’application des méthodes de lutte actuelle.l’image de l’Afrique du Sud qui va construire un centre de recherche de plus de 40 millions d’euros. Il existe donc de nombreuses polémiques sur l’intérêt d’un tel séquençage et surtout sur les applications directes qui en découleront.

LIMITES DE LA SCIENCE POUR LUTTER CONTRE LE PALUDISME 116 .

La lutte globale contre la malaria a débuté dans les années 50 et s’est avérée très efficace : l’épidémie a été sérieusement réduite dans des dizaines de pays à travers la planète. jamais à cette époque le nombre de morts n’a ré-atteint les taux d’avant le DDT. ExURSS. attirant ainsi les investisseurs. notamment en Afrique où l’on trouve près de 90% des victimes. et prouvent ainsi l’implication des pays industrialisés pour les pays les plus durement touchés par le paludisme. qui même s’il devenait moins efficace. à l’heure actuelle ces derniers reçoivent de plus en plus d’aide. surtout dans les régions où une activité économique est développée. Les gouvernements ont fait des choix dans la répartition de leur aides technologiques. qui pourraient contourner les mécanismes de résistance. l’utilisation systématique des mêmes médicaments et insecticides ont permis le développement de résistances chez le moustique et chez le parasite. tout du moins à l’heure actuelle. En effet. permettaient de limiter la transmission du parasite. Une autre raison essentielle dans le problème pour éradiquer la malaria est d’ordre politique. FMI) aux pays pauvres. En effet. en défaveur des pays africains le plus souvent et les grandes sociétés pharmaceutiques ont interrompu leurs 117 . déjà en crise à cette époque. Amérique latine…). • Les avancées récentes comme la publication des séquences d’Anopheles gambiae et de Plasmodium falciparum ouvrent la voie pour des médicaments alternatifs. dans l’article publié dans Science donnent 3 raisons principales à cela : • L’abandon des efforts a permis une résurgence de la maladie dans les pays les plus pauvres qui payent le prix fort en terme de vie. Multilateral Initiative on Malaria). De plus. tant que la maladie était présente dans les pays développé (Europe. • De nouveaux programmes de lutte globale ont été mis en place récemment (Roll Back Malaria. Heureusement. Sachs. La lutte s’est ralentie avec l’apparition des premières résistances aux DDT. Cependant. il semble essentiel de remettre en place un effort de lutte à l’échelle de la planète pour une efficacité optimale. Mais tout le monde s’accorde à dire aujourd’hui qu’une éradication complète de la maladie n’est pas possible. les campagnes de préventions se multipliaient. A cela s’est ajouté une forte diminution des crédits octroyés par les gouvernements et les institutions nationales (Banque Mondiale. Jeffrey D. Une fois ces zones "sécurisées". les pays qui faisaient des recherches sur le paludisme et qui avaient les moyens de mettre au point des médicaments efficaces ont peu à peu abandonné leurs travaux.

et surtout la manière dont il est reparti entre les différentes maladies. les moyens de lutte sur le terrain. Le programme Roll Back Malaria a été créé pour aider à mieux répartir les fonds entre les programmes de recherche et de développement. Il n’existe aujourd’hui aucune entreprise pharmaceutique qui ait un programme de recherche concernant la malaria. 118 . et la fabrication des médicaments anti-paludiques. On voit donc bien que le problème principal reste l’argent. Tout est donc une question de volonté et de beaucoup d’argent. Cependant. alors que les scientifiques s’accordent à dire que 1 milliard d’euros serait nécessaire.programmes de recherche au début des années 80. mais le prix à payer n’est pas comparable au nombre de morts que l’on pourrait éviter. pour un coût avoisinant les 150 millions d’euros. le MMV (Medecine for Malaria Vanture) prévoit de développer de nouveaux médicaments anti-paludiques tous les 5 ans.

PERSPECTIVES DANS LA LUTTE CONTRE LE PALUDISME 119 .

Mais la séquence totale va donner une image plus complète du fonctionnement interne du parasite et une chance d’identifier des aspects vulnérables. il y a une forte activité immunitaire. de nouvelles cibles de médicaments ont été identifiées par des recherches sur des données de séquences de gènes uniques partiellement assemblées. Que va-t-on tenter de développer à partir du séquençage de ces organismes (Pennisi. Une des caractéristiques les plus curieuses dans les stades chez l’homme est la réponse immunitaire humaine . Hoffman et al. Pendant plus d’un siècle. Malaria after the genome. mais elle ne contrôle pas efficacement l’infection. 2002 . et du métabolisme 120 .. Morel et al. Wirth. d’autres ont le risque d’être infectées. 2002 . avec des étapes chez le moustique et chez l’homme. Ce compartiment cellulaire essentiel est connu pour être important dans la biosynthèse d’acides gras et d’isoprénoides. 2002 . ou très fortement différents. En plus du développement de résistances aux médicaments. qui sont la clé du métabolisme dans les autres espèces. Ces gènes pourraient devenir de bonnes cibles pour les médicaments avec moins de risques d’effets secondaires. Ces approches ont été bénéfiques pour la compréhension de la biologie du moustique et des intéractions entre le moustique et Plasmodium falciparum. Quels sont ces points faibles potentiels ? Et que vont-ils découvrir sur les moyens du parasite à déjouer la réponse immunitaire humaine ? Une caractéristique notable du génome du parasite est l’absence apparente de gènes codant pour des protéines..Les génomes du parasite de la malaria Plasmodium falciparum et de son vecteur Anopheles gambiae ont été séquencés dans le but d’en apprendre plus sur leur mode de vie et avec l’espoir que ces génomes nous révèlent des cibles potentielles pour les médicaments. des millions d’enfants en meurent et celles qui survivent le font par une combinaison d’anémie et d’immuno-suppression qui les rendent plus vulnérables à d’autres maladies. Le nombre de gènes prédits (environ 10%) codant des protéines associées à l’apicoplaste est intéressant. Le projet de séquençage du génome a été conçu dans ces buts. 2002 . tout ceci souligne le besoin de trouver des nouveaux traitements contre la malaria et de nouvelles voies de prévention. 2002 . 2003 . Walgate 2003) ? Pourquoi avoir séquencé le génome du parasite ? Tout d’abord pour en apprendre plus sur le fond. Bowman et al. ne fournissant pas les moyens de protection contre des futures infections. En effet. pour comparer Plasmodium falciparum à d’autres espèces. De nombreuses personnes sont atteintes par la malaria.. De Gregorio et al. un des objectifs des programmes de contrôle de la malaria était de bloquer la transmission du parasite par les moustiques. le parasite a un cycle de vie compliqué. Bien avant que la totalité du génome ne soit séquencée.. composants de nombreuses protéines de membrane. 2002 . Les chercheurs travaillant sur la malaria ont une opportunité sans précédent pour trouver des gènes qui sont potentiellement uniques.

La séquence génomique a déjà permis l’identification de molécules de l’apicoplaste qui sont des cibles de plusieurs médicaments existants. Tout ceci est cohérent avec l’hypothèse selon laquelle la régulation des niveaux de protéines est contrôlée à travers les processus d’ARN messagers et de translation.Ceux-ci coderaient pour des protéines de surface qui interagissent avec le systèmes immunitaire humain. particulièrement dans les gamétocytes femelles. les extrémités des chromosomes de Plasmodium sont très particulières. Les études du protéome sur ces stades ont mis à jour une question fondamentale : comment le parasite régule les niveaux de ces protéines ? Le génome code pour relativement peu de protéines qui contrôlent la transcription des gènes en ARN messager. une des études du protéome a révélé des groupes de gènes où la régulation apparaît être coordonnée. Peut-être est-ce une caractéristique générale du parasite et donc une autre cible potentielle pour les médicaments ? De plus. Plasmodium falciparum subit plusieurs changements dans son développement. Il y aurait une famille de gènes (tels que les gènes var). ou au plus. des protéines qui sont présentes dans chaque zygote semblent être absentes dans les gamétocytes. Décoder l’information dans ces génomes et la transcrire en remèdes efficaces est à la fois un challenge et une opportunité pour la communauté scientifique. Mais. elles s’altèrent fréquemment. il semble y avoir peu d’éléments régulant la transcription dans le génome. Ces études du protéome ont déjà montré que les protéines impliquées dans les processus d’ARN messager et de synthèse de protéines (traduction) sont exprimées dans des proportions plus importantes au niveau des gamétocytes. Curieusement. ce qui permet au parasite d’échapper à l’action immunitaire. la comparaison de ces gènes et de leurs séquences flanquantes peut fournir plus d’informations pour connaître leurs modes de régulation. Pendant son cycle de vie. alors que les ARN messagers codant ces protéines sont abondamment présents. et sur les gènes qui sont impliqués dans la reconnaissance du parasite par le système immunitaire humain.du fer. et donc de nouvelles cibles de médicaments. Enfin. L’étude du génome du parasite peut révéler beaucoup d’informations sur la façon dont Plasmodium falciparum interagit avec ses hôtes et porteurs. il y a peu d’éléments qui sont connus dans d’autres organismes. plus que par la transcription du gène. De plus. Un des plus spectaculaires est la différentiation sexuelle et la formation des gamètes mâles et femelles. Mais les analyses de ces gènes peuvent révéler d’autres fonctions possibles. Quelques gènes exprimés simultanément sont regroupés dans le génome . qu’au niveau des autres stades. 121 .

Cribler l’activité des insecticides contre des cibles génomiques spécifiques au lieu des insectes est maintenant faisable et peut accélérer le développement de nouveaux insecticides et insectifuges. sélectionner et exploiter des gènes d’insectes vecteurs. Cela peut déjà mettre à jour les mécanismes moléculaires des résistances aux insecticides. en analysant ce qui les attire chez les hommes. Le prochain challenge est d’inventer des stratégies de conduite efficace et permettre à des génotypes résistants stables de se maintenir dans les populations sauvages de moustiques. les hématies. des piqûres et des réponses immunitaires contre le Plasmodium et autres pathogènes. et peut stimuler le développement de nouvelles interventions de santé publique. De plus. ou sur les gènes exprimés dans les tissus tels que la tête et les antennes qui peuvent servir d’intermédiaire aux comportements de sélection de l’hôte et de reproduction. 1). Cela va favoriser la connaissance de la biochimie. les graisses et les glandes salivaires. des comportements de reproduction. Quelques stratégies peuvent inclure la réduction du nombre et de la durée de vie des moustiques infectés. la séquence complète du génome peut accélérer l’ingénierie des moustiques résistants au Plasmodium et développer des méthodes pour amener ces génotypes à se fixer dans les populations sauvages (cf. L’identification de nouveaux gènes peut améliorer la connaissance de la biologie du vecteur. Les données du génome peuvent déjà aider à développer des stratégies de lutte contre la malaria. fig. identifier. La séquence du génome d’Anopheles gambiae a été comparée à celle de Drosophila melanogaster car ils sont dans le même ordre taxonomique : les Diptères. Les insectes ont un système immunitaire efficace pour combattre les pathogènes qu’ils rencontrent.Le génome d’Anopheles gambiae fournit un échafaudage architectural pour cartographier. 122 . stimulant le développement de nouvelles générations d’insecticides. Les profils d’expression de quelques gènes immuns d’Anopheles gambiae suggèrent que le moustique montre des réponses immunitaires spécifiques adaptées à différents types de pathogènes. de la physiologie et du comportement du moustique dans l’épidémie de la malaria. La disponibilité de la séquence entière d’ADN associée aux outils tels que les puces à ADN peuvent faire d’Anopheles un puissant modèle pour étudier la biologie des insectes. incluant l’intestin moyen. Trouver comment Anopheles répond à l’infection de Plasmodium est essentiel pour obtenir des clés dans le contrôle de la malaria. Les efforts les plus spécifiques dans ce projet sont focalisés sur les tissus du moustique avec lesquels le parasite interagit. Ils ont cependant des styles de vie différents et des habitats environnementaux distincts. et limiter la capacité des parasites à se développer dans l’insecte vecteur.

La malaria est caractérisée par un jeu très complexe d’intéractions entre le parasite. le vecteur et l’hôte. Ce combat ne peut évidemment se faire que si des fonds financiers et des structures internationales le permettent. 1 : les perspectives du séquençage du génome d’Anopheles gambiae 123 . Fig.Les informations apportées par le séquençage des génomes peuvent aider dans l’identification des gènes et des chemins impliqués dans la transmission. la phatogénicité et les réponses aux médicaments. Maintenant que les génomes des trois acteurs ont été séquencés avec succès. l’ère post-génomique pour combattre cette redoutable maladie peut réellement commencer.

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