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Efecto antimicrobiano de la heparina y ampicilina en cultivos de E. coli. Jos Carlos Salamanca Delgadillo 209238042 Lic.

en Biologa, CUCBA, Universidad de Guadalajara. Jalisco Mxico Junio 2011

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1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24.

Antecedentes..............................................................................2 Heparina......................................................................................4 Antibiticos..................................................................................4 Betalactamasas y Penicilinas......................................................5

4.1.

Sitios de accin de las Betalactamasas........................8

Resistencia Microbiana...............................................................9 Escherechia colli.........................................................................10 Prueba de Resistencia Microbiana.............................................11 Mtodo de Difusin en Disco......................................................11 Concentracin Mnima Inhibitoria...............................................12 Halos de Inhibicin.....................................................................12 Problema....................................................................................13 Justificacin................................................................................13 Objetivos Generales...................................................................13

13.1.

Objetivos Particulares..................................................13

Hiptesis.....................................................................................13 Cronograma................................................................................13 Metodologa................................................................................14 Materiales...................................................................................14 Procedimiento.............................................................................14 Tratamientos...............................................................................14 Resultados..................................................................................15 Conclusiones Preliminares.........................................................15 Bibliografa.................................................................................16 Anexo 1. ....................................................................................20 Anexo 2 ..................................................................................23

Efectos sinrgico de la heparina y ampicilina en cultivos de E. coli. Jos Carlos Salamanca Delgadillo 209238042 Lic. en Biologa, CUCBA, Universidad de Guadalajara. Jalisco Mxico Junio 2011 Antecedentes El efecto de la heparina como antibacteriano esta comprobado y los resultados han arrojado que su sola administracin no ejerce inhibicin en el crecimiento de bacterias gram-positivas y negativas(Christman.1956) 2. En estudios con el virus de rabia en clulas CVS-BHK, se observa una inhibicin de la infeccin por la heparina evidenciando un eventual proceso de competencia entre el ligando y el virus de rabia por la Molcula de Adhesin Celular Neural NCAM, uno de sus posibles receptores (Corredor.2003)1 . En aplicaciones clnicas se ha utilizado heparina y antibiticos para realizar el sellado de catetes intravenosos, esta aplicacin ha disminuyo el riesgo por infecciones bacterianas en el paciente(baltrons.2008) 3. Heparina Actualmente se define a la heparina( Fig 1) como una familia de molculas de polisacridos formados por residuos de cido urnico y D-glucosamina con diversos grados de sulfatacin unidos por enlaces l-4. Los residuos de cido urnico pueden ser o bien cido L-idurnico (la,Ido A) o cido D-glucurnico (2,GlcA); los residuos de D-glucosamina (GlcN) estn o N-sulfatados (3,GlcNSo3) o bien N-acetilados (4,GlcNAc)(Lozano.1992) 4.

Figura 1. Molcula de Heparina Modelada Digitalmente. Http://www.bioiberica.com/Business_to_Business/Heparina/Heparina.html

Los residuos que se encuentran ms abundantemente en las heparinas utilizadas en teraputica son IdoA 2-sulfato (Ib) y GlcNSO3 6-sulfato (3b). Un cierto nmero de las molculas de la heparina terminan con una "regin de enlace" constituida por el tetrasacrido que contiene GlcA, dos residuos de D-galactosas y uno de D-xilosa unidos a un residuo de serina (Lozano.1992)4 . El aminocido es un resto del armazn polipeptdico original del cual las cadenas de polisacridos han sido separadas por proteolisis. Sin embargo slo una parte de las cadenas de polisacridos que forman la heparina terminan con serina; ello se debe a la ruptura de puentes glicosdicos en el curso de la biosntesis del proteoglicano, posiblemente por parte de una endoglucoronidasa as como ocasionales despolimerizaciones que pueden ocurrir durante el almacenamiento. Como consecuencia un nmero variable de las cadenas de polisacridos constituyentes de la heparina terminan con residuo de monosacrido.

La heparina (Fig.1) se produce en los mastocitos mediante un complicado proceso biosinttico que incluye unas 12 reacciones diferentes. Los procesos involucrados en dicha sntesis pueden ser divididos en tres fases: formacin de una regin de unin polisacrido-protena que sirve de armazn (proteoglicano), formacin de las cadenas de polisacrido y la ulterior modificacin de las cadenas de polisacrido(Lozano.1992)4 .

Estudios realizados en preparaciones obtenidas de piel de rata han demostrado que cada uno de dichos proteoglicanos contiene unas 15 cadenas de polisacridos (peso molecular entre 60 y 100 KDa) unidos a un armazn peptdico compuesto de 20 a 25 residuos de serina y glicina dispuestas de forma alterna al menos 2 de cada 3 residuos de serina estn unidos a una cadena de polisacrido. La unin del polisacrido al residuo de serina se realiza a travs de secuencia de tres monosacridos (galactosil-galactosilxilosil) que es comn a otros proteoglicanos de importancia biolgica como los del heparn sulfato, condroitn sulfato y dermatn sulfato. La heparina se halla confinada al citoplasma de las clulas cebadas o mastocitos y entre los mamferos algunas especies carecen de ella completamente (el conejo) mientras que en otros (perro y vaca) la poseen en muchos tejidos y a altas concentraciones. Entre los invertebrados, la heparina solo ha sido hallada en algunas especies de moluscos. La aparicin de la heparina se produce tardamente durante el desarrollo fetal. Diversos autores han especulado sobre el papel que jugara la heparina en la proteccin del cuerpo frente a organismos extraos como bacterias y virus, pues algunas de las caractersticas descritas anteriormente, parecen avalar dicha hiptesis. Trabajos experimentales han apoyado la teora de que la heparina intervendra en la defensa contra patgenos sin la participacin del sistema inmune. En este contexto quizs cabe indicar que la heparina aparece en etapas tardas del desarrollo fetal, antes del desarrollo del sistema inmune. Es improbable que las funciones biolgicas de la heparina pueda estar relacionada con la coagulacin dado que organismos con un sistema de coagulacin sangunea complejo (conejo) no poseen heparina, y especies sin mecanismos de coagulacin funcionales (algunos moluscos) contienen grandes cantidades de heparinas. Finalmente, cualquiera que sea la funcin biolgica de la heparina, su heterognea distribucin en la economa sugiere que participa en mecanismos que no son esenciales para la supervivencia del organismo (Lozano.1992)4.

Tipos de Heparina(Alba.2006)(10)(Goodman.1986)(11): Heparina clsica o no fraccionada(HNF): Es el modelo estndar que posee un peso molecular de 16.000 daltons. Heparina de bajo peso molecular (HBPM): Corresponde a las distintas fracciones que se obtienen qumicamente y por procesos industriales de la HNF, aproximadamente entre 7 y 9 mil daltons : enoxaparina, tedelparina, dalteparina, nadroparina, tinzaparina, entre otras. Heparinoides: Son polisacridos sulfatados, poseen accin antitrombtica, las ms importantes son: heparan sulfato, dermatan sulfato, pentosan sulfato. Variantes conjugadas de la HNF. Heparina con sodio. Usada clnicamente para el estudio de linfocitos. Heparina con litio. Aplicada en la determinacin de anlisis en qumica sangunea.

Para este caso se aplicara HNF, por su constitucin en cadenas largas no modificadas.

Antibiticos. Los antibiticos (AB) son compuestos relativamente sencillos, producidos por bacterias u hongos que atacan especficamente a las bacterias. Interfieren en algn paso del metabolismo, para su actividad requieren un blanco adecuado(Sanchez.2006) 5, los blancos pueden estar situados dentro de algn proceso del metabolismo, como la replicacin, transcripcin o la reproduccin; en el cuadro 1, se muestra algunos antibiticos y el blanco en el que acta.

rea o Blanco de Accin Sntesis de las envolturas bacterianas Proceso de replicacin del ADN Proceso de transcripcin de ADN Aparato de biosntesis de protenas Metabolismo
Cuadro 1. Blancos de Accin de algunos antibiticos.

Antibitico Beta-lactamicos, Glicopptidos , Polimixinas, Cicloserin, Vancomicina Quinolonas Rifampicina Tetraciclinas, Eritromicina, Lincomicina, Estreptomicina, Cloranfenicol. Cloranfenicol

Bactericidas y Bacteriostticos; Caractersticas generales. En funcin del proceso que realizan sobre las bacterias pueden clasificarse en dos tipos; bacteriostticos y bactericidas, estos ltimos producen un efecto que las conduce a la muerte, y el primero inhibe su crecimiento y reproduccin, algunos presentan ambas funciones(Sanchez.2006)5 .

Bactericidas

Bacteriostticos

Beta-lactmicos1a Glicopptidos

Macrlidos Tetraciclinas

Aminoglucsidos

Cloranfenicol

Quinolonas

Clindamicina, Lincomicina

Polimixinas

Sulfamidas

Beta-lactmicos y Penicilinas. Dentro de los bactericidas beta-lactmicos se encuentran la penicilina 1a y sus derivados que inhiben la sntesis de la pared celular de las bacterias durante su crecimiento y divisin, condiciones que requieren de la formacin activa del peptidoglicano murena (MU) (constituyente esencial de la pared celular, sustancia que le confiere la forma, rigidez y estabilidad a la membrana celular de casi todas las bacterias de importancia mdica) en cuya sntesis intervienen aproximadamente 30 enzimas. La penicilina, al inhibir la formacin del peptidoglicano, ocasiona durante el crecimiento de la bacteria la aparicin de defectos en su pared, con lo cual desaparece la proteccin de dicha clula, que se hace osmticamente sensible. Como la presin osmtica en el interior de la bacteria es enorme, en medios hipotnicos penetra lquido por smosis hacia su interior, hasta que la clula estalla (lisis bacteriana)
5-7-8

Fig. 3

Fig. 3- Penicilina. La estructura qumica bsica de la penicilina consiste en un anillo de tiazolidina (A) unido a un anillo_b-lactmico (B), al que est unido una cadena lateral (R). El ncleo de la penicilina en s es el principal requerimiento estructural para la actividad biolgica. La cadena lateral determina muchas de las caractersticas antibacterianas y farmacolgicas de un tipo determinado de penicilinas. Los antibiticos beta-lactmicos producen efectos caractersticos sobre las bacterias, estos actan sobre enzimas sintetizadoras de la pared celular de los microorganismos sensibles y provocan el engrosamiento de esta pared y su lisis posterior. Los metabolitos que se derivan de la molcula intacta de penicilina actan como haptenos a travs de su unin de tipo covalente, con las protenas endgenas, preferentemente por ataques a los grupos e-amino de la lisina de estas protenas. El intermediario antignico de las penicilinas es el cido peniciloil (determinante mayor) que se forma al abrirse el anillo b-lactmico. El 95 % de la droga unida a los tejidos aparece en esta forma. http://scielo.sld.cu/img/revistas/hih/v16n2/f0103200.jpg (7) (8) . Fig 4. Las betalactaminasa es la enzima asociada a la pared que rompe el anillo betalactmico e inactiva la penicilina y sus derivados(5).http://www.quimicaviva.qb.fcen.uba.ar/v5n2/sanchez.htm

Fig. 4

La respuesta de una poblacin bacteriana es heterognea, muchas de las bacterias experimentan severos y extensos daos de la pared celular, pero otras slo presentan prdida de sustancia celular sin aparentar mayores lesiones. Las bacterias sobrevivientes a la exposicin a la penicilina reanudan su crecimiento despus de un perodo de inhibicin o quietud al retirarse el antibitico. Concentraciones cercanas a la concentracin minina inhibitoria (CIM) detienen la divisin celular en bacilos gram-negativos pero contina el crecimiento bacteriano con un ritmo cercano al normal de tal manera que los bacilos llegan a formar largos filamentos.

En presencia de altas concentraciones del frmaco y en dependencia de la cepa bacteriana ocurre lisis celular espontnea, sin que sea posible distinguir ningn cambio morfolgico evidente o puede ocurrir su transformacin en esferoplastos, los cuales a veces son capaces de sobrevivir como formas celulares de pared deficiente o secundariamente lisarse en dependencia de la osmolaridad del medio u otros factores locales. La variedad de estos cambios frente a las diversas penicilinas y dosis empleadas hizo pensar que podan existir otros puntos de accin de estos frmacos, y as en 1975 Spratt demostr que las membranas aisladas de bacterias contienen cierto nmero de protenas que son capaces de unirse a las penicilinas y otros betalactmicos.

Estas protenas de unin a las penicilinas (PUP) son numeradas en orden decreciente sobre la base de su peso molecular, de acuerdo con el corrido electrofortico en gel de poliacrilamida. La cantidad de PUPs encontradas en la pared bacteriana vara de una especie microbiana a otra: E. coli posee al menos 7, S. aureus, 4, etc. La afinidad de los diferentes betalactmicos es diferente para cada PUP, as vemos que la cefradina, temocilln y los monobactmicos aztreonam y carumonam se unen a PUP 3 y mecillinam se fija exclusivamente a PUP 2; otros betalactmicos cuando su concentracin es adecuada pueden unirse a ms de una PUP (PUP1a y PUP1b) lo cual desencadena una rpida respuesta celular ltica en algunos bacilos gram-negativos a las penicilinas y cefalosporinas . La PUP de bajo peso molecular4-6 de E. coli son carboxipeptidasas las cules parecen controlar la extensin de los enlaces cruzados en la pared celular; grmenes mutantes que carecen de estas protenas escapan de la accin letal de los betalactmicos y crecen normalmente. Las PUP de alto peso molecular (1 a, 1 b, 2 y 3) se comportan como transpeptidasas que por diversas vas complementan la configuracin de la complicada arquitectura de las clulas bacterianas cilndricas o esfricas durante el crecimiento, tabicacin y divisin. El ncleo activo de las penicilinas es el cido 6-aminopenicilnico, constituido por una estructura beta-lactmico-tiazolidnica anillada, la cual se une a una cadena lateral variable. Productos anlogos a la benzilpenicilina, se produjeron a partir de la introduccin de precursores de cadenas laterales, en caldos de cultivo fermentados, pero el nico compuesto teraputico til, obtenido por esta va, fue la penicilina V (fenoximetilpenicilina).En 1959, el mismo cido 6-aminopenicilnico, fue hallado en fermentaciones, en las cuales no se haban introducido precursores de cadenas laterales. Ms tarde se vio, que era posible la produccin de cantidades significativas de bencilpenicilina, con la utilizacin de enzimas microbianas, conocidas genricamente como amidasas, aciclasas, o acil-transferasas o por procesos qumicos, que dan lugar a la aparicin de los acil derivados del cido 6-aminopenicilnico. Surgi as, un gran nmero de variantes estructurales de la molcula original, como el mecillinam, en el cual, la cadena lateral est unida por un puente amidnico, otros compuestos en los cuales se adi al anillo beta-lactmico, un grupo 6metoxi, etc. As, con la modificacin de la molcula de bencilpenicilina, aparecieron formas de accin prolongada y en base al desarrollo de derivados semi-sintticos, contamos ahora con nuevos compuestos con ventajas sobre sus antecesores, como son: accin ms prolongada, mayor absorcin digestiva, estabilidad frente a beta-lactamasas (enzima que inactiva el efecto de los betalactmicos, producido por las bacterias) y espectro antimicrobiano ampliado. Estas nuevas caractersticas, han dado lugar a la divisin de las penicilinas en 6 grupos, de acuerdo con sus propiedades. Funcin de la ampicilina. La ampicilina inhibe la sntesis de la pared bacteriana. Atraviesa la cubierta externa bacteriana por las porinas, se difunde a travs de la pared celular y llega finalmente a su receptor en la membrana celular bacteriana: la protena ligadora de penicilina o PBP (por

sus siglas en ingls de penicillin binding protein). PBP, en condiciones normales, se encarga de catalizar las reacciones de transpeptidacin que forman enlaces estructurales firmes entre las molculas de peptidoglucanos de la pared celular, enlaces que confieren resistencia y rigidez a la pared celular de la bacteria, impidiendo que esta se deforme o explote a consecuencia de la gran presin osmtica del interior. La ampicilina, al interactuar con su receptor PBP, inhibe la transpeptidacin (unin de las cadenas peptdicas que forman la pared) y por lo tanto, dejan de formarse los enlaces estructurales que confieren firmeza a las molculas de peptidoglucano. La pared celular pierde su rigidez, se deforma y finalmente la bacteria explota y muere.

Para que acten los betalactmicos es necesario que la bacteria se halle en fase de multiplicacin, ya que es cuando se sintetiza la pared celular. Los componentes del peptidoglucano se sintetizan en el citoplasma y son transportados a travs de la membrana citoplasmtica al espacio que existe entre sta y la pared celular. A este nivel existen unas protenas con actividad enzimtica PBP (transpeptidasas y carboxipeptidasas), que son las encargadas de formar los tetrapptidos unidos. Estas enzimas fijan a las penicilinas y otros betalactmicos. La funcin de las PBP es alargar, dar forma y dividir la bacteria. Los anillos de los betalactmicos poseen una estructura similar a los dos ltimos aminocidos del pentapptido (D-alanina-D-alanina) y eso permite una unin covalente en el lugar activo de la transpeptidasa. Tambin pueden inhibir a las carboxipeptidasas y algunas endopeptidasas. (Sanchez.2008)15

Clasificacin por grupos. 1. Bencilpenicilina y sus formas parenterales de accin prolongada. 4. Penicilinas de amplio espectro - Bencilpenicilina 4.1 Ampicilln - Penicilina benetamina 4.2 steres del ampicilln - Penicilina benzatnica - Bacampicilln - Penicilina clemizol -Lenampicilln - Penicilina procanica 4.3 Compuestos similares al ampicilln. 2. Penicilinas absorbibles oralmente, semejantes a la bencilpenicilina. - Azidocilln - Fenetecilln - Fenoximetilpenicilina 3. Penicilinas resistentes a -lactamasas staphyloccicas: 3.1 Isoxazolil-penicilinas - Cloxacilln - Dicloxacilln - Oxacilln - Fluoroxacilln 3.2 Meticilln 3.3 Nafcilln - Amoxicilln - Mecillinam (amdinocilina) - Ciclacilln 5. Penicilinas antipseudomnicas 5.1 Acilureidopenicilinas - Azlocilln - Mezlocilln - Piperacilln 5.2 Carboxipenicilinas - Carbenicilln - Ticarcilln 6. Penicilinas resistentes a -lactamasas (de enterobacterias) - Foramidocilln - Temocilln

Sitio de accin de los antimicrobianos. El peptidoglicno mureina (Mu) de todas las clulas bacterianas, es bsicamente similar, aunque existen diferencias estructurales de este compuesto, entre grmenes gram-positivos y gram-negativos. En ambos tipos de microorganismos, la cadena macro molecular bsica, consiste en N-acetilglucosamina, y alterna con su ter lctico, el cido N-acetil murmico . Cada unidad de cido murmico,est unida a una pequea cadena pentapeptdica, cuyo tercer aminocido, es L-lisina en la mayora de los cocos gram-positivos y cido M-diaminopimlico en los bacilos gram-negativos. La pared celular debe su rigidez y estabilidad a los enlaces cruzados entre este aminocido y el penltimo aminocido de las cadenas adyacentes (el cual es siempre D-alanina).

Los bacilos gram-negativos, poseen una capa muy fina de peptidoglicno, con enlaces cruzados dbiles, en contraste con los cocos gram-positivos, cuya capa de peptidoglicno es muy gruesa y sus puentes interpeptdicos estn fuertemente enlazados. Tambin se caracterizan las bacterias gram-positivas, por su alto contenido de fosfatos polimricos de azcaresalcoholes (cidos teicoico y teicurnico), mientras que los gram-negativos estn cubiertos por una envoltura externa que semeja una membrana compuesta de complejos lipopolisacridos-lipoprotenas, la cual impide a muchos antibiticos penetrar la bacteria y alcanzar estructuras diana dentro de la clula.

1.

El cido N-acetil murmico es un derivado de la N-acetil glucosamina por la adicin de cido lctico derivado de fosfoenolpirvico.

(Bloqueado por fosfomicina).

2.

Los primeros 3 aminocidos de la cadena pentapeptdica que se une al cido murmico son aadidos secuencialmente,pero el terminal D-alanil-- D-alanina se aade como una sola unidad, para formar esta unidad, la forma natural del aminocido debe ser racemizada a su enantiomorfo D-alanina, paso catalizado por la enzima Dalanina sintetasa.

(Bloqueado por la cicloserina)

3.

Inmediatamente que el complejo muramil-pentapptido es formado en el citoplasma celular pasa a unirse a una molcula transportadora de naturaleza lipdica situada en la membrana celular, all se le adiciona una unidad de N-acetil glucosamina conjuntamente con el aminocido necesario para formar el puente peptdico, entonces esta armazn bsica formada est lista para pasar a travs de la membrana celular y completar la fase final del crecimiento de la macromolcula.

(Inhibido por teicoplanina y vancomicina).

4.

La molcula lipdica que sirve como vehculo es fosforilada en esta reaccin y debe ser desfosforilada para recuperar su funcin de transporte.

(Bloqueado por bacitracina).

5.

Finalmente las unidades del pptido preformadas se unen mediante enlaces cruzados para formar la macromolcula que le brinda estabilidad a la pared celular, este ltimo paso es abortado por las penicilinas y otros beta- lactmicos (Ampicilina).

Fig.5Diferenciasestructuralesenlapareddepeptidogligano5);Esenla sntesisdeestamolculadondeseencuentraelsitiodeaccindelosbeta lactmicos.(penicilinas). Resistencia microbiana. Las bacterias desarrollan mecanismos para asegurar su prevalencia frente estmulos externos, esta respuesta es el proceso mediante el cual se adaptan y sobreviven(Marian.2003)
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. Los mecanismos que los microorganismos (bacterias

Gram + y -) emplean para resistir a los agentes antimicrobianos son : 1) La bacteria produce enzimas que destruyen el agente antimicrobiano antes que este alcance su blanco o modifica el agente antimicrobiano de tal forma que ya no puede ser reconocido por su blanco. Fig 7-8. 2) La pared celular se vuelve impermeable al agente antimicrobiano. 3) El sitio de ataque es alterado por mutacin de tal manera que ya no permite la unin del agente antimicrobiano. 4) La bacteria posee una bomba de flujo que expele al agente antimicrobiano de la clula antes que este alcance su blanco. 5) Rutas metablicas especficas dentro de la bacteria son alteradas genticamente para que el agente antimicrobiano no pueda provocar el efecto. La produccin de enzimas constituye el principal mecanismo de resistencia a los betalactmicos, sobre todo en las bacterias gramnegativas.Lasbetalactamasassonenzimas catalticas de naturaleza proteica cuya produccin est controlada por un gen, bien cromosmico o bien transferido por plsmidos otransposones 12.Actanrompiendoelenlace amdico del anillo betalactmico, previa unin al grupo carboxilo, con lo que ste pierde la capacidad de unirse a las PBP. El grado de resistencia que determinan se correlaciona con su concentracin, afinidad por los diferentes betalactmicos y propiedades hidrolticas. La produccin de betalactamasas puede ser constitutiva (se producen siempre) o inducible (slo en presenciadeunbetalactmico)Fig6.

Fig 6 efecto de la beta-lacramasas sobre el anillo betalactamico de la penicilina

En este sentido no todos los betalactamicos tienen el mismo poder de induccion, pudiendo ser desde poco a altamente inductores. En los microorganismos gramnegativos, las betalactamasas plasmaticcas son constitutivas y su grado de produccion esta en relacion ser constitutivas o inducibles. con el numero de copias del plasmido, mientras que en los estafilococos suelen ser inducibles. Las betalactamasas cromosomicas, que son producidas fundamentalmente por bacterias gramnegativas, pueden

Fig. 8 Inactivacion del anillo betalactamico http://t3.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcRb53seTObtxbbk6Um7T2iOyz36uAPInfcsvp9krE0nbxqTlgX-hA

La resistencia a los antibiticos es un mecanismo de sobrevivencia que las bacterias emplean con eficiencia y eficacia en un proceso altamente especializado, a razn de este principio, es necesaria la bsqueda de alternativas para combatir, por un lado bacterias ordinarias y a aquellas que desarrollan procesos de resistencia; aunado al diseo de estrategias para disminuir la posibilidad de proporcionar los medios para que estas encuentren o desarrollen los mecanismos para contrarrestar los ataques de los antibiticos. El desarrollo de nuevos antibiticos, no garantiza que los mecanismos de resistencia se vuelvan pasivos. Escherichia coli. Es un bacilo gram-negativo que forma parte de la microflora anaerbica facultativa del tracto intestinal del hombre y de algunos animales. Existen cepas de E. coli capaces de producir un amplio espectro de enfermedades, entre ellas infeccin urinaria, septicemia, meningitis o enfermedad diarreica. Los virotipos causantes de diarrea se clasifican en: Enterotoxignico (ETEC)

Enteropatognico (EPEC) Enteroagregativo (EAggEC)

Enterohemorrgico (EHEC) Enteroinvasiva (EIEC)

Las cepas de ETEC elaboran dos tipos diferentes de toxinas; la primera es una protena dimrica de alto peso molecular (86 500 daltons), similar en estructura qumica, funcin y antigenicidad a la toxina producida por V. cholerae; sta se inactiva con calor (100 C durante 10 minutos) y se denomina termo lbil. La otra familia de enterotoxinas producidas por cepas ETEC son las denominadas termoestables (TS). Esta bacteria es la causa ms comn de la diarrea del viajero. Los genes plasmdicos que codifican para resistencia son los mismos que contienen la informacin de dos enterotoxinas, por lo que el incremento en la resistencia podra estar ligado a la transferencia de los genes de enterotoxinas a otros organismos entricos.

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Inicialmente, la doxiciclina fue el frmaco de eleccin, pero con su uso se

incrementaron las cepas de ETEC

resistentes, ms recientemente, las fluoroquinolonas la han sustituido. E. coli ha desarrollado mecanismos de resistencia especificos para inhibir a los beta-lactamicos, estas enzimas llamadas beta-lactamasas son enzimas que hidrolizan los agentes antimicrobianos dando como resultado que la clula sea resistente a la accin de los medicamentos beta lactmicos la forma en que acta estas enzimas resulta especializada dado que en bacterias gram-negativas los medicamentos beta lactmicos entran en la clula a travs de las porinas y encuentran a las beta-lactamasas en el espacio periplsmico. Las beta-lactamasas destruyen las molculas beta-lactmicas antes de que stas tengan la oportunidad de alcanzar sus sitios de unin o blancos. Resistencia de E. coli frente a Ampicilina. En Mxico, en cepas aisladas de pacientes peditricos durante 1960-1980, la resistencia para la ampicilina se increment de 35 a 80%; para la tetraciclina, se mantuvo en ms de 90%; para el cloranfenicol, aument de 57 a 68%, y para el TMP/SMZ, de 52 a 72%.(Solorzano.1998)6 En el Hospital Civil de Guadalajara Fray Antonio Alcalde los resultados en el estudio evaluatorio a 350 urocultivos positivos para un germen bacteriano en el cual se aisl un 45% correspondiente a Escherichia coli. El 77% de de estas cepas fueron de origen comunitario. El patrn de resistencia de esta bacteria al trimetoprim-sulfametoxasol fue de 72% y a la ampicilina de 80%. El patrn de resistencia es mayor en cepas de origen nosocomial.(Alvarado.2007)12 En el caso infecciones del tracto urinario que son una patologa comn en la edad peditrica y siendo Escherichia coli el agente bacteriano que con ms frecuencia las causa, en los ltimos aos se ha informado sobre un aumento en la resistencia de Escherichia coli a diversos antibiticos entre ellos la ampicilina (Alvarado.2007)12. D. Prais et al. realizaron un estudio para determinar la susceptibilidad bacteriana en Israel y encontraron una resistencia de E. coli al tmp-smx en 31%, a cefalexina 37% y a ampicilina en 68%.(Paris.2003)13,(Wald.2004)14 Prueba de susceptibilidad microbiana. Es una prueba que se aplica en las situaciones en donde se requiere conocer el efecto o respuesta que tiene o tendr un microorganismo frente a una sustancia conocida como antibitico. Existen parmetros que se aplican a los resultados para evaluar y homologar criterios en funcin de la respuesta obtenida por la prueba considerando el tipo o clase de microorganismo, as como las caractersticas de la sustancia o antibitico que se utilizan. Mtodo de difusin por disco. El principio de las pruebas de difusin por disco ha sido utilizado por ms de 70aos en los laboratorios de microbiologa. Alexander Fleming utiliz una variante de esta tcnica cuando trabajaba con la penicilina en los aos cincuenta. En ese tiempo, haba tantos procedimientos diferentes en uso como microbilogos. Los doctores Bauer, Kirby, Sherris y Turck probaron minuciosamente todas las variables involucradas en el proceso, tales como los medios de cultivo, la temperatura y el espesor del agar. En 1966, publicaron su estudio cimero describiendo la prueba que se usa en la actualidad. Estos pasos deben seguirse en forma minuciosa para obtener resultados precisos(Cavalieri.2005)22.

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Ladifusin(D)deunantibiticoenunmedio, obedecelaleydeFick,siendo X ladistancia deprogresiondelantiobticoeneldisco,Dla constante de difusin del antibitico, t el tiempodeobservacin, m0 laconcentracindel antibitico en la fuente y m la concentracin crtica,quevaraconlasensibilidaddelas bacteriasestudiadas26.

Para este estudio se utilizara el mtodo recomendado por la Organizacin panamericana de la salud en el manual de pruebas de susceptibilidad microbiana(Cavalieri.2005) mtodo de referencia fiable y reproducible.
22

del CLSI (Clinical and Laboratory Standars Institute) por ser un un

Concentracin Mnima Inhibitoria CIM. La concentracin inhibitoria mnima (CIM) de un agente antimicrobiano es la mnima concentracin que inhibe la multiplicacin y produccin del crecimiento visible de una cepa bacteriana dada en el sistema de prueba. Determinamos la concentracin en el laboratorio incubando una cantidad conocida de bacterias con diluciones definidas del agente antimicrobiano. Y donde los resultados son interpretados como susceptible, intermedio o resistente (Cavalieri.2005)22.

En el caso del la ampicilina la concentracin que se utilizara para aplicarla al disco es 10mg/ml esta cantidad es tomada como referencia de las tablas del CLSI( CLSI.2005)28.

Halos de Inhibicin Son la zona o superficie que tuvo contacto con despus de un tiempo que oscila entre 18 y 24 horas se forman los halos de inhibicin alrededor de los discos, que pueden reconocerse porque son zonas ms claras dentro de la muestra; esto halos se miden para determinar la eficacia de los antibiticos.

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Problema En la literatura especializada no se encuentran resultados especficos de inhibicin sobre el uso conjugado de la heparina y ampicilina en cepas de E. coli. Durante la revisin bibliogrfica se han encontrado estudios relacionados con el uso de la heparina y antibiticos con efectos de sinergia pero estos no han determinado con precisin la actividad de la heparina. Justificacin Con el presente trabajo pretendemos comprobar el efecto sinrgico de la heparina y la ampicilina sobre cepas de E. coli, dado que no se encuentra literatura especifica al respecto, considerando esto; es importante dar certeza al respecto. Objetivo General

1. Comprobar el efecto sinrgico de la heparina administrada con ampicilina en cepas de E. coli.


Objetivos Particulares

1.
2. 3. Hiptesis

Dar certeza de la accin de la heparina sobre cepas de E. coli. Estandarizar una metodologa para la evaluacin de la dosificacin de HNF. Plantear rutas alternas para combatir a bacterias que han desarrollado resistencia a los antibiticos.

Ha La administracin de heparina incrementa el dimetro del halo de inhibicin del disco de susceptibilidad microbiana impregnado con ampicilina en cepas de E. coli. Hb No altera el dimetro del halo de inhibicin del disco.

Cronograma de Actividades

Dias Horas diarias SubTotal Horas SubTotal Dias Total Horas Total Dias

Investigacin Bibliogrfica Redaccin del Protocolo Realizacin del experimento De 3 a 5 15 a 20 2a3 3horas 2horas 2 horas 15 40 6 5 20 3 61 28

Investigacin Bibliogrfica Redaccin del Protocolo Realizacin del experimento Redaccin del Protocolo Nota :

Semana Semana Semana Semana Semana

1 2 3 4 5

La consulta de fuentes y referencias se llevo a cabo durante toda la realizacin del protocolo, principalmente para corroborar y contrastar la informacin que se obtuvo durante la fase de investigacin Bibliogrfica

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Metodologa Se realizara la prueba en base a los lineamientos establecidos establecidos en las indicaciones del Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) (Bush.1995)20,(NCCLS.2002)30.Tanto en el procedimiento como en la interpretacin de resultados. Materiales Pinzas estriles Ispos estriles Solucin salina fisiolgica estril Escala de MacFarland Mechero de Bunsen Cajas de Petri estriles Agar Meller-Hinton Multidiscos comerciales con antibiticos. Regla Marcador Permanente Cepas de E.coli Heparina* Comercial No fraccionada. Ampicilina* estndar de 980 g/mg,

Procedimiento (Navrro.2011)31 1. Preparar cajas Petri con 20ml de medio de Mueller-Hinton 2. Humedecer el ispo estril en un cultivo de la bacteria a ensayar en caldo Mueller-Hinton o caldo soya tripticasa ajustado a al estndar 0.5 del nefelometro de MacFarland. Quitar el exceso de caldo presionndolo y girndolo sobre la pared interna del tubo. 3. Inocular la caja de Petri con caldo Mueller-Hinton con el ispo estriado en tres direcciones a lo largo y ancho de la caja, as como en las orillas para obtener un crecimiento uniforme. Dejar reposar la placa de 10 a 15 minutos. 4. Colocar un los discos impregnado con ampicilina 10 mg/ml, utilizando una pinza de diseccin esterilizada a la flama del mechero. Hacer ligera presin sobre el multidisco para que haga contacto con la superficie del medio. 5. Agregar la cantidad de Heparina en cada disco segn la tabla 1 a cada disco del corrimiento.

6. Incubar a 37OCpor 24 horas.


7. Realizar la lectura y medicin del halo de inhibicin, en base a los criterios del CLSI. Tratamientos Se realizara una prueba con 6 aplicaciones, incluyendo el testigo. Las cantidades de heparina estn determinadas arbitrariamente, considerando que no se encontr referencia que indicara o sugiriera alguna, para la aplicacin basndose en el modelo de la prueba de susceptibilidad antimicrobiana (Navrro.2011)31, se descarto las referencias de Christman & Doherty, 1956. 2 , por la magnitud que aplicaron y dado que en su estudio podra haber errores en la lectura del CIM, adems de que su determinacin no se realizo considerando los parmetros del CLSI.
Antibitico Ampicilina 10g 10g 10g 10g 10g 10g HeparinaHNF Testigo 10g/ml 20g/ml 30g/ml 40g/ml 50g/ml

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Resultados En funcin de la diferencia del dimetro del testigo (ampicilina sin heparina), respecto al resto de las aplicaciones se podr comprobar la hiptesis propuesta. Ha Hb La administracin de heparina incrementa el dimetro del halo de inhibicin en discos de susceptibilidad microbiana impregnado con ampicilina en cepas de E. coli. No altera el dimetro del halo de inhibicin del disco.

A partir de los resultados se establecer en el caso de que la hiptesis que se confirme sea Ha :

1. 2.

Que la aplicaciones de heparina- ampicilina incrementa o afecta el diametro del halo de inhibicin en cultivos de E. coli, notando una modificacin en el CIM. Que la cantidad de heparina administrada influye en la modificacin del dimetro del halo (en caso de que encontraran diferencias entre las aplicaciones en las que se administra heparina)

En caso de que la hiptesis sea Hb, se corrobora efectivamente los resultados de Christman & Doherty, 1956.2 Conclusiones Preliminares Tericas. La Ampicilina interacta con los enzimas responsables de la sntesis de la unin entre cadenas pared celular de E. coli, inhibiendo la formacin de los enlaces entre las cadenas de peptidoglicanos que forman la malla peptdica, esto ocasiona lisis celular debido a la presin osmtica del medio en donde se establecen. En este caso suponemos que la heparina actuara como sito de anclaje, por medio del cual, la ampicilina encontrara un numero mayor de sitios de accin para inhibir a las enzimas que realizan la sntesis de la fibras de mureina y su entrecruzamiento. Efecto de la Heparina La accin de la heparina no interfiere con el proceso de las betalactamasas, dado que estas interactan con los betalactamicos antes de que encuentren a las enzimas que generan los enlaces cruzados que propician el desarrollo de la membrana polipeptidica. Por lo tanto se concluye que, en base al supuesto de que la heparina sirva como ancla para cualquier antibitico, este debe de atacar la pared polipeptidica ya formada. Conclusiones La investigacin de alternativas para combatir la resistencia a los antibiticos, es un campo enfocado al desarrollo de frmacos y antibiticos destinados a inhibir el desarrollo, crecimiento, metabolismo y reproduccin en bacterias y microorganismos nocivos para el ser humano y sus intereses, ampliar la visin y concentrarse en los procesos que les permiten a estos organismos generar estrategias para adaptarse a los ataques que tienden a controlarlos o combatirlos, podra incrementar en el corto y largo tiempo la efectividad de los medicamentos y disminuir la resistencia que se genera con el uso y abuso de los mismos. Este protocolo intenta determinar nuevas rutas para combatir a los microorganismo mediante el empleo sinrgico de compuestos como la heparina, que permita elevar el grado de eficiencia de antibiticos ya conocidos, como la ampicilina, evitando generar la resistencia ya determinada en bacterias como E. coli. Los resultados positivos o negativos en la comprobacin de la hiptesis planteadas, estarn arrojando datos, que contribuyen a plantear nuevas investigaciones para dar certeza cientfica en el mbito farmacutico y microbiolgico.

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18

Anexo 1 Preparacin del medio de cultivo gar Mueller-Hinton CLSI

El medio de cultivo, agar Mueller-Hinton, se entuba a razn de 25 ml por tubo y se esteriliza en autoclave, 120C por 15 min. Una vez esterilizado se vuelca en placas de Petri, sobre una superficie horizontal y uniforme con el fin de obtener una profundidad aproximada de 4 mm. Esto requiere unos 25 ml de medio en placas de 100 mm de dimetro. Antes de ser utilizadas se secarn a 35C durante 20 a 30 min. Preparacin del inculo A partir de un desarrollo en agar nutritivo se realiza una suspensin directa a partir de 4 5 colonias con 18-24 hs. de incubacin en solucin fisiolgica ajustando la turbidez al 0.5 de la escala de Mc Farland (aprox. 1.5 x 10 8ufc/ml). Dentro de los 15 minutos de estandarizado en inculo, se siembra el medio de la siguiente manera: se sumerge un hisopo de algodn estril en la suspensin estandarizada y el exceso de lquido se elimina presionando y rotando el hisopo firmemente contra el interior del tubo por encima del nivel de lquido. Luego se pasa el hisopo en franjas uniformes en tres direcciones cubriendo toda la superficie de la placa de agar para obtener una siembra uniforme. Las placas se dejan secar de 3 a 5 minutos antes de aplicar los discos. El inculo debe dar un desarrollo confluente (aplicar los discos dentro de los 15 min. posteriores a la inoculacin). Aplicacin de los discos Los discos de antimicrobianos se aplican sobre la superficie de las placas inoculadas con pinza estril. Todos los discos deben presionarse suavemente sobre el agar para asegurar contacto total con la superficie. Deben colocarse a una distancia igual o mayor de 15 mm del borde de la placa y lo bastante separados para evitar la superposicin de los halos de inhibicin. No usar ms de 6 discos por placa de 100 mm. Dentro de los 15 min. de colocados los discos llevar a incubar con la placa invertida a 35C durante 16 a 18 hs. Lectura e interpretacin Luego del perodo de incubacin se leen los halos de inhibicin utilizando un calibre o una regla. El punto final es la inhibicin total del crecimiento, sin tener en cuenta las colonias diminutas que puedan detectarse solo con una observacin muy minuciosa. Los dimetros de zonas para antimicrobianos individuales se traducen a las categoras de susceptibles, intermedios o resistentes con referencia a tablas interpretativas. Control de calidad del ensayo Para monitorear la exactitud y precisin del procedimiento y la calidad de los reactivos se realiza un control de calidad peridico con cepas control de susceptibilidad conocida y genticamente estable. Las cepas recomendadas para control de mtodos de difusin son: Escherichia coli (ATCC 25922 y ATCC 35218), Cepa Antibitico Halo de inhibicin (mm) Criterio de corte (mm) Interpretacin

Valoracin microbiolgica de antibiticos Objetivo: Determinar la potencia de una muestra de ampicilina inyectable por la tcnica microbiolgica de difusin en gar (3+3). Ensayo aleatorizado en dosis (3+3), por la tcnica de difusin en agar. En el trabajo prctico se realizar la valoracin de una muestra de ampicilina inyectable de 1000mg por el mtodo cilindro-placa. Previo a la valoracin de cualquier antibitico debe realizarse la curva de calibracin Dosis-Respuesta para la seleccin de las diluciones de prueba en las condiciones del ensayo. En este caso el anlisis de la curva log concentracin (g/ml) vs halo (mm) permiti seleccionar las siguientes tres concentraciones de trabajo: 0,15 g/ml - 0,30 g/ml - 0,60 g/ml.

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Realizacin del ensayo de valoracin -Preparacin de las diluciones del estndar de referencia. Utilizar un estndar de Ampicilina de 980 g/mg, Proceder de acuerdo a lo indicado en la USP-XXV (Biological Test/ Antibiotics-Microbial Assays). Pesar exactamente alrededor de 20 mg del estndar. Calcular el volumen de agua destilada estril para resuspender la pesada de forma de obtener una solucin de 5000 g/ml, teniendo en cuenta la potencia (g/mg). Realizar el siguiente esquema de diluciones: 1:50 1:10 0.15: 10 ==> 0.15 g/ml 5000 g/ml 100 g/ml 10 g/ml 0.30: 10 ==> 0.30 g/ml ADE S3 S3 0.60: 10 ==> 0.60 g/ml Solucin 3 (S3): P04K2H -------16.73 g P04KH2 ------ 0.523 g AD -------1000 ml

pH 8, 0.1M

-Preparacin de las diluciones de la muestra. Preparar las diluciones de la muestra siguiendo el esquema utilizado para el estndar. Considerar que la muestra tiene una potencia del 100% segn lo declarado por el fabricante. -Preparacin del inculo. El microorganismo utilizado como indicador es el __________. Sembrar la cepa en 3 tubos de gar para antibiticos N11 de Merck, e incubar 24 hs a 32 C. Resuspender los desarrollos en solucin fisiolgica (0.85% NaCl), de forma de obtener un inculo denso y homogneo. Finalmente calibrar el inculo al 25% de transmitancia leda a 580 nm. As preparado puede conservarse a 4C durante 14 das. Calcular el volumen de inculo a sembrar por placa sobre la base de la relacin propuesta por USP-XXV: 0.5 ml cada 100 ml del medio. -Preparacin de las placas. Se utiliza el gar para antibiticos N11 de Merck, envasado a razn de 16 ml por tubo. Fundir 6 tubos del medio N11, enfriarlos a 45-50C y mantenerlos en Bao Mara. Inocularlos, homogeneizar y volcar en las respectivas placas de Petri estriles. Dejar secar 10 minutos en flujo laminar. -Reservorio del antibitico Utilizar cilindros de vidrio o de acero inoxidable esterilizados en estufa. Sus dimensiones son: dimetro externo: 8 mm; dimetro interno: 6 mm y longitud: 10 mm. -Ensayo Dibujar 4 esquemas de distribucin de las diluciones sobre papel asignndoles las letras A,B,C y D. Cada esquema tendr las 6 diluciones: dosis baja (1), media (2) y alta (3) del estndar y dosis baja (4), media (5) y alta (6).de la muestra Colocar las placas rotuladas con una letra sobre las plantillas segn los esquemas.

Con pinza estril disponer 6 cilindros por placa.

Cargar con pipeta automtica 25 l de cada una de las diluciones en los respectivos cilindros, de acuerdo a la distribucin de cada esquema. Cambiar de la punta descartable (tip) en cada dilucin. Dejar las placas sobre la mesada para permitir la predifusin del antibitico durante 20 minutos. 1 Llevar a incubar a 37 C durante 24 horas. Retirar los cilindros y descartarlos en formol al 5%. Rotular los halos de inhibicin y leer con calibre por el reverso de las placas. Registrar los datos segn la planilla: placas vs. Diluciones.

5 6

A 3

4 2

Luego de evaluar estadsticamente los datos mediante un anlisis de varianza, calcular la potencia real del producto. Graficar el logaritmo de las concentraciones ensayadas en funcin de los halos de inhibicin para el estndar y la muestra.

20

Estndar

Muestra

Placas

0,15 g/ml 0,30 g/ml

0,60 g/ml

0,15 g/ml

0,30 g/ml

0,60 g/ml

A B C D A* B* Prom. (mm) S 1 S2 S3 T1 T2 T3

De acuerdo al procedimiento realizado las dosis alta, media y baja del estndar son iguales a las dosis alta, media y baja de la muestra, por lo tanto se esperara una respuesta coincidente entre ambas. Esto equivale a decir que la potencia real de la muestra es igual a la potencia supuesta. La diferencia real que pueda existir entre las dos respuestas lineales queda demostrada por la distancia vertical que aparezca entre las dos lneas paralelas: M, de donde se estima la potencia real de la muestra. Deduccin de las ecuaciones en el ensayo 3 + 3. Como puede observarse en la figura, para cada una de las dosis supuestas de la muestra, existe una respuesta que puede traducirse en una dosis real si se interpola el dimetro en la curva correspondiente al estndar. Tomando en cuenta lo que se acaba de enunciar podemos decir que:

M= log

Dreal 3 Dreal 2 Dreal 1 =log =log D sup 3 D sup 2 D sup 1

Considerando que la relacin entre la dosis real y la dosis supuesta es idntica a la relacin entre

M= log

Pr eal =log R P sup

la potencia real (de la muestra) y la potencia supuesta (del estndar) podemos escribir: Si se logra determinar la relacin entre Preal y Psup (R) puede determinarse la potencia de la muestra ya que la potencia supuesta es conocida. Para esto calculemos la pendiente de las rectas teniendo en cuenta los datos de que disponemos. Hay dos maneras de hallarla que quedan claras si se observa el Grfico -1. Grafico-1: Relacin entre el log Dosis y el halo de inhibicin en un ensayo de valoracin microbiolgica de un antibitico por el mtodo de difusin en gar, en tres niveles de dosis (3+3).

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Log Dosis Standard (S) D real (3) D sup (3) D real (2) D sup (2) Muestra (T)

M
D real (1) D sup (1)

I
Pendiente = M I = F E

Dimetro del halo

S1

T1

S2

T2 S3

T3

F E
Con (Ntese que se hace un promedio de tres distancias). (Ntese que se hace un promedio de cuatro distancias).

1 F=[ T1S1 T2S2 T3S3 ] 3

1 E=[ S3S1T3T1 ] 4

Simplificando El valor de I tambin es conocido ya que es el logaritmo de la relacin entre dosis sucesivas (usualmente log 2=0.301). Por lo tanto estamos en condiciones de calcular M y R a partir de los resultados Queda claro que de los halos de inhibicin obtenidos. La potencia real de la muestra estar dada por

M=F

I E

Pr eal=RP sup

En este caso, como R>1, la potencia de la muestra es mayor que la del standard (Preal>Psup) lo cual concuerda con el grfico. En el caso que la situacin real sea la inversa de la planteada para deducir las ecuaciones, esto es cuando la potencia de la muestra sea menor que la del standard, las mismas ecuaciones seguirn siendo vlidas pero el valor calculado para F ser negativo, el log M ser negativo y el R<1 (Preal<Psup).Cabe aclarar que todas estas ecuaciones slo podrn aplicarse si el ensayo cumple con el anlisis de varianza que asegure, entre otros requisitos, que se cumplen las condiciones de linealidad y paralelismo requeridas. Apndices 2

22

Anlisis Estadstico Para analizar si existe diferencia significativa entre las Pruebas de heparina y ampicilina se empleara un anlisis de varianza (ANOVA) con un nivel de confianza de 95% en el programa Minitab14. Dicho anlisis se utiliza para determinar una razn de las diferencias observadas y permite verificar la diferencia entre dos o ms medias. Los resultados obtenidos se trataran en el programa Minitab14 de manera ideal se pueden siguiente : Tabla de anlisis de varianza de los halos de inhibicin que mostr cada uno de los tratamientos. muestrearan en una tabla como la

Level 0,054 0,135 0,270 0,405 0,540 5,400

N 6 6 6 6 6 6

Mean 0,000036333 0,000036733 0,000037667 0,000038667 0,000039667 0,000039733

StDev 0,000001528 0,000000643 0,000000577 0,000001528 0,000003512 0,000001617

Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev ------+---------+---------+---------+--(-*--) (--*-) (--*-) (--*-) (--*-) (--*-) ------+---------+---------+---------+---

En la tabla anterior, se presenta la media y la desviacin estndar del dimetro de inhibicin. En el lado derecho de la tabla, se valora la diferencias entre los l, y dado que existe un traslape entre todas ella, se puede afirmar con un nivel de confianza del 95% que no existe diferencia entre los seis tratamientos. Para establecer una comparacin detallada para cada una de la muestras, se realizara la prueba de Turkey. .

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